Sunteți pe pagina 1din 3

Polifenolii din sucul de struguri modifica Homeostazia colesterolului si cresc activitatea receptorilor LDL in celulele umane in Vitro

S-a demonstrat ca polifenolii din sucul de struguri rosii (RGJ) au fost folositi pentru a reduce nivelul circulatiei colesterolului LDL si de asemenea pentru a creste activitatea receptorilor LDL. Pentru a explora efectul plovenolilor derivati din RGJ in homeostazia colesterolului intracelular, hepatocarcinomul uman G2 si liniile celulare promielocitice HL-60, acestea au fost incubate intr0un mediu fara ser, cu sau fara LDL, in prezenta sau in absenta RGJ. In prezeta lui LDL, RGJ a crescut atat activitatea si expunerea suprafetei celulare a receptorilor LDL cat si continutul total al colesterolului celulei. In celulele expuse la LDL, RGJ a crescut de asemenea nivelurile formelor active ale elementelor de legatura ale proteinei 1 din reglementarea sterolului si expresia ARN-ului al receptorilor LDL si reductaza hydroxymethylglutaryl-CoA. In contrast, RGJ a creat o reducere remarcanta in expresivitatea CYP 7A1, apolipoproteina A, ABCA1 si ABCG5. Experimentele care au utilizat acil-CoA, inhibitorul acyltransferazei S-58035 au indicat ca nici o forma masurabila care nu contine colesterol din endocytosed LDL ajunge in reticulul endoplasmatic in celulele tratate cu RGJ. In final, microscopia de fluorescent a dezvaluit ca in celulele tratate cu RGJ, Dil-labeled LDL nu colocalizeaza cu CD63, o proteina localizata in stadiul de echilibru a veziculelor interne situate la capatul endozomului. Aceste rezultate au indicat ca polifenolii din RGJ au distrus sau au intarziat traficul LDL multumita cai endocitice, acestea prevenind colesterolul LDL din exercitarea efectelor de reglementare care se desfasoara asupra homeostaziei lipidelor intracelulare.

Cuvinte cheie: Receptor LDL, polifenolii din sucul de struguri, traficul colesterolului, colesterolul LDL

Materiale si metoda Cultura celulara Celulele hepatocarcinomlui uman HepG2 au fost obtinute din tipuri de culture Americane care au mentinute in DMEM si au fost suplimentate cu 10% FBS si antibiotic la 37C intr-o atmosfera cu umiditate care contine si 5%CO2. Pentru experimente, celulele au fost incubate in DMEM care contine 10% LPDS, imbogatite sau nu cu LDL uman si sau RGJ. Pentru control in mediu s-a adaugat pentru celule, glucoza si fructoza, fiecare intr-o concentratie de 2.1g/L. Analiza polifenolilor in sucul de struguri rosii. Analiza flavonoidelor, acizilor fenolici, s-a putut efectua prin respectareaunei metode si anume: 5 ml RGJ (68Brix) au fost diluati cu 15 ml apa, se separa in 2 alicote si se extrage de 3 ori fiecare cu dietil eter si etil acetat. Fractiunile organice au fost amestecate si uscate cu Na2SO4 timp de 30 minute, acestea fiind concentrate prin uscare si dizolvate intr-un ml de methanol/apa (50:50). Dupa ce s-a filtrat continutul prin membrana, o proba de 100L a fost injectata printr-o coloana cu faza reversibila de la Nova=Pak (300mmX3.9mm, 4m), utilizand un sistem de cromatografie lichida echipat cu un controlor 600-MS, si un detector de fotodioda 996. Detectarea s-a putut realize prin scanarea probei de la 220 la 380 nm. Asimilarea de polifenoli din sucul de struguri rosii (RGJ) de catre celulele Hep G2. Celulele Hep G2 au fost cultivate intr-un balon de 175 cm2 in mediul DMEM care contine 10% FBS pentru a imbogati cu 80% confluenta; atunci mediul se schimba la DMEM care contine 10%LPDS, LDL (0.31 mmol cholesterol/L) si RGJ (5ml/L). La 0, 3, 9 si 20 de ore de incubare, celulele au fost recotate, spalate cu PBS si tratate in gheata cu 300l de solutie de lizare timp de 20 de minute pe urma s-a determinat continutul de proteina a celulei. Lizatele au fost incubate cu 200l de 0.1 mol/L acid ascorbic, 100 l de solutie tampon de acetat de sodium 0.78mol/l (pH 4,8) si 100l de -glucoronidaza din Helix pomatia (melci) la 37C pentru 8 ore. Mixul a fost extras de 2 ori cu 1ml acetat de etil si cumuland supernatant unde este concentrat prin uscare cu SPD121P Speed-Vac System. Proba a fost reconstituita in 300l de amestec methanol:apa (50:50, v:v), filtrate prin membrane cu ochiuri cu diametrul de 0.45 m, iar un continut de aproximativ 200l au fost pastrate pentru a se analiza la HPLC.

Activitatea receptorilor LDL si expresia suprafetei celulelor. LDL-ul uman a fost izolat prin ultracentrifugare si pus in evidenta cu ajutorul lampii cu fluorescent DiI. Celulele HepG2tratate cu componente ale testului timp de 20 ore in 10% LPDS, unde sunt spalate de 2 ori cu PBS urmand a se incuba in forma duplicitara in mediu cu 10% LPDS care contine DiI-LDL pentru 2 ore la 37C pentru a-I permite sa asimileze DiI-LDL. Pentru a analiza expresia suprafetei celulare a proteinei receptorilor LDL, celulele au fost incubate cu receptori monoclonali anti LDL ai anticorpilor IgG C7 (15 mg/L) si analizate cu ajutorul fluxului de citometrie.

Analiza biosintezei colesterolului si determinarea lipidelor: Pentru a examina biosinteza colesterolului celulele HepG2 au fost incubate in mediu LPDS care contine acetat timp de 20 de ore, lizate cu 10% KOH si celulele colesterolului total a fost analizat cu HPLC-ul. Celulele colesterolului total au fost puse in evidenta printr-o metoda enzimatica urmata de analiza HPLC utilizand oxidazele colesterolului si esterazele colesterolului. Microscopia cu fluorescenta Celulele HepG2 au fost cultivate pe lamele de sticla pentru 48 de ore in mediu care contine 10%FBS. Apoi mediul a fost inlocuit cu mediu care contine 10% LPDs si incubate in prezenta DiI-LDL (0,15 mmol cholesterol/ L), RGJ(5mL/L) sau tamoxifem (5mol/L) pentru 20 de ore. Pentru colorarea colesterolului liber, celulele au fost spalate sii fixate in 4% paraformaldehida pentru 15 minute, spalate de 3 ori cu PBS si apoi colorate cu filipin (50mg/L in PBS) pentru 45 minute. ADN-ul a fost colorat cu DAPI. Celulele au fost montate pentru microscopie si examinate la un Olympus BX51 care reflecta fluorescenta microscopului. Rezultate Compozitia polifenolilor din sucul de struguri rosii si asimilarea asimilarea acestora de catre cellule. Analiza RGJ prin HPLC a dus la concluzia ca exista o concentratie semnificativa de antociani, flavonoide, in particular miricetina, glicozidele quercetinei si procianidina B2. Alti fenoli precum trans-resveratrolul, a fost detectat sub forma de urme. Polifenolii din Sucul de struguri rosii sunt asimilati in mod efficient de catre celulele in vitro HepG2 in ficatul uman, intrun mod dependent de timp.

Concluzii Concentratia ridicata a plasmei LDL si oxidarea LDL sunt recunoscute ca avand un rol important in aterogeneza si crescandu-i eficienta claritatii prezentei colesterolului prin cresterea activitatii receptorilor, aceasta fiind o modalitate eficienta de a reduce LDL-ul plasmatic