HPE1 NUKLEINSUREN

Versuch 1: GSH1 = GCL 1) mRNA-Isolierung aus monokotylen und dikotylen Pflanzen 2) Reverse Transkription 3) PCR (prparativ, diagnostisch)

Zusammenfassung

4) Klonierung der PCR-Produkte ber Ligation und Transformation von pBSK in E. coli 5) Sequenzierung Versuch 2: Gateway-Klonierung eines Inserts (Promotorfragment ATT) Regulierung der StilbenSynthese (siehe Flavonoidstoffwechselweg), fr die Protoplasten (misslungen!) 1) Promotor auf der gDNA, Isolierung der gDNA aus Shiraz-Gewebe 2) PCR 3) Gateway-Klonierung, Rekombinationsklonierung misslungen!

Versuch 3: Cystein-Ftterung, GSH1-Erhhung durch Cystein, GSH sollte die Expression nach unten senken, da es der letzte Schritt der Synthese ist 1) Isolierung der RNA (klassische Phasentrennung), fr die PCR (Kit) 2) Northern Blot (RNA-Ebene) nicht funktioniert! Strung durch Kohlenhydrate (gebildet durch Schock beim Transport), Bromphenolblau verdeckt die Banden, keine berprfung der Sonde mglich, da Kontrollbande nicht funktioniert 3) RT-PCR, qPCR 4) Western Blot Die GCL Proteinmenge steigt bei Anwesenheit von Cystein. Wir wollen herausfinden auf welchem Level die Erhhung der Proteinmenge stattfindet, indem wir die RNA und Proteinlevels nach Ftterung von Arabidopsis Zellkulturen miteinander vergleichen. Auf der Proteinebene ist die GCL Aktivitt reguliert durch den Substratvorrat (Cystein), dem neg. Feedback des Endprodukts GSH und durch das Redoxmilieu (DTT, Reduktionsmittel).

Genklonierung Identizierung, Vervielfltigung und Reinigung eines einzelnen Gens, das somit getrennt ist von allen anderen Genen, mit denen es normalerweise in der Zelle vorliegt. 1) Isolation von DNA (genomisch oder cDNA) und Plasmid-DNA ( Insert, Amplifizierung mit PCR) 2) Schneiden der DNA und des Plasmids mit Restriktionsenzym 3) Hybridisieren, Ligation von DNA-Fragmenten mit der Plasmid-DNA mit DNA-Ligase (kovalente Bindung) 4) Transformation von kompetenten Bakterien mit rekombinantem Plasmid 5) Selektion von Bakterienklonen, welche ein Plasmid aufgenommen haben 6) Isolierung des Klons mit dem gesuchten DNA-Fragment

DNA-Isolierung 1) Zellen aufbrechen (vor allem Zellwand). Physikalisch: z.B. zerstoen der gefrorenen Zellen im Mrser. Chemisch: z.B. Zell-Lyse mit Detergenzien (EtOH/Sark + Beta-Mercaptoethanol (Denaturierung)), in CNB Puffer waschen 2) Abzentrifugieren von unlslichen Zelltrmmern 3) Reinigen der DNA. Abbau von Proteinen mit Proteasen. Denaturieren und Ausfllen der Proteine mit Phenol. Zwei-Phasen-Trennung z.B. Phenol-Chloroform-Extraktion DNA sammelt sich in der Interphase, die RNA und die Kohlenhydrate in der wssrigen Phase und die Proteine in der organischen Phase. Auftrennen von unlslicher und lslicher Fraktion durch Zentrifugation, Ribonuclease-Behandlung zum Abbau von RNA. 4) Anreichern der DNA mittels Ethanol- oder Isopropanolprzipitation (+ Ammoniumacetat) 5) Wasch- und Zentrifugationsschritte mit Ethanol 70% und TE-Puffer Zerstrung der DNA: mechanisch instabil (nicht vortexen!), Schutz vor DNAsen EDTA, um den Cofaktor Mg2+ der DNAsen zu entziehen, Trennung der DNA von anderen Proteinen und RNA, RNA ist viel mehr enthalten als DNA und kann als Strfaktor agieren

cDNA-Isolierung cDNA (komplementre DNA) ist ein "Abdruck" der mRNA und entspricht der DNA, welche fr eine gesuchte mRNA codiert. cDNAs enthalten, wie Gene, die Information zur Bildung von Proteinen, haben aber im Gegensatz zu Genen keine Introns.

1) Isolation aller RNAs einer Zelle (80% rRNA, 15% tRNA, 5% mRNA), in der das gesuchte Gen exprimiert, d.h. das Protein synthetisiert wird homogenisieren/mrsern des Pflanzenmaterials (unter flssigem Stickstoff) 2) Reinigung von mRNA (d.h. Abtrennen von tRNA und rRNA) durch Affinittschromatographie (Praktisch jedes mRNA-Molekl hat an seinem 3'-Ende eine Abfolge von Adenin-Nucleotiden = Poly-A-Schwanz) 3) Synthese eines komplementren DNA-Stranges auf der mRNA-Matrize: RNA-DNA Doppelstrang 4) Abbau des RNA-Stranges 5) Synthese eines komplementren DNA-Stranges auf der DNA-Matrize: cDNA (DNA Doppelstrang), man gibt kurze dT-Oligonukleotide zu der gereinigten mRNA, diese hybridisieren mit den Poly-ASchwnzen und wirken dann als Primer fr die Reverse Transkriptase

Mit Hilfe eines Kits kann die Reinheit der mRNA erhht werden. Vorsicht bei der Arbeit mit mRNA (Abbau sehr schnell)! RNAsen mssen inhibiert werden und eluiert werden, allgemein sollte steril gearbeitet werden (Handschuhe). Im basischen Milieu hydrolysiert RNA von selbst. RNA-Abbau kann inhibiert werden ber Temperatur (Khl lagern) und Proteindenaturierung (Formaldehyd, chaotropes Salz). Kit: Zuerst fllen wir die RNA an die Bindesule, Proteine flieen durch. RNAsen knnen ausgewaschen werden.

Die chaotropen Salze denaturieren die Proteine und halten sie in Lsung, whrend die DNA an die Kieselgel-Matrix gebunden bleibt. ebenfalls die Ethanolfllung.
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Nach der Elution der DNA von der Kieselgel-Matrix folgt

Wir bentigen zur RNA-Isolierung: 1) Isolationspuffer, der RNAsen zerstrt oder inhibiert (Bsp.: mit chaotropem Salz) 2) Trennung von RNA und Proteinen (Sule, Phasentrennung) ethanolhaltiger Waschpuffer, um die RNA nicht aufzulsen + Eluitionspuffer (EDTA und TRIS) 3) Aufreinigung (Fllungsschritt)

Klassische Methode zur Entfernung von RNAse: Phasentrennung! RNA in der wssrigen (oben), RNAsen in Phenol/Chloroform-Phase (unten). In der wssrigen Phase sollten keine Proteine sein. In der Interphase befinden sich Proteine und Lipide. Danach erfolgt eine Isopropanolfllung.

Methoden zur Trennung von DNA und RNA: Dichtegradientenzentrifugation (DNA und RNA haben unterschiedliche Dichten), Abbau DNA oder RNA (Verhltnis 1000:1, RNA zu DNA) RNAse freie DNAsen (teuer!) Die RNA-Konzentration kann bei OD260 am Photometer gemessen werden, die Reinheit der RNAKonzentration kann ber das Verhltnis OD260/OD280 und OD260/OD230 berprft werden (OD280 = Protein, OD230 = Kohlenhydrate, Polyphenole). Eine gute Prparation ergibt Werte zwischen 1,6 und 2,0 fr OD260/OD280 und Werte > 1,8 fr OD260/OD230.

Reverse Transkriptase

RT-Puffer (mit Cofaktoren Mg ) Oligo-DT-Primer (Wieso? Unspezifische cDNA-Umschreibung aller RNAs, PolyA-Schwarz, an PolyA-Schwanz kann Marker gehngt werden) dNTPs AMV reverse Transkriptase
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2+

cDNA hat im Gegensatz zur gDNA: eine einzelstrngige Struktur, keine Introns cDNA kann sich selbst zusammenlagern und Sekundrstrukturen bilden, sie knnen also ihre Stabilitt um ein mehrfaches als gDNA erhhen

Southern Blot: Methode fr die Auftrennung von DNA-Fragmenten Northern Blot: Western Blot: Auftrennung von RNA-Fragmenten Proteinblotting mit SDS

Blotting auf Membran: Gel wrde weiter laufen, Sonde wrde durch Gel diffundieren, Membran viel praktischer Sonden sind sehr spezifisch und variabel (Temperatur, pH etc.), Antikrper sind meistens nur monoklonal und sind sehr empfindlich (Reaktionsraum)

Northern Blot Mit dem Northern-Blot kann der Expressionsstatus eines Gens berprft werden. Auf der Membran ist die spezifische Markierung von RNA-Sequenzen durch die Hybridisierung mit komplementren Gensonden mglich. 1) Cross Linking ber UV-Bestrahlung, kovalente Bindung an Membran Prehybridization (Blotten mit Lachssperma) um freie unspezifische Bindungsstellen zu blockieren (unter 55C) Blocking Puffer 2) Hybridization (Sonde mit Detektion), Waschen mit Low und High Stringency (Denaturiere Sonde bei 95C), HRP-Streptavidin-Konjugat an Biotin, Lichtsignal!, wir htten mehrere Banden bekommen mssen Conjugate Puffer 3) Waschschritte: Membran mehrmals mit Salzlsungen niedriger Konzentration waschen, um den ungebundenen Anteil der Sonde restlos zu entfernen Washing Puffer Assay buffer

Spezifitt der Detektion: Hybridization Temperatur und Temperatur in den Waschschritten, Blockingvorgang (Puffer etc.), Spezifitt der eingesetzten Sonde, Natriumgehalt, ordentliches Waschen

Tm = 81,5 + (16,6 * log[Na+]) + (0,4 * (%GC)) (300+2000*[Na+])/bp(Sonde), die Schmelztemperatur ist die Temperatur bei der 50% der Sonde gebunden ist. Einflussfaktoren: Menge der Natriumkonzentration (gleicht neg. Ladung der DNA aus, bessere Bindung), Gehalt an GCs (je mehr desto hher Tm), Lnge in bp der Sonde

Western Blot Proteinauftrennung mittels Gelelektrophorese (PAA, SDS-PAGE), Blotten auf Nitrocellulosemembran mittels Diffusion, Kapillarwirkung oder Elektrophorese, Proteinasen entfernen (PMSF ProteinasenInhibitoren, SDS/Hitze-Denaturierung, auf Eis arbeiten) 1) Blockieren der freien unspezifischen Proteinbindungsstellen mit Milchpulver oder BSA (evtl. vorher Ponceaufrbung) Blocking Puffer 2) 1. Antikrper (Blotting), spezifisch gegen ein oder mehrere Proteine auf der Membran
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3)

Waschschritte mit Detergenslsung entfernen schwcher haftende, unspezifisch gebundene Antikrper von der Membran (TBST)

4) 5)

2. Antikrper richtet sich spezifisch an den 1. Antikrper (anti-mouse-HRP) Detektion: 2. Antikrper ist gebunden an ein Enzym (HRP horseradish peroxidase) Ergebnis: auf Proteinebene passiert wenig, HRP (Phosphatase) berfhrt Luminol (Substrat) in seine oxidierte Form, bei der eine Chemolumineszenz entsteht und auf Rntgenfilmen detektiert werden kann.

Polyklonale (mehr Hintergrund) und monoklonale Antikrper (sensitiver) Proteinauftrennung kann durch Gelauftrennung oder isoelektrische Fokussierung stattfinden, den Proteinen wird durch bspw. SDS eine neg. Ladung gegeben oder durch den isoelektrischen Punkt gesteuert (ber Phosphatgruppen)

Polymerase-Kettenreaktion PCR Die PCR ermglicht es einen spezifischen DNA-Abschnitt zu vervielfltigen. In n-Zyklen werden 2
n

Kopien des DNA-Abschnittes gefertigt (etwa 20-60 Zyklen). Die Reaktion lsst sich in drei Schritte unterteilen, die zusammen einen Zyklus ergeben: a) b) Denaturierung: Annealing: Bei 94C denaturiert die DNA. Es entstehen zwei Einzelstrnge. Bei 52C werden spezifische Oligonucleotide/Primer angelagert, die jeweils den Anfang und das Ende der zu vervielfltigenden Sequenz markieren c) Elongation: Bei 72C verlngert die Taq-Polymerase (thermostabil, aus Thermus aquaticus) mit den Desoxynucleotiden (dNTPs) die DNA-Strnge.

PCR Bestandteile: 2 Primer (reverse and forward), die den Startpunkt der Synthese festlegen, dNTPs, DNA-Polymerase (+ Cofaktor Mg2+!), Puffer, Template Optimierung/Spezifizierung kann ber alle Bestandteile erfolgen. Bspw. Konzentration der dNTPs kann erhht werden, Polymerase kann optimiert werden (Schnelligkeit, Proofreading-Eigenschaft, HotStart-Polymerase startet spter, weil da Primer noch nicht gebunden sind (unspezifisch), Polymerase haben auch Nuklease-Funktionen, das kann verhindert werden ber HotStart), wenn man keine HotStart-Polymerase hat, kann man die neg. Eigenschaften verhindern indem man auf Eis arbeitet, der Puffer kann optimiert werden ber Mg -Gehalt, DMSO und Glycerin Zugabe
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Der wichtigste Bestandteil der PCR sind die Primer: die Sequenz muss spezifisch sein, 18-30 bp lange Primer (Lnge), 3-Ende (nicht variabel!) viele Gs und Cs, 5-Ende ist variabel, optimierte Schmelztemperatur (Def.: Temperatur bei der 50% meiner Primer bindet) der Primer sollte eine Schmelztemperatur (50-60C) haben, die zu meiner Annealing-Temperatur passt

Vorhersage ber Primer: A/T = 2C G/C = 4C 5 AATGCATCGATTGCAGCAC 3 10 A/T = 20C + 9 G/C = 36C = 56C guter Primer AGGCCGAAATTT schlechter Primer TTTAAAGCCGGA schlechter Primer
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Optimierung des PCR-Programmes 1) Nested-PCR: eignet sich sehr gut, wenn nur sehr geringe Mengen der zu amplifizierenden DNA relativ zur Gesamtprobenmenge an DNA vorhanden sind. Hierbei werden zwei PCR hintereinander ausgefhrt. Durch die erste PCR wird neben unerwnschten Sequenzbereichen infolge unspezifischer Bindung der Primer der gewnschte Abschnitt der DNA (Amplikon) erzeugt. Letztere wird fr eine zweite PCR als Matrize verwendet. Durch Primer, die an Bereichen innerhalb der ersten Matrize binden (downstream der ersten Primer), wird der gewnschte Sequenzbereich mit sehr hoher Spezifitt generiert. 2) Touchdown-PCR: In den ersten Synthese-Zyklen wird die Annealing-Temperatur nur knapp unterhalb der Denaturierungstemperatur gewhlt. Damit ist die Primerbindung und somit auch das Amplifikat hchst spezifisch. In den weiteren Zyklen wird die Annealing-Temperatur herabgesetzt. Die Primer knnen jetzt zwar unspezifische Bindungen eingehen, allerdings verhindern die spezifischen Replikate der frhen Reaktion eine bermige Amplifikation der unspezifischen Sequenzen.

Methoden bei nicht bekannter Sequenz: RACE-PCR, Inverse PCR, site directed mutagenesis

qPCR Real Time PCR whrend der PCR werden nach jedem Zyklus die PCR-Produkte gemessen, Ziel ist es die Anfangskonzentration zu ermitteln (ber die exponentielle Phase), Wichtiger Punkt: Threshold-Wert, der knapp ber den Hintergrund ist Bei Ct-Value 26,8 und 28,8 ist der Unterschied 2 Zyklen, es gilt also 2^DeltaCt, also 4 mal so starke Expression (2^2) Anfangskonzentration, bei 100% Effektivitt (ansonsten 1,9 oder 1,8) ber Schmelzkurvenanalyse kann herausgefunden werden, ob die Expressionssignale von einem Produkt stammen, aber die DNA-Gesamtausgangsmenge, knnen wir noch nicht bestimmen, ber Referenzgen Clathrin kann man eine Normalisierung starten (wir berechnen 2^Delta(CtCla CtGSH1)) Wir haben 2 GSH1 Transkripte: CtGSH1 CtCla = DeltaCt, relative Expression! Cla-Werte sollten konstant bleiben mit Eichkurve (Effizienzbestimmung) Signale ber SYBR Green (interkalierender Farbstoff) Bei Cystein nimmt die Templatemenge zu (GSH1), GSH und DTT sorgen fr die Abnahme der GSH1-Menge

Restriktionsenzyme Sie erkennen spezifische Sequenzen von 4 bis 6 Nucleotiden und spalten dort die

Phosphodiesterbrcken. Sie knnen DNA glatt inmitten ihrer Erkennungsstelle spalten und so stumpf endende Fragmente erzeugen. Andere schneiden den Doppelstrang versetzt, so dass kurze Einzelstrang-Schwnze mit spezifischer Sequenz entstehen ("klebrige" Enden, sticky ends). Durch Ligation knnen die einzelnen Fragmente untereinander verbunden werden.

Transformation von Bakterien

Um DNA in E.coli-Zellen einzubringen, muss die Zellmembran fr Makromolekle permeabel gemacht werden. Dazu inkubiert man die Bakterienzellen mit Calciumchlorid (CaCl2). 1) Auf Nhrmedium knnen nur diejenigen Bakterien berleben, die das Resistenzgen fr das Antibiotikum besitzen und somit ein Plasmid aufgenommen haben. 2) Blau-Wei-Selektion: Fr die Selektion wird ein spezielles Plasmid genutzt. Auf diesem Plasmid ist das Gen fr die -Galactosidase kodiert (lacZ), welche X-Gal spaltet. Dabei entsteht ein blauer, wasserunlslicher Farbstoff. Dieses Gen wird bei einer erfolgreichen Transformation zerstrt. Da genau in diesem Gen die Multiple Cloning Site (MCS) liegt und das Genfragment hinein ligiert wird. Dadurch sind positive Kolonien leicht an ihrer weien Farbe zu erkennen, da X-Gal nicht mehr gespalten werden kann.

Plasmid-Isolierung Bakterien mit dem Plasmid werden zentrifugiert, zur Degradation strender RNA enthlt die Lsung RNase. Durch Zugabe einer Lsung von SDS und Natriumhydroxid werden die Zellen alkalisch lysiert. Die Zugabe von Eisessig und einer Kaliumacetat-Lsung bewirkt zum einen eine Neutralisation und zum Anderen, mit Hilfe des in der zweiten Lsung enthaltenen SDS, dass die Proteine und die genomische DNA ausgefllt werden. Nach einer weiteren Zentrifugation wird die Plasmid-DNA meist einer Reinigung unterzogen z.B. einer Phenol-Chloroform-Extraktion. Die DNA kann dann mit einem Alkohol wie Isopropanol ausgefllt werden. Das Isopropanol entzieht der DNA die Hydrathlle. Mit 70 % Ethanol wird die gefllte DNA dann gewaschen und steht dann zur weiteren Verarbeitung zu Verfgung. im Praktikum: Kit, danach Verdau mit EcoRV (linearisiert, blunts ends), der Verdau kann durch ein Agarose Gel berprft werden, verdautes Plasmid ist linearisiert und wandert nicht so schnell wie das supercoiled Plasmid

Gamma-glutamylcysteine synthetase GCL It catalyses the ATP-dependent condensation of cysteine and glutamate to form the dipeptide gammaglutamylcysteine.

Gelelektrophorese Das Trennprinzip der Gelelektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Mobilitt geladener Molekle im homogenen elektrischen Feld innerhalb einer Gelmatrix mit definierter Porengre. In Abhngigkeit der zu trennenden Substanzen kommen in erster Linie Gele aus Agarose und Polyacrylamid zur Anwendung. Agarose Gel: MOPS, SSC, EtBr-Lsung, Formaldehyd (verhindert die Denaturierung der RNA), Glycerin (sorgt dafr, dass die Strnge linearisiert bleiben), Bromphenolblau (kennzeichnet die Lauflinie), (SDS, Denaturierung, Linearisierung, Negative Ladung, Benetzung)

Formamide is used as an RNA stabiliser in gel electrophoresis by deionizing RNA. In capillary electrophoresis, it is used for stabilizing (single) strands of denatured DNA

Biotinylierung
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starke spezifische Wechselwirkung zwischen Biotin und Avidin, bzw. Streptavidin Markierung Kopplung mit Biotin zur Markierung bestimmter Molekle (z.B. Protein), die nachzuweisenden Molekle sind direkt biotinyliert und knnen beispielsweise ber einen Avidin-gekoppelten Farbstoff sichtbar gemacht werden

Gateway-Klonierung beruht auf dem sequenzspezifischen Rekombinationssystem des Phagen , der mit Hilfe bestimmter Enzyme seine DNA in das Genom des E. coli integriert. Der Integrationsprozess (Lysogenie) wird hierbei von zwei Proteinen katalysiert: der Integrase (Int) des Lambda-Phagen und dem E. coli-Protein IHF.

Dieser reversible Vorgang bentigt spezifische Rekombinationsstellen (attachment sites) in der ZielDNA, zwischen denen die zu bertragenden genetischen Informationen eingefgt werden knnen. Fr ihre Integration sind auch an den Enden dieser zu transferierenden DNA-Abschnitte

Verbindungsstellen erforderlich. Fr die Exzision (Lyse) des DNA-Fragments wird zustzlich das Enzym Exzisionase bentigt.

1)

Erzeugung eines attB-PCR-Produkts

Gen von Interesse muss zuerst mit attB-Rekombinationsstellen versehen werden, damit im Expressions-Vektor das Gen von Interesse im korrekten Leserahmen angeordnet ist, wurden die Verbindungsstellen fr beide Enden des DNA-Abschnitts unterschiedlich konstruiert und zwar so, dass sie nach der Integration in den Donor-Vektor die richtige Orientierung erhalten. 2) Erzeugung eines Entry Clones

Austausch des im Donor-Vektor enthaltenen ccdB-Gens gegen das PCR-Produkt (BP-Reaktion, unbedingt Primer entfernen von PCR). Bei dem ccdB-Gen handelt es sich um ein Selbstmordgen, dessen Genprodukt auf die im Labor normalerweise verwendeten Bakterienstmme toxisch wirkt, indem es die Gyrase hemmt, und das an seinen beiden Enden die attP-Verbindungsstellen trgt. Demnach sollten nach erfolgreicher Transformation nur diejenigen Bakterien berlebensfhig sein, bei denen der Austausch des ccdB-Gens gegen das PCR-Produkt erfolgt ist. An der zwischen PCRProdukt und Donor-Vektor erfolgenden BP-Reaktion sind die Enzyme Integrase und IHF a/b beteiligt.
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Die attB1-site reagiert hierbei spezifisch mit attP1 und attB2 mit attP2, wodurch im entstehenden Entry Clone die attL-Sequenzen generiert werden. 3) Erzeugung des Expressions-Vektors

Reaktion zwischen Entry Clone und Ziel-Vektor (LR-Reaktion). Falls eine Genfusion herbeigefhrt werden soll, kann der Ziel-Vektor 5 oder 3 der attR-Seiten die entsprechende Sequenz tragen. Auerdem enthlt der Ziel-Vektor das von den attR-Stellen flankierte ccdB-Gen. Durch die LRReaktion zwischen attL1 und attR1 und zwischen attL2 und attR2 werden im Expressions-Vektor erneut die attB-Seiten generiert. Um erneut eine doppelte Selektion zu ermglichen, trgt der ZielVektor eine andere Antibiotika-Resistenz als der Entry Clone.

Isolierung von Protoplasten Die Epidermis wird mit Klebestreifen abgezogen, damit wir an das Mesophyllgewebe gelangen, ber eine Enzymlsung (Cellulase, Macerocyme, Mannitol, CaCl2, KCl, BSA, MES) gelangen die Protoplasten in Lsung (Vorsicht nicht schtteln!).

Flavonoide 3 Klassen Anthocyane (Pigmentierung, Lockstoffe, Antioxidantien), Proanthocyanidine PAs (kondensierte Tannine, Fraschutz), Flavonole (UV-Schutz, Pigmentstabilisierung, Pollenkeimung, Regulation des Auxin-Transports) Abzweigungspunkt in der Synthese: Dihydroflavonols ( zu Flavonolen) und Leucocyanidin (ber LAR zu Catechin zu Proanthocyanidin/kondensierte Tannine), 1. Wichtiger enzymatischer Schritt: CHS zu Chalcones

Versuch: Betrachtung der Ausgangsreaktion des Flavonoidstoffwechselweges 1) Chalconsynthese 2) LDOX, spezifisch fr Anthocyane und PAs (nicht fr Flavonole) 3) LAR 4) ANR und UFGT Vergleich der MYB-Faktoren und den Einfluss in den Stoffwechselweg ber berexpression Transkriptionsfaktoren: MYB-Faktoren regulieren den Stoffwechselweg, jeder einzelne MYBFaktor reguliert eine spezifische Genexpression: Ausnahme MYBA, nur fr Zielgen UFGT MYBF1 Flavonole FLS, CHS Chalcone, CHI Flavanone MYBPA1 LDOX, LAR, ANR PAs MYBA2 UFGT Anthocyane

MYB-Faktoren, bestehen aus 2 groen Domnen, DNA-Bindedomne (MYB-Faktor) hnlich bei allen, alle haben einen gleichen Cofaktor: bHLH Ausnahme MYBF1, keine Interaktionsstelle, keinen Cofaktor an Bindedomne Versuch: MYBF1* Mutante mit eingefhrter Interaktionsdomne, MYBF1* kann also jetzt mit Cofaktoren interagieren, bentigt diese aber nicht essentiell

Regulatoren verschiedener Flavonoidklassen bilden klar getrennte funktionelle Gruppen, die einzelnen Regulatoren der einzelnen Klassen sind alle sehr hnlich zueinander MYBPA1 und MYBF1 sind sehr hnlich, sie unterscheiden sich durch das Vorhandensein der Cofaktor-Domne Das heit, MYBF1* msste hnliche Proteine wie MYBPA1 exprimieren (PAs) und allgemein hnliche Funktionen zeigen

Das Dual-Luciferase Reporter System Wie hoch ist die Promotoraktivitt (target promotor activity) 1) Plasmid mit Zielpromotor kontrolliert die Firefly-Luciferase (unser Reporter), diesen Vektor bringen wir in eine Pflanze (Transformation: Mglichkeit Elektrotransformation (danach in SOC-Medium zur Erholung), PEG (Polyethylenglykol), etc.) 2) Ein zweites Plasmid mit Renilla-Luciferase (Reporter) und normaler 35S-Promotoraktivitt dient zur Kontrolle bzw. Normalisierung (Luciferase wird immer, auch ohne TFs gebildet) (alles in einer Pflanzenzelle!)

Luc = Akt./Zelle * Zellen transformiert Renilla = konst. Aktivitt * Zellen transformiert

Luceferin in BeetleJuice (Puffer), ist das Substrat von Firefly-Luciferase Wir bilden das Verhltnis zwischen Firefly und Renilla-Aktivitt um die relative Aktivitt des Promotors herauszubekommen!

3 Transformationsmethoden 1) Elektrotransformation Wein 2) PEG Arabidopsis 3) Particle Gun Bombardement Ti-Plasmid (Virulenzregion und T-DNA), Zwei-Vektor-Verfahren, Man unterscheidet zwischen stabiler und transienter Transformation!

In Arabidopsis transformieren wir die Wein-Promotoren und TFs, wir haben also einen geringeren Hintergrund Empty Vector: Gibt uns die Hintergrundaktivitt an, konstante Aktivitt ohne knstlichen Einfluss, in Arabidopsis ist der Hintergrund grer als bei Wein LARI: normalerweise sollte es keine Aktivitt geben bei MYBPA2 MYBF1*, ist fhig von einem spez. Faktor das Gen zu aktivieren (Tannine) UFGT = Negativkontrolle (Anthocyan-Regulatoren) andere DNA-Bindestelle, MYBF1* sollte nicht den UFGT Promotor aktivieren

Autoklavieren Ein Autoklav ist ein gasdicht verschliebarer Druckbehlter, der in der Medizin zur thermischen Sterilisierung im berdruckbereich eingesetzt wird.

Was ist in meinem Puffer?

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Lsungsmittel

Hauptbestandteil von Organismen, natrliche Umgebung, es bestimmt die Lsbarkeit von Substanzen (abhngig von Hydrophobizitt)

Wasser, Methanol, Ethanol

Lsunggrad hngt ab von: Hydrophobizitt, Polaritt, pHWert, Temperatur, Interaktion mit anderen Puffer Einstellung und Konstanthaltung des pH-Wertes, TRIS, Phosphat NaCl, KCl, Saccharose , PEG Ionen Einstellung der Ionenstrke, Leitfhigkeit der Lsung (elektrophoretische Versuche!), Ionen dienen auch oft als Cofaktoren oder beeinflussen das Milieu Chelatoren Binden 2-wertige Ionen, Ionenfnger und verringern diese z.B. um unerwnschte Proteine zu inaktivieren (EDTA und Mg2+ bei DNAsen) Detergenzien Vermittlung zwischen hydrophoben und hydrophilen SDS EDTA, EGTA NaCl, KCl, SDS abhngig vom pKs-Wert halbdissoziierter Zustand Osmotika Wichtig bei Pflanzenzellen, Regulation des Salzgehaltes inner- und auerhalb der Zelle

Substanzen, Lsungsmittel/Denaturierung und Benetzung von Oberflchen Reduktionsmittel Reduzieren Substanzen im Puffer, manchmal auch denaturierend durch SH-SH-Trennung (Inaktivierung von Proteasen) Substanzen der Dichte Enzyminhibitoren Absorber Proteinasen, Nukleasen knnen inhibiert werden Unlsliche Substanzen, die unerwnschte Stoffe binden und ausfllen (wie Phenole) Farbstoffe Farbliche Markierung oder pH-Indikatoren Bromphenolblau zur Einstellung Dichtegradientenzentrifugation oder Gelelektrophorese DTT, Mercaptoethanol Saccharose , Glycerin PMSF PVP, PVPP

Sequenzierung 1. Maxam und Gilbert (nicht mehr verwendet): DNA-Fragment bevorzugt am 5'-Ende radioaktiv markiert, denaturiert und anhand eines chemischen Verfahrens basenspezifisch gespalten. (Guanin wird mit Dimethylsulfat methyliert) Die unterschiedlich langen Spaltprodukte werden dann fr jede Base in einer PAA-Gelelektrophorese getrennt. Anhand des Autoradiogramms der vier Spuren lsst sich die Basensequenz ermitteln. 2. Sanger: enzymatische DNA-Sequenzierung oder Kettenabbruch-Verfahren, basenspezifischer Abbruch der DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase. In vier Anstzen ist jeweils neben dem gewhnlich eingesetzten 2'-dNTP-Gemisch aus dTTP, dCTP, dGTP und dATP je auch eines der vier 2,3'-ddNTPs als Terminator zugesetzt. Diesen 2,3'-ddNTPs fehlt die 3'-OH-Gruppe, so dass

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die DNA-Polymerase das nchste Nucleotid nicht mehr ankondensieren kann und die Synthese beendet 3. Pyro-Sequenzierung: ein Primer wird an die ssDNA gebunden und das erste Nucleosidtriphosphat zugegeben. Passt dieses dNTP zur DNA-Sequenz und wird von der Polymerase eingebaut, entsteht Pyrophosphat als Reaktionsprodukt, das von der ATP-Sulfurylase in Anwesenheit von Adenosin-5'-phosphosulfat in ATP berfhrt wird. Diese ATP nutzt nur die Luciferase, um Luciferin in Oxyluciferin zu berfhren und damit Licht zu produzieren, das von einer Kamera erfasst wird und als Peak in einem so genannten Pyrogramm erscheint.

Gen Proteinkodierender Abschnitt definierter Lnge auf der DNA, 2% davon werden aktiv transkribiert und 80% kodiert
STOP Poly-A-Signal

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