Carla Joice Harter

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS RURAIS PROGRAMA DE PS-GRADUAO ZOOTECNIA
DESENVOLVIMENTO E AVALIAO DE UM MTODO IN VITRO PARA ESTIMAR A DEGRADABILIDADE DAS PROTENAS NO RMEN
DISSERTAO DE MESTRADO
Carla Joice Hrter
Santa Maria, RS, Brasil 2009
DESENVOLVIMENTO E AVALIAO DE UM MTODO IN VITRO PARA ESTIMAR A DEGRADABILIDADE DAS PROTENAS NO RMEN
por
Carla Joice Hrter
Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Ps-Graduao em Zootecnia, rea de Concentrao em Nutrio de Ruminantes, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Zootecnia.
Orientador: Prof. Luis Maria Bonnecarrre Sanchez
Santa Maria, RS, Brasil 2009
"...Ser feliz no querer saber onde o nosso limite. conseguir ver sempre o lado bom das coisas, aprender com os erros, rir do que no tem graa, chorar sem culpa, amar a vida, temer a Deus e aceitar os presentes que ele nos d a cada dia, sempre ter esperana, lutar por uma boa causa, respeitar e ser respeitado, ter a alma leve e no ter a pretenso de que o mundo est contra voc!!! Seja feliz, faa feliz, no complique o simples, sorria, mesmo sem saber porque, agradea mesmo quando no tem porque, ame at quem no te ama, e VIVA..."
AGRADECIMENTOS
A Deus acima de tudo, que o principal provedor de tudo o que conquistei e de tudo o que sou. Aos meus pais, pela educao, amor, incentivo e apoio. Aos meus irmos juntamente com suas respectivas famlias, que de uma forma ou de outra sempre contriburam para que eu chegasse at aqui. Aos amigos, minhas jias preciosas, tanto os de perto como os distantes, que sempre se fizeram presentes, verdadeiros companheiros de todos os momentos, tanto para dar uma fora nas horas de aperto como para comemorar uma vitria. Em especial s companheiras dos bailinhos e aos filsofos de boteco! Aos orientadores Bonne e Gilberto pela ateno, ensinamentos transmitidos e confiana em mim depositada durante todos esses anos de convvio. Aos estagirios e colegas de mestrado do LBNR, pessoas que sempre souberam estender sua mo, ensinando ou ajudando, companheiros de trabalho, inmeros plantes e de algumas festinhas nas horas vagas. E em especial aos guerreiros dos eppendorfes, agradeolhes por todo trabalho realizado, pela persistncia, dedicao e ateno, pois sem suas ajudas essa realidade no estaria se concretizando, saibam que tenho um carinho especial por vocs e os considero verdadeiros amigos.
A todos, o meu Muito Obrigada!
RESUMO Dissertao de Mestrado Programa de Ps-Graduao em Zootecnia Universidade Federal de Santa Maria DESENVOLVIMENTO E AVALIAO DE UM MTODO IN VITRO PARA ESTIMAR A DEGRADABILIDADE DAS PROTENAS NO RMEN AUTORA: CARLA JOICE HRTER ORIENTADOR: LUIS MARIA BONNECARRRE SANCHEZ Data e Local da Defesa: Santa Maria, 13 de fevereiro de 2009.
Foi conduzido um conjunto de ensaios in vitro com o objetivo de desenvolver um mtodo para estimar a degradao de protena no rmen baseado na liberao de amnia no meio de incubao. Foram incubadas amostras de farelo de soja, farinha de carne e ossos, azevm (Lolium multiflorum) e cynodon (Cynodon dactilon var. Dactylon) utilizando-se os procedimentos da tcnica in vitro/gases. Foi avaliado o efeito da quantidade de amostra incubada, da incluso de amido para corrigir a frao de nitrognio capturado pelas bactrias, do teor de nitrognio na soluo tampo e do tratamento prvio das amostras para remoo da frao solvel do nitrognio. Foram conduzidos tambm ensaios in vitro de curta durao para medir a taxa de degradao ou de solubilizao da frao solvel da protena das amostras. Os resultados de degradao protica obtidos em algumas amostras incubadas in vitro foram comparados com os obtidos em ensaios in vivo e in sito, que foram conduzidos paralelamente. A degradao da protena de diferentes amostras no foi afetada pelo tamanho de amostra (15 mg N/ amostra 1 g de amostra), entretanto a degradabilidade e a taxa de degradao protica do azevm, sem correo de amido, foram negativamente afetadas pela excluso do bicarbonato de amnio da soluo tampo (P<0,05). O tratamento prvio da amostra interferiu (P<0,05) nos resultados de degradao protica das amostras de azevm e farelo de soja, mas no da farinha de carne. Em geral, a incluso de amido para correo da amnia utilizada pelos microorganismos, resultou em maiores valores de degradabilidade da protena do azevm (P<0,05), mas no das outras amostras. O coeficiente de determinao (r) das estimativas da taxa de degradao, calculada com base na variao da concentrao de amnia no meio ao longo do tempo de incubao, foram geralmente altos (superiores a 80%). As degradabilidades efetivas da protena das amostras de farelo de soja, farinha de carne e azevm, estimadas pelo mtodo in vitro foram inferiores s estimadas pelo mtodo in situ (P<0,05). Por outro lado, a degradabilidade efetiva da protena de amostras de azevm e Cynodon estimada pelo mtodo in vitro no diferiu dos valores obtidos in vivo com ovinos fistulados no duodeno. Em concluso, o mtodo in vitro/gases pode ser uma ferramenta til para estimar a degradabilidade ruminal das protenas, embora ainda necessite ser melhor validado com estudos in vivo.
Palavras-chave: degradabilidade, in vitro, in situ, in vivo, protena, taxa de degradao.
ABSTRACT Dissertation of Mastership Programa de Ps-Graduao em Zootecnia Universidade Federal de Santa Maria DEVELOPMENT AND EVALUATION OF AN IN VITRO METHOD TO ESTIMATE THE DEGRADATION OF PROTEINS IN THE RUMEN AUTHOR: CARLA JOICE HRTER ADVISOR: LUIS MARIA BONNECARRRE SANCHEZ Date and defenses place: Santa Maria, February 13, 2009.
A set of assays was carried out to develop a method for estimating ruminal degradation of proteins based on ammonia production in vitro. Samples of soybean meal, meat and bone meal, ryegrass (Lolium multiflorum) and cynodon (Cynodon dactilon var. Dactylon) were incubated by using the procedures of the in vitro/gas method. The effects of sample amount; starch inclusion to correct for ammonia uptaked by bacteria; nitrogen concentration in buffer solution and preview treatment of samples for soluble nitrogen extraction were evaluated. Short-time in vitro assays were also carried out to estimate degradation rate or solubilization rate of soluble fraction of nitrogen. Results of protein degradation obtained for some samples incubated in vitro were compared to those obtained from in situ and in vivo assays carried out in parallel. Results of protein degradation of different samples were not affected by sample size (15 mg N/ sample 1 g of sample) whereas degradability and dagradation rate of ryegrass protein, without starch correction, was negativelly affected by exclusion of ammonium bicarbonate from buffer solution (P<0,05). The preview extraction of soluble fraction of samples affected (P<0.05) protein degradation only of the ryegrass and soybean meal samples. Estimates of protein degradation for concentrate samples were not affected by starch inclusion. However, starch inclusion increased (P<0.05) protein degradation for ryegrass samples. Determination coefficient (r) of regressions relating ammonia concentration and incubation time were usually high (above 0.80). Protein degradability of soybean meal, meat and bone meal and ryegrass samples were lower by in vitro than by in situ method (P<0.05). In turn, protein degradability of ryegrass and cynodon samples estimated in vitro was similar to obtained in vivo. In conclusion, although it needs more consistent validation, the in vitro/gas method might be an useful tool for estimating rumen degradabilty of proteins.
Keywords: ammonia, degradability, in vitro, in situ, in vivo, protein, degradation rate.
LISTA DE ILUSTRAES
FIGURA 1. Esquema da degradao protica no rmen. ......................................................19 FIGURA 2. Resumo dos ensaios realizados.......................................................................... 29 FIGURA 3. Quantidade de N-NH3 (mg) presente em cada garrafa, em cada tempo aps incubao, da amostra de farelo de soja em um ensaio in vitro gs. As amostras foram incubadas sem amido ou com incluso de 100, 200 e 300 mg de amido por garrafa. ............. 37 FIGURA 4. Exemplo da reta de regresso gerada a partir das concentraes de N-NH3 de uma amostra, em relao aos respectivos volumes de gs (com amido = 0, 100, 200 e 300 mg). A intercepta da regresso de 17,89, o que corresponde a concentrao de N-NH3 quando a produo de gs for igual a zero. ..........................................................................................38 FIGURA 5. Logaritmo natural da frao indegradvel do nitrognio de amostras incubadas com e sem amido, ao longo de 96 horas de incubao. .........................................................39 FIGURA 6. Teores de nitrognio residual das amostras de farelo de soja (FS), farinha de carne e ossos (FC) e Azevm (AZ), aps solubilizao em tampo, ao longo do tempo. ....... 41 FIGURA 7. Degradabilidade mdia de amostras de farelo de soja e farinha de carne 24, 48, 72 e 96 horas de incubao in vitro (sem correo do nitrognio pelo uso de amido) obtida nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I....................................................................................44 FIGURA 8. Valores mdios de taxa de degradabilidade ( /h) nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro......................................................45 FIGURA 9. Valores mdios de r das taxas de degradao nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro...............................................................45 FIGURA 10. Valores de degradabilidade (% do N incubado) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum), nas 24, 48, 72 e 96 horas aps incubao do
ensaio 2 (n=3). As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I....................................................................................50 FIGURA 11. Valores de degradabilidade (% do N incubado) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum), nas 24, 48, 72 e 96 horas aps incubao do ensaio 3 (n=9). As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I....................................................................................51 FIGURA 12. Valores de degradabilidade (% do N incubado) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum), nas 24, 48, 72 e 96 horas aps incubao do ensaio 4 (n=3). As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I....................................................................................53 FIGURA 13. Valores de degradabilidade (% do N incubado) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum), nas 24, 48, 72 e 96 horas aps incubao do ensaio 5 (n=6). As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I....................................................................................54 FIGURA 14. Taxa de degradao do nitrognio ( /h) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios 2, 3, 4 e 5. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I. ....55 FIGURA 15. Valores de r (%) das taxas de degradao do nitrognio do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios 2, 3, 4 e 5. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro......................................................56 FIGURA 16. Degradabilidades mdias (% N incubado), das amostras incubadas com uso de inibidores in vitro. Amostras com antimicrobiano = Am; Az20 = azevm com 20% de inoculo; Az50 = azevm com 50% de inoculo; Az100 = azevm com 100% de inoculo; Fs20 = farelo de soja com 20% de inoculo; Fs50 = farelo de soja com 50% de inoculo; Fs100 = farelo de soja com 100% de inoculo; ....................................................................................57 FIGURA 17. Taxa de solubilizao do N das amostras de farelo de soja durante 3 horas de incubao. ............................................................................................................................58 FIGURA 18. Taxa de solubilizao do N das amostras de farinha de carne e ossos durante 3 horas de incubao. ..............................................................................................................58
FIGURA 19. Taxa de solubilizao do N das amostras de azevm durante 3 horas de incubao. ............................................................................................................................59 FIGURA 20. Taxa de degradao do nitrognio ( /h) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaio 3 in vitro, calculado com e sem amido e in situ. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade...................................................................................................................60 FIGURA 21. Degradabilidade da PB (%) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios ensaio 5 in vitro, calculado com e sem amido e in situ. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. ......................................................................................................................61 FIGURA 22. Correlao entre os valores de degradabilidade protica ruminal, encontrada in vitro e in vivo com azevm (Lolium multiflorum) e grama-paulista (Cynodon dactilon var. dactylon). .............................................................................................................................62
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Resumo dos ensaios in vitro conduzidos no desenvolvimento da metodologia:.29 TABELA 2. Composio qumica das amostras experimentais:............................................ 30 TABELA 3. Mdias de degradabilidade, taxas de degradao, e r ao longo do tempo do farelo de soja (FS), farinha de carne (FC), e azevm (AZ) (Lolium multiflorum), nos ensaios 2 e 31....................................................................................................................................... 47 TABELA 4. Mdias de degradabilidade, taxas de degradao, e r ao longo do tempo do farelo de soja (FS), farinha de carne (FC), e azevm (AZ) (Lolium multiflorum), nos ensaios 4 e 51....................................................................................................................................... 48
LISTA DE APNDICES
APNDICE A Valores individuais de degradabilidade do farelo de soja, farinha de carne e azevm as 24 e 48 horas, nos cinco ensaios .......................................................................... 78 APNDICE B Valores individuais de degradabilidade do farelo de soja, farinha de carne e azevm as 72 e 96 horas, nos cinco ensaios .......................................................................... 80 APNDICE C Valores individuais de taxa de degradao protica e seus coeficientes de determinao (r) do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos cinco ensaios ................82 APNDICE D Valores individuais de degradabilidade e taxa de degradao protica do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos mtodos in situ, in vitro sem amido e in vitro com amido ...........................................................................................................................84 APNDICE E Valores individuais de taxa de degradao protica do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos mtodos in situ e in vitro, do ensaio 3, calculadas sem amido e com amido...................................................................................................................................85 APNDICE F Valores individuais de desaparecimento de N solvel em tampo boratofosfato em 3 horas e seus respectivos valores transformados em logaritmo...........................87 APNDICE G Valores individuais de degradabilidade de forragens, calculados com base na taxa de degradao da protena obtida in vitro, no fracionamento do nitrognio, com 2% de taxa de passagem..................................................................................................................88
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A. Composio do meio de cultura 1 ...................................................................... 90 ANEXO B. Composio do meio de cultura 1 ...................................................................... 91 ANEXO C. Composio do meio de cultura 1 ...................................................................... 92 ANEXO D. Descrio da metodologia adotada para determinao de aminocidos no lquido ruminal................................................................................................................................. 93
SUMRIO
1 INTRODUO ...............................................................................................................15 2 HIPTESE ......................................................................................................................17 2.1 Hiptese geral ...............................................................................................................17 2.2 Hipteses secundrias...................................................................................................17 3 ESTUDO BIBLIOGRFICO .........................................................................................18 3.1 Protena na nutrio.....................................................................................................18 3.2 Degradao da protena ............................................................................................... 18 3.3 Valor protico dos alimentos estimado por modelos matemticos .............................20 3.4 Mtodos para estimar a degradao protica .............................................................22 3.4.1 Mtodo in vivo:............................................................................................................ 22 3.4.2 Mtodo in situ: ............................................................................................................ 24 3.4.3 Mtodo in vitro:........................................................................................................... 25 4 MATERIAL E MTODOS ............................................................................................28 4.1 Local e poca.................................................................................................................28 4.2 Material experimental ..................................................................................................28 4.3 Desenvolvimento da metodologia.................................................................................30 4.3.1 Ensaios in vitro/gases ..................................................................................................30 4.3.2 Ensaio in vitro de curta durao...................................................................................32 4.3.3 Ensaio de solubilizao do nitrognio .......................................................................... 33 4.3.4 Ensaio in situ ...............................................................................................................33 4.3.5 Avaliao do mtodo in vitro.......................................................................................34 4.4 Anlises qumicas ......................................................................................................... 36 4.5 Clculos e estimativas...................................................................................................36 4.5.1 Correo da concentrao de amnia no meio de incubao pela incluso de amido ....36 4.5.2 Clculo da degradabilidade in vitro da protena bruta...................................................38 4.5.3 Clculo da taxa de degradao in vitro da protena bruta..............................................39 4.5.4 Clculo da taxa de degradao in situ .......................................................................... 39 4.5.5 Clculo da taxa de solubilizao do N.......................................................................... 40 4.5.6 Estimativa da degradabilidade efetiva in vitro e in situ.................................................41 4.6 Anlises estatsticas ...................................................................................................... 42 5 RESULTADOS................................................................................................................44 6 DISCUSSO....................................................................................................................63 6.1 Efeito do tamanho da amostra .....................................................................................63 6.2 Efeito da composio do meio de incubao................................................................ 63 6.3 Efeito do tratamento prvio das amostras...................................................................65 6.4 Efeito da incluso de amido para obteno dos valores de degradabilidade ............. 66
6.5 Uso de inibidores in vitro para estimativa da degradabilidade protica ....................66 6.6 Comparao do mtodo in vitro com os mtodos in situ e in vivo ............................... 67 7 CONSIDERAES FINAIS ..........................................................................................68 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................... 69
1 INTRODUO
O suprimento de aminocidos absorvidos no intestino dos ruminantes provm da frao protica no degradada no rmen e principalmente da protena de origem microbiana, que por sua vez formada a partir da protena degradvel no rmen (PDR). A PDR fornece peptdeos, aminocidos livres e amnia para o crescimento microbiano. Se a quantidade de protena degradada excede disponibilidade de carboidratos fermentveis, grande quantidade de nitrognio no utilizado pelos microorganismos ruminais pode ser perdida na forma de amnia (NOCEK; RUSSEL, 1988). Essa amnia absorvida na parede ruminal para a corrente sangunea e convertida em uria no fgado. A uria pode ser reciclada atravs da saliva ou ser excretada na urina (VAN SOEST, 1994; HUNTINGTON; ARCHIBEQUE, 1999). Com o objetivo de evitar perdas excessivas de nitrognio na forma de uria pela urina busca-se o conhecimento da degradabilidade da protena para formulao de dietas equilibradas, que possibilitem uma sincronia na disponibilidade dos nutrientes fermentao ruminal e capazes de suprir as exigncias dos animais. Dessa forma evitam-se as perdas de nitrognio para a atmosfera, reduzindo os custos de produo e os impactos causados ao meio ambiente. No entanto, para que isso possa ser alcanado, necessita-se de mtodos eficientes para determinar a degradabilidade da protena no rmen. Os mtodos in vivo e in situ so os mais utilizados para estimar a degradao da protena no rmen. Entretanto, estimativas realizadas in vivo, alm de serem mais demoradas, tm custo elevado e necessitam de um grande nmero de animais fistulados (TAMMINGA; CHEN, 2000). J o mtodo in situ, que consiste na suspenso de sacos de nilon com amostra diretamente no rmen, no exige um grande nmero de animais, entretanto ainda limitado o nmero de amostras que podem ser analisadas com esse procedimento. Alm disso, esse mtodo criticado pela interferncia nos resultados de desaparecimento de nitrognio causada pela contaminao microbiana da amostra e pela necessidade de padronizao da tcnica, pois existe muita variabilidade entre os laboratrios em funo de aspectos relacionados conduo dos ensaios (LPEZ, 2005; HVELPLUND; WEISBJERG, 2000; NOCEK, 1988). Tm sido propostos mtodos alternativos in vitro para a estimativa da degradabilidade protica (RAAB, 1983; LANA, 2000; HERNNDEZ 2002; LANA, 2007; BRODERICK; CLAYTON, 1992), ensaios que utilizam inibidores de crescimento microbiano
16 (BRODERICK, 1987; HERNNDEZ, 2002) e uso de enzimas proteolticas
(KRISHNAMOORTHY et al., 1983; BARTLE et al., 1986; KOHN; ALLEN, 1995). O mtodo baseado na produo de gases proposto por Raab foi criado em 1983, quando as incubaes ainda eram realizadas em seringas, utilizando quantidades de amostras relativamente pequenas, o que pode aumentar a variabilidade entre as estimativas. Nesse mtodo a degradabilidade da protena era estimada com a determinao de nitrognio amoniacal pelo mtodo Kjeldahl, sendo analisadas as amostras somente aps o trmino da incubao, nas 24 horas, sem verificar a taxa de liberao de amnia no meio de incubao durante esse tempo. Em vista disso, o presente estudo teve o objetivo de desenvolver e avaliar um mtodo para estimar a degradabilidade da protena com base na taxa de liberao de amnia, ao longo de 96 horas, atravs da tcnica semi-automatizada de produo de gases in vitro.
2 HIPTESE
2.1 Hiptese geral
A degradabilidade ruminal da protena pode ser estimada por um mtodo in vitro com base na produo de gases, onde se mede a liberao de nitrognio amoniacal no meio de incubao.
2.2 Hipteses secundrias
O tamanho da amostra, a presena de uma fonte de nitrognio no meio de incubao e/ou o processamento da amostra podem interferir nas variveis de degradacao proteica obtidas in vitro. As variveis de degradao proteica obtidas com base na liberao de amnia in vitro devem ser corrigidas para a frao da amnia captada pelas bactrias atravs da incluso de amido no meio de incubao.
3 ESTUDO BIBLIOGRFICO
3.1 Protena na nutrio
Protenas so compostos orgnicos de estrutura complexa e de elevado peso molecular, fornecem a base estrutural dos tecidos e rgos dos animais, formam neurotransmissores e hormnios poliptdicos, como por exemplo, a insulina (TAMMINGA; CHEN, 2000). Tambm exercem funo enzimtica, energtica e de defesa (anticorpos). As protenas encontradas dentro do ncleo da clula (DNA) transmitem as informaes genticas e so responsveis pela sntese protica contnua. Alm disso, os protdeos so responsveis pelos mecanismos contrteis (actina e miosina). So compostas por aminocidos como unidades fundamentais, os quais esto unidos por ligaes peptdicas que se estabelecem entre o grupo amina de um aminocido e o grupo carboxilo de outro aminocido, com a perda de uma molcula de gua. Embora na natureza existam mais de 300 aminocidos, apenas 20 desses esto presentes na estrutura das protenas, e para fins nutricionais, so classificados como aminocido essenciais (AAE) e aminocidos no essenciais (AANE). Os AAE no so sintetizados pelo organismo animal, ou sintetizados em quantidades inferiores s exigncias. A eficincia da utilizao da protena metabolizvel pelos ruminantes depende do teor e da proporo de AAE que chegam ao intestino.
3.2 Degradao da protena
A degradao da protena dos alimentos no rmen tem grande importncia no suprimento de aminocidos para os animais ruminantes, e ocorre atravs da ao de enzimas (proteases, peptidases e deaminases) secretadas pelos microorganismos ruminais (figura 1) (KOZLOSKI, 2002). A PDR composta de protena verdadeira e nitrognio no protico (NNP). A protena verdadeira pode ser degradada em peptdeos e aminocidos (AA), os quais podem ser deaminados em amnia (NH3) ou incorporados protena microbiana. O nitrognio no protico composto de cidos nuclicos, NH3, AA, e pequenos peptdeos. Os peptdeos,
19 AA e a NH3 so utilizados como fonte de N pelos microorganismos do rmen (BACH et al., 2005). A massa microbiana, por sua vez, ser a principal fonte de aminocidos que chega ao intestino delgado, representando 45 a 55% da protena metabolizvel. A protena no degradada no rmen (PNDR) pode significar uma segunda fonte de aminocidos disponveis ao animal (SANTOS, 2006).
P RO T E N AS proteases PO LIP EP TD EOS peptidases O LIG O PE PT D E O S peptidases AM IN O CID O S deam inases N -N H 3 P RO T E N A M IC RO BIAN A AG V
Figura 1. Esquema da degradao protica no rmen.
O conhecimento sobre a degradao da protena dos alimentos fundamental para que se chegue a nveis ideais de PDR, o que otimizaria o crescimento microbiano e levaria a encontrar quantidades de PNDR que complementaria as exigncias nutricionais dos ruminantes (NRC, 2001). Adicionalmente, um melhor equilbrio na oferta de PDR levaria uma menor perda de compostos nitrogenados, evitando a produo em excesso de amnia e sua liberao na forma de uria pela urina, reduzindo assim o impacto ambiental. A degradabilidade protica ruminal pode ser afetada por vrios fatores, tais como a composio qumica e fsica da protena bruta (PB). O valor de PB dos alimentos considera o total de nitrognio (N), incluindo o nitrognio protico e outros compostos nitrogenados no proticos como aminas, amidas e aminocidos. A maior parte do nitrognio da planta est em forma de aminocidos formando protena. A proporo de nitrognio no protico (NNP) varia de 23 a 30% do nitrognio total. Considera-se que o NNP rapidamente e totalmente degradado no rmen, e tanto gramneas como leguminosas, possuem teores substanciais dessa
20 frao em sua composio. A presena de altos nveis de compostos secundrios nas plantas, como os taninos, tambm podem modificar a fermentao da frao protica. A estrutura globular, a presena de ligaes dissulfeto na protena e o pH ruminal interferem a atividade proteoltica microbiana, bem como o acesso microbiano protena, dificultando sua a degradabilidade. Alm disso, o aumento da taxa de passagem, causado pela maior ingesto de matria seca est inversamente correlacionado com a quantidade de PDR. O processamento de certos tipos de alimentos tem como objetivo diminuir a degradabilidade ruminal da protena e aumentar a oferta de aminocidos para a digesto intestinal. Entretanto, algumas praticas adotadas, como o aquecimento excessivo, provocam a formao de complexos proticos (reao de Maillard), afetando negativamente a digesto tanto a nvel ruminal como tambm ao longo de todo o trato digestivo dos animais.
3.3 Valor protico dos alimentos estimado por modelos matemticos
Os modelos matemticos baseiam-se na estimativa das exigncias nutricionais de diferentes espcies e categorias de ruminantes, preconizando a melhor eficincia de utilizao dos nutrientes, a fim de reduzir os custos e os impactos ambientais provocados pelas criaes (TEDESCHI et al., 2005). Por muito tempo, as exigncias proticas para a formulao de raes, foram baseadas no teor de protena bruta dos alimentos, no entanto, o potencial de produo individual dos animais vem aumentando e torna-se cada vez mais importante levar em considerao no s a quantidade de protena, mas principalmente o perfil de aminocidos essenciais que chega ao intestino para serem absorvidos (SANTOS, 2006). Com base nisso, em todo o mundo tem sido publicado novos sistemas proticos para estimar as exigncias dos ruminantes. Um dos importantes avanos cientficos empregados para a obteno das exigncias proticas dos ruminantes, foi a introduo do conceito de protena metabolizvel (PM) para predizer a produo de protena microbiana (PMic), pelos sistemas de Burroughs et al. (1974), Institut National de la Recherche Agronmica (INRA, 1989), Agricultural Research Council (ARC, 1980), e do National Research Council (NRC, 1985). O sistema de PM comeou a ser posto em prtica pelo NRC bovino de leite de 1989 e 2001 (NRC, 1989; 2001), e em 1996 para bovinos de corte (NRC, 1996; 2000). O NRC baseia-se no suprimento de protena metabolizvel mediante diviso da protena bruta em duas fraes (PDR e PNDR), separando
21 as exigncias do rmen das do animal (NRC 2000; 2001). Atravs de valores bromatolgicos tabulados, o modelo estima o valor protico com base na composio qumica de determinado alimento, sendo assim classificado como de nvel 1. Esse sistema baseia-se em clculos estticos e deterministas de degradao dos carboidratos e protenas, e produo de protena microbiana, no levando em considerao a mantena dos microorganismos e a reciclagem do N no rmen (TEDESCHI et al., 2005). O Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) publicado em 1992 (RUSSEL et al., 1992) um modelo mecanicistico que leva em considerao a fermentao ruminal, crescimento microbiano, taxa de digesto e passagem do alimento, bem como seu nvel de energia digestvel com base na sua composio bromatolgica e condies fisiolgicas do animal, com o objetivo de avaliar a dieta e o desempenho animal em diferentes situaes. Alm de utilizar o modelo do nvel 1 para predizer as exigncias proticas, o CNCPS tambm adota uma forma mais dinmica, denominada nvel 2, onde compara as taxas de digesto e de passagem de cada uma das fraes dos carboidratos e protenas (fraes A, B1, B2, B3, e C), que so determinadas quimicamente (FOX et al., 2004). Dessa forma, o modelo estima a quantidade de matria orgnica fermentada no rmen, a sntese de protena microbiana, a produo de amnia, PDR e PNDR, digesto intestinal e disponibilidade de energia e protena metabolizvel. O valor protico dos alimentos e os requerimentos dos animais estimados pelo INRA (1989) so expressos em protena verdadeiramente digerida e absorvida no intestino delgado (PDI), sendo essa a soma da frao verdadeiramente digerida da PNDR (PNDRDI) e da protena microbiana (PMDI). Esse sistema calcula dois valores de PMDI, sendo a protena microbiana verdadeira que pode ser produzida mediante a disponibilidade de N ou aquela sintetizada a partir da energia disponvel do alimento. A estimativa da PDI feita com base na quantidade de PB, na degradabilidade da PB, na matria orgnica fermentvel (MOF) e digestibilidade intestinal da protena verdadeira indegradvel no rmen dos alimentos, sendo adotado o mtodo in situ para a estimativa dos parmetros de degradabilidade. Na estimativa de PMDI, o modelo no considera o nitrognio reciclado e assume que os aminocidos correspondem a 80% da protena microbiana, sendo que estes aminocidos teriam uma digestibilidade intestinal de 80%. Nos alimentos energticos, a protena microbiana estimada como 145 g /kg de MOF e nos proticos, como 90% da PB. O sistema Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO) (1990) estima a degradabilidade protica atravs de equaes empricas baseadas no contedo de FDN e PB dos alimentos. estimado uma produo de PMic de 170 g / kg de MO
22 digestvel para leguminosas em estgio inicial de crescimento e gramneas, 130 g / kg de MO digestveis para misturas de alimentos e 95 g / kg de MO para silagens. O modelo considera que 56% da PMic produzida se tornar em PM, e que uma possvel falta de N degradvel no rmen, ser suprida pelo N endgeno reciclado. O Agricultural and food research council (AFRC, 1993) foi desenvolvido com base na reunio de equaes j publicadas no Agricultural research council (ARC, 1980) e AFRCs de 1990, 1992, 1991 e 1991. A sntese de protena microbiana computada como gramas / MJ de energia metabolizvel fermentada e assume que a PMic contm 75% de aminocidos, o quais possuem uma digestibilidade intestinal de 85%, resultando um total de 63,75% de PM da PMic. Esses valores tambm so corrigidos para o nvel de consumo. Esse modelo assume que a sntese microbiana est condicionada a frao rapidamente degradvel (N solvel em gua) e potencialmente degradvel no rmen, determinada pela taxa de degradao e taxa de passagem a qual influenciada pelo nvel de consumo. O nitrognio reciclvel no computado e estima-se que a PNDR tem uma digestibilidade intestinal de 90% depois de descontado o teor de protena insolvel em detergente cido.
3.4 Mtodos para estimar a degradao protica
Os modelos de clculo de rao necessitam de estimativas confiveis da taxa de degradao da frao protica, para que junto s taxas de degradao de carboidratos, possa ser estimada a quantidade de matria orgnica digerida no rmen, a produo microbiana, produo de amnia, a frao no degradada no rmen e a digesto intestinal. As medidas de taxa de degradao podem sem gravimtricas, que se baseia no desaparecimento da amostra incubada in situ ou in vitro, e medidas metablicas, que mede os produtos finais da degradao (PELL et al., 1994). Alm disso, a degradabilidade protica pode ser obtida atravs de experimentos realizados diretamente nos animais (in vivo).
3.4.1 Mtodo in vivo:
23 A forma utilizada para medir a degradao protica in vivo baseia-se na utilizao de animais preparados cirurgicamente com fstula duodenal reentrante ou do tipo T. A protena total que passa pelo duodeno proximal medida e amostrada, e a frao protica proveniente dos microorganismos ruminais pode ser determinada pelo uso de marcadores . Como marcadores, so utilizados cidos nuclicos (RNA, DNA), purinas, amino cidos (2,6 cido diaminopimelico (DAPA), D-alanina), e istopos como sulfrico-35 (P35), fsforo-32 (P32) e nitrognio-15 (N15). A estimativa de nitrognio de origem microbiana (NM) no nitrognio no amoniacal do intestino atravs da seguinte relao:
NM = marcador na digesta marcador nos microorganismos Teor de N dos microorganismos
(1)
Depois de descontadas as quantidades de N amoniacal ( N-NH3) e NM do N total da digesta duodenal estimada a degradabilidade protica com base no valor de N residual, composto pelo N de origem do alimento no degradado no rmen e N endgeno. A principal limitao desse mtodo em estimar a degradao protica pela dificuldade de separar o N de origem endgena da PNDR. Entretanto, muitos pesquisadores assumem esse erro e calculam a PDR com base no N consumido (CN) e fluxo de N no duodeno conforme a equao abaixo:
PDR = CN (N total (NM + N-NH3))
(2)
Teoricamente, essa tcnica a mais confivel para a medida da degradabilidade protica, no entanto ela tem muitas desvantagens, pois invasiva e de elevado custo. Em animais recebendo dieta compostas com mais de um tipo de alimento, impossibilitam a utilizao dessa tcnica, e por se tratar de ruminantes, maior a dificuldade de estimar isoladamente a degradao de um alimento concentrado. A medida do fluxo de digesta intestinal um processo laborioso (REYNOLDS et al., 1994; PONCET et al., 1995), demanda muito tempo (STERN et al., 1994) e o processo cirrgico de canulao pode alterar as taxas de fluxo normais (SUTTON; OLDHAM, 1977; FAICHNEY, 1993). Outra limitao a medida com acurcia da protena microbiana. Como alternativa, o mtodo de esvaziamento ruminal, quando conduzido com cuidado para diferentes tempos aps a alimentao e com uso de marcadores, pode resultar em boas informaes a respeito da dinmica da degradao e sntese microbiana ruminal.
24
3.4.2 Mtodo in situ:
Proposto por Mehrez e rskov, em 1977, o mtodo in situ o mais amplamente utilizado nos estudos de degradabilidade da frao nitrogenada dos alimentos para utilizao em sistemas de predio de exigncias nutricionais em ruminantes (NRC, 1996; AFRC, 1992). Baseia-se no desaparecimento do nitrognio da amostra incubada em saquinhos de polister, diretamente no rmen. Se comparada com o in vivo, considerada uma tcnica de fcil e rpida execuo, necessita pouca quantidade de alimento, alm de possibilitar o acompanhamento da degradao ao longo do tempo. Com isso, embora a amostra no passe os processos de mastigao, ruminao e escape ruminal, esse mtodo o mais utilizado para estudos desta natureza. Entretanto, fatores como, a necessidade de animais fistulados no rmen, o tipo de dieta desses animais, a quantidade e granulometria da amostra a ser incubada, o tamanho e a porosidade do saquinho, devem de ser levados em considerao, pois influenciam nos resultados. Em geral, na lavagem dos saquinhos que correspondem ao tempo zero, ocorrem perdas significativas de amostra, o que superestima a frao prontamente solvel do nitrognio. Outro aspecto negativo a contaminao do resduo da incubao pelos microorganismos aderidos s partculas, sendo uma das maiores fontes de erro para a estimativa da taxa de degradao ruminal da protena (NOCEK, 1988; VANZANT et al., 1998). Alm disso, discutida a barreira fsica que os saquinhos representam ao acesso dos microorganismos amostra, podendo ocasionar sua degradao incompleta (LPEZ, 2005), e alguns estudos afirmam que a populao microbiana, bem como a atividade proteoltica no interior dos saquinhos diferente daquela no ambiente ruminal (MICHALET-DOREAU & NOZIERE, 1998; HUHTANEN, 1998). Em 1979 rskov e McDonald propuseram um modelo para estimar a cintica da degradao dos alimentos, pressupondo a diviso da protena em trs fraes: A, B e C. A primeira, corresponde a todo nitrognio no protico e protena solvel do alimento, sendo a poro totalmente e rapidamente solvel no rmen. A frao B aquela potencialmente solvel, que sofrer degradao durante todo o tempo de incubao. E por ltimo, C a frao indegradvel no rmen. O modelo expresso pela seguinte equao linear:
c*t
P= a + b * (1-exp )
(3)
25
Onde: P = degradabilidade potencial da protena;

t
= tempo de incubao
a = representa o substrato solvel e rapidamente degradvel; b = representa o substrato insolvel, mas potencialmente degradvel;
c
= taxa constante da funo b.
Adicionalmente, na equao acima foi includa a taxa de passagem do alimento para estimar a degradabilidade efetiva.
Degradabilidade efetiva = a+ ((b c) / (c + k))
(4)
Onde: k = taxa de passagem das partculas slidas do rmen.
Aps a determinao das fraes A, B, C, taxa de passagem (kp) e obteno da taxa de degradao protica (kd) atravs do modelo acima descrito, torna-se possvel o clculo das fraes PDR e PNDR da protena de determinado alimento com as seguintes equaes (NRC, 2001):
PDR= A + B [ kd/ (kd+kp)]
(5)
PNDR = B [ kp/ (kd+kp)] + C
(6)
3.4.3 Mtodo in vitro:
A degradao ruminal fundamental para o fornecimento de nutrientes para suprir as exigncias nutricionais dos microorganismos anaerbicos e tecidos dos ruminantes. Portanto essencial o estudo da dinmica da fermentao e potencial nutritivo de vrios alimentos antes de sua utilizao na formulao de dietas. Muitos mtodos so utilizados, entretanto, alguns se tornaram indesejveis devido s implicaes ao bem estar animal. Portanto, h uma necessidade de desenvolver mtodos in vitro que no exijam a interveno cirrgica nos
26 ruminantes, ou que pelo menos as amenize par obteno do lquido ruminal em estudos de degradao protica. As tcnicas in vitro utilizadas para estimar a degradao protica baseiam-se na medida dos produtos finas da degradao, como por exemplo, o nitrognio amoniacal. Esses ensaios tm como objetivo diminuir intervenes cirrgicas em animais, e como principais vantagens podemos citar a praticidade, pois envolve menos tempo para conduo e baixo custo por no demandar de um grande nmero de animais para sua realizao. Em geral, os mtodos in vitro estimam a degradabilidade com base no aparecimento dos produtos da degradao protica no meio de incubao. Os primeiros estudos in vitro realizados para estimar a de degradao protica no rmen foram conduzidos por Little no ano de 1963, citado por Calsamiglia et al. (2000), que incubou amostras de alimentos com inoculo sob condies anaerbicas e estimou a degradao protica pela liberao de N-NH3 no meio. Mais tarde, Raab et al. (1983) desenvolveu um mtodo que se baseia na incluso de nveis crescentes de carboidratos fermentveis no meio de incubao para determinar a frao de N-NH3 utilizada pelas bactrias. Por equao de regresso relacionando as concentraes de N-NH3 nos diferentes nveis de incluso de carboidratos chegaram a um valor de liberao de N-NH3 quando a produo de gs era igual zero. Esse valor de N-NH3 foi ento considerado ser proveniente da degradao protica, incluindo a frao utilizada para o crescimento bacteriano. Broderick, em 1987, props um mtodo utilizando hidrazina e clorafenicol como inibidores do crescimento bacteriano para estimar a degradabilidade protica atravs da liberao de aminocidos e N-NH3. Em 1992, Broderick e Clayton, obtiveram resultados mais consistentes de degradabilidade protica, em duas horas, usando um modelo matemtico baseado nas equaes de Michaelis-Menten. Neutze et al. (1993) modificou o mtodo que utiliza inibidores in vitro pela estimativa da frao degradvel da protena com nitrognio solvel em cido tricloroactico. Hristov e Broderick (1994) desenvolveram um sistema utilizando
15
N para distinguir a frao protica utilizada pelos microorganismos da frao
indegradvel. Vrios estudos foram conduzidos com o objetivo avaliar o uso, em meio anaerbico, de proteases extradas de plantas e enzimas obtidas de bactrias ou fungos
(KRISHNAMOORTHY et al., 1983; BARTLE et al., 1986; AUFRRE et al. 1991). Os procedimentos enzimticos requerem o uso de enzimas obtidas comercialmente, sendo que as mais comumente usadas so a pepsina e proteases, as quais possuem um pH timo de ao,
27 mas que, no entanto no condizem com o pH ruminal (VAN SOEST, 1994). Outro problema relacionado a esse mtodo a difcil obteno de um perfil enzimtico semelhante ao que se tem no ambiente ruminal. Estudos conduzidos por Kohn e Allen (1995) revelam que o uso conjunto de enzimas proteolticas com celulolticas melhora a estimativa de degradao.
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 Local e poca
Os ensaios in vitro, in situ e in vivo (figura 2), bem como todas as anlises laboratoriais, foram conduzidos no Laboratrio de Bromatologia e Nutrio de Ruminantes, do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Santa Maria, durante o perodo de maio de 2007 a dezembro de 2008.
4.2 Material experimental
Para desenvolvimento da metodologia foram incubadas in vitro (tabela 1) e in situ amostras de farelo de soja (alta degrababilidade), farinha de carne e ossos (baixa degradabilidade) e azevm (Lolium multiflorum). A farinha de carne no foi fornecida como dieta animal, sendo usada somente em ensaios in vitro e in situ. Paralelamente, para avaliao da metodologia, foram utilizados alguns dados de amostras de azevm (Lolium multiflorum) e capim-paulista (Cynodon dactilum), testadas in vivo, onde foram oferecidas verdes, mediante corte dirio (tabela 2).
29
Figura 2 Resumo dos ensaios realizados
Tabela 1 Resumo dos ensaios in vitro conduzidos no desenvolvimento da metodologia: Quantidade de amostra 1g 15 mg N 15 mg N Meio de incubao 11 mg/dl N 11 mg/dl N sem N
Ensaio
Amido (mg)
Tratamento prvio da amostra
1 2 3
100, 200, 300 e 400 100, 200, 300 e 400 100, 200 e 300 100, 200 e 300
Amostra pura Amostra pura Amostra pura Amostra solubilizada momentos antes incubao Solubilizao de uma grande quantidade de amostra
30 mg N
8 mg/dl N
30 mg N
8 mg/dl N
30 Tabela 2 Composio qumica das amostras experimentais: Alimento Ensaios in vitro e in situ Farelo de soja Farinha de carne e ossos Azevm Ensaio in vitro e in vivo4 Azevm 1 Azevm 2 Cynodon 1 Cynodon 2
1
% MS
MO (% MS)
N (% MS)
N solvel (% N)
B (%N)
NIDA (%N)
96,7 97,5 95,2
93,1 71,4 76,0
8,26 9,67 3,09
20,0 25,4 41,5
75,6 72,7 46,3
4,4 1,9 12,2
92,4 92,6 91,7 91,5
93,0 77,7 77,4 77,4
5,11 3,94 1,77 1,91
43,3 70,8 8,0 35,2
52,5 23,2 81,5 53,4
4,2 6,0 10,5 11,4
N solubilizado aps tratamento de 3 horas em tampo borato-fosfato 4C; 2 B= N total (Nsolvel em tampo borato-fosfato + N insolvel em detergente cido); 3 NIDA = N insolvel em detergente cido; 4 Amostras obtidas de ensaios in vivo;
4.3 Desenvolvimento da metodologia
4.3.1 Ensaios in vitro/gases Foram conduzidos cinco ensaios utilizando a tcnica semi-automatizada de produo de gases in vitro (MAURCIO et al., 1999) descritos abaixo:
Ensaio 1: Foi incubado aproximadamente 1g de amostra de farelo de soja e farinha de carne e ossos, com 100 ml de fludo ruminal tamponado (THEODOROU et al., 1994), numa relao tampo/fludo ruminal de 8:2 conforme Goering & Van Soest (1970) (ANEXO A). As amostras foram incubadas anaerobicamente, em triplicatas, em frascos de vidro (capacidade de 160ml) vedados com tampas de borracha. O lquido ruminal foi obtido de bovinos fistulados no rmen, recebendo pastagem de azevm (Lolium multiflorum) vontade. Aps a coleta, o lquido foi filtrado atravs de duas camadas de gaze sob injeo contnua de CO2 e mantido em banho-maria a 39 C. Os frascos foram vedados e incubados a 39C em estufa de ar forado.
31 Para estimar a taxa de degradao da protena foi coletado 0,5 ml do contedo de cada garrafa, nos tempos 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72 e 96 horas aps a incubao, com auxlio de uma seringa de 1mL com agulha. Esse contedo era transferido para frascos eppendorf, imediatamente adicionado 1,5 ml de uma soluo de cido sulfrico 0,36 molar e refrigerado para posterior determinao de nitrognio amoniacal.
Ensaio 2: Foi conduzido utilizando-se os mesmos procedimentos do Ensaio 1, exceto que a quantidade de amostra incubada em cada garrafa foi modificada de modo a serem incubadas quantidades equivalentes a 15 mg de nitrognio. Foram ainda incubadas garrafas adicionais contendo, alm de cada amostra, 100, 200, 300 e 400 mg de amido (amido solvel p.a., MERCK). Adicionalmente a presso originada na parte superior dos frascos foi medida nos tempos 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72 e 96 horas aps a incubao, utilizando-se um transdutor de presso conectado a uma vlvula de trs sadas. A primeira sada foi conectada a uma agulha (0,6 mm), a qual era inserida na tampa de borracha, a segunda ao transdutor de presso e a terceira permanecia livre sendo utilizada para retirada dos gases do interior dos frascos a cada leitura, at presso nula. Os valores de presso foram convertidos em volume de gs utilizando-se equao previamente determinada (SENGER, 2005): y = - 0,0593x2 + 5,01x 0,4694 .
(7)
A produo de gs em cada tempo era corrigida para a produo de gs mdia obtida de frascos contendo fludo ruminal tamponado sem amostra (brancos).
Ensaio 3: Foram conduzidas trs corridas utilizando-se os mesmos procedimentos do Ensaio 2, exceto que o tampo utilizado no meio de cultura foi modificado, retirando-se bicarbonato de amnia (ANEXO B).
Ensaio 4: Foi conduzida uma corrida utilizando-se os mesmos procedimentos do Ensaio 2, exceto que: as amostras foram pesadas em triplicata e individualmente em saquinhos de
32 polister (cujo tamanho equivaleu a 25 mg de amostra/cm2) em quantidades equivalentes a 30 mg de N, os quais foram selados e, previamente incubao, foram mergulhados em uma soluo tampo borato-fosfato por 3 horas 4C. Esse procedimento foi adotado a fim de retirar a frao instantaneamente solvel do N das amostras, pois a mesma poderia estar interferindo no perfil de degradao da frao potencialmente degradvel. Foram utilizados somente trs nveis de incluso de amido (100, 200 e 300 mg) e a soluo tampo foi modificada de modo a ter uma concentrao de N de 8 mg/dl (ANEXO C). Em ensaio prvio, foi observado que a amostragem ao longo do tempo causa a diminuio gradual do volume no interior das garrafas, e conseqente diminuio na produo de gases, ento em cada coleta o volume equivalente ao retirado foi reposto com uma soluo tampo de meio sem N.
Ensaio 5: Uma quantidade de aproximadamente 50g de cada uma das amostras foi acondicionada em sacos de polister (com tamanho aproximado de 30 20 cm) e submetida ao tratamento com tampo borato-fosfato por 3 horas a 4C. Posteriormente, foram lavadas com gua corrente durante alguns minutos, secas em estufa de ar forado por 72 horas a 55C e modas (peneira com porosidade de 1 mm), obtendo-se um resduo livre de N solvel. Foram ento conduzidas duas corridas utilizando-se os mesmos procedimentos do Ensaio 4, exceto que em cada frasco foi incubado uma quantidade de resduo de cada amostra equivalente a 30 mg de N.
4.3.2 Ensaio in vitro de curta durao Foi conduzido um ensaio in vitro de curta durao (at 6 horas) para testar procedimentos que permitissem avaliar a taxa de degradao da frao solvel do N, baseando-se no uso de antimicrobianos para obteno dos produtos da degradao protica, evitando sua utilizao pelos microorganismos ruminais. Foram pesadas, em triplicatas, amostras de azevm e farelo de soja em quantidades equivalentes a 30 mg de N e colocadas em frascos de 160 ml contendo fludo ruminal (inculo) e diferentes propores de soluo tampo formulada conforme Theodorou et al. (1994). Tambm foi utilizado inibidores do crescimento bacteriano para estimativa da taxa de degradao. Como antimicrobiano, foi adicionado a cada frasco 1 mM de hidrazina, 3 g de cloranfenicol, 2 mM de mercaptoetanol e 330 mg de maltose (BRODERICK, 1987).
33 Foram testados os seguintes meios de incubao: 1. Com antimicrobiano e 20 % de inoculo 2. Com antimicrobiano e 50 % de inoculo 3. Com antimicrobiano e 100 % de inoculo 4. Sem antimicrobiano e 20% de inoculo 5. Sem antimicrobiano e 50% de inoculo 6. Sem antimicrobiano e 100% de inoculo
O lquido ruminal foi obtido de bovinos fistulados no rmen, recebendo pastagem de azevm (Lolium multiflorum) vontade. Aps a coleta, o lquido foi filtrado atravs de duas camadas de gaze sob injeo contnua de CO2 e mantido em banho-maria a 39 C. Os frascos foram vedados e incubados a 39C em estufa de ar forado. Foi medido o pH do meio de incubao em cada frasco antes e depois da incubao. Foram coletadas amostras (500ul) do contedo dos frascos aps 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 360 minutos de incubao com uma seringa de 1mL com agulha. A amostra era imediatamente transferida para tubos eppendorf contendo 1,5 ml de cido tricloroactico (TCA). Deste modo, a concentrao final de TCA foi 5%. As amostras foram centrifugadas (3000 g) e coletado o sobrenadante, o qual foi congelado para posterior anlise de N-NH3 e aminocidos .
4.3.3 Ensaio de solubilizao do nitrognio
Foi conduzido um ensaio com o objetivo de estimar a taxa de solubilizao da frao prontamente solvel do N. Foram pesadas aproximadamente 300 mg de amostra em saquinhos de nylon as quais foram submetidas em triplicata a tratamento com soluo tampo borato-fosfato, a 4C, durante 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos. Aps a retirada da soluo foi determinado o teor de N no material residual.
4.3.4 Ensaio in situ
Paralelamente aos ensaios in vitro, foi conduzido um ensaio de degradao in situ utilizando-se trs bovinos fistulados no rmen, alimentados com uma dieta a base de azevm (Lolium multiflorum) e suplementados com farelo de glten de milho (Refinazil).
34 As amostras experimentais foram secas em estufa (55 C) com ar forado por 72 horas e modas em moinho tipo Willey com peneira de porosidade 2 mm. Trs gramas de cada amostra foram pesadas em sacos de polister (10 x 10 cm e porosidade de 50m), proporcionando uma relao de 15 mg de amostra/cm2 de superfcie do saco, os quais foram selados e incubados no rmen em duplicatas por horrio. As amostras foram incubadas seqencialmente durante 3, 6, 9, 12, 24, 36, 72, 96 h, com retirada conjunta de todas as amostras ao final das 96 h de incubao. Deste modo, em cada animal foram incubados 60 saquinhos (3 alimentos 9 tempos 2 replicatas). Para a incubao, os saquinhos foram colocados dentro de sacos maiores de tecido sinttico com grande porosidade, sendo este preso a uma pea de metal, com a funo de manter os sacos na parte ventral do rmen, e fixado externamente com uma corda de nilon. Aps a retirada do rmen os sacos foram lavados extensivamente com gua corrente at esta fluir lmpida. Adicionalmente, sacos no incubados tambm foram lavados, correspondendo ao tempo zero. Aps a lavagem, todos os sacos foram mantidos submersos por 24 h em uma soluo de dissociao de bactrias (WHITEHOUSE et al., 1994). Posteriormente, foram novamente lavados em gua corrente, colocados em estufa com ar forado 55 C por 72 h, pesados e armazenados para posterior anlise.
4.3.5 Avaliao do mtodo in vitro
Os procedimentos descritos no ensaio 5 foram adicionalmente conduzidos com amostras de forrageiras utilizadas previamente em ensaios de digestibilidade in vivo, exceto que os tempos de coleta foram reduzidos ( 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas). Os ensaios in vivo foram conduzidos com ovinos machos, fistulados no duodeno, mantidos em gaiolas de metabolismo e alimentados ad libitum com azevm (Lolium multiflorum) ou capim-paulista (Cynodon dactilon var. dactylon) cortados diariamente . Os experimentos eram constitudos de perodos experimentas com 15 dias cada, num delineamento experimental Quadrado Latino 4 x 4. A sntese de protena microbiana foi estimada com base no fluxo de purinas no duodeno. A partir de uma composio de microorganismos isolados do rmen, de 78,14% de MO, 9,51 % de N e 1,56% de purinas (expressos em % de MS), obteve-se uma relao de N
35 total:purinas de 6,1. Este valor foi ento utilizado para o clculo de nitrognio microbiano, sendo que: NM= Concentrao purinas (mg/g de MS incubada) x 6,1
(8)
O fluxo de MO no duodeno foi calculado com base na excreo fecal e na concentrao duodenal de FDN da seguinte forma:
MO duodenal (g/dia)=Excreo fecal (g/dia) FDN fecal (%) / FDN duodenal (%)
(9)
O fluxo de N total foi calculado considerando o fluxo de MS duodenal e a porcentagem de N no contedo duodenal, da seguinte forma:
N duodenal (g/dia)= (N duodenal (% da MS) MS duodenal (g/dia)/100
(10)
O fluxo de N amoniacal foi calculado de acordo com a relao entre o fluxo de N total, em g/dia, e a porcentagem de N amoniacal, em relao ao N total, respectivamente:
N amoniacal (g/dia)= (N duodenal (g/dia) N amoniacal (% do N))/100
(11)
O fluxo de nitrognio microbiano foi estimado pelo produto entre a concentrao de Nm (g/gMS) e o fluxo de MS duodenal (g/dia). O fluxo N residual do alimento foi estimado como a diferena entre o fluxo de N total, N amoniacal e N microbiano:
N residual= Nt - NNH3 Nm
(12)
A degradabilidade da protena foi estimada pela diferena entre o consumo total de N (CN) e o N residual:
PDR = CN N residual
(13)
Assume-se que o N endgeno est includo no N residual do alimento.
36 4.4 Anlises qumicas
Foram determinados os teores de matria seca (MS) por secagem em estufa a 105C e cinzas por queima em mufla a 600C durante 3 horas. O teor de N total foi determinado pelo mtodo de Kjeldahl (mtodo 984.13, AOAC, 1995), modificado por usar uma soluo de cido brico 4% (p/v) como receptor da amnia livre durante a destilao, uma soluo de 0,2% (p/v) de verde de bromocresol e 0,1% (p/v) de vermelho de metila como indicador, e uma soluo padro de cido sulfrico para titulao (Kozloski et al., 2003). A anlise da concentrao de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente cido (FDA) foram realizadas em autoclave a 110C, por 40 minutos, conforme Senger et. al. (2008). O N solvel em tampo borato-fosfato e N insolvel em detergente cido (NIDA) foram analisados de acordo com Licitra et al. (1996). A concentrao de N-NH3 no meio de incubao foi determinada colorimetricamente conforme Weatherburn (1967). A concentrao de aminocidos foi determinada colorimetricamente utilizando um mtodo adaptado de Palmer e Peters (1969) (ANEXO D). Nas amostras de contedo duodenal foram determinados os teores de purinas (MAKKAR; BECKER, 1999), MS, MO e FDN. Na amostra do sobrenadante filtrado, foi analisado o teor de amnia (WEATHERBURN, 1967). O teor de N total, aminocidos e peptdeos foram determinados numa amostra reconstituda onde a relao entre amostra slida e lquido de sobrenadante era mensurada sempre obedecendo a proporo de matria parcialmente seca da digesta duodenal.
4.5 Clculos e estimativas
4.5.1 Correo da concentrao de amnia no meio de incubao pela incluso de amido
A concentrao de N-NH3 no meio de incubao foi estimada pelo mtodo proposto por Raab et al. (1983), que tem como princpio corrigir a frao incorporada pelos
37 microorganismos atravs da correlao entre os resultados de produo de gs e de concentrao de N-NH3 das amostras incubadas com os diferentes nveis de amido (Figura 3).
0 amido
100 mg amido
200 mg amido
300 mg amido
15,00 Contedo de N-NH3 (mg) na garrafa
10,00
5,00
0,00 0 -5,00 tempo (h) 20 40 60 80
Figura 3 Quantidade de N-NH3 (mg) presente em cada garrafa, em cada tempo aps incubao, da amostra de farelo de soja em um ensaio in vitro gs. As amostras foram incubadas sem amido ou com incluso de 100, 200 e 300 mg de amido por garrafa.
Mediante a incluso de amido, obtm-se uma relao inversamente proporcional de produo de N-NH3 em relao a produo de gases. Com esses resultados, para cada tempo de leitura, foi gerada uma equao de regresso que resultou na concentrao de N-NH3 quando a produo de gs fosse igual a zero (Figura 4). Portanto a liberao de N-NH3 proveniente da degradao protica no meio de incubao, em cada tempo de leitura, estimada pela intercepta da regresso gerada com as concentraes de N-NH3 de cada uma das amostras com suas respectivas incluses de amido.
38
20,0 Contedo de N-NH3 (mg) garrafa
15,0
y = -0,2907x + 17,899 R2 = 0,9953
10,0
5,0
0,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 volume de gs 25,0 30,0 35,0 40,0
Figura 4 Exemplo da reta de regresso gerada a partir das concentraes de N-NH3 de uma amostra, em relao aos respectivos volumes de gs (com amido = 0, 100, 200 e 300 mg). A intercepta da regresso de 17,89, o que corresponde a concentrao de N-NH3 quando a produo de gs for igual a zero.
4.5.2 Clculo da degradabilidade in vitro da protena bruta
A degradabilidade dos compostos nitrogenados em cada tempo de incubao foi calculada multiplicando-se a concentrao de N-NH3 (descontado o valor encontrado nos brancos) pelo volume do meio de incubao, dividido pela quantidade de nitrognio incubado.
DNIV =(( [N-NH3] - [N-NH3 Br]) volume) / NI Onde: DNIV = degradabilidade do nitrognio in vitro; [N-NH3] = concentrao de amnia medida ou estimada pela incluso de amido; [N-NH3 Br] = concentrao de N-NH3 na amostra coletada dos brancos; NI = N incubado.
(14)
A degradabilidade tambm foi calculada no ensaio in vitro com uso inibidores do crescimento bacteriano em cada horrio de coleta, da seguinte forma:
39 DNIV = ([N-NH3+N-amino] - [N-NH3+N-amino Br]) / NI Onde: DNIV = degradabilidade do nitrognio in vitro; [N-NH3+N-amino] = concentrao de N amoniacal e de aminocidos; [N-NH3+N-amino Br]= concentrao de N amoniacal e de aminocidos do branco; NI = N incubado.
(15)
4.5.3 Clculo da taxa de degradao in vitro da protena bruta
A taxa fracional de degradao protica foi estimada como o coeficiente de regresso entre o logaritmo natural da proporo indegradvel (Ln (1 DNIV)) e o tempo de incubao (horas) (BRODERICK, 1987). Um exemplo apresentado na Figura 5.
sem amido 0,200 Ln do N indegradvel 0,000 -4 -0,200 -0,400 -0,600 -0,800 -1,000 -1,200 -1,400 16 36
com amido
56
76
2
96
y = -0,0108x + 0,1473 R = 0,989 y = -0,014x + 0,1549 R = 0,9885

2
tempo (h)
Figura 5 Logaritmo natural da frao indegradvel do nitrognio de amostras incubadas com e sem amido, ao longo de 96 horas de incubao.
4.5.4 Clculo da taxa de degradao in situ
40 Os valores do desaparecimento de N das amostras, ao longo do tempo de incubao, foram ajustados ao modelo de rskov e McDonald (1979) para clculo das taxas de degradao, conforme equao a seguir:
c*t
P= a + b (1-exp )
(16)
Onde: P = degradabilidade potencial do alimento;

t
= tempo de incubao
a = representa o substrato solvel e rapidamente degradvel; b = representa o substrato insolvel, mas potencialmente degradvel;
c
= taxa constante da funo b.
Os resultados de taxa de degradao foram obtidos com auxlio do programa Ficurve, conforme programa criado pela International Feed Resources Unit (2004).
4.5.5 Clculo da taxa de solubilizao do N
A solubilidade do N foi calculada como a proporo que desapareceu da amostra a vrios tempos de tratamento com soluo tampo (Figura 6):
NS = (Ninc Nres)/Nsol total Onde: NS = nitrognio solvel (proporo do N solvel total); Ninc = teor de nitrognio da amostra (inicial); Nres = teor de nitrognio no material residual; Nsol total = nitrognio solvel total aps 4 horas em soluo tampo.
(17)
A taxa fracional de desaparecimento do N solvel foi estimada pelo coeficiente de regresso do logaritmo natural da proporo da frao solvel no solubilizada (ln (1 NS)) em 3 horas de incubao no tampo borato-fosfato.
41
FS 10 9 8 N residual (% APS) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0,5 1
FC
AZ
1,5 tempo (h)
2,5
Figura 6 Teores de nitrognio residual das amostras de farelo de soja (FS), farinha de carne e ossos (FC) e Azevm (AZ), aps solubilizao em tampo, ao longo do tempo.
4.5.6 Estimativa da degradabilidade efetiva in vitro e in situ
Foi calculada a degradabilidade efetiva (DE) dos alimentos com os resultados obtidos in vitro, com e sem amido, e in situ, atravs da seguinte equao (RSKOV; MCDONALD, 1979):
Degradabilidade efetiva = A+ ((B c) / (c + k))
(18)
Onde: a = representa a frao solvel e rapidamente degradvel; b = representa a frao insolvel, mas potencialmente degradvel; c = taxa de degradao da frao b; k = taxa de passagem das partculas no rmen (5 %/h)
42 Nas amostras incubadas in vitro, os valores da frao a foram determinados aps a solubilizao em tampo borato-fosfato por 3 horas a 4C, enquanto que no mtodo in situ esta frao correspondeu ao N que desapareceu das amostras no tempo zero. Os valores de degradabilidade efetiva do ensaio in situ foram obtidos com auxlio do programa Fitcurve, enquanto que do in vitro foi calculado manualmente pela equao acima. Para comparar com o mtodo in vivo, no clculo da degradabilidade efetiva das amostras de azevm e cynodon incubadas in vitro, utilizou-se a taxa de passagem para forragens encontrada pela equao ( Fox et al., 2004): Kpf=(0,38+(0,022*CMS*1000/PV0,75)+2*1/100)
(19)
Onde: Kpf = taxa de passagem da forragem expressa em %/ hora; CMS = consumo de matria seca ( kg / dia); PV0,75 = peso metablico (kg);
4.6 Anlises estatsticas
Os resultados de degradabilidade, taxa de degradao e seus coeficientes de determinao foram submetidos anlise de varincia considerando o seguinte modelo matemtico:
Yij(k)= + i + j + ()ij + ij Onde: Yi = varivel dependente = media das observaes i = efeito do tratamento (i.e. tamanho da amostra; composio do meio de incubao; tratamento prvio da amostra ou correo pelo amido) j = efeito dado tipo de amostra = efeito da interao tratamento vs tipo de amostra i = erro experimental
43 O ensaios foram comparados pelo teste F, onde foi avaliado o efeito da quantidade de amostra incubada (ensaio 1 vs ensaio 2), a presena ou ausncia de uma fonte de N (bicarbonato de amnio) no meio de incubao (ensaio 2 vs ensaio 3) e o tratamento prvio da amostra antes da incubao (ensaio 4 vs ensaio 5). Os resultados de degradabilidade e das taxas de degradao da protena obtidas com e sem correo pelo uso de amido para cada amostra e em cada ensaio foram comparadas pelo teste t para dados pareados. Os resultados de degradabilidade in vitro e in situ foram comparados pelo teste de Tukey, a nvel de 5 % de probabilidade. Os resultados de degradabilidade in vitro foram comparados com os obtidos in vivo pelo teste t para dados pareados e, adicionalmente, relacionados por regresso linear simples. Todas as anlises estatsticas foram realizadas utilizando-se o programa estatstico SAS (2001).
5 RESULTADOS
O efeito da quantidade de amostra utilizada no meio de incubao foi avaliado comparando-se os resultados de degradabilidade (Figura 7), taxa de degradao (Figura 8) e r da taxa de degradao (Figura 9) entre os ensaios 1 e 2. Com exceo da degradabilidade 24 horas de incubao, a qual foi mais alta (P<0,05) no ensaio 2, todas as demais variveis analisadas foram similares nos dois ensaios.
D24hsa 120 100 80 60 40 b 20 0 1 a a a
D48hsa
D72hsa
D96hsa
degradabilidade (% do N incubado)
a a
a a
a a
2 ensaio
Figura 7 Degradabilidade mdia de amostras de farelo de soja e farinha de carne 24, 48, 72 e 96 horas de incubao in vitro (sem correo do nitrognio pelo uso de amido) obtida nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I.
45
0,025 taxa de degradabilidade ( /h) 0,02 0,015 0,01 0,005 0 1 ensaio 2
Figura 8 Valores mdios de taxa de degradabilidade ( /h) nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 ensaio 2
Figura 9 Valores mdios de r das taxas de degradao nos ensaios 1 e 2. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro.
r das taxas de degradao (%)
46 Na tabela 3 encontram-se os resultados de degradabilidade em diferentes tempos, taxa de degradao e seus coeficientes de determinao (r), dos ensaios 2 e 3. Todos os resultados, com exceo da degradabilidade as 24 horas e o r corrigidas pela utilizao do amido, no sofreram efeito de ensaio, entretanto na maioria, houve efeito da interao entre ensaio e amostra (P<0,01). A degradabilidade protica do azevm, nas 24, 48, 72 e 96 horas, calculadas com e sem correo pelo uso do amido e a taxa de degradao sem uso de amido foram superiores no ensaio 2 (P<0,01). Entretanto os valores de r com correo pelo amido foram melhores no azevm no ensaio 3. J os valores de degradabilidade da farinha de carne e ossos foram superiores s 24, 48 e 96 horas com uso amido, bem como em 72 e 96 horas e taxa de degradao sem amido. Da mesma forma os valores de degradabilidade do farelo de soja foram maiores nas 72 horas. Os resultados obtidos com o tratamento prvio de retirada da frao solvel do nitrognio da amostra esto na tabela 4. Com exceo da degradabilidade s 48 horas e valores de r, corrigidos pela incluso de amido, para todos os demais resultados houve interao entre ensaio e amostra (P<0,01). Nas amostras de farelo de soja, as degradabilidades as 24 e 48 horas, corrigidas ou no pelo amido, e a taxa de degradao sem amido foram maiores no ensaio 4 (P<0,01). Da mesma forma, para o azevm, as degradabilidades, s 24, 48, 72 e 96 horas sem amido, s 24 e 72 horas com amido e ambas as taxas de degradao foram superiores no ensaio 4 (P<0,01). No entanto os resultados obtidos com a incubao de farinha de carne no foram diferentes entre os ensaios.
47
Tabela 3 Mdias de degradabilidade, taxas de degradao, e r ao longo do tempo do farelo de soja (FS), farinha de carne (FC), e azevm (AZ)
(Lolium multiflorum), nos ensaios 2 e 31. Ensaio 2 DP3 DP AZ 25,2b 11,0 9,3 16,0 10,8 16,9
b
Varivel2 FCO 30,3 9,1 20,4 12,5 30,0 16,4 37,9 20,3 40,3 0,009 0,012 6,6 8,8 93,2 0,03 93,0 0,03 88,9 91,3 82,6 93,4 91,5 0,032
a
Ensaio 3 FS 38,6 40,5 66,1 67,0 84,8a 73,8 102,2a 100,1a 0,033a 87,7a 62,1b 79,6 73,5b 83,1b 0,016b 0,023 96,4 95,0a 33,4 63,3 62,8a
b
P4 E ns ** ns ns ns E*A ** ** ** ** **
D24hsa 49,7 49,1 44,5b 60,6b 62,0 64,3b 66,9b 0,013b 0,014 90,3 90,0 84,1b 0,031 94,4 130,3 106,9a 142,6a 0,034a
a a
FS 34,1 75,0 76,4a 109,4a 94,1a

a
AZ 46,4a 35,2 47,3b 67,0b

b
FCO 36,2
D24hca D48hsa D48hca
35,9 60,7 57,5
D72hsa
63,7b
D72hca D96hsa D96hca TxDsa
53,5 72,6 63,9 0,017
18,0 19,6 17,0 0,015 0,013 6,3 5,5
ns ns ns ns ns ns **
** ** ** ** ns ns ns
TxDca Rsa
0,016 88,7
Rca
84,0
a,b = mdias da mesma amostra na mesma linha seguidas de letras diferentes so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I. 1 Ensaio 2 = presena de bicarbonato de amnio (NH4HCO3) na soluo tampo; Ensaio 3 = soluo tampo do meio de incubao sem bicarbonato de amnio (NH4HCO3). 2 D24hsa = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida sem amido; D24hca = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D48hsa = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida sem amido; D48hca = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D72hsa = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida sem amido; D72hca = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D96hsa = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida sem amido; D96hca = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; Desvio padro das mdias onde n= 3 por amostra no ensaio 2 e n=9 por amostra no ensaio 3. 4 Probabilidade do erro Tipo I, calculada pelo teste F: *=P<0,05; **=P<0,01. E= efeito de ensaio e E*A= efeito da interao ensaio vs. amostra.
48
Tabela 4 Mdias de degradabilidade, taxas de degradao, e r ao longo do tempo do farelo de soja (FS), farinha de carne (FC), e azevm (AZ)
(Lolium multiflorum), nos ensaios 4 e 51. P4 E ** 16,0 26,1 27,7 36,4 80,1 7,1b 101,1 0,002b 0,015b 46,5 0,011 0,012 95,8 91,7 88,3
b
Varivel2 AZ 25,7 91,3 50,0 79,0 82,5a 16,7 60,4 17,6 40,0 0,013 0,024 4,7 11,0 91,5 0,018b 0,023 85,2 121,7 77,0 110,5 43,5 54,9 60,5 65,8 44,5 180,8 92,0a 160,1 0,033a 0,048a 92,1 79,8
a a a a
FS 20,7 17,1 48,1 43,2 66,2 62,8 74,7 72,3 0,015 0,014 96,0 96,2 3,6b 25,9 51,5 47,4 52,4b
b
Ensaio 4 FCO DP3 FS 27,7 32,9 32,9 36,7 0 56,0

b b b
Ensaio 5 FCO AZ 1,54 13,7

b b
DP 13,0
E*A ** ** ** ** ** ** ** Ns **
D24hsa 37,9 10,4
55,5
17,7
12,4
D24hca
73,3
D48hsa D48hca
99,0 125,7a
D72hsa
102,3
D72hca D96hsa D96hca
129,8 112,7 135,9
50,5 41,3 51,3 0,009 0,008 33,7 7,3
** ** ns ** ** ns ns
** ** * ** ** ** Ns
TxDsa TxDca Rsa
0,044a 0,043 94,6
Rca
85,5
a,b = mdias da mesma amostra na mesma linha seguidas de letras diferentes so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I. 1 Ensaio 4 = Amostra submetida a solubilizao por 3 horas e imediatamente incubada; Ensaio 5 = Amostra submetida a solubilizao e secagem previamente a incubao. 2 D24hsa = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida sem amido; D24hca = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D48hsa = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida sem amido; D48hca = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D72hsa = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida sem amido; D72hca = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; D96hsa = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida sem amido; D96hca = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida com correo pelo uso de amido; Desvio padro das mdias onde n= 3 por amostra no ensaio 4 e n=6 por amostra no ensaio 5. 4 Probabilidade do erro Tipo I, calculada pelo teste F: *=P<0,05; **=P<0,01. E= efeito de ensaio e E*A= efeito da interao ensaio vs. amostra.
49 As mdias de degradabilidade nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas de incubao calculadas com e sem correo pelo uso de amido, das amostras de farelo se soja, farinha de carne e ossos, e azevm, dos ensaios 2, 3, 4 e 5 esto representados nas figuras 10, 11, 12 e 13, respectivamente. No ensaio 2 todos os resultados de degradabilidade protica do azevm, ao longo do tempo de incubao foram superiores quando calculadas mediante utilizao do amido para correo da frao utilizada pelos microorganismos (P<0,05). O mesmo foi observado no ensaio 3 (P<0,01), mas tambm foi detectado uma maior degradabilidade na amostra de farinha de carne incubada sem amido as 72 horas (P<0,05).
50
sem amido
90 degradabilidade (%N incubado) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24 48
com amido
Farelo de soja
72
96
degradabilidade (% N incubado)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24 48 72
Farinha de carne
96 Azevm
a a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 24 48 horrio aps incubao 72 96

b a b a b b
Figura 10 Valores de degradabilidade (% do N incubado) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum), nas 24, 48, 72 e 96 horas aps incubao do ensaio 2 (n=3). As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I.
51
sem amido
120 100 80 60 40 20 0 24
140 d g a a ilid d (% o Nin u a o er db a e d c bd) 120 a 100 80 60 40 20 0 24 48 72 b
com amido
degradabilidade (% do N incubado)
Farelo de soja
48
72
96
Farinha de carne
120 degradabilidades (% N incubado) 100 80 b 60 40 20 0 24 48 72 b a a a b a a a
Azevm
96
a a
96
horrio aps incubao
52 As degradabilidades do ensaio 4 em geral foram similares, com exceo das 24 e 96 horas de incubao do farelo de soja onde os resultados foram superiores quando calculados com base no uso do amido, da farinha de carne as 24 e 96 horas, que foram maiores quando obtidas sem amido e do azevm que foi superior somente nas 96 horas com uso do amido (P<0,05). Quanto ao uso de amido para o clculo de degradabilidade, os resultados do farelo de soja no ensaio 5, foram iguais ao ensaio anterior (P<0,05). Neste ensaio a degradabilidade da farinha de carne tambm foi superior quando calculada sem amido, mas somente no tempo de 24 horas (P<0,05). As observaes obtidas com a incubao do azevm, em geral, resultaram em degradabilidades mais elevadas quando corrigidas pelo uso do amido (P<0,05). Os valores de taxa de degradao das amostras, calculados com e sem correo pelo uso do amido, e seus r esto representados nas figuras 14 e 15, respectivamente. A incluso de amido, gerou resultados superiores de taxas de degradao (P<0,01) s amostras de azevm, nos ensaios 3 e 5, onde o N da amostra ou do meio de incubao era inferior. A forma de obteno das taxas (com e sem amido) nas amostras de farelo de soja e farinha de carne e ossos, foi semelhante. A porcentagem da variao total (r) entre as formas de estimar a taxa de degradao da protena nos diferentes ensaios foi estatisticamente similar.
53
sem amido 160 degradabilidade (% N incubado) 140 120 100 80 60 40 20 0 b a a com amido
Farelo de soja
b
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
a a
24
48
72
96
Farinha de carne a b a a
b a
24
300 degradabilidade (% N incubado) 250 200 150 100 50 0 24
48
72
96 Azevm
a a b a
48
72
96
horrio aps incubao
54
sem amido
180 degradabilidade (% N incubado) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 24 48 72 96 Farinha de carne
com amido
Farelo de soja
b
a a
a a
90 degradabilidade (% N incubado) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24
200 degradabilidade (% N incubado) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 24 48 72 b a a a a
48
72
96 Azevm
a a
96
horrio aps incubao
55
TxDsa
Taxa de degradao do N ( /h) 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 Farelo de soja Farinha de carne e ossos Azevm
TxDca
Ensaio 2
Taxa de degradao do N ( /h)
0,06 0,05 0,04 0,03
Ensaio 3
a b
0,02 0,01 0
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

0,035
Farelo de soja
Farinha de carne e ossos
Ensaio 4 Azevm
Farelo de soja
Azevm Ensaio 5
0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 Farelo de soja Farinha de carne e ossos Amostra Azevm
b a
Figura 14 Taxa de degradao do nitrognio ( /h) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios 2, 3, 4 e 5. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste F a 5% de probabilidade do erro Tipo I.
56
r sa 100 80 r (%) 60 40 20 0 Farelo de soja Farinha de carne e ossos r ca
Ensaio 2A
EnsaioB 3 Azevm
100 80 r (%) 60 40 20 0 Farelo de soja

100 80 r (%) 60 40 20 0 Farelo de soja Farinha de carne e ossos Azevm Ensaio 5 D
EnsaioC 4 Azevm
100 80 r (%) 60 40 20 0 Farelo de soja Farinha de carne e ossos Amostra Azevm
Figura 15 Valores de r (%) das taxas de degradao do nitrognio do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios 2, 3, 4 e 5. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro.
57 As degradabilidades obtidas com o uso de inibidores in vitro esto representadas na figura 16. No foi possvel chegar aos resultados de taxa de degradao com os resultados obtidos nesse ensaio. O mtodo utilizado para quantificar os aminocidos foi inadequado, pois os antimicrobianos reagiram com os reagentes utilizados na determinao colorimtrica dos aminocidos, o que provavelmente subestimou sua concentrao no meio de incubao. Somente nas amostras incubadas com 100% de lquido ruminal, que foi possvel detectar valores crescentes de degradabilidade ao longo do tempo, provavelmente devido a maior atividade microbiana nesse tratamento.
20,0 15,0 Degradabilidade (%) 10,0 5,0 0,0 -5,0 -10,0 -15,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 Az20Am Az50Am Az100Am Fs20Am Fs50Am Fs100Am Az20 Az50 Az100 Fs20 Fs50 Fs100
Tempo de incubao (horas)
Figura 16 Degradabilidades mdias (% N incubado), das amostras incubadas com uso de inibidores in vitro. Amostras com antimicrobiano = Am; Az20 = azevm com 20% de inoculo; Az50 = azevm com 50% de inoculo; Az100 = azevm com 100% de inoculo; Fs20 = farelo de soja com 20% de inoculo; Fs50 = farelo de soja com 50% de inoculo; Fs100 = farelo de soja com 100% de inoculo;
A taxa de solubilizao do N em tampo borato-fosfato encontrada no farelo de soja foi de 83,46%, 78,23% na farinha de carne e 147,84% no azevm, estando representadas nas, figuras 17, 18 e 19, respectivamente.
58
0 0,000 -0,500
Ln do N no solubilizado
0,5
1,5
2,5
-1,000 -1,500 -2,000 -2,500 -3,000 -3,500 -4,000 tempo (h)
y = -0,8346x - 0,9196 R = 0,7587

2
Figura 17 Taxa de solubilizao do N das amostras de farelo de soja durante 3 horas de incubao.
0 0,000 Ln do N no solubilizado -0,500 -1,000 -1,500 -2,000 -2,500 -3,000
0,5
1,5
2,5
y = -0,7823x - 0,4356 R = 0,9491

2
tempo (h)
Figura 18 Taxa de solubilizao do N das amostras de farinha de carne e ossos durante 3 horas de incubao.
59
0 0,000 Ln do N no solubilizado -1,000 -2,000 -3,000 -4,000 -5,000 -6,000 tempo (h) y = -1,4784x - 0,5551 R = 0,8472
2
0,5
1,5
2,5
Figura 19 Taxa de solubilizao do N das amostras de azevm durante 3 horas de incubao.
A comparao dos resultados de taxa de degradao obtidos nos ensaio 3 e in situ dos trs alimentos, est representada na figura 20. Com exceo da farinha de carne, as degradabilidades do farelo de soja e azevm encontradas pelo mtodo in situ foram superiores (P<0,01). Os resultados de degradabilidade estimados pelo ensaio 5 e in situ, esto apresentados na figura 21. Todos os resultados obtidos pelo mtodo in vitro, utilizando ou no o amido para clculo, foram inferiores ao in situ (P<0,01).
60
Fareo de soja taxa de degradao ( /h) 0,2 0,15 0,1 0,05 0 in situ in vitro s/amido in vitro c/amido
Farinha de carne taxa de degradao ( /h) 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 in situ
0,2 0,15 0,1 0,05 0 in situ in vitro s/amido in vitro c/amido
in vitro s/amido
in vitro c/amido Azevm
taxa de degradao ( /h)
Figura 20 Taxa de degradao do nitrognio ( /h) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaio 3 in vitro, calculado com e sem correo pelo uso de amido e in situ. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
61
Fareo de soja 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Degradabilidade PB (%)
in situ
in vitro s/amido
in vitro c/amido Farinha de carne
Degradabilidade PB (%)
70 60 50 40 30 20 10 0 in situ 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 in vitro s/amido in vitro c/amido Azevm a b b
Degradabilidade PB (%)
b b
in situ
in vitro s/amido
in vitro c/amido
Figura 21 Degradabilidade da PB (%) do farelo de soja, farinha de carne e ossos e azevm (Lolium multiflorum) dos ensaios ensaio 5 in vitro, calculado com e sem correo pelo uso de amido e in situ. As barras sobre as colunas representam o respectivo desvio padro. Letras diferentes sobre as colunas indicam que as mdias dos dois ensaios so diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
62 A correlao entre os resultados obtidos in vivo com os in vitro, est representada na figura 22. Na aplicao do teste t para dados pareados, no houve diferena estatstica entre os resultados obtidos entre dois mtodos.
90 Degradabilidade PB in vivo 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Degradabilidade PB in vitro y = 0,3542x + 39,122 R = 0,1576

2
Figura 22 Correlao entre os valores de degradabilidade protica ruminal, encontrada in vitro e in vivo com azevm (Lolium multiflorum) e grama-paulista (Cynodon dactilon var. dactylon).
6 DISCUSSO
6.1 Efeito do tamanho da amostra
Inicialmente foi conduzido um ensaio obedecendo aos procedimentos convencionais da tcnica in vitro/gs, onde se incubava um grama de amostra nas garrafinhas. Pressupondo que os resultados obtidos poderiam ser muito variveis devido ao fato de que as quantidades de amostras incubadas no foram equivalentes quanto ao teor de N, posteriormente foi realizado o segundo ensaio onde as amostras foram incubadas em quantidades equivalentes a 15 mg de N. Os resultados obtidos com a comparao dos ensaios 1 e 2, sugerem que no necessria uma fixao na quantidade de N incubado para estudos de degradabilidade protica, permitindo a conduo de um ensaio com quantidades mais adequadas de amostra, entretanto observou-se que quando incubadas quantidades iguais de N, a variao entre os resultados foi menor. Isso indica que mais estudos referentes ao tamanho de amostra so necessrios para ajuste da tcnica. Em funo do baixo teor de N de alguns tipos de amostras, mediante a necessidade de um valor fixo de N, as quantidades a serem incubadas poderiam extrapolar o recomendado de um grama por garrafa nos ensaios in vitro gases (MAURICIO et al., 1999). Entre os grupos de pesquisa, os tamanhos de amostra chegaram a variar de 100 a 1250 mg (GETACHEW et al. 1998). Uma amostra de maior tamanho pode prover resultados mais precisos, entretanto um aspecto importante a ser levado em considerao a capacidade de tamponamento do meio, ao longo de todo o tempo de incubao (MAURICIO et al., 1999; PELL; SCHOFIELD, 1993). Theodorou (1994) observou que um aumento na quantidade de substrato no meio de incubao aumentou linearmente o volume de gases, mas a taxa de produo de gases no foi afetada, no entanto estudos dessa natureza, referentes liberao de NH3 no meio de incubao ainda so escassos.
6.2 Efeito da composio do meio de incubao
64 No presente estudo o meio de incubao do ensaio 2 era constitudo de 4 g/L de bicarbonato de amnio, correspondendo a 111,1 mg de N/l, o que poderia proporcionar um possvel atraso no incio da digesto microbiana da protena do alimento incubado, interferindo nos resultados finais de degradao. Em vista disso, conduziu-se um novo ensaio onde foi completamente iliminada qualquer fonte de N instantaneamente solvel no meio de incubao (ensaio 3). No entanto, de uma forma geral a degradabilidade e taxa de degradao do azevm sem uso de amido foi negativamente afetada pela ausncia do bicarbonato de amnio no meio de incubao (P<0,05). Grande parte dos estudos realizados com objetivo de estimar a degradao protica pelo mtodo in vitro utiliza no meio de incubao tampes sem presena de N. Em geral so baseados no uso de tampo proposto por Menke (1979) (RAAB, 1983; HERNNDEZ et al., 2002) e principalmente uso da saliva artificial criada por McDougall (1948) (BRODERICK, 1987; HERNNDEZ et al., 2002; LANA et al., 2007; BRODERICK; CLAYTON, 1992; LUCHINI et al., 1996). Estudos realizados em busca de uma concentrao de NH3 que permita a maximizao do crescimento microbiano e degradao da MO, mostram resultados que variam de 50 mg de N/l (SATTER; STYTER, 1974) a 200 mg de N/l (MILLER, 1973; MEHREZ et al., 1977; ERDMAN et al., 1986). Dryhurst e Wood (1998) recomendam uma concentrao mnima de 80 mg N/l no meio de incubao para que a atividade microbiana no seja negativamente afetada, assim como Nagadi et. al. (2000) relatam uma concentrao de N/l de 50 a 100 mg, dependendo da disponibilidade de FDN fermentvel disponvel. Mediante um excesso de carboidratos fermentveis, as bactrias iro direcionar seu metabolismo para um maior gasto de ATP, atravs de reaes fteis (RUSSELL, 1998; KOZLOSKI, 2002). Ao contrrio, mediante excesso de N, uma parte que est na forma de aminocidos ser metabolizada pelos microorganismos para obteno de energia, e a outra parte, na forma de N-NH3, escapar da fermentao, sendo absorvida na parede ruminal e a poro no destinada reciclagem pelo organismo do animal ser excretada na urina na forma de uria (NOCEK; RUSSEL, 1988; BACH et. al. 2005). No entanto, nas condies de um ensaio in vitro, o excesso de N-NH3 na soluo tampo, poder influenciar no perfil da degradabilidade protica, uma vez que o mtodo empregado se baseia na liberao deste produto no meio de incubao. Isso indica que deve de ser includa no meio de incubao uma quantidade mnima de N necessrio para garantir a atividade microbiana. Dessa forma assegurado um perfil de degradao da protena, atrelado s caractersticas do alimento e no
65 a uma deficincia ou excesso de substrato (RYMER et. al., 2005). Com isso, decidiu-se utilizar uma concentrao de 80 mg de N/l a partir do ensaio 4. Como esperado, ainda observa-se que as degradabilidades do azevm foram significativamente deprimidas quando retirado o bicarbonato de amnio do meio de incubao. Isso indica que as bactrias provavelmente demoraram mais tempo para iniciar a degradao, chegando a um valor de degradabilidade inferior, se comparado com o ensaio 2. Entretanto o contrrio foi observado com as amostras de farinha de carne e farelo de soja. Com isso, possvel afirmar que a caracterstica qumico-fsica da protena instantaneamente solvel dos alimentos incubados, diferente, e que nem sempre instantaneamente degradvel. Mahadevan et al. (1980), afirma que a protena solvel pode ser digerida em diferentes taxas de degradao, podendo estas ser menores at que as taxas da frao potencialmente degradvel. Mediante tal observao surge a hiptese de que a frao solvel da protena esteja influenciando de alguma forma a estimativa final da degradabilidade protica. Entretanto, de uma forma geral, nota-se a necessidade da conduo de mais estudos a fim de estabelecer uma concentrao de N ideal no meio de incubao para os diferentes alimentos, de forma que o perfil de degradao protica no seja negativamente afetado.
6.3 Efeito do tratamento prvio das amostras
Levando em considerao que os modelos que estimam os valores de PDN consideram que a frao totalmente solvel (frao A) totalmente degradada e que a frao potencialmente degradvel (frao B) depende da taxa de passagem e de degradao do alimento (NRC, 2001), resolveu-se ento, partir para ensaios onde foi incubado somente o resduo do alimento pr-solubilizado em tampo, para a obteno de valores de taxa de degradao reais da frao B. Outro fator que reforou esta deciso foi a suposio de que a frao prontamente solvel estivesse interferindo na degradabilidade da frao mais lentamente degradvel. Devido aos menores valores de desvio padro, principalmente para os parmetros de taxa de degradao, a melhor forma considerada para separar a frao B foi a de tratar toda a amostra previamente com soluo tampo, sec-la e depois ento com base no teor de N residual realizar a incubao. Acredita-se que com o procedimento do ensaio 4 o N das amostras no foi suficientemente solubilizado. Contudo destaca-se a necessidade de
66 aperfeioar o mtodo de secagem da amostra, sugerindo-se a utilizao de liofilizador para tal procedimento. Se usados isoladamente, as taxas de degradao encontradas no ensaio 5, so bons indicadores de comparao entre os alimentos.
6.4 Efeito da incluso de amido para obteno dos valores de degradabilidade
Os resultados de degradabilidade e taxa de degradao dos ensaios 2, 3, 4 e 5 sugerem que a incluso de amido para correo da frao capturada pelas bactrias funcionou somente com o azevm, no sendo necessrio adotar esta prtica para concentrados proticos ao longo de 96 horas. Tal observao atribui maior praticidade ao mtodo, pois possibilita uma reduo considervel no nmero de amostras coletas para serem analisadas. Com o tratamento de solubilizao das amostras, alm do N, a frao de carboidrato solvel tambm foi perdida. Como o crescimento microbiano depende no s de uma fonte de N, mas tambm de energia (RUSSEL et al, 1992), a incluso de amido no meio de incubao parece ter sido importante para uma melhoria na degradao protica.
6.5 Uso de inibidores in vitro para estimativa da degradabilidade protica
Com o objetivo de encontrar a taxa de degradao da frao protica prontamente solvel dos alimentos, conduziu-se um ensaio de curta durao com utilizao de inibidores do crescimento bacteriano. Entretanto no foi possvel obter resultados precisos com a utilizao deste mtodo, pois alm de ter ocorrido problemas na determinao de aminocidos, possivelmente existam outras limitaes para o seu uso na estimativa da degradabilidade da protena. A acumulao dos produtos finais da degradao pode ter causado uma inibio das enzimas proteolticas, e a ao de inibio dos antimicrobianos sobre o crescimento microbiano, provavelmente influenciaram negativamente na sntese enzimtica (CALSAMIGLIA et al., 2000).
67 6.6 Comparao do mtodo in vitro com os mtodos in situ e in vivo
Os resultados de degradabilidade da protena, obtidas atravs das taxas de degradao encontradas no ensaio 5, que se referem somente a degradao da frao B das amostras, foram utilizados para comparao com os resultados obtidos in situ. Os resultados in vitro foram significativamente menores. Possivelmente isso pode estar relacionado a uma subestimativa da degradabilidade in vitro por no computar juntamente com o N-NH3 os demais produtos da degradao protica como os aminocidos. As correes pelo uso de amido tambm poderiam no estar estimando verdadeiramente o total das quantidades de NNH3 liberadas com a degradao da protena. Por outro lado, o mtodo in situ, pode estar superestimando a degradabilidade dos alimentos, pois se baseia no desaparecimento de amostra do interior dos saquinhos incubados no rmen, o que no quer dizer que essa frao que desapareceu realmente sofreu degradao. Outro problema deste mtodo a determinao da frao A, que corresponde ao N que desaparece dos saquinhos no tempo zero (somente lavado em gua). Na maior parte das vezes uma grande parte do que sai do saquinho com esse procedimento corresponde a perdas de amostra pelos poros, desta forma superestimando a frao A e todo o demais perfil de degradao ao longo do tempo de incubao (HVELPLUND; WEISBJERG, 2000). Outro aspecto que atribui desvantagem do mtodo in situ em relao ao in vitro, o nmero limitado de amostras a ser usado em um ensaio. Os resultados obtidos in vivo, quando comparados com os in vitro pelo teste t foram estatisticamente similares. Entretanto, o grfico mostra a equao de regresso entre os dois mtodos com um valor de r baixo, o que refora a necessidade da realizao de mais testes para obteno de um maior nmero de comparaes, a fim de validar o mtodo in vitro. Embora o mtodo in vivo possivelmente seja o mais confivel, ainda no h uma forma padronizada para sua utilizao na determinao da degradabilidade protica ruminal. Alm disso, invasivo, demanda bastante tempo e possui custo mais elevado para execuo. Com isso, ressalta-se a necessidade do desenvolvimento de mtodos mais simples e rpidos para estimar a degradao protica ruminal (STERN et al., 1994). Como o mtodo in vitro baseado na produo de gases j est consolidado na estimativa da degradao da matria orgnica, busca-se ento sua utilizao para fins de estimativa da degradabilidade protica ruminal.
7 CONSIDERAES FINAIS
As variveis de degradao protica obtidas com base na liberao de amnia in vitro so afetadas pelo tamanho e processamento da amostra, assim como pela concentrao de nitrognio no meio de incubao. A incluso de amido, por sua vez, interfere nas variveis de degradao da protena de amostras de volumoso, mas no de concentrados. Embora ainda necessite de mais estudos para sua validao e de adequao da quantidade de amostra a ser incubada, a taxa e extenso da degradao ruminal da protena dos alimentos pode ser estimada pela medida da liberao de amnia no meio de incubao utilizando um ensaio in vitro/gases. Neste caso, a amostra deve ser previamente tratada com soluo tampo pH 7.0 para retirada da frao solvel do nitrognio, a soluo tampo deve ter uma concentrao de nitrognio de 80 mg/l e as amostragens de lquido do interior dos frascos devem ser feitas nos tempos 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas apos incubao, com a devida reposio do volume.
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APNDICES
78 Apndice A Valores individuais de degradabilidade do farelo de soja, farinha de carne e azevm as 24 e 48 horas, nos cinco ensaios Ensaio1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Corrida 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 Amostra Repetio D24hsa2 D24hca3 D48hsa4 D48hca5 farelo de soja 1 19,28 . 48,53 . farelo de soja 2 17,74 . 50,11 . farelo de soja 3 16,84 . 49,02 . 1 17,05 . 94,59 . farinha de carne farinha de carne 2 18,78 . 36,73 . farinha de carne 3 17,18 . 31,85 . farelo de soja 1 28,60 31,5 59,73 53,8 farelo de soja 2 28,97 31,4 62,93 62,1 farelo de soja 3 44,73 44,7 59,47 56,6 1 24,49 41,7 52,40 50,9 farinha de carne farinha de carne 2 31,17 68,0 44,64 38,7 farinha de carne 3 35,37 39,4 50,24 43,8 azevm 1 48,52 87,4 70,35 108,4 azevm 2 44,69 76,7 75,93 112,1 azevm 3 46,03 60,9 83,06 107,7 farelo de soja 1 43,68 40,9 70,71 66,1 farelo de soja 2 49,25 43,1 75,92 76,7 farelo de soja 3 49,29 44,3 65,61 64,9 farinha de carne 1 14,15 31,6 26,97 83,8 farinha de carne 2 35,82 24,0 64,17 54,1 3 32,51 19,8 76,96 53,5 farinha de carne azevm 1 27,40 35,8 55,02 62,6 azevm 2 36,13 45,1 56,12 71,7 azevm 3 25,42 33,2 50,30 57,1 farelo de soja 1 43,55 54,53 80,52 85,70 farelo de soja 2 37,88 45,23 77,02 80,49 farelo de soja 3 44,77 51,64 78,11 82,13 farinha de carne 1 36,43 36,50 63,88 54,72 farinha de carne 2 39,62 33,29 64,63 64,19 farinha de carne 3 38,28 38,93 64,53 53,60 azevm 1 13,15 21,20 28,14 71,42 azevm 2 13,63 23,86 27,00 68,80 azevm 3 15,05 25,46 31,66 59,43 farelo de soja 1 25,90 26,88 46,84 47,99 farelo de soja 2 26,59 28,50 49,55 47,71 farelo de soja 3 26,26 29,61 50,97 51,71 farinha de carne 1 36,84 36,59 62,30 63,67 2 40,02 35,94 70,98 66,65 farinha de carne farinha de carne 3 52,00 43,71 75,05 71,37 azevm 1 29,54 43,26 55,99 68,61
79 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
1
3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2
azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm
2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
32,61 34,24 59,07 53,34 54,24 22,89 16,61 22,58 26,28 12,76 38,22 27,48 11,81 19,20 9,91 10,90 1,00 -21,48 -24,23 -25,29 32,87 34,94 40,24 16,24 17,14 19,44 -5,02 3,88 5,38
43,46 45,97 72,62 73,63 73,62 18,63 12,78 19,77 58,85 128,90 86,25 28,3 13,1 22,0 7,6 7,0 1,6 -4,0 -5,6 -4,5 37,2 49,2 47,9 14,3 14,7 17,1 17,0 27,3 38,0
59,67 62,12 96,40 102,53 98,06 51,67 45,65 46,91 63,79 39,79 46,12 36,90 12,69 23,43 14,16 24,54 25,56 -20,34 -20,42 -20,10 67,82 69,68 74,18 38,90 42,98 51,02 -4,72 -4,49 -1,63
70,17 73,01 137,11 128,52 111,39 45,49 37,20 46,88 94,13 -25,34 142,90 60,4 -17,2 -5,7 26,4 41,2 20,3 41,3 31,0 39,5 81,1 91,3 81,5 40,1 42,5 49,9 81,0 62,0 81,3
Ensaio 1 = Incubao com 1g de amostra, somente sem amido; Ensaio 2 = presena de bicarbonato de amnio (NH4HCO3) na soluo tampo; Ensaio 3 = soluo tampo do meio de incubao sem bicarbonato de amnio (NH4HCO3); Ensaio 4 = Amostra submetida solubilizao por 3 horas e imediatamente incubada; Ensaio 5 = Amostra submetida solubilizao e secagem previamente a incubao. 2 D24hsa = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida sem amido. 3 D24hca = Degradabilidade s 24 horas de incubao obtida com amido. 4 D48hsa = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida sem amido. 5 D48hca = Degradabilidade s 48 horas de incubao obtida com amido.
80 Apndice B Valores individuais de degradabilidade do farelo de soja, farinha de carne e azevm as 72 e 96 horas, nos cinco ensaios Ensaio1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Corrida 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 Amostra Repetio D72hsa2 D72hca3 D96hsa4 D96hca5 farelo de soja 1 66,00 . 66,02 . farelo de soja 2 65,22 . 73,79 . farelo de soja 3 62,40 . 70,37 . farinha de carne 1 131,70 . . . farinha de carne 2 50,73 . 51,35 . farinha de carne 3 43,91 . 48,68 . farelo de soja 1 58,40 44,5 71,78 79,0 farelo de soja 2 70,00 58,1 80,30 61,4 farelo de soja 3 62,65 58,0 65,83 51,3 farinha de carne 1 61,81 67,4 68,98 81,9 farinha de carne 2 60,91 71,3 59,78 58,1 farinha de carne 3 59,23 47,2 64,31 60,8 azevm 1 94,12 145,8 107,10 142,5 azevm 2 90,79 128,0 99,53 129,4 azevm 3 97,32 117,0 114,10 155,8 farelo de soja 1 80,34 81,3 79,56 83,3 farelo de soja 2 93,98 91,2 97,73 95,2 farelo de soja 3 84,32 83,8 88,35 85,4 farinha de carne 1 65,86 74,5 . 108,5 farinha de carne 2 70,94 29,0 76,61 96,0 farinha de carne 3 88,42 43,6 99,87 86,0 azevm 1 62,10 71,1 88,32 91,7 azevm 2 64,57 92,3 71,00 85,7 azevm 3 58,73 72,4 67,16 73,1 farelo de soja 1 99,23 105,40 119,22 124,30 farelo de soja 2 97,92 97,95 111,25 109,22 farelo de soja 3 100,75 99,72 117,81 118,50 farinha de carne 1 92,01 68,60 103,33 82,14 farinha de carne 2 85,82 83,10 103,35 104,21 farinha de carne 3 93,52 91,89 93,16 94,16 azevm 1 49,81 59,55 58,38 69,15 azevm 2 51,11 66,55 55,46 69,45 azevm 3 44,10 93,40 56,53 67,59 farelo de soja 1 69,03 62,48 72,53 74,70 farelo de soja 2 65,47 60,48 72,67 63,76 farelo de soja 3 72,48 61,56 81,28 69,32 farinha de carne 1 92,99 92,45 108,54 106,92 farinha de carne 2 97,90 90,21 110,43 106,17 farinha de carne 3 101,73 91,26 122,54 116,61 azevm 1 73,84 89,82 84,36 98,31
81 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
1
3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2
azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm
2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
71,51 82,96 107,40 106,15 93,35 70,31 59,01 69,36 87,58 83,72 76,15 47,02 20,30 36,59 18,95 34,92 29,77 -10,68 -11,09 -12,87 68,36 86,90 135,57 57,41 61,26 64,70 10,51 4,78 6,36
79,78 91,95 136,20 145,65 107,52 67,96 51,08 69,53 173,79 244,03 124,66 108,2 191,1 93,7 33,3 26,6 17,6 46,0 36,6 29,8 76,3 102,0 159,0 58,6 62,2 62,5 149,3 85,5 133,7
87,50 93,29 120,39 117,74 99,87 75,53 72,37 76,24 94,99 85,26 95,92 41,57 27,92 49,75 27,89 36,22 42,90 -2,00 -17,50 -5,16 94,81 94,35 153,91 72,66 71,08 78,76 16,01 13,30 13,22
96,70 95,90 146,85 133,94 126,87 72,08 70,63 74,30 151,97 173,56 154,72 123,3 65,0 71,4 53,6 51,9 24,5 78,8 -16,4 47,0 113,0 109,7 180,5 75,8 73,2 84,2 179,1 134,7 167,3
Ensaio 1 = Incubao com 1g de amostra, somente sem amido; Ensaio 2 = presena de bicarbonato de amnio (NH4HCO3) na soluo tampo; Ensaio 3 = soluo tampo do meio de incubao sem bicarbonato de amnio (NH4HCO3); Ensaio 4 = Amostra submetida solubilizao por 3 horas e imediatamente incubada; Ensaio 5 = Amostra submetida solubilizao e secagem previamente a incubao. 2 D72hsa = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida sem amido. 3 D72hca = Degradabilidade s 72 horas de incubao obtida com amido. 4 D96hsa = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida sem amido. 5 D96hca = Degradabilidade s 96 horas de incubao obtida com amido.
82 Apndice C Valores individuais de taxa de degradao protica e seus coeficientes de determinao (r) do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos cinco ensaios Ensaio1 Corrida 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Amostra Repetio farelo de soja 1 farelo de soja 2 farelo de soja 3 farinha de carne 1 farinha de carne 2 farinha de carne 3 farelo de soja 1 farelo de soja 2 farelo de soja 3 farinha de carne 1 farinha de carne 2 farinha de carne 3 azevm 1 azevm 2 azevm 3 farelo de soja 1 farelo de soja 2 farelo de soja 3 farinha de carne 1 farinha de carne 2 farinha de carne 3 azevm 1 azevm 2 azevm 3 farelo de soja 1 farelo de soja 2 farelo de soja 3 farinha de carne 1 farinha de carne 2 farinha de carne 3 azevm 1 azevm 2 azevm 3 farelo de soja 1 farelo de soja 2 farelo de soja 3 farinha de carne 1 farinha de carne 2 farinha de carne 3 TxDsa2 1,53 1,49 1,37 2,59 0,88 0,77 1,58 2,06 1,53 1,53 1,18 1,3 3,42 3,22 3,47 2,01 4,07 2,54 0,65 1,53 2,97 1,8 1,27 1,2 4,59 4,75 5,71 4,78 4,62 3,31 1,08 1,02 1,02 1,6 1,54 1,93 2,65 4,49 4,92 r2 97,35 98,15 98,29 87,63 95,58 98,35 93,25 97,26 75,73 92,6 87,07 91,19 93,44 97,93 92 92,89 98,7 96,31 80,33 94,47 93,4 87,98 95,76 92,34 85,24 89,17 80,64 88,06 84,59 94,21 98,9 97,87 98,8 96,52 98,16 99,7 96,18 87,56 80,96 TxDca3 . . . . . . 1,74 1,43 1,65 1,82 1,12 1,17 2,04 5,14 2,24 2,15 3,45 2,34 1,71 1,54 1,89 2,19 2,02 1,73 4,69 4,75 4,91 1,85 4,42 3,27 1,4 1,47 1,43 1,59 1,28 1,44 2,77 4,52 4,93 r2 . . . . . . 95,31 80,91 75,72 98,36 86,88 84,77 75,96 96,33 79,97 96,47 99,06 95,25 96,06 96,01 93,22 91,93 96,54 90,16 85,57 91,45 84,3 98,71 83,01 94,3 98,85 97,73 91,4 98,89 93,52 94,71 96,21 86,81 77,87
83 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
1
3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2
azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
2,01 2,12 2,81 5,1 3,85 4,21 1,64 1,31 1,61 3,86 2,73 3,23 0,81 1,5 0,77 0,36 0,77 0,81 0,4 0,19 0,29 1,88 3,19 2,86 1,41 1,37 1,72 0,16 0,02 0,02
99,78 98,21 97,85 90,42 94,85 98,64 97,95 91,88 98,3 99,25 91,74 85,3 61,3 95,87 75,91 91,85 89,65 96,39 96,37 61,24 97,66 92,27 98,39 87,8 98,88 98,85 99,45 23,05 0,39 0,42
4,08 3,24 3,49 6,82 2,73 3,3 1,46 1,35 1,51 1,82 7,29 5,38 2,31 1,23 1,47 0,93 0,97 0,52 2,34 1,29 0,9 1,94 4,02 2,81 1,52 1,48 1,93 1,26 1,46 1,53
95,68 93,56 99,09 87,48 86,73 82,21 96,6 96,43 95,65 83,25 94,21 62,03 86,71 97,66 94,71 95,88 85,99 74,97 92,21 82,01 87,81 86,76 96,68 86,6 98,06 98,84 96,21 77,09 92,91 97,72
Ensaio 1 = Incubao com 1g de amostra, somente sem amido; Ensaio 2 = presena de bicarbonato de amnio (NH4HCO3) na soluo tampo; Ensaio 3 = soluo tampo do meio de incubao sem bicarbonato de amnio (NH4HCO3); Ensaio 4 = Amostra submetida solubilizao por 3 horas e imediatamente incubada; Ensaio 5 = Amostra submetida solubilizao e secagem previamente a incubao. 2 TxDsa = Taxa de degradao obtida sem amido (%/h). 3 TxDca = Taxa de degradao obtida com amido (%/h).
84 Apndice D Valores individuais de degradabilidade e taxa de degradao protica do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos mtodos in situ, in vitro sem amido e in vitro com amido Mtodo in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido Amostra farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm Degradabilidades 74,89 68,06 77,69 51,82 52,14 59,23 80,12 80,97 72,3 30,52 37,43 30,07 30,29 35,11 35,54 44,92 43,19 44,03 40,64 49,43 47,49 41,40 41,05 44,02 42,93 41,67 41,67 43,87 34,91 37,16 36,81 37,22 32,25 56,26 50,99 48,56 41,12 53,68 47,18 42,36 42,02 45,66 50,81 51,96 52,34 Taxa de degradao (%/h) 18,0 11,0 13,4 4,1 3,0 4,3 14,3 18,0 9,0 0,81 1,5 0,77 0,36 0,77 0,81 0,4 0,19 0,29 1,88 3,19 2,86 1,41 1,37 1,72 0,16 0,02 0,02 2,31 1,23 1,47 0,93 0,97 0,52 2,34 1,29 0,90 1,94 4,02 2,81 1,52 1,48 1,93 1,26 1,46 1,53
85 Apndice E Valores individuais de taxa de degradao protica do farelo de soja, farinha de carne e azevm, nos mtodos in situ e in vitro, do ensaio 3, calculadas sem amido e com amido Mtodo in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in situ in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vito sem amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido Amostra farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja Taxa de degradao (%/h) 18,00 11,02 13,42 4,11 3,03 4,34 14,32 17,99 8,96 2,01 4,07 2,54 0,65 1,53 2,97 1,8 1,27 1,2 4,59 4,75 5,71 4,78 4,62 3,31 1,08 1,02 1,02 1,6 1,54 1,93 2,65 4,49 4,92 2,01 2,12 2,81 2,15 3,45 2,34
86 in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido in vitro com amido farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm 1,71 1,54 1,89 2,19 2,02 1,73 4,69 4,75 4,91 1,85 4,42 3,27 1,4 1,47 1,43 1,59 1,28 1,44 2,77 4,52 4,93 4,08 3,24 3,49
87 Apndice F Valores individuais de desaparecimento de N solvel em tampo boratofosfato em 3 horas e seus respectivos valores transformados em logaritmo Amostra farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farelo de soja farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne farinha de carne azevm azevm azevm azevm azevm azevm azevm azevm azevm
1
Tempo (h) 0,017 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3 0,017 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3 0,017 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3
Desaparecimento1 43,1 62,4 81,7 78,9 89,9 86,2 90,8 103,7 100,0 27,3 56,7 49,7 55,1 78,6 81,3 100,0 89,3 94,1 30,4 64,1 71,7 71,7 91,3 93,5 98,9 96,7 100,0
Resduo2 0,569 0,376 0,183 0,211 0,101 0,138 0,092 -0,037 0,000 0,727 0,433 0,503 0,449 0,214 0,187 0,000 0,107 0,059 0,696 0,359 0,283 0,283 0,087 0,065 0,011 0,033 0,000
Log (resduo) -0,564 -0,978 -1,696 -1,556 -2,293 -1,983 -2,389 . . -0,318 -0,837 -0,688 -0,800 -1,542 -1,676 . -2,235 -2,833 -0,363 -1,025 -1,264 -1,264 -2,442 -2,730 -4,522 -3,423 .
Desaparecimento = % do N total solvel que desapareceu no respectivo tempo de tratamento com soluo tampo. 2 Ressuo = frao do N total solvel ainda no solubilizado no respectivo tempo de tratamento com suluo tampo.
88 Apndice G Valores individuais de degradabilidade de forragens, calculados com base na taxa de degradao da protena obtida in vitro, no fracionamento do nitrognio, com 2% de taxa de passagem Alimento1 A AZExp.1 P1 AZExp 3 P1 CYExp.2 P1 CYExp.2 P4
1
Fraes N (%) B 52,5 23,2 81,5 53,4 C 4,2 6,0 10,5 11,4
Tx. Degradao (%/h) 1,1 0,61 0,49 0,071
Degradabilidade in vitro 96 78 35 37
43,3 70,8 8,0 35,2
AZExp.1 P1= amostra de azevm do experimento 1, correspondente ao perodo 1; AZExp.3 P1= amostra de azevm do experimento 1, correspondente ao perodo 1; CYExp.2 P1= amostra de grama-paulista do experimento 2, no perodo 1; CYExp.2 P4= amostra de grama-paulista do experimento 2, no perodo 4.
ANEXOS
90 ANEXO A - Composio do meio de cultura 1
Composio do Meio Ingredientes: gua destilada Sol. Tampo Sol. Macrominerais Sol. Microminerais Sol. Rezasurim Meio B Total Soluo Tampo Reagentes NH4HCO3 NaHCO3 Soluo de Macrominerais Reagentes Na2HPO4 KH2PO4 MgSO4 7 H2O Soluo de Microminerais Reagentes CaCL2.2H2O MnCl2.4H2O CoCl2.6H2O FeCL3.6H2O Meio B Reagentes Cysteine HCl (gramas) gua destilada (mL) NaOH 1M (mL) Na2S (gramas) Soluo de rezasurina Reagentes Rezasurina
1
Mililitro/Litro 520,30 208,10 208,10 0,11 1,00 62,40 1000
Gramas/Litro 4,0 35,0
Gramas/Litro 9,45 3,32 0,60
Gramas/Litro 132,00 100,00 10,00 80,00
Quantidade/1000mL 6,25 950 40 6,25
g/l 1,0
Adaptado de Theodorou et al., (1994).
91 ANEXO B - Composio do meio de cultura 1
Composio do Meio Ingredientes: gua destilada Sol. Tampo Sol. Macrominerais Sol. Microminerais Sol. Rezasurim Meio B Total Soluo Tampo Reagentes NaHCO3 Soluo de Macrominerais Reagentes Na2HPO4 KH2PO4 MgSO4 7 H2O Soluo de Microminerais Reagentes CaCL2.2H2O MnCl2.4H2O CoCl2.6H2O FeCL3.6H2O Meio B Reagentes Cysteine HCl (gramas) gua destilada (mL) NaOH 1M (mL) Na2S (gramas) Soluo de rezasurina Reagentes Rezasurina
1
Mililitro/Litro 520,30 208,10 208,10 0,11 1,00 62,40 1000
Gramas/Litro 35,0
Gramas/Litro 132,00 100,00 10,00 80,00
Quantidade/1000mL 6,25 950 40 6,25
g/l 1,0
Adaptado de Menke et. al., (1979).
92 ANEXO C - Composio do meio de cultura 1
Composio do Meio Ingredientes: gua destilada Sol. Tampo Sol. Macrominerais Sol. Microminerais Sol. Rezasurim Meio B Total Soluo Tampo Reagentes NH4HCO3 NaHCO3 Soluo de Macrominerais Reagentes Na2HPO4 KH2PO4 MgSO4 7 H2O Soluo de Microminerais Reagentes CaCL2.2H2O MnCl2.4H2O CoCl2.6H2O FeCL3.6H2O Meio B Reagentes Cysteine HCl (gramas) gua destilada (mL) NaOH 1M (mL) Na2S (gramas) Soluo de rezasurina Reagentes Rezasurina
1
Mililitro/Litro 520,30 208,10 208,10 0,11 1,00 62,40 1000
Gramas/Litro 2,88 35,0
Gramas/Litro 132,00 100,00 10,00 80,00
Quantidade/1000mL 6,25 950 40 6,25
g/l 1,0
Adaptado de Dryhurst & Wood (1998).
93 ANEXO D Descrio da metodologia adotada para determinao de aminocidos no lquido ruminal.
Preparao da amostra:
Coletar o 0,5 ml de fludo ruminal do interior dos frascos de incubao, transferir para eppendorfes e adicionar 1,5 ml de cido tricloroactico (TCA) numa diluio que permita uma concentrao final de 5% de TCA (amostra + cido). Centrifugar em 3000g por 10 minutos, coletar o sobrenadante e armazenar em congelador at posterior anlise.
Equipamentos e vidrarias:
Seringas de 1ml com agulha; Eppendorfes com capacidade de 2ml; Centrfuga de at 3000g; Balana analtica; Balo volumtrico de 50 e 1000 mL; Becker de 50, 100 e 250 mL; Tubo de ensaio de 15 mL; Pipetas automticas (10 a 1000L); Cronmetro; Agitador de tubo de ensaio; Banho Maria Espectrofotmetro para leitura na do visvel em 420 nm;
Reagentes:
1. cido tricloroactico (TCA) 50% Pesar 500 g de TCA, diluir em 400ml/ H2O destilada, transferir o contedo para balo volumtrico de um litro e completar o volume com gua destilada.
94 2. NaOH 0,1N Pesar 4 gramas de hidrxido de sdio (NaOH) PA, diluir e 800ml/ H2O destilada, transferir o contedo para balo volumtrico de um litro e completar o volume com gua destilada.
3. TNBS 0,1% Pipetar 1ml de TNBS em um balo e completar o volume com 50 ml de gua destilada. Manter no refrigerador por at uma semana.
4. Soluo salina (0,9% NaCl)- Tampo Borato Pesar 19,07 gramas de Borato de Sdio (Na2B4O710 H2O) em 800ml/ H2O destilada, transferir o contedo para balo volumtrico de um litro e completar o volume com gua destilada.
5. HCl 1N: Utilizando um cido com 37% de pureza e 1,19 de densidade, pipetar 82,8 ml de cido clordrico PA (HCL) em um balo volumtrico de 1 litro e completar com gua destilada.
6. Soluo padro: Serina 1mM = pesar 0,1051 gramas diluir e 800ml/ H2O destilada, transferir o contedo para balo volumtrico de um litro e completar o volume com gua destilada.
Procedimentos: 50 l de fludo ruminal 550 l de gua destilada; 500 l de Soluo Tampo Borato; 250 l de TNBS; Levar ao banho Maria de 37 C durante 20 minutos; Adicionar 500 l de HCl 1N aps a incubao; Ler absorbncia em 420 nm de comprimento de onda;
95 Ex. de Curva Padro: Tubo Pado ( L) Serina 1Mm B 1 2 3 4 25 50 100 150 Concentrao (g serina ) 0 2,627 5,254 10,508 15,763 H2O l 600 575 550 500 450 Tampo l 500 500 500 500 500 TNBS l 250ul 250ul 250ul 250ul 250ul HCl 1N l 500 500 500 500 500 Leitura (Absorbncia) (420nm) 0,0665 0,128 0,255 0,3965
A obteno da concentrao de aminocidos totais na amostra obtida pelo produto entre a leitura de absorbncia, fator de diluio e o fator de clculo (FC): Aminocidos totais = Absorbncia da amostra fator de diluio FC
O FC, por sua vez, obtido pelo cociente entre a concentrao de serina e sua respectiva leitura de cada ponto da curva padro.

Carla Joice Harter

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS RURAIS PROGRAMA DE PS-GRADUAO ZOOTECNIA

Carla Joice Hrter

Santa Maria, RS, Brasil 2009

Carla Joice Hrter

Orientador: Prof. Luis Maria Bonnecarrre Sanchez

Santa Maria, RS, Brasil 2009

A todos, o meu Muito Obrigada!

Palavras-chave: degradabilidade, in vitro, in situ, in vivo, protena, taxa de degradao.

Keywords: ammonia, degradability, in vitro, in situ, in vivo, protein, degradation rate.

16 (BRODERICK, 1987; HERNNDEZ, 2002) e uso de enzimas proteolticas

2.1 Hiptese geral

2.2 Hipteses secundrias

3.1 Protena na nutrio

3.2 Degradao da protena

Figura 1. Esquema da degradao protica no rmen.

3.3 Valor protico dos alimentos estimado por modelos matemticos

3.4 Mtodos para estimar a degradao protica

3.4.1 Mtodo in vivo:

NM = marcador na digesta marcador nos microorganismos Teor de N dos microorganismos

PDR = CN (N total (NM + N-NH3))

3.4.2 Mtodo in situ:

Onde: P = degradabilidade potencial da protena;

= taxa constante da funo b.

Degradabilidade efetiva = a+ ((b c) / (c + k))

Onde: k = taxa de passagem das partculas slidas do rmen.

PDR= A + B [ kd/ (kd+kp)]

PNDR = B [ kp/ (kd+kp)] + C

3.4.3 Mtodo in vitro:

N para distinguir a frao protica utilizada pelos microorganismos da frao

4.1 Local e poca

4.2 Material experimental

Figura 2 Resumo dos ensaios realizados

Tratamento prvio da amostra

96,7 97,5 95,2

93,1 71,4 76,0

8,26 9,67 3,09

20,0 25,4 41,5

75,6 72,7 46,3

4,4 1,9 12,2

92,4 92,6 91,7 91,5

93,0 77,7 77,4 77,4

5,11 3,94 1,77 1,91

43,3 70,8 8,0 35,2

52,5 23,2 81,5 53,4

4,2 6,0 10,5 11,4

4.3 Desenvolvimento da metodologia

4.3.3 Ensaio de solubilizao do nitrognio

4.3.4 Ensaio in situ

4.3.5 Avaliao do mtodo in vitro

N duodenal (g/dia)= (N duodenal (% da MS) MS duodenal (g/dia)/100

N amoniacal (g/dia)= (N duodenal (g/dia) N amoniacal (% do N))/100

Assume-se que o N endgeno est includo no N residual do alimento.

36 4.4 Anlises qumicas

4.5 Clculos e estimativas

4.5.1 Correo da concentrao de amnia no meio de incubao pela incluso de amido

15,00 Contedo de N-NH3 (mg) na garrafa

0,00 0 -5,00 tempo (h) 20 40 60 80

20,0 Contedo de N-NH3 (mg) garrafa

y = -0,2907x + 17,899 R2 = 0,9953

4.5.2 Clculo da degradabilidade in vitro da protena bruta

4.5.3 Clculo da taxa de degradao in vitro da protena bruta

y = -0,0108x + 0,1473 R = 0,989 y = -0,014x + 0,1549 R = 0,9885

4.5.4 Clculo da taxa de degradao in situ

Onde: P = degradabilidade potencial do alimento;