Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad de Ciencias Biolgicas Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa Biologa de Microorganismos Bio151E-1

Informe 2: Gentica Bacteriana, Hongos unicelulares y pluricelulares

Nombre: Hernn Gonzlez A. Profesor: Dr. Lus Larrondo. Instructor: Daniela Ruiz. Ayudante: Sonia Abarca. Fecha de entrega: 21 de noviembre del 2012.

Introduccin
Un virus corresponde a un agente infeccioso que es capaz de reproducirse a travs de mecanismos celulares de organismos vivos ajenos (1), en donde el virus inyecta una serie de protenas incorporadas en su ADN o ARN a la clula del hospedero para sintetizar cadenas de ADN virulentas y as lograr reproducirse (2). Los virus requieren necesariamente otro organismo para lograr multiplicarse, dado que no poseen metabolismos para lograr dividirse por si mismas (3). En esta fase extracelular, en la cual estas protenas no han infectado ninguna clula hospedera el virus pasa a llamarse virin (4). Estas dos ltimas caractersticas son esenciales en la evolucin de otras especies, ya que este estado fuera de la clula garantiza que estos cdigos de informacin gentica puedan mantenerse a lo largo del tiempo, y por sobre todo mantener una diversidad gentica, por medio de una transferencia horizontal de genes (5), especficamente en microorganismos unicelulares de mayor tamao; las bacterias (6). Los virus en que su infeccin es exclusiva a bacterias de diferentes especies son los denominados bacterifagos (7). Estos tienen dos vas efectivas de infeccin; la va ltica que ltica que corresponde a la destruccin del microorganismo para la produccin de otros viriones para posteriores infecciones (8). Y est la va lisognica, el cual el virus esta incorporado en el ADN de la bacteria, pero no expresa ningn tipo de dao estructural al hospedero (9). La mayora de las bacterias son susceptibles a algn fago dado su tamao superior, lo que permite una permeabilidad relativamente alta a protenas y ADN libres extra celulares, y adems a su nula diferenciacin celular y sexual, ya que, en contraste de los organismos eucariontes, estos poseen mecanismos de defensa como linfocitos, que protegen al organismo en caso de posibles infecciones (10). Sin embargo, no todos los organismos eucariontes poseen estos mecanismos. De hecho existe un reino completo que es posible encontrarlo tanto pluricelular con una reproduccin sexuada y diferenciaciones celulares explcitas, como unicelulares con caractersticas sexuales similares a bacterias; estos organismos corresponden al Reino Fungi (11). Estos hongos, como se mencion recin, estn en la naturaleza como tipo levadura, es decir, unicelulares con reproduccin asexual conocida como hiemacin, y los hongos de tipo filamentos, que corresponde a organismos multicelulares, visibles por el ojo humano, de los cuales su reproduccin sexual es por medio de esporas (12). En los laboratorios 3 y 4 se trataron estos 2 temas mencionados; el laboratorio 3, gentica bacteriana, en primer lugar se vieron placas de lisis de los fagos H5 y P22 y se realizaron sembrado de stos en placas verde ya que stos fagos tienen la facultad de provocar lisis en Salmonella Enterica Serovar Typhimuriu (fago P22 especficamente), bacteria muy usada en laboratorios (13), y por ser capaces de realizar una exitosa trasduccin gentica(14), por lo que fue posible ver la distincin entre fagos lticos y lisognicos en estas placas de lisis y a la vez, comprobar en la prctica la transferencia latera de genes. En segunda lugar se deseaba ver la especificidad de los fagos frente a 3 cultivos de bacterias; Escherichia Coli, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium, Klebsiella pneumoniae. En tercer lugar se buscaba extraer de una muestra ambiental algn tipo de fago por medio de cloroformo, ya que el cloroformo es capaz de, por un lado realizar una lisis a las membranas lipdicas de las bacterias presentes en la muestra, y por otro lado los disuelve y aumenta la separacin de fases, facilitando su extraccin (15). Otro punto importante es indicar que se utilizaron placas verdes para realizar estos sembrados, ya que poseen mayor concentracin de glucosa y por ende el aislamiento de Salmonella Enterica Serovar Typhimuriu es eficaz, dado que corresponde a su principal fuente de nutrientes (16).

En el laboratorio 4 se observaron los 2 diferentes tipos de hongos, filamentosos y levadura tanto microscpicamente, como microscpicamente. Estos sembrados fueron realizado en medio Sabouraud ya que contienen peptonas que son la principal fuente de nitrgeno y carbono a los hongos, y por otro lado, el pH cercano a 5 es apto para evitar posibles sembrados indeseados de otros microorganismos. (17) En sntesis, los objetivos principales son; en primer lugar lograr distinguir la diferencia entre un fago ltico y lisognico por medio de profundidades y cantidad de agujeros observador en placas de lisis. En segundo lugar observar la transferencia lateral de genes mediada por fagos, para analizar el rol que estos virus juegan en la variabilidad de genes expresados en bacterias. Tercero, ver la especificidad de fagos frente a distintas bacterias. Cuarto diferenciar los hongos tipo filamentosos entre los del tipo levadura, tanto a nivel microscpico como a nivel microscpico, y por ltimo se debi reconocer las diferentes estructuras microscpicas y sus diferenciaciones celulares y sexuales entre los dos tipos de hongos, unicelulares y pluricelulares.

Materiales y Mtodos
Para realizar el laboratorio de gentica bacteriana (18), se utilizaron los materiales descritos en la tabla I.
Tabla I, Lista de materiales e instrumentos utilizados en el laboratorio 3, trabajo con bacterifagos.

Placas petri Placas verdes Muestra de agua ambiental (sacado de agua estancada en lavaplatos) Cloroformo Agar Blando licuado como placa de lisis Agar Luria Pipetas pasteur Mechero Bunsen Asa de platino Mondadientes esterilizados Respecto a los mtodos en el laboratorio 3 no se dividi en dos una placa verde para cultivar los dos tipos de fagos, H2 y P22 en un mismo agar, sino que se usaron 2 placas petri diferentes, una para cada fago. Otro detalle a exponer es el hecho de que el tiempo de exposicin del csped de bacterias de ambos agar verde con sus respectivos fagos no se realizaron en el plazo determinado por la gua (19), en cambio la infeccin fue realizada en un periodo cercano a los 14 das. Otro asunto a explicitar es que no se usaron gotas como unidad de medida en la prctica correspondiente a la separacin de fagos en la muestra ambiental pedido, debido a que no usamos alcuota. La unidad de medida utilizada en el laboratorio fueron los ml, donde se tomaron tanto muestra como cantidad de cloroformo, la cantidad requerida de 600 ml para luego ser realizado la emulsin posterior con otros 600 ml adicionales de bacteria Escherichia Coli. Donde se deseaba evaluar la especificidad de los hospederos, en este caso Escherichia Coli, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium y Klebsiella pneumoniae el tiempo de espera tampoco fue, como el caso anterior, de 24 horas, sino que fueron 2 semanas de exposicin. En la segunda parte de laboratorio 3 (20) se realiz un cambio casi completo del prctico. Los materiales usados en el prctico estn explicitados en la tabla I, y los cambios realizados a lo largo de ste se pueden apreciar en la tabla II.

Tabla II, Cambios realizados en el laboratorio 3, transferencia lateral de genes.

Mezcla 1 Muestra 1 250 ml Escherichia Coli c1000 250 ml LC Salmonella 100 ml LB

Mezcla 2 250 ml Cherry

Mezcla 3 250 ml fago P221063

Muestra 2

250 ml Salmonella wild type 100 ml LB

250 ml Salmonella wild type 100 ml LB

Muestra 3

Tipo de agar Sembrados

Agar verde Rastrillo con pipeta pasteur 1 hora, 37C Ampicilina Kanamicina

Agar verde Zigzag y csped

Agar MacConkey Zigzag y csped

Exposicin Antibiticos

1 hora, 37C Ampicilina

1 hora, 37C Kanamicina

Los materiales utilizados en el laboratorio correspondiente estn tabulados en la tabla III.

Tabla III, Lista de materiales e instrumentos utilizados en el laboratorio 4, hongos.

Alcuota Azul de Lactofenol Tinta China Lugol Cristal Violeta Agua Destilada Cubreobjetos Aceite de inmersin Microscopio ptico Caldo Sabouraud

Para el laboratorio 4 el nico cambio realizo fue cambiar el aumento del microscopio ptico de 40x hasta 20x en el fungi Aspergillius Fumigatus. Fue un cambio forzado ya que no fue posible enfocarlo en 40x.

Resultados
En el primer laboratorio de gentica bacteriana se observaron placas de lisis en agar blando de los fagos P22 y H5. En la placa con el fago H5 fue notorio la baja cantidad de lisis que se realiz en el csped, ya que la cantidad de agujeros en el agar fueron un nmero menor, en cambio en la placa que contena al fago P22 la lisis era abundante la cantidad de agujeros a lo largo del agar, sin embargo la profundidad de los agujeros era de una intensidad mas dbil que la del H5. Respecto a la siembra realizada de P22 y H5 con un mondadiente estril en una placa verde, a primera vista no hubo efecto alguno, ya que el csped era regular y homogneo por lo que no se mostraba lisis, sin embargo se lograba ver con mucho cuidado pequeos agujeros en puntos centrado desde una vista frontal en el agar verde del fago H5, lo que indica una dbil, pero existente lisis. En relacin al aislamiento de fagos desde la muestra ambiental, el agar Luria no mostr resultado alguno, el csped estaba intacto. El mismo resultado mostr al evaluar la especificidad del fago respecto a alguna bacteria. No hubo un rango de lisis, ni puntos de o agujeros negros que muestren algn tipo de infeccin al csped de bacteria presentes. Salmonella Enterica Serovar Typhimurium creci normalmente. En el prctico, correspondiente al laboratorio 3, transferencia lateral de genes, de la tabla II, mezcla 1 se mostr un csped homogneo sin ningn tipo de agujeros, por lo que la lisis en el agar verde no ocurri. De la misma tabla II, mezcla 2, en zig-zag la placa verde mostr un sembrado de bacteria Salmonella Enterica Serovar Typhimurium de color blanco brillante sin alteraciones ni agujeros, por lo que no hubo lisis. El mismo resultado mostr el csped realizado un rastrillado con una pipeta Pasteur. Se observ un csped homogneo sin lisis. En la muestra 3, no se mostr color rojo, ni ningn tipo de color en el agar Macconkey en sembrado zig-zag, slo se vio la placa con un sembrado de bacterias homogneo, en cambio en el csped realizado de la muestra si se mostr unas pequeas proliferaciones de bacteria de color rojo. Hubo una evidente lisis, ya que aparecen discontinuidades en el csped, pero es notorio que existieron colonias de bacterias que si resistieron a la ampicilina. Para el laboratorio nmero 4 al analizar los hongos tipo levadura, es clara la similitud entre ellos, tanto microscpicamente como microscpicamente. En la tabla IV se muestra lo visto macroscpicamente en los 3 diferentes tipos de levaduras puestas en el laboratorio.

Tabla IV, Anlisis Macroscpico de Hongos tipo Levadura.

Hongo Rhodotorula Candida Albicans Cryptococcus Neoformans

Forma Circular Circular Circular

Color

Superficie

Borde Liso Liso Liso

Elevacin Convexa Crea Elevado

Brillo Brillante Opaca Opaca

Crema Lisa Blanco Lisa Blanco Lisa

En la tabla V notamos otros 3 tipos de hongos, pero en este caso no corresponden a tipo levadura, sino que son hongos filamentos. En ellos se aprecia a simple vista lo parecido a lo que son los hongos conocidos en a vida cotidiana como moho (21).
Tabla V, Anlisis Macroscpico de Hongos Filamentosos.

Hongo Aspergillus Niger Aspergillus Fumigatus Mucor

Anverso de la placa Puntos negros con borde blanco. Aterciopelado. Verde con bordes blancos. Algodonoso blanco con algunos puntos negros y cafs.

Reverso de la placa Color crema y pulvurulenta. Color crema y pulvurulenta. Color Amarillo.

A continuacin, en la tabla VI se muestran las tinciones de Gram realizadas a los hongos tipo levadura. Cabe destacar que no son bacterias y por ende no corresponden a ningn tipo de Gram, sin embargo esta tincin es la que realiza la diferencia entre Gram Positiva y Negativa, por lo que aunque suene absurdo adjuntarle un valor, slo es un mtodo de anlisis microscpico, por lo que a pesar de asociarle positivo o negativo a un hongo no representa mas que la reaccin frente a esta prueba y poco tiene que ver con el comportamiento procarionte que pueda tener (22).
Tabla VI, Anlisis Microscpico de Hongos tipo Levadura. Tincin de Gram y examen al fresco.

Hongo Rhodotorula Candida Albicans Cryptococcus Neoformans

Gram + -

Caractersticas Clulas ovaladas Clulas con forma de ovoides. Presencia de pseudomicelos Clulas circular en forma de racimo color rojo

Simbologa: +; positivo. -; negativo.

Por ltimo, la tabla VII explicita lo observado en microscopio en las muestras de los 3 tipos de hongo filamentoso. Cabe destacar que enfocar a 40x estas muestras fue una ardua tarea, puesto que a ser organismos pluricelulares, dificult la visin por el tamao que poseen. De hecho Aspergillus Fumigatus como de dijo anteriormente, fue cambiado de 40x a 20x debido a la dificultad de enfocarlo en microscopio (23).
Tabla VII, Anlisis Microscpico de Hongos Filamentosos.

Hongo Aspergillus Niger Aspergillus Fumigatus Mucor

Caractersticas Conidioforo y Conidios distinguibles. Todas sus estructuras bien definidas. Cabeza aspergilar, Conidioforo y fialides se lograron ver con nitidez. Esporangioforos y Esporangio bien definidos. No se logr apreciar Columela ni Endoesporas a cabalidad.

Discusin
Para el laboratorio 3 dado los resultados de ambas placas de lisis en agar blanco, y en consecuencia de que en primera instancia no se conoce la concentracin inicial de fagos ni del fago P22 ni del fago H5, la cantidad de agujeros va directamente relacionada con la cantidad de bacterifagos que se encuentra a lo largo de la placa (24), y puesto que mayor cantidad de virus en la muestra requiere previamente una reproduccin de ellos, el fago P22 al verse una notable lisis en la placa necesito anteriormente reproducirse en el mismo agar, por ende utilizo la maquinaria de las bacterias en csped presentes en la placa para lograrlo y as finalmente logr abarcar mayor superficie (25). En sntesis, el fago P22 debi corresponder a un fago lisognico. Por otra parte, y en contra posicin con lo anterior, el fago H5 si bien no mostr una cantidad de lisis muy extensa, logr tener una profundidad no despreciable dentro de la placa respectiva. Esto debido a que el fago H5 no entr a va lisognica ya que no hay muestras de reproduccin de fagos. Considerando lo anterior, el fago H5 correspondi ser un fago ltico (26). Respecto a las siembras realizadas en placas verdes de estos mismos fagos, la falta de lisis se debe primero a la poca sensibilidad que poseen los fagos a este agar verde (27), y segundo al tiempo excesivo de exposicin, lo que permiti al csped volver a reproducirse luego de la infeccin(28). Sin embargo, y considerando que en la placa verde con el fago H5 si mostr ciertos puntos de lisis, a diferencia del fago P22 que no hubo resultado, por ende se reafirma el hecho de que el fago H5 es ltico ya que al infectar para realizar slo lisis produce mayor profundidad en los agujeros (29), y el fago P22 es un fago lisognico. Lo que debi haberse visto son puntos color verde oscuro en la placa para el fago P22, y un color azul para el fago H5 (30). Lo otro es que el agar verde posee una concentracin de glucosa en niveles altos, por lo que la cantidad de nutrientes y fuentes de carbono en general es suficiente para que en estas 2 semanas de exposicin, las bacterias luego de ser infectadas, vuelvan a crecer en el csped, por lo que se debi utilizar una alta concentracin de fagos tanto para el fago P22 como para el fago H5. En relacin a la muestra ambiental, se debi haber disociado el fago de las bacterias presentes en el agua ya que el cloroformo rompe la membrana lipdica de las bacterias pero no al virus puesto que son slo protenas sin membrana (31), adems separa en fases dado las diferentes polaridades que se produjeron en la mezcla (32). Sin embargo, esto no pudo ser definido, puesto que la placa no mostr ningn tipo de lisis. La razn de esto, independiente del error sistemtico o humano que se pudo haber cometido, es el hecho de que no se conoce a priori la concentracin de fagos en la muestra. Otro motivo es la sensibilidad del fago a Escherichia Coli presente en el csped (33), adems no se sabe si el fago presente era ltico ni lisognico, es ms, ni siquiera se tiene conciencia si que realmente existieron fagos en la muestra misma y que tipos de fagos pueden existir. Los resultados que deberan haberse visto es algn tipo de lisis en el agar, y dado el resultado emprico se debi utilizar otro mtodo para aislar el fago de manera mas eficaz, o bien utilizar otro tipo de muestra ambiental donde se asegure que existe una alta concentracin de fagos (34). En la especificidad de los fagos no notamos ningn tipo de infeccin a ninguna de las 3 bacteria presentes. El fago P22 debi infectar a Salmonella, pero no hubo lisis (35). Similar a la parte anterior, el tiempo de cultivo fue excesivo, permitiendo que luego de la infeccin la bacteria volviera a reproducirse. El error en la prctica fue mnimo ya que hubo crecimiento de cada bacteria de forma normal (36).

Ya en la segunda parte del laboratorio 3, en la tabla II mezcla 1 se esperaba una transferencia lateral de genes entre E.Coli y S. Typhimurium en el cual esta E.Coli en particular posea genes de resistencia a kanamicina que son traspasados por conjugacin a S. Typhimurium, y por otro lado S. Typhimurium le transfiere resistencia a ampicilina, por lo que el agar al estar en presencia de kanamicina y ampicilina ambos deberan existir en el csped correspondiente sin lisis, lo que ocurri en la prctica a cabalidad, por lo que si existi una transferencia de genes exitosa (37). En la tabla II mezcla 2 se observ que Cherry, una mezcla del fago P22 ms S. Typhimurium con un colorante de color rojo, de ah el nombre (38), resistente a ampicilina le traspas genes a S. Typhimurium de cepa silvestre, dado caractersticas similares al agar anterior, ya que no existieron zonas despojadas de csped, por lo que la ampicilina no tuvo efecto en S. Typhimurium de cepa silvestre, lo que era lo esperado, tanto en el agar con zig-zag como el csped (39). En la ltima mezcla de la tabla II, sin embargo, el fago MST1063 en el agar MacMconkey zig-zag no mostr la S. Typhimurium de cepa silvestre resistencia a la kanamicina que debi ser trasducida desde el fago MST1063 resistente a kanamicina. Por otro lado, el csped realizado del mismo si mostr unas colonias de S. Typhimurium por lo que en este caso, el transposn si efectu una trasferencia de genes, por lo que debi haber existido mutagnesis en este agar. El error del zig-zag es la baja concentracin y la poca sensibilidad del fago MST1063 en la muestra tomada con el asa de platino (40). El resultado esperado era efectivamente una mutagnesis en ambas. Ya en el laboratorio 4, los resultados de las tablas IV y VI fueron concordantes con las caractersticas tanto microscpicas como macroscpicas de lo estudiado en la teora (41), sin embargo no se pudo observar a cabalidad el tipo de reproduccin asexuada por gemacin, pero dado las caractersticas similares a colonias de bacterias procariontes, se asumi este tipo de reproduccin (42). En los resultados de las tablas V y VII fueron concluyentes y se corroboraron las caractersticas tpicas de los hongos filamentosos (43). El nico detalle es que Aspergillus Fumigatus se encontraba en posible estado vegetativo por tener puntos negros en lado frontal del agar (44). Finalmente, Aspergillus Fumigatus no fue posible observarlo en microscopio ptico aumentado en 40x, dado su gran tamao, por lo que se fue forzada a cambiarlo a 20x para realizar la observacin pertinente (45).

Conclusiones
En el prctico nmero 3 de gentica bacteriana, P22 mostr mayor cantidad de lisis en el agar blanco que H5, sin embargo la calidad de los agujeros del fago H5 es mayor, por lo que P22 es un fago lisognico y H5 corresponde a un bacterifago ltico, mostrando el resultado esperado en primera instancia. En relacin a los sembrados realizados con estos mismo fagos, los resultados no fueron concluyentes dado la poca sensibilidad y el excesivo tiempo de exposicin del fago respecto al csped. En la especificidad de los fagos tampoco se logr el objetivo de ver un crculo de lisis en Salmonella Enterica Serovar Typhimurium, resultado no esperado puesto que debi haber sido infectado. En el mismo laboratorio 3, pero en la transferencia lateral de genes se logr de buena manera realizar un intercambio de genes tanto en la mezcla 1 como la mezcla 2 de la tabla II, por lo que se logr eficazmente expresar los genes resistencia a antibiticos, sin embargo la muestra 3 resulto con problemas con el agar con zig-zag dada la baja concentracin de fagos en l y posible esterilizacin apresurada del asa de platino. Por ltimo, para el laboratorio 4 de hongos, tantos los de tipo levadura como los filamentosos lograron ser vistos sin dificultades las similitudes entre lo prctico y lo estudiado tanto en el curso, como en lo visto en la vida cotidiana.

Bibliografa
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