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22. Al terminar de usar su equipo desconctelo de la electricidad. 23. Tomar slo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental. 24. No lleve sus manos sin lavar a la boca u ojos cuando haya utilizado productos qumicos. 25. Lavarse las manos antes y despus de haber finalizado las tareas en el laboratorio. 26. Todo el material utilizado para cultivar E.coli debe ser esterilizado con lavandina o autoclavado antes de ser descartado.
Pictograma de advertencias
2-Mercaptoetanol Nocivo por ingestin, txico en contacto con la piel, provoca quemaduras y lesiones oculares. Metanol Irrita las mucosas nasales y oculares. Produce asfixia, vrtigo, tos, dolor de cabeza, nuseas, vmito, trastornos oculares, convulsiones e inconsciencia. En casos graves: coma, paro respiratorio, ceguera, convulsiones, acidosis metablica severa y muerte. cido actico glacial Los vapores producen irritacin en vas respiratorias. Sustancia muy corrosiva. Puede provocar bronconeumona, edemas en el tracto respiratorio. Quemaduras de piel. Trastornos de visin, ceguera (lesin irreversible del nervio ptico). Quemaduras en mucosas, en esfago y estmago. Espasmos, vmitos, por ingestin. Riesgo de perforacin intestinal y de esfago. No se descarta: shock, paro cardiovascular, acidosis, problemas renales. Radiacin UV (usada en el transiluminador) La exposicin a radiaciones UV puede producir quemaduras de retina, conjuntivitis, queratitis y cataratas. Y en piel puede producir eritemas.
PARTE A
STOP
Pst I
+
A A
+
Pst I P0 C-t Pst I
T4 DNA ligasa
T EcoRI A
A T
EcoRI
pGEMT
Transformacin E. coli
Plaquear
LB-Ampicilina
Mezclar la reaccin por pipeteo. Dar un spin en microcentrifuga e incubar 1 hora a temperatura ambiente. 2) Transformacin de clulas DH5 competentes con los productos de ligacin 1. 2. 3. 4. 5. Poner los productos de ligacin en hielo. Agregar 100 ul de bactrias competentes. Mezclar suavemente Incubar 10 min en bao de hielo Transferir los tubos a un bao de agua a 42C durante 45 segundos. Evitar agitar los tubos. 6. Transferir rpidamente los tubos a un bao de hielo e incubar durante 10 min. 7. Adicionar 0,8 ml de medio SOB SIN ANTIBITICO a cada tubo e incubar 45 min en estufa a 37C. 8. Preparar las placas: agregar a cada placa 40ul de X-gal 2% en DMF y 20ul de IPTG 100 mM Falta el antibiotico. Rastrillar y dejar secar. 9. Centrifugar la suspensin a 4.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante dejando aproximadamente 100 ul de medio SOB y resuspender el pellet. 10. Plaquear en placas LB-Agar-Ampicilina (50 ug/ml). 11. Incubar toda la noche a 37C. DIA 2 3) Anlisis de placas de clulas transformadas 1. Analizar las placas. Anotar observaciones. 2. Seleccionar 4 colonias blancas y una azul de cada placa con ampicilina. 3. Tomar una colonia con un tip estril e inocular un tubo con medio LB lquido con ampicilina (100 ug/ml). 4. Crecer los cultivos toda la noche a 37C con agitacin.
DIA 3 4) Anlisis de cultivos mediante preparacin rpida de cidos nucleicos. 1) 2) 3) 4) 5) 6) Tomar 100 ul de cada cultivo y transferirlo a un tubo eppendorf Agregar 10 ul de Buffer de Muestra para DNA 6X. Agregar 50 ul de Fenol: Cloroformo (1:1) equilibrado a pH 8.0. Vortexear. Centrifugar a 5000 rpm x 5 min. Sembrar 20 ul de la fase acuosa (superior) en un gel de agarosa 1 %.
Agregar 600ul de Cloroformo: Isoamlico (24:1). Vortexear. Centrifugar a 13.200 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos.
Recuperar el sobrenadante. Precipitacin.
H2O mQ Buffer Reaccin EcoRI 10X Plsmido EcoRI Incubar 1 hora a 37C. Correr en un gel de agarosa 2 %.
6 ul 1 ul 1 ul 0.5 ul
Incubar a 37C durante 3 hs. Inactivar la enzima calentando a 80C durante 20 min. 2) Religacin del vector Agregar en un tubo: H2O mQ Buffer Ligasa 10X Producto de digestin T4 DNA ligasa Tubo 1 6 ul 1 ul 2 ul 1 ul Tubo 2 (control sin ligasa) 7 ul 1 ul 2 ul ----
Incubar a temperatura ambiente durante 2 hs. 3) Transformacin de bacterias competentes con el producto de ligacin. Transformar 100 ul de bacterias competentes con 0.5 ul del producto de ligacin anterior. Seguir el mismo protocolo que para el clonado en pGEM-T easy, pero plaquear en placas sin X-Gal ni IPTG. DIA 2. 4) Anlisis de placas de clulas transformadas 1) Analizar las placas. Comparar el nmero de colonias en cada una. Anotar observaciones. 2) Seleccionar 3 colonias de la placa transformada con la ligacin del tubo 1 y una colonia de una placa transformada con el plsmido original sin digerir. 3) Tomar una colonia con un tip estril e inocular un tubo con medio LB lquido con ampicilina (100 ug/ml). 4) Crecer los cultivos toda la noche a 37C con agitacin.
DIA 3. 5) Anlisis de cultivos mediante preparacin rpida de cidos nucleicos. Tomar 100 ul de cada cultivo y transferirlo a un tubo eppendorf Agregar 10 ul de Buffer de Muestra para DNA 6X. Agregar 50 ul de Fenol: Cloroformo equilibrado a pH 8.0. Vortexear. Centrifugar a 5000 rpm x 5 min. Sembrar 20 ul de la fase acuosa (superior) en un gel de agarosa 1 %.
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