TCNICAS IMUNOLGICAS Parte 2

Reagentes Marcados
- Imunofluorescncia - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) (Quimioluminescncia, Fluorimetria) - RIA (radioimunoensaio) - Western Blotting

Imunofluorescncia
Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos, mantendo a especificidade contra o antgeno(Conjugados)

-Anticorpos Marcados (Fluorocromos- substncias que absorvem a luz UV e emitem luz visvel Isotiocianato de Fluorescena* )

REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA

A reao Ag-Ac detectada pela emisso de fluorescncia Pesquisa de antgeno amostra (Ag??) + Ac especfico conjugado a substncia fluorescente (conjugado)* microscpio de fluorescncia

Deteco direta de microrganismos em secrees, urina, fezes, cortes de tecido,Streptococcus do grupo A

Ex. cortes de tecido do paciente

IMUNOFLUORESCNCIA USADA PARA DETECO DE DOENAS INFECCIOSAS COMO DOENA DE CHAGAS, AIDS, HEPATITES, DOENAS AUTO-IMUNES

-UTILIZADAS AINDA -SUBSTITUIO POR ELISA -NECESSIDADE DE MICROSCPIO FLUORESCENTE -SUBJETIVIDADE DE LEITURA -IMPOSSIBILIDADE DE AUTOMAO

MICROSCPIO DE IMUNOFLUORESCNCIA

PADRES DE IMUNOFLUORESCNCIA FAN-FATOR ANTINUCLEAR- PARA DETECO DE DOENAS AUTO IMUNES, SORO DO PACIENTE + CLULAS, CONJUGADO COM FLUORESCENA PADRES PARA CERTAS DOENAS

T ou B

Ensaios em fase slida

ELISA
Competitivo

No competitivo-indireto

Ensaios em fase slida

ELISA
Sandwich ou de captura

Vantagens e Desvantagens: -Sensibilidade, especificidade e simplicidade da tcnica; --Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; -Erros operacionais, variveis analticas - Adaptao a diferentes graus de automao -Instabilidade dos reagentes - Influncia em manipulaes e do equipamento

-Uma microesfera de poliestireno revestida com anticorpo monoclonal contra antgeno analisado -Adio do soro do paciente, que incubado com agitao intermitente. -Lavagem para retirada do antgeno no fixado -Adio de anticorpo monoclonal especfico para o antgeno pesquisado conjugado a enzima (fosfatase alcalina). -Incubao do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo no fixado -Adio do substrato da enzima (produto quimioluminescente), em seguida, incubao. Y
Anticorpo monoclonal Substrato

Conjugado Antgeno do soro do paciente

Y Y Y

-A adio de substrato quimioluminescente sofre hidrlise na presena da enzima, produzindo substncias instveis que geram emisso de ftons (luz).

Ensaio quimioluminescente
Produo de luz a partir de uma reao quimica, habitualmente uma reao de oxidao-reduo um dos modo mais sensvel de deteco em imunoensaios Compostos utilizados: Esteres de acridina Derivados do isoluminol

QUIMIOLUMINESCNCIA - TCNICAS UTILIZADAS PARA O ENSAIO: - Pesquisa de marcadores tumorais; - Hormnios**; - HIV; - Hepatites; - Vitaminas; - IgE total e especfica, etc.

QUIMIOLUMINESCNCIA Vantagens: - Maior sensibilidade, eficincia e simplicidade que os RIAs. -So altamente sensveis -Mtodo de escolha para quantificao de substncias, como hormnios e marcadores tumorais. Desvantagens: - Maior probabilidade de sofrer interferncia por mltiplos fatores.

Tipos de ensaios Quimioluminescentes

-mais sensvel que os com substratos cromognico; - So altamente sensveis; - Mtodo de escolha para quantificao de substncias, como hormnios e marcadores tumorais.

RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcaes: I125: emite raios gama H3: raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade Desvantagem a manipulao de istopo radioativo. Aplicaes:

Triagem vrus da hepatite B em doadores de sangue, Hormnios,

protenas sricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

WESTERN BLOTTING tipo de imunoblotting

- Imunoblotting ou imunodeteco tipo de tcnica que permite reconhecer e quantificar antgenos a partir de um gel de eletroforese, geralmente SDS - Identifica antgenos ou anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING