Facult des Sciences Rabat

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Molculaire -------------------------------------Universit Mohamed V - Agdal Facult des Sciences B.P. 1014 - Rabat - MAROC

Filire SVI S4 Module de Biochimie et Biologie Molculaire Elment 2: Biologie Molculaire

Biologie Molculaire des Procaryotes

Pr. B. BELKADI
Anne universitaire 2011 - 2012

Biologie Molculaire?
Etude des gnes portant linformation gntique, leurs transformations et leurs fonctions

Que faut il tudier?

Les complexes macromolculaires de lADN, de lARN et des protines Transfert de linformation: Rplication, Transcription, Traduction

Ex. de dcouvertes ralises grce aux bactries:

- Recombinaison intra-gnique; - Rplication de lADN; - Code gntique; - Rgulation (opron); - Enzymes de Biologie Molculaire : Enzymes de restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN), Polymrases thermostables (PCR), etc..

Quelles sont les consquences du dveloppement de la biologie molculaire?

des connaissances dans le domaine fondamental des applications pratiques: - production de protines dintrt mdical - vaccins - diagnostic en mdecine - plantes et animaux transgniques

PLAN

q Introduction q Transmission dinformation q Expression gntique et rgulation

I- Introduction
Les 3 domaines du vivant

Plantes

Fungi

Cyanobacteria Gram positif Proteobacteria

Animaux

Sulfolobus Mthanognes

Archaea

Halophiles

Les 3 domaines du vivant

Cellule vgtale

PROCARYOTE

Bactrie

Cellule animale

EUCARYOTE

Procaryotes ou Bactries
Deux grands groupes, les eubactries et les archaebactries avec des fonctionnements diffrents au niveau molculaire mais une organisation similaire

Structure:
v Petite taille gnralement (avec des exceptions) v Leur structure est trs simple, le plus souvent sans cytosquelette ni rseau de membrane interne v Prsence d'une paroi complexe v Dans le cytoplasme, il y a prsence des ribosomes et d'une masse "plus claire", le nuclode qui contient l'ADN sous forme dun ou quelques chromosomes ( svt circulaire)

Procaryotes ou Bactries
Division binaire:
Par scissiparit (fission binaire): 1 cellule donne par division 2 cellules filles gntiquement identiques (notion de clone) Pas d'individualisation de chromosomes visibles en cytologie aucun moment de leur cycle de vie Multiplication exponentielle: Xn = 2n X0

X0 : nombre de cellules au dpart Xn: nombre de cellules obtenues un temps donn n: nombre de divisions ou de gnrations

Temps de Gnration : 20 min (E.coli) dans des

conditions optimales quelques heures Taux de croissance : 2 divisions / h ou moins Echange gntique se fait par transferts horizontaux (transformation, conjugaison, transduction)
0 min cellule mre 18 heures de croissance

109 bactries/ ml 2 cellules filles identiques

20-30 min

Grande complexit de mtabolisme et de fonctionnement au niveau molculaire

Trs diversifies et prsentes dans TOUS les milieux et Biotopes Adaptation rapide diverses conditions et divers environnements (mers froides, sources thermales) Des plus dangereuses (pathognes) au plus utiles et exploitables: Biotechnologies

Escherichia Coli Legionella sp

Bactrie du desert

Clostridium botulinum

GFAJ-1 (arsenic) sdiments du lac Mono Lactococcus lactis en Californie

Deinococcus radiodurans

Les lments gntiques dans une cellule

1- Le chromosome (unique et circulaire en gnrale) porte les gnes essentiels la croissance 2- Les lments gntiques non chromosomiques, principaux processus dvolution rapide des bactries - Les plasmides - Les transposons - Les virus - Le gnome des organelles

II Transmission de linformation gntique

( Les plasmides, les transposons, les virus) Forme la plus connue de transfert : Recombinaison gntique: change physique de gnes entre les lments gntiques (chromosome, plasmide..)

Recombinaison homologue : change rciproque entre une paire de squence homologue dADN entre cellule donneuse et receveuse

Trois principaux mcanismes dchange gntique chez les bactries

Bactrie rceptrice

1- Transformation Bactrie + ADN libre

2- Conjugaison Bactrie + bactrie 3- Transduction Bactrie + bactriophage

Transferts d'ADN par conjugaison

Le transfert entre les organismes donneur et accepteur de plasmide se fait en 4 grandes tapes: Conjugaison F+ X F- 2 F+

1- Reconnaissance entre donneur (F+) et accepteur (F-) grce la synthse du pili (tube creux) 2- Transfert d'un des deux brins du plasmide 3- Synthse du brin complmentaire chez l'accepteur 4- Re circulisation du plasmide chez l'accepteur

Objectifs du cours :
- Dfinir un plasmide ? - Prciser les proprits biologiques codes par les plasmides ? - Les consquences mdicales de ce type de transfert ? - dfinir la transposition et le transposon ?

I- Introduction gnrale II- Transmission de linformation A- Les Plasmides I- Gnralits II- Mthodes dtude: extraction, purification et curage des plasmides (TD) III- Proprits des plasmides IV- Diffrents types de plasmides et rles biologiques V- Expression et rgulation VI- Utilisation des plasmides B- Les transposons

A- Les Plasmides

I- Gnralits

A- Les Plasmides
Plasmides Milliers pb

Chromosome bactrien circulaire 4millions pb

Bactrie
En gnral circulaire, le nombre de copies par cellule peut varier de 1 quelques centaines. * Petit nombre de copies/ cellule (1 3) = Plasmide Stringent / Rplication stringente. * Grand nombre de copies / cellule (20 2000) = Plasmide relch / Rplication relche

1- Dfinition: Molcules dADN double brin libres le plus souvent circulaire, localisation extrachromosomique, capacit de rplication autonome et procure un avantage slectif.

2- Structure et organisation:
Prsents chez la plupart des espces bactriennes: Tailles trs variables entre 1Kb 1 mgabase (gnralement infrieures 5% de celle du chromosome) ADN double brin Superhlicale avec 3 formes:

Confrent la bactrie-hte une grande souplesse gntique. Augmentent son patrimoine gntique.

Diffrentes formes des plasmides

Forme I: CCC: Circular Covalently Closed (circulaire, covalemment ferm) Forme II: OC: Open Circular ( circulaire relch, un des 2 brins coup) Forme III: Linaire (2 brins coups)

3- Caractristiques gnrales:
Ils sont porteurs de gnes non essentiels mais utiles et donc non indispensables au mtabolisme normal de la cellule hte. Leur transmission naturelle au cours des divisions cellulaires est stable et se fait habituellement par conjugaison. Ils possdent plusieurs proprits confrant aux bactries une meilleure adaptation lenvironnement.

II- Mthodes d'tudes des plasmides : TD

III- Proprits des plasmides:

Les plasmides sont des associations modulaires de gnes regroups en units fonctionnelles. Ils comportent: Zone obligatoire de rplication: Origine de rplication Rgion de transfert (opron tra) chez les plasmides conjugatifs codant pour: pili et protines de conjugaison Des lments gntiques mobiles ou non (IS, Tn, Int) Gnes divers (rsistance aux antibiotiques, etc)

1: Gne codant la rsistance un antibiotique 2: Gnes de transfert (opron Tra) 3: Origine de rplication

IV- Type de plasmides et rles biologiques

Plasmides cryptiques: aucun rle connu Les plasmides peuvent coder pour diverses fonctions Quelques plasmides clbres: u Facteur R: Plasmides de rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds (conjugatifs le plus souvent) u Facteur F: (Rle de fertilit) gros plasmide conjugatif petit nombre de copies, confrant la capacit de synthse de Pili sexuels chez la bactrie dite F+ ou Hfr. u pBR322: Vecteur de clonage trs utilis aux premier temps du clonage et du gnie gntique

V- Expression gntique et rgulation: Gnes codant diffrentes fonctions

1- Les gnes impliqus dans la rplication

2- Les gnes de transfert: Plasmides conjugatifs 3- Les gnes confrant des proprits supplmentaires la cellule hte

V 1- Les gnes impliqus dans la rplication :

La fonction ori : cest lorigine de la rplication, elle est responsable de linitiation de la rplication et du contrle du nombre de copies d'un mme plasmide prsent dans une bactrie.

Ce systme de rgulation est lorigine du phnomne dincompatibilit

Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la mme cellule, car leur rplication est soumise au mme systme de rgulation, >>> ils sont fortement apparents structuralement do prsence de fortes homologies ADN/ADN Ces plasmides sont ainsi classs en groupe dincompatibilit ou groupe Inc.

V 2- Les gnes de transfert, Plasmides conjugatifs:

Un plasmide conjugatif est autotransfrable dune bactrie mle une autre femelle par conjugaison. Sa taille est suprieure 30 kb

Ex: chez Escherichia coli, 90 kb, dont 30 50 kb pour les gnes ncessaires au transfert conjugatif.
Ces plasmides sont en faible nombre de copies de 1 3 par cellule.

 Lensemble des gnes ncessaires la conjugaison est organis en un opron tra codant pour les pili sexuels et les protines de conjugaison. Principaux lments des plasmides conjugatifs

Le transfert se ralise de manire oriente et progressive.

Rle trs important dans la dissmination de linformation gntique et particulirement des gnes de rsistance aux antibiotiques.

Cas de Bactrie Hfr (Haute frquence de recombinaison) Grace la prsence des squences IS, le facteur F peut sintgrer dans le chromosome dune bactrie F+, appels pisomes.
IS

Bactrie F+

Bactrie Hfr

>>> Les squences IS du plasmide F ont des squences homologues sur le chromosome. Linsertion se fait par recombinaison site spcifique. >>> La rplication est sous le contrle du chromosome.

Lors dune conjugaison entre bactrie Hfr et bactrie F-

Le plasmide peut mobiliser le transfert de lADN chromosomique dune cellule vers une autre et tre incorpor dans le chromosome par recombinaison entre les rgions homologues.

Plasmides conjugatifs: Diffusion plasmidique au sein de la mme espce ou entre divers groupes
Escherichia Salmonella Proteus Enterobacter

Serratia

Klesbsiella

Pseudomonas Acinetobacter

Transfrables dans une large gamme dhtes - intra spcifique (mme espce) - intra gnrique (entre espces) - inter gnrique (phylogntiquement diffrentes)

Notions importantes retenir sur le transfert conjugatif du plasmide Contact direct entre les cellules est indispensable Transfert est orient - Commence toujours en un point fixe (OriT) - Unidirectionnel: du donneur vers le receveur Transfert accompagn par la rplication de lADN transfr Suite au transfert - Le donneur garde sa copie du F - Le receveur est transform en mle car il porte une nouvelle copie du F Aucun transfert des gnes chromosomiques par le biais du plasmide F libre

Plasmide conjugatif

Plasmide non conjugatif

Transfert Plasmides non conjugatifs Ne sont pas autotransfrables.

Pas de transfert

Taille plus petite de 1 70 kb, souvent cryptiques, et en grand nombre de copies ( > 10), du fait d'un contrle relch de leur rplication. Transfrs une autre bactrie par deux autres mcanismes de transfert : la transduction et la mobilisation grce la prsence d'un plasmide "mobilisateur".

V 3- Gnes confrant des proprits supplmentaires la cellule hte 3a- Les gnes mtaboliques spciales
Les gnes mtaboliques codent pour la synthse de protines permettant lutilisation de nutriments - chez E. coli: gnes dutilisation du citrate comme source de carbone, production de soufre, hydrolyse de lure - chez les Salmonelles: gnes de dgradation du lactose

Remarques
Gnes non indispensables la vie de la bactrie qui peuvent tre une cause derreur pour lidentification des souches. Grand intrt sur le plan biotechnologique: dgradation des produits chimiques (polluants toxiques).

3b- Les gnes de rsistance

Les gnes de rsistance (ou virulence) peuvent tre ports par des - plasmides (svt conjugatif et de grandes tailles >> 200kb) - transposons - phages. Ils confrent une rsistance aux antibiotiques et dautres inhibiteurs de croissance

Les mcanismes de rsistance aux antibiotiques

1- Rsistance chromosomique:
- Observe chez des mutants (spontans ou artificiels) - Elle est due : - aux changements de la permabilit de la bactrie lantibiotique - la modification de la cible ou du site daction de lantibiotique.

Exemple de mode daction: Streptomycine

Mode daction:

Inhibition de la traduction par fixation sur la petite sous unit du ribosome

Site de fixation

Strepto
RIBOSOME ACTIF RIBOSOME INACTIF

PROTEINE

Mode de rsistance: Modification du site de fixation de lantibiotique

Site de fixation modifi

Strepto
RIBOSOME ACTIF RIBOSOME ACTIF

PROTEINE

2- Rsistance plasmidique:
Gnes codant la synthse de nouvelles enzymes qui soit: Inactivent lantibiotique Empchent sa pntration dans la cellule Ou le rejettent activement en dehors de la bactrie Selon divers mcanismes en fonction de la souche et le type de plasmide

Exemple: Streptomycine
Mode de rsistance plasmidique: Phosphorylation ou Adnylylation de lantibiotique et pour certains cas Actylation
Site de fixation

Strepto modifie

PROTEINE

RIBOSOME ACTIF

RIBOSOME ACTIF

Plusieurs plasmides confrent des rsistances multiples aux antibiotiques

Un simple plasmide R peut contenir plusieurs gnes diffrents codant chacun une enzyme dinactivation dantibiotique diffrente.

Les plasmides R: Rle de protection de la cellule

1. Synthse d'une protine de rsistance la substance toxique: elle va neutraliser l'activit toxique de la substance (en la dnaturant, hydrolysant, etc.) 2. Modification des proprits denveloppe de la cellule et en la rendant impermable la substance toxique (mtaux lourds).

Plasmide R100 de 94,3Kpb

Fonction de rplication

Rsistance :
Ori V

inc

mer tra sul str

- Sulfamides, - Streptomycine, - Spectinomycine, - Acide fusidique, - Chloramphnicol, - Ttracycline - Mercure - Prsence de gnes Inc: Exclusion de

Ori T

tet

tout autre facteur R du mme type.

- Prsence dun facteur R empche le maintien dun autre plasmide apparent.

- Autres facteurs R, portant des gnes de rsistance : Kanamycine, Pnicilline, Ttracycline, Nomycine - Plusieurs gnes de rsistance ports par les facteurs R sont des lments transposables, appels aussi TRANSPOSONS Tn, utilis comme Marqueurs de slection Mutagnse dirige
Rem: Lmergence de bactries rsistantes plusieurs antibiotiques a une importance mdicale >>>>> cest corrle avec laugmentation de lutilisation des antibiotiques pour les traitements des maladies infectieuses.

VI- Utilisation des plasmides

VI 1- Les plasmides sont utiliss comme vecteur de clonage Intgration dun fragment dADN dans un plasmide par recombinaison in vitro: P. recombin ou P. chimre. L'ensemble des descendants d'une telle cellule constitue un clone: Clonage dun fragment d'ADN. Lintgration de gnes dorigines trs varies permet le transfert de matriel gntique en franchissant les barrires despces.

La technologie de lADN recombin permet: de prlever un fragment spcifique dADN de manipuler ce fragment dans un tube essai de le remettre dans un organisme (le mme ou un autre)

Production de fragments dADN

Liaison de ces fragments un support molculaire (= vecteur) Introduction du vecteur dans une cellule hte pour en faire de multiples copies (= pour lamplifier) Slection du fragment que lon veut tudier

VI 2- Les plasmides sont utiliss comme vecteur d'expression

LADN clon dans un plasmide peut exprimer les gnes qu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli
Transcription et traduction du messager

Faire fabriquer E. coli des protines trangres ( l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine)

VI 3- Les plasmides sont utiliss comme vecteur pour la transformation de cellules eucaryotes Introduire et faire exprimer de l'ADN dans des cellules eucaryotes - levure, cellules de Mammifres en culture, - cellules rsultant des premires divisions de l'uf d'un mammifre par exemple Aprs un clonage dans Escherichia coli Rintroduire le gne clon dans des cellules eucaryotes Expression

Conclusion
Les plasmides confrent aux bactries qui les hbergent de nombreux caractres gntiques par un mcanisme d'addition et non par un mcanisme de substitution. Ils reprsentent un lment essentiel d'adaptation bactrienne. Ils sont responsables d'pidmies de gnes (notamment de rsistance aux antibiotiques), qui sont la base de la dcouverte des transposons, appels encore gnes sauteurs ou mobiles.

B- Les transposons (Tn)

B- Les lments gntiques mobiles: les transposons (Tn)

Dfinition: v Squences d'ADN capables de changer de localisation dans le gnome sans jamais apparatre l'tat libre. v Ils ne peuvent se rpliquer, mais, codent pour les dterminants de la transposition et ceux d'autres fonctions telle la rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds .
bta-lactamines, aminosides, phnicols, cyclines, rythromycine, sulfamides et trimthoprime

Transposition :Mcanisme d'volution rapide.

Cest l'addition dune squence de gnes (ADN) de taille dfinie au sein d'un gnome (chromosome bactrien ou plasmide) et en l'absence d'homologie de squence nuclotidique par recombinaison illgitime.

Structure des transposons

Le transposon est constitu d'un fragment d'ADN limit de part et d'autre par des squences rptitives inverses (IR) appartenant des squences d'insertion (IS).
IRL

IS1
768 pb
IRR

Les squences d'insertion portent les gnes ncessaires la transposition, transposase (lments rgulateurs de la transposition) et les marqueurs spcifiques ( ex: Rsistance aux antibiotiques).

RLE INTRT
Les transposons constituent un gnome collectif ou un patrimoine gntique commun, dans lequel puisent les bactries en fonction de leur ncessit d'adaptation ou de la pression de slection. Ces lments sont la preuve du "gnie gntique in vivo". Ils sont trs utiliss en mutagnse in vitro, ou encore par les bactries elles-mmes pour moduler l'expression d'un gne.