SediMAX

Deteccin de Bacteriuria basado por Microscopia Automatizada de todo el campo con reduccin a un nmero de cultivos de orina necesarios

Bacteriuria Screening by Automated Whole-Field-Image-Based Microscopy Reduces the Number of Necessary Urine Cultures
DIPLOMADO DE MICROBIOLOGIA UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA PRESENTACION DE ARTICULO CIENTIFICO Rosanna Falbo , una M. Roberta Sala , un Signorelli Silvia , una Natascia Venturi , una Stefano Signorini , una y Paolo Brambilla a

LIC. SUAREZ AGUILAR DANIEL

danielsuarez2005@hotmail.com

Saba Ud. que ...

El examen de orina es el de mayor valor para determinar la integridad anatmica y funcional de los riones que esta disponible a los mdicos clnicos
Schreiner From J. Szwed, The Importance of Microscopic Examination of the Urinary Sediment, American Journal of Medical Technology, 48:2, Feb. 1982

HISTORIA DEL EXAMEN DE ORINA

GRECIA (550AC AL SIGLO II)

Urianlisis:

Muestra

Centrifugacin

Decantacin

Informes

Microscpica

Preparacin

Diagrama de Flujo
Llegan las muestras al Lab
Aadir una gota de tinte Mezclar la orina y el tinte Identificar las Muestras Pasar las muestras a un tubo

Pedir nuevas muestras ?

No

Aspirar en la pipeta

Colocar en el portaobjetos

Verificar el volumen de orina en el tubo

Al menos 10 mL?
Colocar cubreobjetos Si Colocar tubos en la centrfuga Examinar en Campo bajo
X 10

Reportar el Color y la Claridad

Medir la Gravedad Especfica

Centrifugar
Colocar en la orina la tira qumica Sacar los tubos de la centrfuga

Examinar en Campo alto

X 40

Reportar Resultados Decantar el sobrenadante

= Fuentes de error

1. IMPORTANCIA ANALISIS ORINA

 En todos los laboratorios

>200 millones muestras por ao Qumica (Tira) Microscpica Microbiolgica Creciendo >5%

Proceso Manual

IMPORTANCIA CLNICA
Urianlisis con tiras de orina/Elementos Formes
Screening y monitoreo de:
Enfermedad Renal y del tracto urinario

Por deteccin de:

Leucocitos (WBC) Nitrito Valor pH Protenas Sangre (RBC, hemoglobina) Gravedad especfica
Glucosa Cetonas Urobilingeno Bilirubina

Metabolismo de carbohidratos (Diabetes mellitus)

Enfermedad del hgado y desrdenes hemolticos

MINSA

EsSalud

Importancia del Anlisis de Orina EsSalud

2. EQUIPO AUTOMATIZADO

Software de procesamiento de imgenes con interfaz de PC fcil de usar

NO hay reactivos / soluciones

necesarias

15 PARTCULAS reconocido
y clasificado Otras partculas puede ser visto en la pantalla

VISTA "REAL" microscopio (250x) en la pantalla

MENOR VOLUMEN de muestra
Hasta 80 MUESTRAS / hora de rendimiento

AUTOMTICA de la muestra de probeta y manejo cubeta

ALMACENAMIENTO de imgenes y resultados (hasta 1000 muestras) Ampliar opcin

Copyright 2010

14

RASGOS TCNICOS
PREPARACIN DE LA MUESTRA REACTIVO

AUTOMTICO, REPRODUCIBLE NO SE REQUIERE

RESULTADO DIRECTO
RESULTADO FINAL RENDIMIENTO CAPACIDAD DE MEMORIA LAS PARTCULAS DETECTADAS

HPF-COMO IMAGEN (15 POR DEFECTO) PARTCULA CONC. Y CATEGORA

HASTA 80 MUESTRAS / HORA LTIMOS 1000 MUESTRAS RBC, WBC, HYA, PAT, EPI, NEC, BAC, S, , CAOXM, CAOXD, URI, TRI, MUC, SPRM A LA AMPLIACIN 250X, 20X ZOOM PTICO 2000 RPM

MICROSCOPIO CENTRFUGO VOLUMEN DE LA MUESTRA CUVETTE PAQUETE

2,0 ML (0,2 ML SLO SE UTILIZA)

50 PC / EL RECIPIENTE (12 CONTENEDORES PUEDEN SER INSERTADOS AL MISMO TIEMPO) UNIDAD DE MEDIDA: 100-250 VAC 50-60 HZ / 600 W 230 VAC, 50 HZ / 400 W 58 KG 600X600X600 MM
Copyright 2010 15

PODER OPERATIVO PARA PC PESO TAMAO

Copyright 2010

16

Copyright 2010

17

Automated Whole-Field-Image

Copyright 2010

18

LEUCOCITOS

INFECCION URINARIA
GLOMERULONEFRITIS NEFRITIS INTERSTICIAL

Copyright 2010

19

HEMATIES NORMAL

INFECCION URINARIA LITIASIS NEOPLASIAS HEMATURIA DE ESFUERZO

Copyright 2010

20

HEMATIES DIMORFICOS

GLOMERULONEFRITIS OTRAS ALTERACIONES CLOMERULARES

Copyright 2010

21

CELL EPITELIALES ESCAMOSA

ORIGEN: VAGINA - URETRA POCO VALOR DIAGNOSTICO VAGINITIS

Copyright 2010

22

CELL EPITELIALES

Copyright 2010

23

CELL EPITELIALES NO ESCAMOSA

CELL TUBULAR RENAL: Necrosis tubular Nefritis Intersticial CELL EPIT. TRANSITORIA Neoplasia

Copyright 2010

24

CELL EPITELIALES ATIPICAS

Copyright 2010

25

CILINDRO HIALINO

26

CILINDRO GRANULOSO

27

CILINDRO LEUCOCITARIO

28

CILINDRO ERITROCITARIO

29

CRISTALES URATOS AMORFOS

30

CRISTALES OXALATO CALCIO

31

CRISTALES FOSFATOS TRIPLES

32

CRISTALES ACIDO URICO

33

BACTERIAS

34

LEVADURAS

35

3. POBLACION DE ESTUDIO

MICCION LIMPIA MUESTRA CATETER

2010

2009
NOV

ENE

1011
0

AMBULATORIO

213

HOSPITALIZADOS

798

95

X=55

3. CULTIVO

CHROM ID CPS

RECUENTO MANUAL = N COL X f DILU

POSITIVO

105 UFC/mL

CATERIZACION, ANTIBIOTICOTERAPIA

104 UFC/mL
39

2. ASPECTOS PRE-ANALTICOS

Tcnica adecuada y procedimiento

Precauciones en la recoleccin de muestras

No haga esto !!!!!

Tcnica adecuada y procedimiento

Precauciones en la recoleccin de muestras

TOMA DE MUESTRA Primera orina de la maa Higiene, TRANSPORTE No exponer a la luz. Transporte inmediato No usar preservantes PROCESAMIENTO EN LABORATORIO Procesar inmediatamente

Muestra chorro medio

Cerrar tapa. Rotular, nombre hora.

2 horas

Influencia del almacenaje de muestras

Destruccin Cilindros Lisis de WBC y RBC Degradacin de Glucose

Aspectos pre-analticos

Otras reacciones qumicas Oxidacin de bilirubina y urobilingeno

Cambios en pH

2. RESULTADOS OBTENIDOS

80% NEG

ITU
SIGNIFICATIVA BACTERIURIA NO TIENE ITU

Copyright 2010

45

18 CELL/uL
WBC 4 CELL/HPF (Campo Alta Potencia)

MP = POSITIVA
BAC 10 ELEM/HPF (Campo Alta Potencia)

44 ELEM/uL
Copyright 2010 46

59
EXCLUIDOS x PARTICULAS SD (HACINAMIENTO)

CULTIVO

778
952 174
BACTERIA Escherichia coli Enterococcus faecalis Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Morganella morganii Staphylococcus epidermidis Citrobacter freundii Alcaligenes faecalis Staphylococcus aureus Providencia stuartii flora polimicrobianas f 105 12 9 9 5 5 3 3 1 1 1 1 19 % 60,3 7,0 5,2 5,2 2,9 2,9 1,7 1,7 0,6 0,6 0,6 0,6 11,0

81,7%

1011

18,3%

SEDIMAX / TIRA REACTIVA

RESULTADO (%)
TEST PRUEBA
CARACTERSTICAS

Sensibilidad

Especificidad

PPV
34.9

NPV

FNR
1.7

FPR

SediMAX

WBC > 4 cells/HPF, BACTERIA > 10 elements/HPF

98.3

59

99.4

41

Tira Reactiva

Esterasa de leucocitos> 25 leu /ul, nitritos sangre positivo,> 0,03 eritrocitos /ul

33.1

98.6

82.4

88.2

66.9

1.4

Implica CULTIVO INNESESARIO (Representa 1/3 MP)

SEDIMAX / CULTIVO
SEDIMAX CULTIVO
N DE MUESTRAS CON CULTIVO DE ORINA COMO

RESULTADO UN

BACTERIA
> 10 Elem/HPF (44 Elem/l)

WBC
> 4 cells/HPF (18 cells/l)

N MUESTRAS

NEGATIVO

Polimicrobianas flora 10 4 ^ UFC / ml b

Polimicrobianas flora 10 4 ^ UFC / ml

10^4 UFC / 10 ^ 5
ml / ml

UFC

10 ^ 6 UFC
/ ml

Levadura

NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

462

459

1 0

52
267
171

42
169
66

1 37 4

1 8 10

4 7 18

2 39 71

2 2 1

NEGATIVO

5 1

POSITIVO POSITIVO

952

38,6% TRATAMIENTO ANTIBACTERIANO

1. ESTUDIOS RELACIONADOS

Copyright 2010

51

Utilidad Clnica

Resultados: Fueron 2010 sujetos considerados con el diagnstico de ITU, se obtuvieron Resultados: El equipo UF 100 tiene una sensibilidad y especificidad de 0.83 y 0.94 529 casos (26.32%). El screening con UF 100 tuvo una sensibilidad de 0.94; respectivamente para detectar sangrados no glomerulares. El valore predictivo positivo y especificidad de 0.93; valor predictivo positivo de 0.83; valor predictivo negativo de 0.98. negativo son 0.95 y 0.78 respectivamente.Los valores que correspondieron a la microscopa fueron 0.79 y 0.90 respectivamente y 0.93 y 0.74 respectivamente. Conclusiones: En nuestra experiencia el resultado de screening con el UF-100, muestra muy buena correlacin con ITU aguda en pacientes adultos. Conclusiones: Fluorometra automatizada puede ser utilizado para distinguir entre hematuria glomerular y no glomerular.

Utilidad Clnica

Conclusiones: la citometra de flujo del LCR con el UF 100 ofrece un rpido y confiable conteo de leucocitos y eritrocitos

La conductividad monitoriza fielmente la concentracin de los electrolitos urinarioscorrelaciona muy bien con la concentracin de creatinina urinaria. Cuando hay presencia de osmolitos no inicos (glucosa y urea), conductividad complementa la medida de osmolalidad

Utilidad Clnica

Estudios de investigacin

Task Force de la Sociedad de Laboratorio de Hematologa (ISLH) Los valores provisionales de referencia para neonatos son.eritrocitos 5cell/uL (0 - 2 cell/HPF), leucocitos 12 cell/uL (0-3 cel/HPF)

Estudios de investigacin
Clin Nephrol 2001 May;55(5):384-92.

Regineter A, Haenni V, Rish L, Kochli HP, Colombo JP, Frei R, Huber AR

CONCLUSION: The analyzer is capable of providing rapid and reliable urine analysis of cellular particles avoiding the known imprecision of dipstick and sediment methodology. Thus, when used in an algorithm, combined with dipstick or quantitative urine chemistry analysis (for hemoglobin, esterase, protein, glucose, etc.), this analyzer might serve as a rapid and accurate screening tool in routine urine analysis, thereby reducing manual reviewing rate as well as the number of missed samples, compared to screening with dipstick alone.

Estudios de investigacin

Aspectos pre-analticos

Influencias de una adecuada colecta de la muestra

Muestra colectada SIN precauciones Muestra colectada CON precauciones

Sexo
Hombre

positivo

negativo

positivo

negativo

7 (14 %)
31 (48 %) 38 (33 %)

44
34 78

1 (2 %)
4 (6 %) 5 (4 %)

50
61 111

51
65 116

Mujer

D. Kutter, D. Ann. Biol. Clin. 38 (1980) 179

GRACIAS

SENSIBILIDAD EN PRUEBAS
Sensibilid ad (Se) =
positivos

Verdaderos

Verdaderos positivos + falsos negativos

Sensibilidad. Es la capacidad de una

prueba para dar resultados positivos cuando el animal est verdaderamente enfermo.

SENSIBILIDAD EN PRUEBAS

Formula

Se =

a
a+c

a = Verdaderos positivos b = Falsos positivos c = Falsos negativos Estado de salud del animal d = Verdaderos negativos.
Enfermo Sano

Resultados de la prueba

+
-

a c
a+c

b
d b+d

a+b
c+d a+b+c+d

ESPECIFICIDAD EN PRUEBAS

Especificidad (Es) =

Verdaderos negativos Verdaderos negativos + Falsos positivos

Especificidad. Es la capacidad de la prueba para dar resultados negativos cuando un animal no est verdaderamente enfermo.

ESPECIFICIDAD EN PRUEBAS
Formula Es =

b= + d positivos a Verdaderos
Estado de salud del animal

b = Falsos positivos c = Falsos negativos d = Verdaderos negativos.

Enfermo

Sano

Resultados de la prueba

+
-

a
c a+c

b d
b+d

a+b
c+d a+b+c+d

FALSOS POSITIVOS
Formula FP =

b+d

a = Verdaderos positivos b = Falsos positivos c = Falsos negativos d = Verdaderos negativos.

Estado de salud del animal

Enfermo

Sano

Resultados de la prueba

+
-

a
c a+c

b d
b+d

a+b
c+d a+b+c+d

FALSOS NEGATIVOS
Formula FN =

a+c
a = Verdaderos positivos b = Falsos positivos c = Falsos negativos d = Verdaderos negativos.
Estado de salud del animal

Enfermo

Sano

Resultados de la prueba

+
-

a c
a+c

b
d b+d

a+b
c+d a+b+c+d

Centrifugacin
Porcentaje de Sedimento Recobrado Elementos Formados CV del residuo - 45%

RBC 60% se recobran en el sedimento

WBC 73% son recobrados en el sedimento Clulas Epiteliales 84% son recobrados en el sedimento Cilindros 88% son recobrados en el sedimento

Bacterias 40% son recobradas en el sedimento

Las partculas en la orina decantada no pueden estar en el sedimento Hannemann-Pohl Clin Chem Lab Medicine 1999

UF-100 Principio de Medicin

Fenantridina Dye inserted

Tincin del DNA Fenantridina afinidad por los cidos nucleicos excitacin onda 488 nm onda de emisin 610 nm luz anaranjada Tincin de la membrana Carbocianina apetencia por fosfolpidos de la membrana celular excitacin onda 488 nm onda de emisin 505 nm luz verde

Citmetro de Flujo: Informacin Luz dispersa frontal: tamao y ancho de partcula

Deteccin de la seal

Electrode Photomultiplier

Argonlaser
-

Collecting Lens Photodiode

Flowcell

Luz dispersa frontal

La intensidad de luz dispersa frontal refleja el tamao (dimetro) de la partcula

Cel. epitelial
Fscw (duracion)

Fsc (intensidad)

RBC

y x y

El tiempo del pulso electrnico derivado de la luz dispersa frontal (Fscw) refleja en ancho de la partcula

WBC

Cilindro
x

Bacteria
x

Principio de Medicin. Citometria de Flujo fluorescente.

Fluorescencia: Diferenciacin Determinada por la Composicin Celular

+

Electrode Photomultiplier

Argon / laser
-

Collecting lens
Photodiode

Flowcell

La intensidad de fluorescencia (Fl) indica la tincin de cada elemento formado El ancho del seal de fluorescencia (Flw) Indica el largo de la rea con contenido de tincin

(Fl)

Cel Epiteliales
(Flw) y x y x y x

GR GB Cilindros

Bacteria
x

Principio de Medicin. Citometria de Flujo fluorescente.

Parameter GR GB Celulas Epiteliales Cilindros, Hialinos Bacteria Levaduras Crystales Celulas Epiteliales Redondas Cilindros Patolgicos Esperma Nucleo
No

Membrana
Si

Tamano
8u

Si

Si

10 - 14 u

Si

Si

40- 60 u

No Si Si No

No Si Si No

Grande, Variable 0.2 - 20 u Pequeno, Variable Pequeno, Variable

Si

Si

12 - 60 u

Si (inclusions only)

Si (inclusions only)

Grande, Variable

Si

Si

3 - 5 u (head)

Dispersogramas
Fl // Fsc - Scattergram Fl Fsc - Scattergram

Fscw // Flw - Scattergram Fscw Flw - Scattergram

Morfologa Clasificacin Automtica

Dispersograma

Resultados numricos

Avisos de alta sensibilidad, confirmacin simplificada

Retos Clinicos
Deteccin de sangrado de la parte baja del tracto urinario de origen metablico (clculos renales), canceroso (tumores), o traumtico RBC WBC Precisin y exactitud an a niveles de concentracin muy bajo Ms volumen analizado para mayor sensibilidad Ninguna clula se pierde debido a la centrifugacin

Ureterolitiasis, Pielonefritis

Retos Clnicos
Deteccin de bacteria, leucocitos y clulas tubulares, para el diagnstico de infecciones (UTI). Leucocitos Bacterias Clulas epiteliales redondas Cilindros celulares Levaduras Clasificacin superior y enumeracin de elementos formados por medio de la citometra de flujo fluorescente Resultados de urianlisis rpidos y eficientes

Pielonefritis

Retos Clinicos
Sensibilidad incrementada para los sangrados (hematuria) para la bsqueda de desordenes que compromete la integridad del sistema vascular del tracto urinario RBC WBC Cilindro Clulas epiteliales redondos Confirmacin solamente por excepcin a los lmites definidos por el usuario Especificad de revisin por expertos

Diabetes Sindrome Nefrtico

Algoritmo Urolgico
Primera orina de la maana. Analizada < 2hr o preservada GR (+)

GR (-)

Hematuria microscpica 1 3/hpf Valor de corte para enf renal puede ser significativamente ms bajo que para ITU Cilindros (+) Cilindros RBC
Cilindros (-)

Avisos de morfologa de GR generados por el UF-100 Dimorfismo (+) Protena (+) Repetir el examen microscpico en otra primera muestra de la maana GB (+) Bacteria (+) Cultivo (+) Infeccin del tracto urinario bajo > 80% Isomorphic GR (-)

GB (-) Bacteria (-) Cultivo (-) Imagen en el TU

Desordenes urolgicos + Citoscopia Ca vejiga TURBT Marcadores Citologia Urotelial CA Marcadores

Desordenes renales Tubulares o Glomerulares Funcin renal (DC) Ecogafas, Bx Glomerulonefritis primaria, desrdenes hereditarios, enfermedades sistmicas secundarias

Cistitis, Uretritis, Pelonefritis

Prostatitis Episodio agudo febril

Neoplasias Obstrucciones Urolitiasis

Algoritmo Nefrolgico
Primera orina de la maana. Analizada < 2 hrs o preservada

GR (+) Hematuria microscpica 1 3/hpf Valor para enf renal puede ser menor que para ITU

GR (-)

Cilindros (-)

Cilindros (+), Cilindros (GR)

Avisos de morfologa de GR generados por el UF-100

> 80% Dismorfismo RBC (+)

Repetir el examen microscpico en otra primera muestra de la maana

Dismorfismo (-) Protena (tira 1+) Protena, Orina 500 1000 mg/24 hr| Creatinina srica & DC <60 ml/min/1.73 m3

Hematuria aislada

Desordenes renales -Tubulares o Glomerulares Biopsia renal

Enfermedad Renal Crnica

Hematuria de marcha Monitor factores de riesgo Hipertension & DM Causas Urolgicas

Glomerulonefritis primaria
Desordenes hereditarios Dolencias sistemticas secundarias

Predice Inicio de IR Monitoreo de GFR Monitoreo de factor riesgo: IR y proteinuria, BP Acute Decline: Toxina, Isquemia, deplesin Volume, Obstruction por prostata, urolitiasis, tumor

Glucosa control en DM BP control en HTN Drogas

Valorar el efecto