PRTICA : TCNICAS DE CONTAGEM

PROFESSORA : OLGA MARTINS MARQUES

OBJETIVOS: Determinar a concentrao de clulas de leveduras pelo uso das seguintes tcnicas: Tcnica do Plaqueamento, Contagem direta ao microscpio (pelo uso da cmara de Neubauer),e por turbidimetria. 1. Contagem de Clulas Viveis pela Tcnica do Plaqueamento Material - Amostra: Saccharomyces cervisiae (soluo de fermento prensado em gua) - Meio de cultura: Glicose Agar - Diversos: Pipetas de 1ml, Placas de Petri, tubos de ensaio com 9ml de gua estril, Erlenmeyer com 99ml de gua estril, Bico de Bunsen Procedimento Experimental
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para a contagem em placa, da amostra contendo a cultura S. cerevisiae fazer diluies at 1x10-7 e plaquear em duplicata 1ml das diluies de 1x 10-4 a 1x10-7. colocar 1 ml de cada diluio em placas e adicionar 10-20ml de meio de cultura (GA) , homogeneizar, esperar solidificar. incubar a temperatura ambiente por 24-48 horas.

FIG 1: Esquema de diluio da tcnica das diluies sucessivas

2. Concentrao Celular e Contagem de Clulas Viveis de Leveduras pelo Uso da Cmara de Neubauer A contagem direta por microscpio, a mais rpida, e levada a efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumerao feita com o auxlio de lminas espessas, conhecidas como cmaras de contagem. As mais comuns so as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. estas cmaras apresentam uma rea reticulada, com pequenos quadrados de superfcie conhecida. Fazendo parte do conjunto, existe uma lamnula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a altura destes lamnula conhecida. No nosso experimento, as leveduras sero contadas numa cmara de Neubauer, que apresenta uma rea dividida em quadrados com 1/400mm2; a cmara coberta com uma lamnula, deixando uma altura de 1/10mm, i.., de cada quadrado lamnula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado de 1/4000 mm3. Esta contagem inclui organismos viveis e mortos, sendo denominada de contagem total de clulas. Este mtodo de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de no se ter a distino entre clulas vivas e mortas. Material - Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae - Reagentes: Soluo salina fisiolgica (0,85% NaCl) -Equipamentos:Microscpio tico comum, Cmara de contagem de Neubauer Bico de Bunsen - Diversos: Pipeta Pasteur Procedimento Experimental
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Pipeta 1ml da amostra de suspenso celular para um tubo de ensaio; Adicionar 1ml de corante celular (soluo 0,02% de azul de metileno em soluo a 2% de citrato de sdio) Homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspenso da cultura de levedura sobre a rea reticulada da cmara; Ajustar a cmara platina do microscpio; Colocar a lamnula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a lamnula, e deixar-se que a suspenso do microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ao capilar sob a lamnula; Esperar cerca de dez minutos, at que o material sedimente;

Usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 quadrados dispostos em X (ver figura 1).

OBSERVAO
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Na contagem das clulas devem ser desprezados os brotamentos a menos que seu tamanho seja maior que metade da clula original; O nmero de clulas por quadrado deve estar situado entre 20 e 30. Caso a concentrao no campo tico seja superior faixa desejada, fazer diluies da suspenso original e em seguida corar as clulas com a soluo de azul de metileno; As clulas situadas sobre as linhas divisrias esquerda e abaixo dos quadrados, so contadas como pertencentes quele quadrado.

CLCULO: Concentrao Celular - Calcular o nmero de leveduras/mL, contidas em uma suspenso utiliza-se a seguinte frmula Concentrao Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluio onde n= nmero de clulas dos quadrados Exemplo: n = 232 diluio 1:100 Concentrao celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 108 clulas/mL VIABILIDADE CELULAR (%) = Nv x 100 Nt Onde: Nv = nmero de clulas vivas, Nt = nmero total de clulas (vivas e mortas)

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FIG.1- Cmara de Neubauer