Equipo no.

2 Preparacin de los medios de cultivo para pruebas bioqumicas

INTRODUCCION Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de manera detallada su actividad bioqumica, porque otras caractersticas no son suficientemente distintivas o diferenciales. En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la caracterizacin bioqumica de una especie. Adems de los productos finales de los procesos metablicos, tambin se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como ocurren paso a paso las reacciones qumicas, cuales enzimas intervienen, cuales son los productos intermediarios adems de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioqumicas que tienen lugar dentro de la celula. En general el microrganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especifica o sustrato y despus de la incubacin del cultivo se examina para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido. MEDIOS DIFERENCIALES: Son empleados para detectar reacciones bioqumicas con carcter diferencial de grupos, generos o especies microbianas, mediante el viraje de color del indicador presente en el medio, demostrando algunas de sus caractersticas. Estos medios son el TSI, LIA,MIO, CITRATO DE UREA entre otros.

TRIPLE SUGAR IRON AGAR (T.S.I)

Un medio para la diferenciacin deEnterobacteriaceae basado en la produccin de sulfuro de hidrogeno y fermentacin de lactosa, sucrosa y dextrosa Conservacin y caducidad Todos los contenedores deben de ser mantenidos cerrados hermticamente y almacenados en un lugar seco a 25oC o menos hasta la fecha de caducidad mostrada en la etiqueta del envase. Precauciones Exclusivamente para uso diagnostico in vitro. Respetar las precauciones de seguridad y utilizar tecncas aspticas. Antes del desecho esterilizar todo el material biolgico. Consultar la fecha de seguridad del producto.

Materiales requeridos pero no proporcionados Accesorios y productos para anlisis microbiolgico de base por ejemplo anillos para anlisis, suplementos de selectivos MAST esponjas, torundas,incineradores y termostatos, etc. Otros reactivos bioqumicos y serolgicos y aditivos como sangre. Procedimiento 1. Referirse a la etiqueta del envase para cantidades volmenes requeridos. Preparar Triple SugarIronAgar (T.S.I) MAST suspendiendo los polvos en agua destilada o desionizada. Para los envases de sobre disolver el contenido entero del sobre del volumen mostrando en la etiqueta. 2. Hervir hasta disolucin completa 3. Mezclar bien y distribuir en los contenedores finales adecuados(i.e tubos o botellas) 4.Autoclave a 121oC durante 15 minutos 5. Dejar que las vertientes con extremos de aprox. 3.5 cm de longitud se solidifiquen. 6. Obtener de muestras clnicas o alimenticias un cultivo puro de organismo a examen 7. Usando una aguja inoculadora, inocular las vertientes inyectando en el centro del medio la profundidad del tubo a 3.5 mm del fondo 8. Sacar a aguja inoculadora, y rayar en la superficie de la inclinacin 9. Antes de incubar retira la tapa o destapar el contenedor. 10. Una vertiente de Urea debe de ser inoculada en paralelo para ayudar a la identificacin de Proteus spp y otros microrganismos. 11. Incubar durante 18-48 horas a 35-37 C. Interpretacion de resultados. Despus de la incubacin, leer los tubos para ver si en la cepa o vertiente hay produccin de cido gas y reacciones al sulfuro de hidrogeno. Una reaccin alcalina en la inclinacin de la cepa acida (roja/amarilla). Indica fermentacin dela dextrosa, lactosa y/o sacarosa. Una reaccin en la inclinacin alcalina de la cepa(roja/roja) indica que ni la dextrosa ni la lactosa han sido fermentadas. Grietas o burbujas en el medio indican la produccin de gas. Un precipitado negro en la cepaindica produccin de sulfuro de hidrogeno. Control de calidad Comprobar si hay signos de deterioro. El control de calidad debe ser llevado acabo con almenos un organismo que demuestre la actuacin esperada. No usar si el resultado de controldel microorganismo es incorrecto. La lista de abajo ilustra una variedad de actuaciones de las cepas de control de uso rutinario que el usuario final puede obtener fcilmente.

UREA
I. Principio La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2 molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia ono de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una actividad 37caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-); Yersiniapseudotuberculosis (+) de Yersiniapestis (-). II. Materiales El medio base est disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, quecontiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotsico 5.0 g, solucin de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 5 ml de una solucin de urea al 40% por cada 100 ml de medio. Mezclar y fraccionar en volmenes de 2.5 ml en tubos estriles. Guardar en heladera. La urea se pesa aspticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70C por 20 minutos, se guarda en frascos estriles con cloroformo (igual que para los azcares). III. Procedimiento A) Con un ansa estril se toma abundante material y se inocula por puncin. B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. C) Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados da por da. IV. Resultados Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacteraerogenes Escherichiacoli Proeusvulgaris

AGAR HIERRO Y LISINA

USO El Agar de Hierro y Lisina es un medio utilizado para la diferenciacin de microorganismos entricos en base a su capacidad para desaminar o descarboxilar la lisina y de producir sulfuro de hidrgeno. Este medio tambin es conocido como LIA EXPLICACION Edwards y Fife desarrollaron este medio para diferenciar a Salmonella arizonae. Debido a que S. arizonae fermenta la lactosa rpidamente, la produccin de H2S es suprimida en el Agar de Hierro y Triple Azcar. Eliminando la lactosa e incorporando la lisina, Edwards y Fife encontraron que este medio diferenca a los bacilos entricos en base a su capacidad para descarboxilar o desaminar la lisina y producir H2 S. Este

medio es especialmente recomendado para la identificacin de bacilos que fermentan rpidamente la lactosa. En este medio la peptona provee la fuente de carbono y nitrgeno. El extracto de levadura provee vitaminas y cofactores para el crecimiento. La dextrosa es la fuente de energa. El hidrocloruro de Llisina es el sustrato donde actan las enzimas descarboxilasa o desaminasa. El citrato frrico de amonio y el tiosulfato de sodio actan como indicadores de la produccin de H2S. El prpura de bromocresol es un indicador de pH. El agar es adicionado como agente solidificante. FORMULA Peptona de Gelatina 5.0 L-Lisina 10.0 Extracto de Levadura 3.0 Tiosulfato de Sodio 0.04 Dextrosa 1.0 Citrato de Hierro y Amonio 0.5 Prpura de Bromocresol 0.02 Agar Bacteriolgico 1305 pH 6.7 0.2 PREPARACION Mtodo: Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin horizontal. Procedimiento: 1. A partir de una colonia aislada sembrar el medio por picadura en el fondo y por estra en la superficie. 2. Incubar a 35 2C durante 18 a 48 horas. 3. Examinar los tubos para observar cambios de color y ennegrecimiento RESULTADOS Prueba Produccin de H2S Descarboxilacin de la Lisina Desaminacin de la Lisina Reaccion positiva Formacin de un precipitado negro en la superficie Fondo y superficie del medio de color prpura ( alcalino) Superficie roja Reaccion negativa No hay formacin de precipitado negro Fondo amarillo (cido), superficie prpura (alcalina) Superficie purpura

Proteus y Providenza producen cultivos con superficie roja sobre fondo amarillo Almacenamiento: 2-30 C. Caducidad: 5 aos en frasco cerrado. Presentacin: Frasco con 450 g Caja con 20 sobres para un litro Medio preparado en caja con 10 Tubos

AGAR CITRATO DE SIMMONS

El Agar Citrato de Simmons es un medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad de utilizar el citrato. Este medio es recomendado para el estudio de enterobacterias a partir de muestras clnicas, de agua y alimentos. Koser fue quien originalmente desarroll un medio lquido para la diferenciacin de coliformes y coliformes fecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina. Este medio tena la desventaja de presentar turbidez cuando se utilizaban inculos grandes, an cuando no hubiera desarrollo. Simmons modific el medio hacindolo slido, eliminando esta desventaja del medio lquido, y adicionando azul de bromotimol como indicador de pH. Los microorganismos que metabolizan el citrato crecen abundantemente. El medio al ser alcalinizado cambia de color verde a azul intenso. El fosfato de amonio proporciona la fuente de nitrgeno, el magnesio acta como cofactor de algunas reaccione metablicas, el fosfato acta como buffer, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar acta como agente solidificante. Fosfato Dibsico de Amonio 1.0 Fosfato Dipotsico 1.0 Cloruro de Sodio 5.0 Citrato de Sodio 2.0 pH 6.9 Sulfato de Magnesio 0.02 Azul de Bromotimol 0.08 Agar Bacteriolgico 15.0

Mtodo: Suspender 24.2 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin inclinada. Procedimiento: 1. Obtener un cultivo puro del microorganismo a ser probado. 2. Tomar una colonia bien aislada a partir de un medio slido. 3. Sembrar por estra slo la superficie inclinada del medio. 4. Incubar los tubos con las tapas flojas.

Una reaccin positiva se observa por el crecimiento en el medio con un intenso color azul. Una reaccin negativa es indicada por la ausencia, o pobre crecimiento sin cambio de color en el medio que permanece verde.

MIO (MOTILITY INDOLE ORNITHINE) MEDIUM

MIO test medium is a semisolid medium used as differential test medium by ability to produce indole from tryptophan, to descarboxylate the ornithine and exhibit motility by turbidity throughout of medium. FORMULA In grams per liter purified filtered water pH 6, 5 +/- 0, 2 at 25 C This approximate formula may be adjusted and/or enriched to obtain best results. PRECAUTIONS This medium is for IN VITRO diagnostic use only. STORAGE Store prepared media at 2 8 C protected from direct light and dehydrated powder, in a dry place in tightly sealed containers at 2 25 C. SIGN OF DETERIORATION Media should not be used if the expiry date has passed. Prepared media should not be used if there are signs of contaminations (shrinking, cracking, evaporation or discoloration). Don not use dehydrated media if it is caked. DIRECTIONS Suspend 31 g in 1 000 ml of purified water. Heat with frequent agitation and boil for one minute. Mix thoroughly and dispense into culture tubes. Sterilize at 121 C for 15 minutes. PROCEDURE Bring prepared medium at room temperature before inoculation. 1. Inoculate with 2 -3 similar colonies from an overnight growth, by stabbing with a straight needle to over half the depth. 2. Incubate at 35 C for 24 hours with loosened caps. Gelatin peptone 10, 0 Casein peptone 10, 0 Yeast extract 3, 0 Dextrose 1, 0 Bromcresol purple 0, 02 L Ornithine 5, 0 Agar 2, 0

3. Examine for motility, for ornithine descarboxylate. Add 2 3 cups of Kovacs Reagent, observe for production of red ring (positive reaction for indole). QUALITY CONTROL Expected results after 24 hours at 35 C. Organisms Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae LIMITATIONS OF METHOD This is only a part of the identification. Other test may be required. ATCC 25922 13028 13883 Motility + + Indole + Ornithine + + -