Sunteți pe pagina 1din 520

MICROBIOLOGIE GENERALA Gr.

Mihaescu, Carmen Chifiriuc, Lia Mara Ditu CUPRINS


Prefa Cuvnt nainte Introducere Evoluia microbiologiei ca tiin Diviziunile microbiologiei Importana practic a microorganismelor Poziia microorganismelor in sistemele de clasificare a lumii vii Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor Clasificarea lumii vii n 3 domenii pe baza criteriilor moleculare Caracteristicile distinctive ale organismelor celor trei domenii Tipuri morfologice de bacterii Capitolul I. STRUCTURA i FUNCIILE CELULEI BACTERIENE Peretele celular Structura molecular a peretelui celular la bacteriile Gram pozitive Peretele celular la bacteriile Gram negative Peretele celular la Archaea Peretele celular acido-rezistent al micobacteriilor Stratul S Funciile peretelui celular Protoplatii Spaiul periplasmic Membrana plasmatic Membrana archaea Funciile membranei plasmatice Difuzia i transportul moleculelor n celul Difuzia pasiv Sisteme de transfer cu molecule purttor Difuzia facilitat Translocaia de grup Transportul activ Ttransportut ionilor Aparatul fotosintetic Mezosomul Citoplasma Echilibrul osmotic al celulei Echilibrul osmotic la bacteriile halofile Nucleoidul bacterian Organizarea fizic a cromosomului Replicarea ADN bacterian Ribosomii Particularitile sintezei proteinelor la bacterii Secreia proteinelor extracelulare la bacterii Sporul Structura intern a endosporului Particularitile biochimice ale sporului Semnificaia biologic a procesului de sporogenez Formarea sporilor de multiplicare la actinomicete Vacuolele cu gaz (aerosomii) Incluziile Glicocalixul

Natura chimic a materialului capsular Sinteza exopolizaharidelor Glicocalixul comportamental Flagelul Structura flagelului Motilitatea i chimiotaxia Fimbriile Pilii Capitolul II. CRETEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR Creterea celulei bacteriene Multiplicarea prin diviziune Mecanismul molecular al diviziunii Diviziunea asimetric Segregarea cromosomilor Reglarea procesului de diviziune Dinamica unei culturi bacteriene discontinui Culturi continui Capitolul III. NUTRIIA BACTERIAN~ Tipuri de nutriie a microorganismelor Nutriia autotrof Nutriia fotolitotrof Nutriia chimiolitotrof Bacteriile care oxideaz H2 i CO Bacteriile metanogene Importana ecologic a bacteriilor metanogene Bacteriile care oxideaz sulful i compuii si Bacteriile care oxideaz compuii Fe Bacteriile care oxideaz amoniacul i nitritul Fixarea CO2 la bacteriile chimiolitotrofe. Ciclul Calvin Nutriia organic a bacteriilor chimiolitotrofe Nutriia chimioorganotrof (heterotrof) Factorii de cretere Capitolul IV. METABOLISMUL BACTERIAN Particularitile generale ale metabolismului bacterian Metabolismul energetic bacterian Tipuri de metabolism energetic n funcie de acceptorul final de electroni Reacii de oxidare a substratului energetic Potenialul redox si fora proton-motrice Respiraia aerob bacterian Componentele catenei respiratorii bacteriene Sinteza ATP dependent de gradientul protonic Mecanisme moleculare protectoare care permit respiraia aerob Respiraia anaerob Respiraia nitrailor Reducerea asimilatorie a nitrailor Respiraia sulfatului Respiraia fumaratului Respiraia carbonatului(Reducerea respiratorie a CO2) Fermentaia Fermentaia glucidelor Fermentaia lactic Fermentaia alcoolic produs de levuri Fermentaia alcoolic bacterian Fermentaiile acide Fermentaia butiric

Fermentaia butanediolului Fermentaia acidului propionic Catabolismul lipidelor Catabolizarea compuilor organici cu azot Catabolismul compuilor aromatici Catabolismul compuilor cu un atom de C. Bacterii metilotrofe si metanotrofe Catabolismul alcoolului etilic Reaciile de anabolism Cile anaplerotice. Calea glioxilatului Cap. V. INFLUENA FACTORILOR FIZICI I CHIMICI ASUPRA MICROORGANISMELOR Temperatura Microorganisme criofile Microorganisme mezofile Microorganisme termofile Microorganisme hipertermofile Sterilizarea Principiile sterilizrii termice i dezinfeciei Presiunea osmotic Presiunea hidrostatic Energia radiant Aciunea laserului Aciunea ultrasunetelor Aciunea substanelor chimice asupra microorganismelor Mecanismele de aciune a substanelor antibacteriene Substane antibacteriene active prin modificri de permeabilitate Substane care acioneaz prin denaturarea proteinelor Evaluarea potenialului antibacterian al agenilor chimici Coeficientul fenolic Substane care acioneaz prin interferen cu gruprile active ale proteinelor-enzime Colorani antiseptici Ageni sterilizani n faz de vapori Agenii chimioterapeutici Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv. Sulfonamidele Quinolonele Ali ageni chimioterapeutici Antibioticele Clasificarea antibioticelor in funcie de structura chimic Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular Antibiotice antiribosomale Antibiotice care modific permeabilitatea membranei plasmatice Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici Capitolul VI. VIROLOGIE Modelul general de structur a virionului Capsida viral Inveliul extern Genomul viral. Organizare fizic Modaliti particulare de codificare a informaiei genetice Genomuri virale ARN segmentate (divizate, multipartite) Definirea conceptului modern de virus Natura virusurilor Simetria virusurilor Simetria helical Simetria icozaedric Construcia virionilor icozaedrici

Simetria complex (binar) Multiplicarea virusurilor Iniierea procesului infecios Ptrunderea virusului n celul Sinteza ARNm la dezoxiribovirusuri Sinteza ARNm la ribovirusuri Biosinteza proteinelor timpurii Replicarea genomului viral Replicarea genomului ADN Replicarea i transcrierea genomului viral ARN Biosinteza proteinelor tardive Asamblarea (morfogeneza) viral Eliberarea virionilor Infeciozitatea acizilor nucleici Tipuri de relaii virus-celul Patologia celulelor infectate cu virusuri Mecanismele moleculare ale interaciunii virus-celul. Efectul citopatic (ECP) 1. Modificri metabolice 2. Pierderea funciilor membranei celulare 3. Modificri ale citoscheletului 4. Apariia corpilor de incluziune Relaii ntre virusuri i organisme Tropismul viral Tipuri de infecii in vivo Persistena viral Mecanismele persistenei virale Bacteriofagii Anatomia molecular a fagilor din seria T-par Relaiile fag-bacterie Ciclul litic al interaciunii fag-bacterie. Multiplicarea bacteriofagului Importana fenomenului de bacteriofagie Ciclul lizogen Proprietile bacteriilor lizogene Importana studiului cuplului lizogen fag -E. coli Noiuni generale de oncogenez Agenii fizici i chimici ai malignizrii Caracterele generale ale celulelor normale Particularitile funcionale ale celulelor maligne Oncogenele celulare Virusuri oncogene Oncogeneza cu retravirusuri Oncogenele retravirale Interaciunea oncodnavirusurilor cu substratul celular Transformarea cu papovavirusuri Transformarea cu papilomavirusuri Latena Dezvoltarea verucilor Ageni infecioi subvirali Viroizii Patogenitatea viroizilor Virusoizii Virino Prionii Originea i apariia prionilor Originea i evoluia virusurilor Originea virusurilor din acizii nucleici celulari Originea ribovirusurilor Evoluia virusurilor

Recombinarea ca factor de evoluie Rolul mutaiilor n evoluia ribovirusurilor Capitolul VII. NOIUNI DE GENETIC~ BACTERIAN~ Organizarea funcional a genomului bacterian Plasmidele Clasificarea plasmidelor Structura molecular a plasmidelor Structura genetic i funciile plasmidelor Controlul numrului de copii plasmidiale Incompatibilitatea plasmidelor Eliminarea plasmidelor Replicarea plasmidelor Distribuia plasmidelor in procesul diviziunii celulare Recombinarea plasmidelor Plasmidele F Plasmidele R Mecanismele rezistenei bacteriene la antibiotice Cauzele fenomenului de rezisten la antibiotice Plasmidele Col Mecanismele de aciune a bacteriocinelor Mecanismele variabilitii la bacterii 1. Mutaiile Mecanisme de reparaie genetic Fotoreactivarea Rspunsul reparator adaptativ Excizia bazelor catalizat de glicozilaze i endonucleaze Reparaia prin excizia i resinteza nucleotidelor Sistemul reparator inductibil SOS 2. Elementele genetice transpozabile ale bacteriilor Secvenele de inserie Transpozonii Bacteriofagii transpozani Transpoziia Consecinele transopoziiei 3. Mecanisme de transfer al materialului genetic la bacterii Transformarea genetic Mecanismul molecular al transformrii genetice Conjugarea bacterian Determinismul genetic al procesului de conjugare Etapele procesului de conjugare Rolul pililor n procesul de conjugare Transferul ADN plasmidial n cuplul F+ x FTransferul ADN cromosomal n cuplul Hfr x FConjugarea la bacteriile Gram pozitive Sexducia Transducia genetic Conversia fagic Transfecia Reglarea activitii celulei bacteriene Modelul reglator al operonului Reglarea pozitiv(Inducia sintezei enzimelor) Reglarea negativ(Represia sintezei enzimelor) Represia sintezei enzimelor ntr-un sistem biosintetic. Operonul triptofanului Controlul activitii enzimelor. Inhibiia prin produsul final Controlul sintezei proteinelor la nivelul traducerii Represia prin catabolit

Principii de inginerie genetic Ingineria genetic la nivel celular Fuziunea protoplatilor bacterieni Premisele tiinifice ale ingineriei genetice moleculare Enzimele de restricie Enzimele de modificare Etapele reprogramrii microorganismelor prin tehnologia ADN recombinant(clonarea molecular) Aplicaii ale clonrii moleculare Utilizarea microorganismelor n biotehnologie Fazele culturii unui microorganism industrial Scopul biotehnologiilor cu microorganisme Enzime glicolitice Proteaze Celulaze Lipaze Acidul lactic Acidul citric Acidul acetic Aminoacizi Vitamine Utilizarea levurilor in microbiologia industrial Fermentaia alcoolic a. Obinerea alcoolului etilic din cartofi i cereale b. Utilizarea levurilor in vinificaie c. Utilizarea levurilor n industria berii d. Utilizarea levurilor n panificaie Biosinteza substanelor antibiotice Biosinteza penicilinei Bioconversia Producerea masei celulare Dirijarea proceselor fermentative Capitolul VIII. BIODIVERSITATEA MICROORGANISMELOR Importana studiilor de biologie molecular pentru determinarea biodiversitii Particularitile diversitii microorganismelor n diferite ecosisteme Semnificaia marii diversiti microbiene ntr-un habitat Grupe de microorganisme eucariote Alge Organizare celular i fiziologie Reproducere Clasificare Chlorophyta(Alge verzi) Phaeophyta (Alge brune) Rhodophyta(Alge roii) Bacillariophyta(Diatomee) Pyrrophyta(Dinoflagelate) Euglenophyta Importana algelor Protozoare Organizare celular i fiziologie Reproducerea Clasificare Mastigophora (Flagelate) Sarcodina Sporozoa Ciliophora

Fungii Organizare celular i fiziologie Reproducerea Clasificare Oomycetes Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) Myxomycetes (Gymnomyxa) Importana fungilor Micotoxine Capitolul IX. NOIUNI DE ECOLOGIA MICROORGANISMELOR A. TIPURI DE INTERACIUNI {NTRE POPULAIILE DE MICROORGANISME Interaciuni negative Interaciuni pozitive Simbioza Rolul endosimbiozei n geneza celulei eucariote Simbioze insecte-microorganisme Simbioze fixatoare de N2 Simbioza Rhizobium-plante leguminoase Simbioze asociative. Fixarea azotului n rizosfer Actinorize. Simbioza Frankia-angiosperme neleguminoase Micorizele Ectomicorize Endomicorize. Micorizele veziculo-arbusculare Rolul micorizelor in biologia plantelor Simbioza cianobacterii-fungi sau alge-fungi (Lichenii) Parazitismul intracelular Prdarea Procariote prdtoare B. MICROBIOTA NORMALA A MAMIFRELOR Colonizarea i succesiunea populaiilor de microorganisme ale organismului uman Microbiota normal a tegumentului Microbiota tractului respirator Microbiota tractului digestiv Microbiota din rumen Rolul fiziologic al microbiotei gastrointestinale Translocaia bacteriilor din intestin Microorganismele probiotice Microbiota tractului urogenital Gnotobioza i animalele gnotobiotice Caracteristicile animalelor germ-free PROPRIET~ILE MICROORGANISMELOR PATOGENE Patogenitatea Virulena Factorii care condiioneaz virulena a)Infeciozitatea Adezinele Sideroforii ca factori de virulen b)Agresivitatea (Invazivitatea) c)Toxigenitatea Toxine bacteriene

Clasificarea toxinelor Toxicitatea exotoxinelor Receptori celulari pentru toxine Mecanismele generale de aciune a toxinelor Endotoxine Efectele endotoxinelor LPS Condiile de apariie a procesului infecios a)Izvorul de infecie b)Cile de eliminare a agenilor patogeni c)Cile de transmitere a agenilor infecioi d)Poarta de intrare in organism Tipuri de infecii D. ROLUL MICROORGANISMELOR {N CIRCUITUL GLOBAL AL MATERIEI {N NATUR~ Circuitul biogeochimic al azotului Amonificarea Nitrificarea Denitrificarea Circuitul oxigenului Circuitul carbonului Degradarea biologic a constituienilor vegetali Scoaterea din circuit a carbonului organic sau anorganic Circuitul fosforului in natur Circuitul sulfului in natuir Mineralizarea compuilor organici ai sulfului Oxidarea compuilor anorganici ai sulfului E. NOIUNI DE MICROBIOLOGIA APELOR Diversitatea mediilor acvatice Factorii fizici si chimici care influeneaz prezena microorganismelor in mediile acvatice Comportamentul microorganismelor n mediul salin Marea - mediu natural pentru microorganisme Degradarea substanelor organice n ocean ACTIVITATEA GEOLOGIC~ A MICROORGANISMELOR Transformrile microbiene ale fierului i manganului Biosolubilizarea metalelor. Leierea bacterian Recuperarea metalelor prin acumulare de ctre microorganisme Rolul microorganismelor n formarea zcmintelor de petrol NOIUNI DE MICROBIOLOGIA SOLULUI Formarea solului Materia organic din sol Factorii de mediu care influeneaz microbiota din sol Microbiota din sol Interaciuni intre rdcinile plantelor i microorganismele din sol. Rizosfera BIODEGRADAREA SI BIODETERIORAREA MICROBIAN~ Modificri ale substratului induse de aciunea microorganismelor Biodegradarea petrolului Biodeteriorarea cauciucului Degradarea tesuturilor vegetale asociat cu termogeneza microbiana Coroziunea bacterian a metalelor Substanele xenobiotice-poluani ai mediului nconjurtor Efectele ecologice ale substanelor xenobiotice Degradarea microbian a substanelor xenobiotice Bazele genetice ale degradrii compuilor organici halogenai

Incapacitatea poluanilor de a induce sinteza enzimelor degradative Cap. X. Imunologie A. Antigene Modelul general al structurii antigenelor Proprietile definitorii ale antigenelor Determinanii antigenici Haptene Clasificarea i imunogenitatea antigenelor Antigene moleculare Antigene corpusculare B. Sistemul imunitar Mecanisme de aprare la nevertebrate Organizarea sistemului imunitar la vertebrate Limfocitele Limfocitele B Limfocitele T Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT) Celulele NK Imunoglobulinele (Anticorpii) Structura moleculei de Ig Funciile moleculei de Ig Heterogenitatea anticorpilor Heterogenitatea izotipic Ig G Ig A Ig M Ig E Ig D Variantele alotipice Variantele idiotipice C. Bazele genetice ale generrii diversitii receptorilor de antigen Mecanismele genetice ale diversitii imunoglobulinelor Mecanismele genetice ale generrii diversitii RCTi D. Moleculele complexului major de histocompatibilitate Structura moleculelor CMH clasa I Structura moleculelor CMH clasa II E. Rspunsul imun adaptativ Particularitile generale ale rspunsului imun Etapele rspunsului imun Celulele prezentatoare de antigen (CPA) Prelucrarea antigenelor Rolul moleculelor CMH n prezentarea antigenelor Prezentarea antigenelor exogene n asociaie cu moleculele CMH II Prezentarea antigenelor endogene n asociaie cu moleculele CMH I Modelul recunoaterii antigenelor de ctre limfocitele T Dinamica rspunsului imun mediat humoral Rspunsul imun humoral secundar F. Rezistena antiinfecioas nscut Sisteme celulare cu rol n rezistena antiinfecioas nespecific Sistemul fagocitar mononuclear Receptorii membranari ai macrofagului Activarea macrofagului Sistemul fagocitar polimorfonuclear Diferenierea neutrofilelor

Sisteme bactericide n PMNN Sistemul complement Mecanismul general de activare a sistemului complement Calea clasic de activare a complementului Calea altern a fixrii complementului Calea lectinic Funciile complementului Rolul complementului n aprarea antiinfecioas Procesul inflamator Efectorii celulari ai inflamaiei Reactanii de faz acut

Bibliografie selectiv Coninutul acestui manual a fost elaborat pe baza consultrii unui vast material bibliografic, reprezentat n primul rnd Microbiological reviews, MMBR sau Annual Reviews of Immunology, la care se adaug numeroase articole din alte reviste, dar i cri sau tratate de specialitate. Periodice Applied Microbiology Applied and Environmental Microbiology Archives of Microbiology J. of Biological Chemistry Can. J. of Microbiology Clinical Microbiological Reviews Journal of Bacteriology J. of. Gen. Microbiology J. of Clinical Microbiology J. of Medical Virology Journal of Virology Journal of General Virology Microbiological Reviews Microbiology and Molecular Biology Reviews (MMBR) Nature Proc. Natl. Acad. Sci. USA Science Virology Scientific American, etc. Cri Alberts B., Bray D., Lewis J. Molecular biology of the cell, 3rdEdition, Garland Publishing, 1994. Black J. G. Microbiology. Principles and Applications, 3rd Edition, Prentice Hall, Upper Sadle River, 1996 Brock Th. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988, 2000, 2003. Cajal N. Tratat de Virologie Medical, vol. I, Editura Medical Bucureti, 1990.

Davis B., Dulbecco R., Eissen H. Microbiology, 4th Edition, New York Lippincott, 1990. Fields B. N., Knipe D. M. Virology, Second Edition, Raven Press, Ltd., New York, 1990. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology, 3rd Edition Lippincot-Raven Publishers, Philadelphia, 1996 Freifelder D. Molecular Biology, second Edition, Jones adn Bartlett Publishers Inc., Boston, 1987. Lederberg J. Encyclopedia of Microbiology, Academic Press Inc., 1992. Lehninger A. L. Biochimie, vol. I, Traducere dupa editia a II-a, Editura Tehnica Bucuresti, 1975. Le Minor Leon, Michel V. Bacteriologie medicale, Flamarion Medicine Sciences, 1990. Mihescu G., Gavril L. Biologia microorganismelor fixatoare de azot, Editura Ceres, Bucureti, 1989. Nester E., Pearsall N., Roberts J., Roberts E. The Microbial Perspective, Saunders College Publishing, 1982 Stanier R. Y., Doudoroff M., Adelberg E. A.- The Microbial world, Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, 1970. Starr M. P si colab., The Prokaryotes, Springer Verlag, Berlin, New York, 1981. Streips N. U., Yasbin R. E. - Modern Microbial Genetics, Willey- Liss, 1991. Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Edition, Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990 Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, A. Sussman, 1998. Watson J. D., Hopkins R, Steitz W. Molecular Biology of the Gene, The Benjamin Cummings Comp.,1987. Wistreich G. A., Lechtman M. D. Microbiology, Macmillan Publishing Comp., 1984. Zarnea G. Microbiologie general, Editura Didactic i Pedagogic Bucureti, 1970 Zarnea G. Tratat de Microbiologie general, volumele I, II, III, V, 1983-1994. Pentru elaborarea seciunii de Imunologie au fost consultate urmtoarele titluri de reviste i cri: Periodice Annual Reviews Biochemistry Annual Reviews Immunology Annual Reviews Microbiology Bulletin dInstitut Pasteur Cancer Immunology Cell Clinical Microbiology Reviews EMBO Journal Immunology Today Journal of Immunology Mediators of inflamation Microbiology and Molecular Biology Reviews Nature Scientific American Science Cri Delves P.J, Roitt I. M. Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4, sec. ed., 1998, Acad. Press. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fields Virology, 3rd edition, Lippincot Raven Publishers, Philadelphia, 1996. R. A Goldsby, T. J. Kindt, Barbara A. Osborne - Kuby Immunology, 4-th Ed., W.H. Freeman and Company, New York. Male D., Champion B., Anne Cook Advanced Immunology, J.B. Lippincot Company, 1987. Patrick S. and Larkin M. J. - Immunological and molecular aspects of bacterial virulence, J. Wiley & Sons, 1995. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, 1997, Blackwell Science Samter M, Talmage D.W., Frank M.M., Austen K.F., Claman H.N. Immunological diseases, vol. I, II, fourth ed., Boston, Toronto. Serhan C. N., Ward P. A. - Molecular and Celular basis of Inflamation, 1999, Humana Press. Sheehan Catherine Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis, sec. edition,

1997, Lippincot, Philadelphia, New York Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990 Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, vol. IV Immunology, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998. Weir D.M., Stewart J. Immunology , seventh edition, Longman Group, UK, 1993. Zarnea G. Tratat de Microbiologie, vol. IV Imunobiologie, Ed. Academiei Romne, 1990. Zarnea G., Mihescu Gr., Ioni A. - Principii i tehnici de imunologie, Ed. Univ. Buc., 1993. Zarnea G., Mihescu Gr. Imunologie, Ed. Universitii Bucureti, 1995. Zwilling B.S., Eisenstein T. K. Macrophage- Pathogen Interactions, 1994, New York, Basel, Hong Kong.

INTRODUCERE Obiectul de studiu al Microbiologiei este biologia microorganismelor, adic studiul organismelor mici, vizibile numai la microscop. Etimologic, noiunea de microorganism are sensul de organism mic. Cu acelai sens se folosete noiunea de microb, mai ales in cazul microorganismelor patogene. Dei utilizat n mod curent, termenul de microb nu este tiinific. Noiunea de microb a fost introdus de Sedillot (l878), cu sensul ei tiinific: micro + bios = via scurt. Termenul s-a pstrat i a dat numele domeniului Microbiologiei. Noiunea de microorganism nu are semnificaie taxonomic, deoarece reunete un grup vast i heterogen de organisme diferite ca poziie sistematic i ca organizare structural, dar care se aseamn prin trei proprieti comune: - toate au dimensiuni microscopice, ceea ce le face invizibile cu ochiul liber; - n general au organizare unicelular. Chiar dac unele microorganisme formeaz asociaii pluricelulare, ele rmn, n esen, organisme unicelulare, deoarece, o celul izolat din complexul multicelular i pstreaz viabilitatea, crete, se divide i reface asociaia; - structura lor intern este relativ simpl, comparativ cu a macroorganismelor. Heterogenitatea microorganismelor este definit de alte trei caracteristici: - poziia sistematic a microorganismelor este foarte diferit; - activitile biologice (fiziologice) pe care le desfoar sunt foarte diversificate - morfologia si structura intern a diferitelor grupe de microorganisme sunt foarte diferite. Cadrul larg al noiunii de microorganism cuprinde urmtoarele grupe: 1. Eubacteria (bacterii adevrate); 2. Cyanobacteria (fostele alge albastre-verzi) 3. Archaea, un grup de microorganisme asemntoare cu bacteriile adevrate, din punct de vedere morfologic i structural. Toate cele trei grupe au organizare celular de tip procariot. Celelalte microorganisme, cu poziie sistematic heterogen au organizare celular de tip eucariot: 1. Fungii microscopici, cu un numr mare de reprezentani; - levurile cu organizare unicelular - mucegaiurile (fungi filamentoi), cu organizare pluricelular; 2. Algele microscopice 3. Protozoarele. Denumirea de bacterie a fost introdus de Ehrenberg (l838). El a creat denumiri de gen: Bacterium, Spirillum, Spirochaeta, fr s stabileasc deosebiri ntre bacterii i protozoare. Dei virusurile nu sunt microorganisme, aceast lucrare cuprinde un capitol de Virologie n care sunt prezentate, ntr-o form general, virusurile i entitile moleculare infecioase cu organizare subviral (viroizii i prionii). Virusurile sunt entiti infecioase cu un nivel nalt de organizare, alctuite n esen, din proteine i un acid nucleic (ADN sau ARN). Studiul interaciunii virus-celul (in special fagul lambda-E. coli) a avut un rol decisiv in dezvoltarea biologiei moleculare. Viroizii sunt entiti infecioase alctuite dintr-o molecul de ARN pur, patogene pentru unele plante de cultur. Prionii sunt entiti infecioase de natur proteic. Pentru studiile referitoare la natura lor, modalitatea de transmitere i la mecanismele patogenezei, lui S. Prusiner, n l997 i s-a decernat Premiul Nobel. Evoluia Microbiologiei ca tiin Microbiologia este o tiin relativ tnr. Ea s-a cristalizat ca un domeniu particular al tiinelor biologice, n a II-a jumtate a secolului l9. In l655, A. Kircher a intuit existena unor forme de via, invizibile cu ochiul liber. Primele microorganisme au fost vzute cu ajutorul unui aparat optic de mrire a imaginii, de ctre olandezul A.van Leevenhoek in l676. Cu aparatele sale de construcie proprie, el a examinat picturi de ap din diferite surse naturale sau de saliv cu raclaj dentar i a observat o lume fascinant, cu densiti neobinuite, ntr-o micare perpetu. In descrierile i n desenele sale pe care le-a prezentat Societaii Regale din Londra, printre alte organisme se recunosc bacteriile. Din acest motiv, pn n l976, Leevenhoek a fost considerat descoperitorul bacteriilor. Dar gndirea de atunci nu a reuit s reuneasc lumea microorganismelor cu restul lumii vii. In l976, la 300 de ani de la descrierea lor, chiar cercettorii olandezi au considerat c este nedrept ca Leevenhoek s fie considerat descoperitorul bacteriilor, deoarece el nu a intuit particularitile structurale i

funcionale ale acestor organisme, ci le-a considerat ca fiind nite pui ai animalelor acvatice mai mari. De aceea le numea animalcule. Dei lupele sale aveau o putere de mrire net superioar celor de azi, Leevenhoek nu a sesizat noutatea lumii pe care a vzut-o. Caracterele aparte ale microorganismelor au fost intuite de F. Cohn (l875). El le-a definit ca organisme microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct i este considerat ntemeietorul Microbiologiei ca tiin. De o importan excepional pentru dezvoltarea Microbiologiei sunt descoperirile lui L. Pasteur (l822l895). El era preocupat de activitile fziologice ale microorganismelor, n special fermentative i patologice. Pentru a le descrie, Pasteur folosete diferite denumiri: ciuperci, infuzori, bacterii, levuri, monade. El a nfiinat primele laboratoare de cercetare microbiologic. Contribuiile sale de excepie se nscriu n urmtoarele domenii: - a demonstrat experimental, ca fermentaiile nu sunt procese pur chimice, ci sunt procese biologice, rezultatul activitii metabolice a microorganismelor anaerobe. A definit procesul fermentativ ca fiind rezultatul vieii fara aer a microorganismelor anaerobe. Odat cu descrierea proceselor fermentative, Pasteur a pus bazele Microbiologiei industriale; - a pus bazele teoretice ale Microbiologiei medicaleumane i veterinare, demonstrnd cauzele producerii maladiilor infecioase. Pn atunci se cunotea caracterul transmisibil (contagios) al acestora, dar nu se tia ca ele sunt rezultatul ptrunderii in organism a unor ageni patogeni; - a demonstrat ca proprietile de patogenitate si virulent a microorganismelor se pot modifica in vitro. Astfel, din culturile de bacterii patogene i virulente deriv culturi cu virulen atenuat, care se pot utiliza ca vaccinuri. Pasteur a pus astfel bazele unei activiti practice de o importan practic excepional vaccinarea; - a fundamentat tiinific domeniul imunitii antiinfecioase, creind un domeniu nou al tiinelor biologice Imunologia, nscut ca o ramur a Microbiologiei, dar care ulterior s-a separat complet, ca un domeniu de sine stttor; - este ntemeietorul primului Institut de Microbiologie din lume Institutul Pasteur din Paris; - n plan teoretic, Pasteur a a rezolvat controversa generaiei spontane, demonstrnd cu argumente experimentale c microorganismele sunt forme de via cu un grad nalt de organizare, ce nu pot lua natere spontan din materia organic. Totdeauna microorganismele i au originea n alte celule, care contamineaz materia organic. In l897, Beijerinck a descoperit virusurile. El a intuit natura particular a agentului mozaicului la tutun i l-a considerat ca fiind contagium, vivum, fluidum (agent contagios, viu-corpuscular-filtrabil). Iniial, Virologia s-a dezvoltat ca o ramur a Microbiologiei, dar raportndu-ne la natura particular a virusurilor, Virologia este o tiin independent. La noi n ar, V. Babe, mpreun cu Cornil (Frana) este autorul primului Tratat de Bacteriologie din lume. In sistemul nervos al animalelor moarte de turbare a descris prezena incluziilor Babe-Negri. I. Cantacuzino este ntemeietorul Institutului de Microbiologie i mentorul colii de Microbiologie din perioada interbelic. Diviziunile Microbiologiei Procariotele populeaz orice mediu adecvat pentru formele superioare de via, dar i o varietate de medii cu condiii extreme, restrictive pentru majoritatea organismelor superioare. Diversitatea proceselor fiziologice bacteriene, precum i rolul lor esenial n ecosistemele naturale, dar i capacitatea de a sintetiza substane utile sau de a produce procese infecioase la organismele superioare au creat, nc de la nceputurile dezvoltrii sale ca tiin, premisele diversificrii domeniilor de studiu al microorganismelor, unele cu un accentuat caracter utilitar. Microbiologia industrial s-a dezvoltat pornind de la descoperirea proceselor fermentative de ctre Pasteur. Ea studiaz utilizarea microorganismelor productoare de substane utile pentru alimentaie, terapeutic sau pentru diferite industrii. Domeniul s-a extins la studiul proceselor de biosintez si bioconversie. Microbiologia solului studiaz ansamblul microorganismelor din sol, interrelaiile dintre ele, precum i interaciunile dintre microorganisme si plante, dar n mod deosebit, rolul microorganismelor n fertilitatea solului i n circuitul elementelor biogene n natur. Geomicrobiologia se distinge prin caracterul ei pregnant utilitar. Studiaz, n special, microbiologia petrolului: rolul microorganismelor n geneza petrolului; posibilitatea utilizrii microorganismelor n exploatarea petrolului; rolul microorganismelor n biodegradarea petrolului. Studiaz rolul microorganismelor n geneza zcmintelor minerale i posibilitatea utilizrii microorganismelor pentru exploatarea zcmintelor i pentru recuperarea metalelor din zcmintele srace.

Hidromicrobiologia studiaz microorganismele din mediile aquatice i rolul lor n lanurile trofice. Microbiologia marin, ramur a Hidromicrobiologiei studiaz microorganismele din marile bazine de ap srat, dar n special rolul lor n circuitul elementelor biogene. Microbiologia insectelor studiaz relaiile dintre microorganisme i artropode. S-a concretizat ca domeniu de sine stttor datorit rolului important pe care l au artropodele n patologia uman, animal i vegetal, ca vectori ai unor microorganisme patogene i ai unor virusuri. Microbiologia medical studiaz microorganismele patogene pentru om i animale. Studiaz particularitile lor fundamentale, adic patogenitatea i virulena, factorii care condiioneaz virulena, precum i modul lor de transmitere i posibilitile de combatere. Ecologia microorganismelor este o stiin de sintez care stabilete legitile generale de evoluie i interaciune a microorganismelor n natur. Studiaz interaciunile dintre microorganisme, precum i interrelaiile microorganismelor cu macroorganismele. Genetica microorganismelor este o ramur tnr, conturat dup l940. Studiaz substratul molecular al ereditii i variabilitii microorganismelor i mecanismele de transfer al materialului genetic la bacterii. Microbiologia general este o tiin biologic fundamental, care studiaz particularitile generale ale organizrii structurale i funcionale ale celulei bacteriene, sistematica, rspndirea microorganismelor n natur, relaiile lor ecologice cu alte microorganisme i cu macroorganismele, originea i evoluia lor, fenomenele de ereditate i variabilitate microbian. Microbiologia general este o tiin de sintez i se bazeaz pe datele domeniilor aplicative ale microbiologiei. Cadrul larg al Microbiologiei generale, contribuia sa imens la dezvoltarea multor ramuri ale biologiei i implicaiile ei teoretice i practice n evoluia altor stiine, determinate de posibilitatea utilizrii microorganismelor ca model experimental fac, ca studiul principiilor fundamentale ale microbiologiei generale s fie de o necesitate absolut pentru orice biolog modern indiferent de domeniul sau de specialitate ca i pentru biochimist i biofizician, genetician, medic, agronom, cercettor n industria fermentativ etc. Importana practic a microorganismelor De la descoperirea lor i pn astzi, interesul pentru studiul microorganismelor a nregistrat o cretere permanent, deoarece un mare numr de specii desfoar activiti benefice, realiznd procese de o valoare imens pentru societatea uman sau produc infecii la om i animale, cu efecte patologice mai mult sau mai puin grave. In mediile naturale, microorganismele realizeaz treapta mineralizrii (descompunerii) materiei organice vegetale i animale, avnd astfel un rol decisiv pentru ncheierea ciclului unor elemente biogene n natur (C, N, P, S), fcndu-le disponibile pentru reintegrarea lor n circuitul vieii. Fertilitatea i productivitatea sistemelor agricole depind n mare msur de activiti fiziologice ale bacteriilor din sol. Fixarea N2 este o activitate fiziologic exclusiv a unor procariote (eubacterii, cianobacterii). Cele din g. Rhizobium produc nodoziti pe rdcinile plantelor leguminoase. Ele reduc N2 la NH4, pe care l pun la dispoziia plantei gazd, fiind utlizat pentru sinteza proteinelor proprii. Astfel, bacteriile simbiotice, dar ntr-o msur mai mic i cele libere reduc necesarul de fertilizatori industriali pentru producia agricol. Bacteriile produc amonificarea materiei organice din sol, iar cele nitrificatoare oxideaz NH4+ la nitrai, iar cele denitrificatoare, reduc nitraii diminund fertilitatea solului. Microorganismele care populeaz tractul digestiv al animalelor i al omului formeaz microbiota normal, ce sintetizeaz vitamina K, esenial pentru mamifere, acidul folic, nicotinic, pantotenic, tiamina, riboflavina, biotina. De o importan deosebit este microbiota din compartimentul ruminal al mamiferelor rumegtoare. Rumenul are rolul unui fermentator natural, n care substratul vegetal este transformat n mas celular, format n special din bacterii i protozoare. Microorganismele constituie adevrata surs de proteine a ierbivorelor. Fr microbiota ruminal, producia ierbivorelor ar fi imposibil. In industria farmaceutic, producia de antibiotice (circa loo ooo t/an) este rezultatul activitii microorganismelor. Microorganismele au roluri multiple in industria alimentar. Majoritatea microorganismelor contaminante au aciune degradativ si de aceea alimentele trebuie protejate prin conservare chimic, prin ngheare sau uscare. Unele microorganisme au efecte favorabile asupra unor produse alimentare: brnzeturile, iaurtul i alte derivate din lapte sunt rezultatul activitii fiziologice a unor microorganisme asupra substratului. Dospirea aluatului de pine, producerea vinului i berii sunt rezultatul fermentaiei alcoolice a levurilor. Conservarea alimentelor vegetale i a furajelor se bazeaz pe fermentaia lactic produs be bacterii. Microorganismele sunt utilizate pentru producerea buturilor acidulate. Acidul citric, adugat multor buturi pentru conferirea aciditii este produs industrial de Aspergillus. De multe ori, astfel de buturi conin

fructoza, obinut din amidonul de porumb, prin aciunea bacteriilor amilolitice. Aspartamul, ca ndulcitor este un amestec de doi aminoacizi (acid aspartic si fenilalanina), ambii obinui pe cale microbiologic. Metanul este produs prin aciunea bacteriilor metanogene. Un interes deosebit prezint microorganismele n raport cu industria petrolului. Petrolul brut este supus atacului viguros al microorganismelor si de aceea forarea, exploatarea, dar in special depozitarea se fac in condiii care minimalizeaz aciunea microorganismelor. Microorganismele fotosintetizante utilizeaz energia solar pentru producerea biomasei, care poate fi convertit, ca i deeurile vegetale, in biocombustibili (metan si etanol), de alte microorganisme. Activitatea uman diminu rezervele diferitelor substane (metale) i microorganismele se folosesc pentru recuperarea metalelor din minereurile srace. Unul dintre cele mai importante domenii practice ale Microbiologiei este biotehnologia. In sens larg, biotehnologia utilizeaz microorganismele n procesele industriale, dar n ultimii l5 20 de ani, biotehnologia folosete microorganisme reprogramate genetic, prin tehnicile de inginerie genic. Importana microorganismelor a fost subliniat de Pasteur n aseriunea rolul unor fiine infinit de mici este infinit de mare. Microorganismele nu sunt numai benefice pentru activitatea uman. Un numr relativ mic de microorganisme patogene cauzeaz o larg diversitate de procese patologice, de la infecii locale, pan la septicemii. Microorganismele triesc n mediile naturale (ap, sol), pe suprafaa tegumentului i n tractul digestiv al omului i animalelor. Majoritatea populeaz mediile cu condiii obinuite, dar bacteriile cresc n mediile care ofer condiii fiziologice i biochimice extreme. Condiiile extreme sunt acelea care se abat mult de la cele normale(pH neutru, atmosfer aerob, salinitate de 1,5%, substratul energetic glucoza). Bacteriile sunt importante att din punct de vedere practic ct i teoretic, pentru studiul proceselor vieii n condiii extreme. Unele bacterii supravieuiesc n condiiile cele mai neadecvate: temperaturi extreme, desicare, ngheare, iar bacteriile extremofile, pentru creterea optim, sunt dependente de condiii speciale de mediu: presiunea uria a abisurilor marine, temperaturi mai mari de l00 grade, concentraii saline apropiate de nivelul de saturare a soluiei de NaCl, pH mai mic de 2 sau mai mare de 10. Bacteriile cresc n condiiile stresului produs de substratul energetic (energie chimic limitat sau chiar n prezena substanelor toxice). Dintre bacteriile extremofile, speciile hipertermofile anaerobe (Pyrococcus furiosus) cresc la temperaturi mai mari de 100o. Exist habitate naturale cu temperaturi crescute: solurile expuse radiaiei solare, platformele de gunoi (cu temperaturi de 60-70o), pn la lava vulcanic, de circa 1000o. Care este temperatura care permite desfurarea proceselor vieii ? Dup Brock, bacteriile cresc la orice temperatur la care exist ap lichid, chiar deasupra punctului de fierbere. Pn de curnd, mediile naturale cunoscute ca fiind populate de bacterii au avut circa 100o. In ultimele decade s-au identificat medii cu temperaturi de peste 350o, n emanaiile de pe fundul oceanelor, ridicnd problema existenei vieii n aceste medii. Din astfel de medii s-au izolat specii hipertermofile anaerobe, ce cresc la peste 100o. Deoarece legturile covalente ale proteinelor, ale ARN, ADN, ATP i NADP hidrolizeaz la 250 o i pentru c structura teriar a celor mai multe macromolecule este alterat la temperaturi mult mai mici, temperatura limit pentru procesele vieii pare a fi de peste 100o, dar mult sub 250o. Cel mai interesant grup de bacterii termofile este cel hipertermofil. Izolarea lor a ridicat pragul termic la care se cunoate c exist via. Pyrodictium occultum crete la 110o. Poziia microorganismelor in sistemele de clasificare a lumii vii In sistemul vechi de clasificare al lui Aristotel, lumea vie este mparit n dou regnuri: Plantae si Animalia. Odat cu descoperirea altor grupe de organisme, aceast clasificare a devenit nesatisfctoare, astfel nct numrul regnurilor s-a extins treptat Hogg (l86o) si Haeckel (l866) au sesizat dificultile de incadrare a unor organisme (Euglena, Chlamydomonas) si au propus un nou regn - Protista , pe care ulterior Hogg l-a denumit Protoctista , alturi de Plantae i Animalia. Acest sistem de clasificare a fost ameliorat de R. Stanier, prin diviziunea regnului Protista in dou subregnuri: - protiste inferioare, in care include microorganismele cu organizare de tip procariot (bacterii si cianobacterii) ; - protiste superioare, corespunznd microorganismelor eucariote si care cuprind algele, fungii si protozoarele. In aceas clasificare, regnul Protista include toate microorganismele eucariote i procariote, dar i un numr de macroorganisme pluricelulare nedifereniate (alge marine, bazidiomicete) .

Copeland (l938) a propus sistemul celor patru regnuri de clasificare a lumii vii: l. Regnul Monera, n care sunt incluse bacteriile i cianobacteriile. 2. Regnul Protoctista, cuprinznd organismele eucariote inferioare, cu organizare, n esen, unicelular, sinciial sau multicelular, fr difereniere celular avansat (alge, fungi, mixomicete si protozoare). 3. Regnul Plantae cuprinde plantele terestre i acvatice. 4. Regnul Animalia. Whittaker (l969) a propus un nou sistem de clasificare, care mparte lumea vie n 5 regnuri: Monera, Protoctista, Fungi, Plantae, Animalia. Bergey a schimbat denumirea regnului Monera, n cel de Procaryota. Criteriile de grupare ale sistemului se bazeaz pe trei niveluri de organizare: procariot; eucariot unicelular i pluricelular, precum i pe existena a trei modaliti principale de nutriie: fotosintetic si secundar absorbtiv caracteristic plantelor, ingestiv, tipic pentru majoritatea animalelor i absorbtiv, caracteristic fungilor. In acord cu aceste principii, sistemul de clasificare a celor 5 regnuri are urmtoarea structur: l. Regnul Monera include organisme unicelulare, cu organizare de tip procariot: bacterii, cianobacterii, actinobacterii. Toate sunt unicelulare sau unicelular-coloniale, cu excepia actinomicetelor, care au o organizare de tip micelial. Modul de nutriie este absorbtiv, iar metabolismul este de tip foto- sau chimiosintetizant. 2. Regnul Protoctista cuprinde microorganismele eucariote: algele microscopice, fungii acvatici flagelai i protozoarele. Limitele sale fa de celelalte regnuri nu sunt bine precizate. Termenul de Protoctista este preferat celui de Protista, deoarece, pe lng protozoare sunt incluse i organisme pluricelulare (alge marine, fungi inferiori), dar datorit absenei diferenierii tisulare sunt mai apropiate de organismele unicelulare. Metabolismul este foto- sau chimiosintetizant, iar nutriia este absorbtiv sau ingestiv. 3. Regnul Fungi cuprinde organisme eucariote imobile ce formeaz spori. Din spori, prin germinare se formeaz hifele, compartimentate n celule, prin septuri transversale. O aglomerare de hife formeaz miceliul. Prezint procese sexuale de tip connjugativ, rezultatul fiind un miceliu dicarion. Starea dicariot este eventual urmat de fuziune, iar diploidia este tranzitorie, deoarece prin diviziuni meiotice se formeaz spori haploizi. In absena procesului sexual, sporii se formeaz pe cale asexuat la vrful unor hife specializate i se numesc conidii. La germinare, sporii sexuai sau asexuai formeaz o hif. Aproape toi fungii sunt aerobi, dar sunt heterotrofi fr excepie. Nutriia este de tip absorbtiv. Fungii secret enzime care degradeaz moleculele nutritive complexe din mediul extern. Moleculele simple sunt transportate prin peretele i membrana fungic. 4. Regnul Plantae este mprit n dou grupe: plante nevasculare (briofite) i plante vasculare (trachaeofite). Ultimele au esuturi conductoare (xilem si floem). Xilemul transport apa i ionii de la rdcini spre parile aeriene, iar floemul transport seva elaborat n fotosintez, de la nivelul frunzelor, n toat planta. Plantele se dezvolt din embrioni diploizi. Spre deosebire de animale, formate n cea mai mare parte din celule diploide i de fungi care sunt organisme haploide sau dicariote, plantele alterneaz n ciclul lor de dezvoltare, generaiile haploid i diploid. Generaia haploid se numete gametofit, iar cea diploid se numete sporofit. La briofite predomin faza de gametofit, iar sporofitul este mic i cu aspect total diferit. La tracheofite, predomin sporofitul, iar gametofitul este constituit dintr-un grup de celule dependente de sporofit. 5. Regnul Animalia cuprinde organisme multicelulare, cu nutriie de tip ingestiv. Celulele sunt diploide si se dezvolt din doi gamei haploizi: ovulul si spermatozoidul. Dup fertilizare rezult celula ou diploid, ce strbate etapele de blastul i gastrul. Celulele animale sunt lipsite de perete i de plastide, dar au o difereniere tisular foarte inalt. Sistemele de clasificare cu 4 i 5 regnuri scot n eviden heterogenitatea microorganismelor. In sistemul celor 5 regnuri, microorganismele aparin regnurilor Monera, Protoctista i Fungi. Bacteriile se disting de celelalte organisme prin organizarea celular de tip procariot., pe care Chatton a evideniat-o nc din l925. Toate sistemele moderne de clasificare rezerv bacteriilor o poziie sistematic separat. Incadrarea lor alturi de plante este arbitrar si nelogic (Stanier, l977), iar pstrarea ei n pofida numeroaselor argumente tiinifice care probeaz contrariul este rezultatul refuzului de a privi lucrurile n fa. Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor Estimarea diversitii vieii este o provocare permanent a biologiei. Pentru microorganisme, scopul este complicat de faptul c subiectul inventarierii nu este vizibil cu ochiul liber i nici nu se difereniaz pe criterii morfologice. Estimrile anterioare ale numrului de specii bacteriene erau de 107- 109.

Clasificarea microorganismelor, anterior utilizrii analizei moleculare, s-a fcut pe baza urmtoarelor criterii: - morfologice (coci, bacili, spirili) - tinctoriale (reacia Gram) - structurale - metabolice (prin evidenierea capacitii de a metaboliza anumite glucide sau aminoacizi) - biochimice prin evidenierea markerilor moleculari caracteristici (mureina, acizii teichoici, lipidele cu legturi eterice din membrana Archaea etc). Criteriile clasice de clasificare a bacteriilor s-au dovedit utile pentru determinrile curente de laborator, dar nu au permis elaborarea unui sistem de clasificare bazat pe criterii naturale i nici explicarea legturilor filogenetice dintre procariote i eucariote. Pornind de la observaia lui Chatton (l925), n acord cu care exist dou tipuri distincte de organizare a lumii vii, procariot i eucariot, R. Stanier (n anii 60) a elaborat conceptul clasic, unificator, privind structura i funciile celulei bacteriene, pe baza unor criterii discriminatorii de tipul "totul sau nimic". Procariotele au fost definite pe baza diferenelor de compoziie chimic i a funciilor pe care le ndeplinesc structurile omologe ale organismelor procariote i eucariote. Conceptul elaborat de Stanier, dei a dominat gndirea microbiologic circa 30 de ani, nu corespunde realitii tiinifice, deoarece nu cuprinde toate procariotele. Clasificarea lumii vii n 3 domenii pe baza criteriilor moleculare In ultimii 15-20 de ani, locul criteriilor clasice a fost luat de metodele de analiz molecular. Descoperirea organismelor procariote, grupate n domeniul Archaea a invalidat conceptul clasic de bacterie, bazat pe particulariti biochimice i funcionale discriminatorii, n raport cu celula eucariot. Microorganismele Archaea creeaz o punte de legtur ntre tipul de organizare procariot i eucariot (Woese, l994), permind elaborarea unui arbore filogenetic comun al organismelor procariote i eucariote. Metodele de biologie moleculara, de secventiere a proteinelor si acizilor nucleici (denumite semantide Zuckerkandl si Pauling, 1965) au permis conturarea filogeniei bacteriene intr-un sistem de clasificare care cuprinde toate procariotele. Cu cat secventele semantidelor a doua organisme sunt mai asemanatoare, cu atat ele sunt mai apropiate filogenetic. Acest criteriu presupune ca genele codificatoare sa nu se transfere pe orizontala, de la o celula la alta. La bacterii, secvenierea proteinelor pentru scopuri filogenetice este neadecvat, pentru c uneori, o protein are o distribuie limitat sau este greu de secveniat (Zinder, l998). Metodele de biologie molecular au fost orientate n primul rnd asupra studiului acizilor nucleici. S-a determinat procentul G + C din ADN, dar testul nu este edificator, deoarece dou organisme cu secvene diferite de ADN pot avea aceeai proporie de G + C. Testul ramne valabil pentru a caracteriza un organism nou. Tehnica secvenierii ADN a revoluionat sistemele de clasificare a bacteriilor, deoarece a permis accesul la informaia coninut n ADN. Un alt test furnizat de biologia molecular, util pentru studiul filogeniei bacteriene este hibridarea ADN-ADN. ADN se denatureaz prin tratament termic sau cu baze. Metoda evideniaz capacitatea unei secvene de ADN monocatenar al unui organism de a forma un heteroduplex cu ADN monocatenar de la alt organism, pe baza omologiei secvenei de baze. Dac deosebirile secvenei de baze sunt mai mari de l5%, heteroduplexul nu se formeaz, astfel c acest test este negativ pentru organismele ndeprtate filogenetic, dar este decisiv pentru delimitarea speciei bacteriene. Woese i Fox au propus, ca instrument filogenetic pentru evaluarea raportului evolutiv dintre microorganisme, analiza secvenei ADN din care este transcris ARNr 16S (ribotipia). Ribotipia presupune folosirea probelor capabile s detecteze genele ce codific ARNr. Utilizarea genelor ARNr pentru identificarea bacteriilor i are originea n gradul nalt de conservare a genelor codificatoare a ARNr. Genele pentru sinteza ARNr sunt organizate n operoni, n care genele individuale sunt adeseori separate prin ADN necodificator. O prob de ARNr marcat sau ADN de la o specie va hibrida cu variate regiuni ale ADN de la specii bacteriene nenrudite. Tehnica de ribotipie implic izolarea ADN total al celulei bacteriene i fragmentarea sub aciunea unei enzime de restricie. Rezult astfel o colecie de fragmente de ADN cu o distribuie uniform a dimensiunilor. Fragmentele se separ prin electroforez n gel de agaroz i se transfer pe o membran de nitroceluloz prin capilaritate (blotting). Apoi fragmentele sunt hibridate cu o prob marcat care conine genele ARNr (ARNr de E. coli). Hibridarea apare numai n acele fragmente cromosomale care conin secvenele genelor ARNr.

Ribotipia a fost una dintre primele tehnici moleculare folosit cu succes pentru taxonomia vibrionilor. Astfel s-au identificat (i s-au depozitat n GenBank) peste 78 000 secvene ale genei pentru sinteza ARNr 16S, izolate de la bacterii cultivate sau obinute prin amplificare, direct de la probele din sol, fr cultivare. In anii 70, C. Woese a iniiat studiul secvenei ARNr (16S), ca un posibil marker filogenetic, folosind ARNr l6S cu lungimea l500-l600 nucleotide, component al subunitii mici (30 S) a ribosomului. Tehnica presupune izolarea ARNr i digestia sa cu RN-aza T1, care cliveaz dup fiecare rest de G. Rezult o varietate de fragmente de oligoribonucleotide, cu lungimea de l-25 baze, fiecare terminndu-se cu G. Amestecul se separ prin metoda electroforezei bidimensionale. Se nregistreaz tabloul oligonucleotidelor i se compar cu cel obinut de la alte organisme, stabilindu-se un coeficient de asemnare, a crui valoare variaz ntre 0 (pentru neasemnare) i 1 pentru identitatea complet. Astfel s-a evideniat c Cyanobacteria sunt asemntoare cu cloroplastele. Secvenele obinute prin amplificarea direct a probei din mediu, ofer singura informaie disponibil pentru 99% dintre procariotele din mediile naturale. Studiile recente sugereaz c numrul total al speciilor bacteriene, evaluat prin secvena de baze a genelor pentru ARNr 16S, este de peste 1030, grupate n cel puin 50 de filumuri bacteriene. Jumtate dintre ele sunt alctuite n ntregime din bacterii necultivabile. Alte 3 filumuri sunt formate din specii cultivate n proporie mai mic de 10%. Membrii a numai 6 filumuri au fost cultivai n proporie de peste 90%. Rezultatele cercetrilor de nivel molecular au artat ca sistemul de clasificare a lumii vii n cele 5 regnuri nu este corect din punct de vedere filogenetic, din mai multe motive: - cele dou regnuri de microorganisme eucariote Protista i Fungi sunt artificiale; - plantele i animalele (Metaphyta i Metazoa) au evoluat din organisme eucariote unicelulare; - n sistemul celor 5 regnuri, diferenele dintre Monera (Procaryotae) i celelalte 4 regnuri sunt mult mai mari dect diferenele ntre reprezentanii celor 4. Noul sistem de clasificare accept c forma de organizare eucariot nsumeaz o multitudine de caractere comune i definete o unitate filogenetic. Regnul Procaryotae (Monera) reunete diviziunea EUBACTERIA i ARCHAEA. La nivel citologic, ambele sunt procariote, dar la nivel molecular ARCHAEA se disting de EUBACTERIA. Ele nu constituie o unitate filogenetic, deoarece nu ntrunesc caractere unitare. La nivel molecular, organismele ARCHAEA se aseamn mai mult cu EUCARIOTELE dect cu EUBACTERIILE. Din aceast cauz, regnul Procaryotae (Monera) este un taxon nevalidat de datele de ordin molecular. Woese (l990) consider c noul sistem filogenetic, pe baza criteriilor moleculare, permite mprirea lumii vii n trei sisteme primare distincte. Clasificarea trebuie s recunoasc, n primul rnd, cele trei tipuri fundamentale de organisme: Eubacteria, Archaea i Eucaryotae. Gruprile trebuie s aib statutul de domenii, o categorie taxonomic superioar regnului. Autorul propune abandonarea denumirii de Archaebacteria, deoarece sugereaz nrudirea strns cu Eubacteria, care n realitate nu exist. Cele trei domenii se numesc Bacteria (sinonim Eubacteria), Archaea si Eucarya (sinonim Eucaryotae), care include organismele eucariote (protozoare, alge, fungi, plante, animale). Din punct de vedere fiziologic, microorganismele domeniului Archaea aparin la trei tipuri: metanogene, halofile i sulf-dependente. Metanogenele sunt strict anaerobe i produc gaz metan ca produs final al fermentaiei. Cele sulf-dependente triesc n medii termofile i reduc sulful elementar sau oxideaz compuii sulfului pentru a obine energie sub forma potenialului reductor. Sunt specii aerobe si anaerobe. Halofilele triesc n medii hipersaline i unele se protejeaz de lumin cu un pigment care conine carotenoizi. Sunt aerobe obligate. Din punct de vedere filogenetic, domeniul Archaea are dou diviziuni distincte (Kandler, l993): - Crenarchaeota (crenos = izvor) cuprinde exclusiv microorganisme hipertermofile dependente de sulf, care i dobndesc energia prin reacii de reducere a sulfului (Thermoproteus, Pyrodictium etc.), sau de oxidare a compuilor cu sulf (Sulfolobus). Sunt rspndite n mediul marin i n mediile vulcanice terestre; - Euryarchaeota cuprinde metanogenele chimiolitotrofe hipertermofile strict anaerobe ce cresc la ll0o (Methanopyrus) i metanogenele mezofile (din ap, sol, intestinul animalelor). Ali reprezentani sunt halofilele extreme ce triesc n soluii saturate de NaCl (Halobacterium halobium), sulfat-reductorii termofili (Thermococcus, Pyrococcus). Clasificarea lumii vii in trei domenii recunoate independena filogenetic a bacteriilor (Eubacteria) i a reprezentanilor Archaea. Nici unul dintre sistemele de clasificare a lumii vii nu include virusurile. Ele formeaz un grup de entiti infecioase fr echivalent n lumea vie, dar au relaii foarte strnse cu aceasta, deoarece se multiplic numai n substratul celular viu.

Fig. 1: Arborele filogenetic universal, bazat pe secvena ARNr a subunitaii ribosomale mici, care cuprinde cele trei domenii (dupa Woese, 1991)

Caracteristicile distinctive ale organismelor celor trei domenii Particularitile lumii bacteriene au fost sesizate de F. Cohn, in perioada l850-l875. El le-a definit ca organisme de dimensiuni microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct. Din acest motiv, F. Cohn este considerat intemeietorul microbiologiei ca tiin. Arhitectura celular a organismelor grupate in domeniul Archaea se aseamn cu cea a eubacteriilor. Moleculele componente ale celulelor Archaea se aseamn, unele cu ale eubacteriilor, altele cu ale eucariotelor, dar exist i molecule specifice (tabel nr. 1).
Tabel nr. 1: Caracterele structurale si funcionale ale eubacteriilor, Archaea si eucariote Caracter Dimensiuni Perete celular Eubacterii Civa m Prezent constant (cu excepia micoplasmelor). Conine un peptidoglican (mureina), totdeauna cu acid muramic. Permeabilitate foarte selectiv (pentru ap i molecule cu diametrul mai mic de o,8 nm), pentru enzimele degradative i pentru fragmente mici de ADN. Nu fac endocitoz sau exocitoz. Lipsesc sterolii (cu excepia micoplasmelor). Lipidele sunt esteri ai acizilor grai cu glicerolul. Archaea Civa m Conine proteina denumit pseudomurein fr acid muramic. Lipsete la Thermoplasma. Idem Eucariote Celule mult mai mari (zeci de um). Unele eucariote sunt unicelulare Lipsete la celulele animale. La cele vegetale conine celuloz, iar la fungi conine chitin.

Membrana plasmatic

Are o plasticitate accentuat. Celula face endocitoz prin fagocitoz sau pinocitoz. Sterolii sunt prezeni constant.

Lipidele au legturi eter ntre glicerol i catenele de C. Au catene izoprenoidice ramificate cu metil. Unele lipide sunt tetraeteri. Transformri reversibile sol-gel. Prezint cureni citoplasmatici. Idem

Citoplasma

Este ntr-o permanent stare de gel, necesar meninerii integritii structurii materialului nuclear. Lipsesc

Membrane intracitoplasmaice Organite care conin ADN Citoschelet Organite de locomoie

membranele interne. Curenii citoplasmatici sunt abseni. Dimensiunile mici ale celulei uureaz difuzia substanelor nutritive i de catabolism. Absente. Membrana poate trimite invaginri la nivelul crora se desfoar activiti respiratorii --------------Flagelul cu structur simpl, format din molecule de flagelin, aezate dup o simetrie helical. Flagelul este pus n micare de un motor rotativ situat ntre perete i membrana. Energia de micare este produs de un gradient protonic de o parte i de alta a membranei Diviziunea este simpl (direct). Rareori are loc o diviziune asimetric prin nmugurire. Bacteriile filamentoase sufer diviziuni multiple prin segmentare sau fragmentare. Un cromosom circular ce conine o,6l26 perechi de baze. Material genetic accesoriu (plasmide) Un echivalent nuclear denumit nucleoid cu aspect de mas fibrilar, nedelimitat de membran, ce corespunde cromosomului bacterian. Absena membranei delimitante a materialului genetic este particularitatea fundamental a organizrii celulare de tip procariot. Cromosomul mezosom 70 S Abseni este legat fizic de

Idem

Au organite delimitate de o membran cu o structur trilaminar de unit membrane. Mitocondrii, cloroplaste

--------------

Prezent Accesorii. Dac exist sunt cili sau flageli de tip eucariot, cu o structur complex de 2 x 9 + 2 tubuli.

Idem

Tipul diviziune

de

Diviziunea este indirect, cu aparatul mitotic si fazele caracteristice. Idem Un cromosom circular cu l-4 x lo6 baze perechi i plasmide. Un numr constant de cromosomi, cu caracter de specie. ADN este asociat cu proteine histonice. In mitocondrii i cloroplaste, ADN dublu catenar circular nu conine histone. Nucleu tipic, cu nucleol. Idem

Cromosomi

Nucleul

Distribuia materialului genetic dup diviziune Ribosomi* Introni

Prin intermediul aparatului mitotic Idem 70 S Prezeni n genele ce codific ARNr si ARNt. Genele ce codific proteinele sunt continui. Ribosomii lor sunt 70 S, dar sunt rezisteni la inhibitorii clasici ai sintezei proteice la Eubacteria (streptomicin i cloramfenicol) (--) 80 S. In mitocondrii si cloroplaste sunt ribosomi 70 S. Prezeni n genele ce proteinele, ARNr i ARNt.

codific

Sensibilitatea ribosomilor la streptomicin (inhiba initierea catenei polipeptidice) i la cloramfenicol (inhiba alungirea

Nu inhiba sinteza proteinelor in citoplasma, dar cele doua antibiotice inhiba sinteza proteinelor in cloroplaste si mitocondrii pentru ca au ribosomi cu caracteristici functionale de tip procariot.

catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la cicloheximid (inhiba alungirea catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la toxina difteric

Cicloheximida inhiba specific functia ribosomilor celulei eucariote.

Toxina difterica inhiba alungirea catenei peptidice, la Archaea, pentru ca inactiveaza un factor de alungire. (+) Metionina Complex (minimum 7 subuniti). + Proteina care se leag de secvena TATA 110 grade

Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor la eucariote se produce dupa acelasi mecanism ca si la Archaea.

Aminoa-cidul iniator al catenei polipepti-dice Structura ARNpolimerazei** Operoni Iniierea transcrierii Tempera-tura maxim de cretere Sinergonul respirator i fotosintetic

N-formyl-metionina

Metionina Idem _ Idem 60 grade Cele dou funcii au sedii diferite i se desfoar independent. Sinergonul respirator este localizat n mitocondrii, iar cel fotosintetic, n cloroplaste.

Simpl (5 subuniti) + Factorul sigma 95 grade Sinergonul se definete ca un ansamblu de enzime ce functioneaz coordonat pentru realizarea unei ci metabolice. Cele dou sinergoane sunt nempachetate, sediul lor structural fiind membrana plasmatic. De aceea, cele dou funcii sunt interrelate, modificarea uneia antrennd modificarea celeilalte Nu adpostesc niciodata endosimbioni Absenta. Sunt organisme unicelulare. Uneori formeaz asociaii coloniale, dar totdeauna fiecare celul i pstreaz individualitatea structural i funcional. Prin diviziune reface asociaia. Foarte rar si limitat la structuri de rezisten (sporul i echivalentul sau chistul). Fac excepie mixobacteriile, care au ciclu de dezvoltare i capacitate de difereniere Sunt heterospecifice. Transferul informatiei genetice se face ntre specii i chiar ntre genuri diferite. Informaia genetic este ntr-o permanent mobilitate, ceea ce face dificil definirea speciei bacteriene.

Idem

Formarea endosimbiontilor Capacitatea de a forma organisme multicelulare Capacitatea de difereniere celular Mecanisme de transfer genetic

Idem

Inglobeaz frecvent celule pe care le pstreaz ca endosimbioni Uneori, celula eucariot constituie organisme unicelulare, dar de cele mai multe ori formeaz organisme multicelulare.

Idem

Absent

Foarte marcat

Fuziunea gameilor este intraspecific. Idem

Pentru proteinele ribosomale, omologia dintre Archaebacteria i Eucariotae nu are corespondent la Eubacteria (Kandler, l993). Dar Archaea i eucariotele sunt foarte diferite i se disting, fiecare n parte, de eubacterii.
**

Eucariotele se disting prin existena a 3 ARN-polimeraze*: ARN-polimeraza I transcrie ARNr; ARN-polimeraza II transcrie ARNm; ARN-polimeraza III transcrie ARNt. Cele 12 subuniti ale ARN-pol II sunt codificate de de tot attea gene i sunt foarte bine conservate la eucariote. De exemplu, 6 subuniti ale ARN-pol II uman pot nlocui omologele lor la levuri. Toate cele 3 ARN-polimeraze ale celulelor eucariote sunt alctuite fiecare din 12 subuniti. 5 dintre ele sunt comune pentru toate cele 3 ARN-polimeraze, iar 3 dintre ele sunt specifice ARN-pol II. Astfel, ARN-polimerazele sunt asamblate din subuniti comune i subuniti specifice de clas.

Uneori, moleculele Aarchaea se aseamn cu omologele lor de la eucariote, mai mult dect cu ale eubacteriilor. Tipuri morfologice de bacterii Anatomia bacterian studiaz forma celulelor, ultrastructura si structura molecular a diferitelor organite celulare, in strns corelaie cu funciile pe care le indeplinesc. Forma celulelor bacteriene este controlat genetic i se realizeaz n mare masur prin intermediul peretelui care confer celulei un grad de rigiditate i prin aceasta, forma tipic (fig. 2). Peretele celular este rigid, dar n acelai timp, suplu i elastic, adic este deformabil.

Fig. 2: Tipuri morfologice de bacterii: A = diplococi; B = streptococi; C = stafilococi; D = bacili; E = cocobacili; F = bacili fusiformi; G = forme bacilare filamentoase; H = vibrioni; I = spirili; J = sarcina

Datorit elasticitii sale, forma celulei bacteriene, n diferite condiii de mediu are tendina s varieze ntre anumite limite, ns forma tipic a celulelor unei populaii rmne dominant. Celulele bacteriene aparin urmtoarelor tipuri morfologice: a. Forma sferic (sferoidal) denumit coc (coccus, latin = smn). Celulele sunt izodiametrice. Dup modul de grupare se disting urmtoarele subtipuri: - cocul simplu (celule solitare) - diplococ (celule perechi) - streptococ (celule asezate n lan, streptos = lan) - tetracoc (tetrada) - sarcina (dou tetrade suprapuse) - stafilococ (staphylos = ciorchine) La diplococi i streptococi, diviziunile celulare se succed dup un singur plan. La ali coci (Pediococcus, Thiopedia, Lampropedia, Deinococcus), prin diviziuni succesive se formeaz grupri de 4 celule aranjate n tetrade bidimensionale. Ulterior se formeaz tablete de form ptrat, de 16-64 celule, ceea ce denot existena a dou planuri de diviziune, perpendiculare unul pe cellalt i care se succed alternativ. La

Sarcina i la Synechocystis, dup trei diviziuni celulare rezult 8 celule aranjate n pachete tridimensionale cuboide. Diviziunile se succed dup toate cele trei planuri ale spaiului, fiecare perpendicular pe celelalte dou. b. Forma bacilar (bacillus, latin = bastona). Diametrul mare (lungimea) depete de cteva ori pe cel transversal. Extremitile celulei sunt rotunjite sau tiate n unghi drept. Se disting mai multe subtipuri morfologice, n funcie de modul de grupare a celulelor: - cocobacil, o forma intermediar intre coc si bacil - diplobacil - streptobacil - rozet (stea) - palisad - litere chinezeti c. Forma spiralat, cu cteva subtipuri: - vibrion - spiril - spirochet La spirili, spirele sunt rigide i puine, iar la spirochete sunt laxe i numeroase. Celulele unei populaii bacteriene unitare, teoretic aparin aceluiai tip morfologic, dar frecvent apare un polimorfism, mai accentuat n mediile naturale (ap, sol, tractul digestiv). Morfologia celulelor este mai uniform n culturile bacteriene in vitro, dar se modific n cursul evoluiei unei populaii celulare. De aceea, pentru a evita confuziile, descrierile morfologice, considerate tipice pentru o populaie bacterian se refer la celulele cultivate n laborator pe medii optimale (medii care conin toate substanele necesare creterii celulelor), in condiii adecvate de temperatura, pH, grad de aerare. Deoarece n culturile bacteriene mbtrnite apar frecvent forme de involuie, cu morfologie atipic, forma caracteristic a celulelor unei specii este aceea a celulelor tinere, dintr-o cultur bacterian aflat la sfritul perioadei de multiplicare. Bacteriile care se abat de la tipurile morfologice eseniale sunt mai rare. Astfel se disting: bacterii ptrate, bacterii prostecate, bacterii cu apendice acelulare, bacterii cu trichoame (filamentoase), bacterii miceliene. Bacterile ptrate, au fost descrise de Walsby (l980) n apele hipersaline din peninsula Sinai. Pe seciune au aspect de lentil biconcav, datorit coninutului foarte mic de ap. Din aceast cauz, presiunea intern a celulei este practic nul. Nu se exercit presiune asupra nveliurilor celulare. Pentru ele s-a propus denumirea de gen Quadra i aparin archaebacteriilor. Bacteriile prostecate (prosteca = apendice, coad, anex, adaus). Caracteristica structural este existena prostecii, o prelungire semirigid n continuarea celulei, cu diametrul mai mic dect al celulei mature. Prosteca este o prelungire celular, ceea ce o deosebete de structurile apendiculare acelulare. Se disting dou categorii de bacterii prostecate: bacterii pedunculate (de exemplu, Caulobacter); bacterii prostecate care nmuguresc (de exemplu, Hyphomicrobium). Bacteriile cu apendice acelulare (de exemplu, Gallionella) sunt reniforme. De pe faa concav pornete un apendice acelular lung, format dintr-un produs de secreie a celulei Bacteriile ce formeaz trichoame (de exemplu Beggiatoa, Sphaerotilus) au aspectul unui filament multicelular, n care celulele vin n contact prin extremitile lor i sunt nvelite printr-un nveli parietal comun. Bacteriile miceliene (actinomicete, iar denumirea nou este aceea de actinobacterii) au un aparat vegetativ reprezentat de micelii fine, ramificate, cu organizare procariot.

CAPITOLUL I

STRUCTURA I FUNCIILE CELULEI BACTERIENE


Cunoaterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizrii tehnicilor de citochimie i de microscopie electronic. Tehnicile de citochimie presupun utilizarea unor metode de colorare selectiv, adic a

coloranilor cu afinitate pentru o anumit structur celular. Astfel s-a demonstrat structura si arhitectura molecular a componentelor celulare. Prin arhitectur molecular se intelege modalitatea de aranjare ordonat a moleculelor constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alctuiesc protoplastul bacterian) i structurile extraparietale (fig. 3). Structurile intraparietale sunt: - spaiul periplasmic - membrana plasmatic - mezosomul - citoplasma - ribosomii - incluziile - vacuolele - sporul - aparatul fotosintetic - rhapidosomii (rhapidos = baston) incluzii ribonucleoproteice n form de baston - magnetosomii incluzii intracelulare delimitate de membran, cu structur cristalin formate din magnetit (Fe3O4). Magnetosomii confer dipol magnetic permanent celulei, permindu-i s se alinieze pasiv la cmpul geomagnetic. Bacteriile care produc magnetosomi manifest magnetotaxie, adic procesul de orientare i migrare de-a lungul liniilor cmpului magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de; - glicocalix cu variantele sale structurale: capsula i glicocalixul comportamental; - flageli - fimbrii i pili - spini structuri pericelulare groase la baz i ascuite la vrf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt eseniale (obligatorii) i se gsesc la toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsul, flageli), fiind prezente numai la anumite grupe de bacterii.

Fig. 3. Diagrama organizrii unei celule procariote (un bacil cu flagel polar).

Peretele celular Perete celular este o structur rigid de nveli, care nconjur complet celula bacterian. La cele mobile, peretele este strbtut de flageli. Structura parietal lipsete la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum i la cele halofile extreme (cele care triesc n medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare fa de ocul osmotic nu este necesar). Evideniere. La microscopul optic, peretele celular se evideniaz dup colorare selectiv, cu colorani de mare afinitate fa de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se evideniaz fie direct, fie dup utilizarea unor artificii de tehnica, ce constau in lezarea mecanic a structurii parietale cu perle de sticl sau cu ultrasunete. Coninutul celular se pierde i peretele rmne ca un sac gol i rigid, care

pstreaz forma original a celulei, ceea ce sugereaz rolul esenial al peretelui n determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprins ntre l5-30 nm (uneori pn la 80 nm). n ciuda strii incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric cu o valoare practic deosebit n clasificarea i identificarea procariotelor este comportamentul la coloraia Gram (C. Gram 1884). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebiri structurale majore ale peretelui. n funcie de particularitile structurale ale peretelui, bacteriile se mpart in 4 categorii: l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = nveli) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros i rigid, la care mureina reprezint pn la 80% din greutatea uscat a acestei structuri i bacteriile acidoalcoolo-rezistente 2. Gracillicutes (gracillis = subire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subire, la care mureina reprezint circa l0% din greutatea uscat a peretelui. 3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete. Periferia celulei este acoperit de o membran ce conine steroli, cu rol protector fa de liza osmotic. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a crete pe medii inerte. Se dezvolt ca saprobionte n cavitile organismului uman i animal sau sunt patogene pentru om, animale i plante. 4. Mendosicutes (mendosus =o structur cu defecte). Noiunea desemneaz organismele domeniului Archaea, care au perete celular din care lipsete mureina. Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparin grupului Gram pozitive sau Gram negative. Structura molecular a peretelui la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent i rigid. Componenta esenial este mureina, denumit nc i peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formeaz un strat rigid, adiacent membranei plasmatice i sub aspectul compoziiei chimice este unitar la toate eubacteriile (Gram pozitive i Gram negative). Mureina este alctuit dintr-o component peptidic i una glucidic. Componenta glucidic repetitiv este un dizaharid format din N-acetil-D-glucozamin i acid N-acetilmuramic, legate l-4. Acidul Nacetilmuramic rezult prin stabilirea unei legturi ester ntre N-acetil-D-glucozamin i acidul lactic (Fig. 4, 5).

Fig. 4. Derivaii glucidici cei mai comuni n structura peretelui celular bacterian : N-acetil-glucozamina si acidul N-acetilmuramic.

Fig. 5. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitaile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale. Aceasta structura chimica se gasete la E. coli, dar bacteriile conin si ali aminoacizi.

La fiecare unitate diglucidic este legat o component peptidic, reprezentat de un tetrapeptid, a crui compoziie n aminoacizi este variabil n funcie de specie, dar conine L-alanin, acid D-glutamic, acid diaminopimelic (derivat al lizinei) sau lizina i D-alanina i se leag de acidul N-acetilmuramic. Acidul Nacetil muramic i D-aminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

a. Acidul diaminopimelic, derivat al lizinei. b. Lizina.

Legturile glicozidice nu sunt suficiente pentru a asigura rigiditatea structurii parietale. Tetrapeptidele sunt legate prin puni peptidice transversale (Fig. 6). La bacteriile Gram negative, punile transversale reunesc gruparea NH2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-alaninei terminale a altei grupri peptidice.

a.

d
Fig 6. (a) Structura chimic general a peptidoglicanului. (b) Sgeile indic situsurile la care peptidoglicanul poate fi atacat de hidrolazele peretelui celular. Sunt reprezentate trei catene de peptidoglican ce constau din resturi alternante de acid N-acetil muramic i N-acetil glucozamina. Tetrapeptidele legate de acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin puni de pentaglicin. (c) La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin puni de pentaglicin. (d) Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid N-acetilmuramic). Liniile groase reprezint legaturi peptidice transversale (dupa Brock, 1988).

La bacteriile Gram pozitive, legtura transversal a tetrapeptidelor nvecinate este realizat de o punte peptidic, cu compoziie variabil. La S. aureus este format de pentaglicin. Cu ct numrul de legturi peptidice este mai mare, cu att crete rigiditatea sa. Se formeaz astfel o structur covalent perfect continu n jurul celulei, o molecul mureinic gigant, un adevrat sac mureinic, cu structur tridimensional dinamic.

Peptidoglicanii diferitelor specii difer prin aminoacizii 2 i 3 ai tetrapeptidului i prin frecvena punilor transversale de pentaglicin. Speciile patogene au o frecven superioar a punilor transversale, ceea ce se coreleaz cu o rezisten mai mare a mureinei la aciunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul etc.). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modeleaz creterea sa: murein-hidrolazele taie legturile chimice ale mureinei, iar murein-sintetazele inser noi uniti de construcie. Importana mureinei, ca element structural esenial al peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive a reieit din studiul aciunii a doi ageni antibacterieni: lizozimul i penicilina. Lizozimul cliveaz legturile glicozidice l-4 i hidrolizeaz mureina celulelor aflate n faza staionar. Penicilina inhib celulele bacteriene aflate n faza de cretere, deoarece inhib treapta final a sintezei mureinei, reacia de transpeptidare, adic formarea legturilor peptidice transversale ntre catenele de glican adiacente. Inhibiia transpeptidrii sub aciunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subire, urmat de liza i moartea celulei, pentru c autolizinele continu s funcioneze, iar alte puni peptidice nu se mai formeaz. De aceea, penicilina este activ numai asupra celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active i peptidoglicanul nu este degradat. Mureina formeaz o matrice, n care se gsesc ali polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii teichoici sunt molecule lungi i flexibile. Din punct de vedere chimic sunt polimeri de l-3poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legai fosfo-diesteric. Polimerii formeaz axul central al moleculei. Gruprile OH libere ale glicerolului i gruparea OH C3 a ribitolului sunt ocupate de resturi de D-alanin, Dglucoz sau de N-acetilglucozamin.

Poliglicerol fosfat

Poliribitol fosfat Bacteriile Gram pozitive au dou categorii de acizi teichoici: a) acizi lipoteichoici (ALT) traverseaz peptidoglicanul i cu o extremitate se leag de glicolipidele din membrana, iar cellalt capt este liber la suprafaa celulei; b) acizi teichoici parietali, ataai covalent de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei. mpreun cu mureina, acizii teichoici formeaz o reea polianionic sau matrice, cu rol n meninerea echilibrului cu cationii metalici, dar i n reglarea traficului de ioni, nutrieni, proteine i antibiotice. Funciile acizilor teichoici sunt multiple: - acizii teichoici sunt structuri moleculare filamentoase, care confer un plus de rigiditate peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive ; - fiind polianionici, au rol n transportul cationilor metalici n/i din celul; - au rolul de receptori de fagi; - au rolul de adezine (mediaz aderena celulei la substrat, favoriznd formarea biofilmelor), confer rezisten la antibiotice. La bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de virulen, deoarece au proprieti chimiotactic negative fa de fagocite. Acizii teichoici parietali sunt imunogeni, att n stare liber ct i asociai celulei. Uneori bacteriile secret cantiti mari de acizi teichoici solubili. Nu toate bacteriile Gram pozitive au acizi teichoici: cele care nu au acizi teichoici, poart molecule anionice cu funcii asemntoare (de exemplu, lipomananul, n locul ALT la Micrococcus luteus). Peretele celular la bacteriile Gram negative

Bacteriile Gram negative se caracterizeaz prin prezena membranei externe. Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvenierii proteinelor a dus la concluzia existenei unor diferene filogenetice majore ntre organismele cu nveli dublu membranar (didermice) i cele cu membran simpl (monodermice). La bacteriile Gram negative, mureina reprezint numai 2,5-l0% din greutatea uscat a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorit unei structuri caracteristice denumit membrana extern a peretelui celular, o replic structural a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerat ca membran intern (fig. 7).

Fig. 7. Reprezentarea schematic a structurii moleculare a peretelui la bacteriile Gram negative. Proteinele trimere matriceale din membrana externa sunt asociate cu lipoproteine i cu lipopolizaharide (LPS). LPS sunt legate covalent de peptidoglican.

La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorit structurii trilaminare a membranei externe a peretelui. Mureina este localizat n stratul cel mai intern al peretelui. Dup un tratament adecvat, membrana extern se poate ndeprta i se obine sacul mureinic pur, extrem de fin care pstreaz forma original a celulei i care sugereaz c mureina ar putea fi o reea bidimensional (un monostrat molecular), n timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult. Membrana extern a peretelui conine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) i lipopolizaharide (50%). Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece regleaz permeabilitatea i constituie canalele membranare de transport celular. Iniial s-au descris trei tipuri de porine trimerice : OmpF, OmpC i PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze x relev c porinele sunt proteine transmembranare a cror configuraie secundar este cea de -pliere. Aproape invariabil, secvenele porinelor la captul C-terminal au fenil-alanina. Rareori restul C-terminal este triptofanul. O celul de E. coli produce circa 105 molecule porine, al cror rol este barier selectiv de permeabilitate. In mediul hiperosmotic, numrul porinelor diminu. Cel puin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric: - stratul extern conine aproape exclusiv LPS - stratul intern conine aproape exclusiv fosfolipide. Lipoproteinele leag ferm membrana extern, de peptidoglicanul profund. Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate n membrana extern. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia) (fig. 9). Dei sunt localizate la suprafaa celulei, se numesc endotoxine, deoarece se elibereaz numai dup pierderea integritii celulei.

Fig. 8. Raporturile macromoleculelor componente ale peretelui celular (dupa Todar, 2004).

Structura chimic a moleculei de LPS Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alctuite dintr-o fracie lipidic i una polizaharidic. De aici deriv proprietile amfipatice ale acestui agregat molecular, conferit de grupri polare hidrofile i grupri apolare hidrofobe. Datorit poziiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45- 60%. La microscopul electronic, filamentele LPS au o structura trilaminar, corespunztoare celor dou straturi poliozidice i stratului lipidic. Cele mai studiate LPS sunt cele produse se tulpinile de Salmonella. Din punct de vedere structural, molecula LPS are trei regiuni(fig. 9): - o regiune polizaharidic extern (polizaharidul O) - o regiune oligozaharidic intermediar (regiunea R) - o regiune intern hidrofob, denumit lipidul A, prin care LPS se ancoreaz n membrana extern, printre moleculele fosfolipidice.

Fig. 9. Reprezentarea schematica a structurii moleculei de LPS

Regiunile intermediar i intern ale moleculei LPS au compoziie chimic relativ constant la diferite specii de bacterii Gram negative. Polizaharidul regiunii externe este un polimer de uniti oligozaharidice repetitive i confer specificitate serologic de grup, diferitelor variante antigenice de Salmonella. Unitile oligozaharidice conin 2-4 glucide: D-manoza, D-galactoza, L-ramnoza, o dezoxihexoza, o didezoxihexoza. Didezoxihezozele sunt zaharuri care nu exist n stare liber n natur, dar intr frecvent n structura polizaharidului enterobacteriilor i au primit denumiri care deriv de la speciile de origine: abequoza, tiveloza, paratoza, colitoza. Variaia antigenic a polizaharidului regiunii externe se amplific pe urmtoarele ci: - schimbri ale poziiei legturilor (de exemplu, 1-4 n loc de 1-6); - configuraii moleculare modificate; nlocuiri la nivelul diferitelor subuniti repetitive; deleia sau substituia unui rest glucidic din subunitile oligozaharidice. Regiunea centrala a LPS (miezul R) are o variabilitate chimic mult mai restrns i confer specificitate de gen. Oligozaharidul este legat covalent de lipidul A printr-un trizaharid, 2-ceto-3-dezoxioctonat (KDO). -

Lipidul A este inserat i ancorat, prin catenele acizilor grai, cu lipidele membranei externe. Intreaga molecul LPS este astfel orientat, nct polizaharidul O se proiecteaz la exterior i determin specificitatea antigenic a celulei bacteriene. La Salmonella, lipidul A este alctuit din dizaharide de D-glucozamin, legate l-6 (fig. 10). Perechile de D-glucozamin sunt interconectate l-4, prin puni pirofosfat.

Fig. 10. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO i cu resturile de acizi grai.

Gruprile OH din poziiile 3, 4 si 6 ale fiecrui dizaharid sunt substituite de acizi grai (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic). Grupul OH din poziia 3 se leag de componenta polizaharidic (acidul 2-ceto,3-deoxioctanoic) (KDO). Gruprile -NH2 ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic. Componenta lipidic confer moleculei LPS, calitatea de toxin. Lipidul A are proprieti endotoxice, evideniate la mutantele R care sintetizeaz LPS incomplet, cruia i lipsete polizaharidul O i unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R. In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizeaz polizaharidul O i formeaz colonii S. Cele care nu sintetizeaz polizaharidul O formeaz colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenitii, deoarece formele coloniale R ale B. pertusis, N gonorrhoeae sunt patogene. Permeabilitatea membranei externe Membrana extern, ca i celelalte membrane biologice, este alctuit din stratul lipidic dublu, puin permeabil pentru moleculele hidrofile. Membrana extern conine proteine, denumite porine, ce formeaz canale pentru influxul nutrienilor i pentru eliminarea produselor de catabolism. Porinele s-au gsit la toate bacteriile Gram negative i chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium-Nocardia-Mycobacterium, care produc un perete celular bogat n lipide, asemntor dublului strat. Porinele clasice OmpF i OmpC transport preferenial cationi, iar PhoE, transport anioni. Moleculele de LPS formeaz baza structural a membranei externe. LPS este polianionic datorit sarcinilor negative ale lipidului A i leag cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivaleni (Ca2+, Mg2+) i formeaz o structur compact ca un acoperi de igl, pe suprafaa membranei externe. Situsurile LPS care leag cationii

sunt eseniale pentru integritatea membranei externe, dar n acelai timp ele reprezint clciul lui Ahile al acestei structuri, deoarece antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern. n clasificarea empiric a bacteriilor, un rol deosebit l-a avut comportamentul lor la coloraia Gram. Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebirile structurale majore ale celor diviziuni. Coloraia Gram implic tratamentul succesiv al celulelor cu cristal-violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluie de iod i ulterior, extracia cu un solvent organic polar (alcool sau acetona). In celul, cristal-violetul i iodul formeaz un complex insolubil. Celulele care rezist etapei decolorrii i rein complexul insolubil (cristal violet-iod) albastru nchis sunt celule Gram pozitive, iar cele care nu rein colorantul sunt Gram negative Reacia Gram nu se coreleaz direct cu compoziia chimic a peretelui, ci depinde de structura sa fizic, de starea fiziologic a celulei, de integritatea ei structural. Astfel, levurile, dei au perete celular gros, dar cu o compoziie chimic diferit de a mureinei, se coloreaz Gram pozitiv. Peretele celular la Archaea Archaea constau din 2 linii filogenetice: linia metanogen include halofilele extreme (Thermococcus, Thermoplasma) ; termofilele extreme (Sulfolobales i Thermoproteales). La Archaea, peretele celular prezint diferene structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor (fig. 12). Diferitele specii de Archaea se coloreaz Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conine acid muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei.
-

Fig. 11. Structura pseudomureinei, polimerul peretelui celular la Methanobacterium sp.

Din punct de vedere chimic, peretele la Archaea este heterogen. La Archaea Gram pozitive (Methanobacterium - productoare de metan), peretele conine o pseudomurein, metanocondroitin sau hetropolizaharide. Pseudomureina (markerul biochimic al metanobacteriilor) este alctuit din uniti repetitive formate din dou zaharuri aminate (N-acetilglucozamin i acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al metanobacteriilor), legate l-3. Resturile acidului N acetiltalosaminuronic sunt legate prin puni peptidice (ca i la murein), iar aminoacizii sunt numai izomeri L. Legturile l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la aciunea lizozimului. Componenta peptidic este alctuit din 3 L-aminoacizi: acid glutamic, alanina i lizina.

Ambele componente pot fi modificate : N-acetilglucozamina poate fi nlocuit total sau parial de Nacetilgalactozamin, iar resturile de glicin, treonin, ornitin sau asparagin pot lua locul celor 3 aminoacizi, dac sunt n concentraii mari n mediul de cretere. Mureina i pseudomureina sunt componente omologe ca structur i funcie, dar diversitatea compoziiei chimice exclude originea lor comun. La Methanosarcina, celulele au un perete celular ce const din N-acetilgalactozamin, acid glucuronic sau galacturonic, glucoz i manoz. Forma celulei este meninut de un polimer fibrilar alctuit din acid uronic i 2 resturi de N-acetilgalactozamin. Polimerul formeaz o matrice, reminiscen a esutului conjunctiv al eucariotelor. La Methanospirillum i Methanothrix, lanurile de celule sunt nvelite de o teac tubular format din proteine i glucide. In interiorul tecii, fiecare celul este nconjurat de un strat format din subuniti proteice, cu aezare bidimensional paracristalin (strat S) (Konig, 1988). Archaea cu alte tipuri de nveli celular reacioneaz Gram negativ, dar structura tipic de perete Gram negativ lipsete. La g. Halobacterium, la Sulfolobales i Thermoproteales (specii termofile extreme) cel mai comun nveli celular, care menine forma celulei, este reprezentat de un singur strat molecular alctuit din subuniti proteice sau glicoproteice (stratul S), strns asociate cu faa extern a membranei. Peretele celular acido-alcoolo- rezistent al al micobacteriilor Cel de al IV-lea tip de structur chimic a peretelui se gsete la micobacterii (fig. 13). Unele genuri (Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae, Nocardia asteroides) conin lipide complexe, care nu se gsesc n structura parietal a altor bacterii. Ele se coloreaz slab dup protocolul coloraiei Gram, dar se coloreaz la cald cu fuxin bazic concentrat i sunt rezistente la decolorare succesiv cu acid sulfuric diluat i alcool etilic 96%. Aceste organisme se numesc acido-alcoolo-rezistente.

Fig. 12. Reprezentarea schematic a componentelor peretelui celular acido-rezistent la grupul Mycobacterium Nocardia. Regiunea extern a nveliului conine unitai lungi de acid micolic legat de arabinogalactan (dupa Holt, 1998).

Rezistena la decolorare se datoreaz compoziiei chimice a peretelui celular. Peptidoglicanul micobacteriilor conine acid diaminopimelic ca acid diaminic major, iar acidul muramic este N-glicozilat (i nu N-acetilat). Un alt compus major parietal al micobacteriilor este polizaharidul cu gr. mol. mare arabinogalactanul, un copolimer polizaharidic, alctuit din arabinoz i galactoz, esterificate cu acizi grai cu caten lung acizii micolici cu 70 - 90 atomi de C. La Corynebacterium i Nocardia, acizii grai au caten mai scurt (40-60 de atomi de C). Glicolipidele complexe din structura peretelui confera proprietatea de acidoalcoolo-rezistenta. A II-a categorie de lipide, cele libere sunt lipooligozaharide ce conin trehaloza i lipoarabinomanani. Stratul S Stratul S este o component a nveliului celular, alctuit dintr-o reea cristalin tridimensional de subuniti proteice. La bacteriile Gram pozitive i la Archaea Gram pozitive, reeaua cristalin a stratului S este ancorat de matricea rigid a peptidoglicanului i respectiv a pseudomureinei. La bacteriile Gram negative, stratul S este ancorat de LPS ale membranei externe.

Subunitile proteice sunt aezate simetric: simetrie ptrat, hexagonal sau simetrie oblic. Grosimea stratului S este de 5-25 nm. Reeaua moleculelor proteice componente formeaz pori de 2-10 nm. Proteinele stratului S sunt glicozilate i predomin aminoacizii hidrofobi (fig. 13). Stratul S are rol de nveli protector, de sit molecular, de canale ionice i mediaz interaciunea celulei cu substratul.

Fig. 13. Imagine electrono-optic a stratului S la Aquaspirillum serpens pe preparate colorate negativ. Se distinge simetria hexagonal (dup Koval S., 1988).

Funciile peretelui celular Peretele celular este o structur cu rol esenial n arhitectura celular, pentru c fiind rigid, determin forma celulei i meninerea ei. Dup pierderea coninutului celular, sacul mureinic pstreaz forma iniial a celulei. Mureina confer elasticitate celulei, permind mrirea volumului ei prin cretere. Elasticitatea este capacitatea de a suferi deformri la presiune, fr alterarea structurii celulare. Peretele celular regleaz funcia de permeabilitate, constituind o barier mecanic suplimentar, alturi de membrana citoplasmatic. La bacteriile Gram pozitive, peretele are o porozitate de 1,1 nm, permind trecerea moleculelor mai mici de l200 Da*.
*

Un dalton este egal cu masa atomului de H, adic l,672649 x l0-24 g. l kDa = l 000 Da.

La bacteriile Gram pozitive, peretele particip la formarea septului de diviziune, ce separ cele dou celule surori i la procesele de cretere. Creterea volumului celular este rezultatul creterii peretelui. La bacteriile Gram negative, porinele membranei externe, legate necovalent de murein, regleaz procesele de permeabilitate prin modificri conformaionale, deoarece funcioneaz ca adevrate canale moleculare. {n mediile cu osmolaritate mic (cele naturale), porinele sunt mai permeabile, iar la bacteriile patogene, n organismul gazd, porinele au permeabilitate mai mic. Membrana extern este o barier selectiv: permite difuzia moleculelor mici n ambele sensuri, fiind impermeabil pentru macromolecule. Permite difuzia limitat a substanelor hidrofobe, deoarece lama extern nu conine glicerofosfolipide. Suprafaa este acoperit cu LPS, care formeaz o structur quasicristalin. Din aceast cauz, lama extern nu prezint o difuzie lateral marcat a moleculelor, tipic membranelor alctuite din glicerofosfolipide. Membrana extern conine proteine cu funcii de transport molecular. Ele au rolul de receptori de vitamine, glucide, aminoacizi, de transferine (leag Fe i l transfer n celul). La bacteriile patogene, n membrana extern se gsesc proteine de virulen: adezine, cu rol de fixare a bacteriei pe celulele sensibile. LPS are proprieti chimiotactic negative fa de fagocite, mrind nivelul virulenei bacteriene i confer individualitate biochimic i serologic diferitelor tulpini. LPS este antigenic i induce sinteza anticorpilor specifici cu rol protector.

In concluzie, peretele celular este o structur esenial a celulei bacteriene, ndeplinind funcii multiple, cea mai important fiind protecia fa de liza osmotic n mediile hipotonice. Peretele celular lipsete la micoplasme. Ele se pot izola din organismul uman, de la animale, plante, insecte, fungi, sol, ape menajere. Sunt saprobionte, trind pe materia organic n mediile naturale (ape menajere, sol) sau comensale la om i animale, pe mucoasele bucofaringian i genitourinar, incapabile s se dezvolte n mediul extern ca saprobionte. Unele dintre cele comensale sunt potenial patogene. Dei nu au perete celular, supravieuiesc, pentru c au o membran citoplasmatic rigid (care conine steroli) i pentru c triesc n medii protejate osmotic, aa cum este organismul animal i uman.

Protoplatii bacterieni Protoplastul este structura organizat a componentelor celulare care ramne dup ndeprtarea peretelui celular i care, pstrndu-i viabilitatea realizeaz procese metabolice, biosinteze i transfer de energie (fig. 14). Protoplatii bacterieni au fost obinui experimental n l952 de ctre Salton. El a evideniat c peretele celular de Micrococcus lysodeikticus s-a digerat sub aciunea lizozimului.

Fig. 14. Imaginea electrono-optic a celulelor de Bacillus subtilis. a. In regiunea central s-a initiat formarea septului de diviziune. b. Un stadiu intermediar al degradarii peretelui sub aciuna lizozimului i retracia protoplastului. c. Protoplastul (original).

Cea mai folosit metod de obinere a protoplatilor este digestia enzimatic cu lizozim, a peretelui bacteriilor Gram pozitive. Lizozimul, care se gsete n lacrimi, saliv, albuul de ou, atac mureina (peptidoglicanul) prin hidroliza legturilor l-4 ale lanurilor polizaharidice. Rezult un dizaharid format din N-acetilglucozamin i N-acetilmuramic, la care ramn ataate catenele peptidice. Protoplastul este foarte sensibil la liza osmotic. Citoplasma celulei bacteriene este o soluie mai concentrat (l0 mM) dect a mediului de suspensie. Apa trece din compartimentul cu concentraie mic, n cel cu concentraie crescut, printr-un proces denumit osmoz. Intr-un mediu neprotejat osmotic, apa ptrunde n protoplast i se produce plasmoliza. Intr-un mediu protejat osmotic, protoplatii celulelor Gram pozitive i pstreaz integritatea structural, capacitatea respiratorie, de biosintez, de cretere i diviziune i chiar de replicare a fagului, dac infecia s-a fcut nainte de ndeprtarea peretelui. Mediul de protecie osmotic (de protoplastizare) trebuie s conin o concentraie mare a unor substane pentru care membrana celular este impermeabil (soluie de sucroz 0,3 M). Dac mediul de suspensie este hipertonic, protoplastul pierde apa i colapseaz, proces denumit plasmoptiz. In condiii speciale de mediu, protoplastul i regenereaz peretele i revine la forma original a celulei, proces denumit reversie. Regenerarea este sigur dac protoplastul mai pstreaz un rest de perete, care va funciona ca primer al resintezei structurii parietale. Tratamentul cu lizozim nu este eficient pentru conversia bacteriilor Gram negative la protoplati, datorit membranei externe care mpiedic accesul enzimei la peptidoglican. Pentru creterea eficienei aciunii enzimatice, celulele se trateaz cu EDTA, care dimueaz concentraia ionilor de Mg. Se formeaz sferoplati (celule sferice nconjurate parial sau total de membrana extern).

Spaiul periplasmic Spaiul periplasmic este un compartiment celular al bacteriilor Gram negative, delimitat de membrana extern a peretelui celular i de membrana intern (citoplasmatic). Este singurul compartiment al celulei procariote i conine un volum apos semnificativ n care se gsesc proteine si oligozaharide. Proteinele sunt reprezentate de enzime degradative (DN-aza, RN-aza, proteaze, fosfataze, penicilinaza etc.) i proteine de legare specifice pentru diferite molecule, cu rol n transport i chimiotaxie. Oligozaharidele se gsesc n concentraii variabile i au rolul de a regla presiunea osmotic a celulei. Cnd presiunea osmotic a mediului crete, oligozaharidele trec n citoplasm, iar cnd scade, oligozaharidele revin n spaiul periplasmic. Spaiul periplasmic ndeplinete o funcie esenial ce const n acumularea nutrienilor moleculari din mediu, nainte de a ptrunde n celul. Spaiul periplasmic funcioneaz ca un compartiment adaptativ, a crui funcie de depozit este foarte important, deoarece bacteriile Gram negative triesc, de cele mai multe ori, n mediile oligotrofe (mediile aquatice). In spaiul periplasmic, nutrienii sunt scindai parial sub aciunea enzimelor degradative i de aici sunt preluai de proteinele de transport din membrana intern i transferai n celul. Proteinele periplasmice pot fi eliberate prin conversia celulelor la protoplati, dup tratamentul cu cloroform sau prin oc osmotic (tratamentul celulelor cu EDTA n mediu hipertonic i transferul lor n mediu hipotonic).

Membrana plasmatic Membrana plasmatic nconjur celula bacterian i este bariera separatoare a citoplasmei de mediul extern. Consecina imediat a lezrii membranei este pierderea componentelor citoplasmatice. Grosimea membranei este de 7-10 nm. La microscopul electronic are o structur trilaminar, dup modelul unitar al membranelor celulare (unit membrane) al lui Robertson. Pe baza structurii fine s-a considerat (eronat) c membrana plasmatic este alctuit din dou straturi de proteine, ntre care se gsete unul lipidic, dar cantitatea de proteine este prea mic pentru a forma dou straturi continui. Membrana celulei procariote conine proteine, glucide i lipide, dar spre deosebire de membrana celulei eucariote nu conine steroli (fig. 15a). Singer i Nicolson au propus modelul mozaicului fluid (fig. 15b) de organizare a membranelor biologice, n acord cu care membranele sunt structuri bidimensionale de proteine globulare i lipide, cu distribuie orientat, stabilizate de cea de a III-a component major apa. Moleculele de ap sunt legate prin puni intermoleculare de H, formnd o structur de reea. Dizolvarea unei molecule n ap semnific stabilirea unei continuiti ntre structura chimic a moleculei dizolvate i structura de reea a apei. Pentru a se integra (dizolva) n structura de reea de apei, molecula trebuie s formeze o legtur de H cu apa sau s accepte o legtur a acesteia.
Fig. 15. a. Reprezentarea schematic a moleculei fosfolipidice, componenta structural a membranei. Fosfolipidele sunt molecule polare. Cozile de acizi grai sunt foarte hidrofobe (nu formeaz legturi cu apa) i constituie o barier de permeabilitate fa de moleculele hidrosolubile. Capul moleculei este format din gruparea fosfat, legat de o grupare care conine N i din glicerol. Este foarte hidrofil (formeaz legturi cu moleculele de ap). b. Modelul mozaicului fluid al structurii membranei. Fosfolipidele formeaz un strat dublu, cu componentele hidrofobe orientate spre interior, iar capetele hidrofile constituie suprafaa intern i externa a membranei. In marea lipidic proteinele plutesc ca niste iceberg-uri. Unele se extind n toata grosimea dublului strat lipidic, iar altele sunt ancorate pe faa intern sau extern. Membrana micoplasmelor i eucariotelor conine colesterol.

Membrana este un dublu strat fosfolipidic i glicolipidic, la care se asociaz proteinele membranare. Ansamblul molecular al membranei este asemnat cu un ocean fosfolipidic, n care plutesc ca nite iceberguri, proteinele. Proteinele confer membranelor, multe dintre proprietile funcionale specifice (de exemplu, meninerea i utilizarea gradientului transmembranar de H pentru sinteza ATP). In raport cu dispunerea lor n structura membranei, proteinele sunt periferice i integrate. Proteinele periferice* sunt asociate cu membrana, dar nu au nici o secven inclus n structura ei. Structura lor este analog proteinelor hidrosolubile.
*

Clasa proteinelor periferice este mprit n dou subclase: - proteinele asociate membranei sunt globulare, legate pe suprafaa membranei, fie de stratul lipidic, fie de proteinele integrate; proteinele membranare de schelet formeaz scheletul membranei i sunt localizate imediat sub membrana plasmatic a celulei. Ele se asociaz componentelor membranei, iar n celula eucariot se leag i cu citoscheletul. La procariote se accept existena unui citoschelet primitiv, format din EF-Tu Elongation Factor Termo-unstable) i FtsZ (Factorul termo-stabil), cu rolul de suport al structurii celulare. Lipsesc structurile de tipul microfilamentelor i microtubulilor. FtsZ are potenial de polimerizare i are funcia se reea celular de suport. Echivalentul lui EF-Tu n celula eucariot este EF1a.

Proteinele membranare integrate au cel puin un domeniu al moleculei situat n regiunea hidrofob a stratului lipidic. Ele pot fi dislocate din structura membranei numai sub aciunea detergenilor ce solubilizeaz lipidele. Clasa proteinelor integrate se mparte n dou subclase: 1. Proteinele transmembranare au o mare parte a masei lor inclus n dublul strat fosfolipidic, dar expun domenii semnificativ diferite pe ambele fee ale membranei, ceea ce confer asimetria funcional a acesteia. Ele au o structur heterogen, deoarece cel puin un domeniu al moleculei este inclus n mediul hidrofob al lipidelor i trebuie s fie compatibil cu acesta. Secvena de 19-23 aminoacizi a domeniului inclus n stratul lipidic este hidrofob i are configuraia -helix (fig. 17). Domeniile extralipidice ale proteinelor integrate sunt hidrofile, ceea ce confer asimetria structural i funcional a membranei. Proteinele integrate difuzeaz liber n planul lateral al matricei lipidice, dar nu trec liber dintr-un strat n altul i de aceea asimetria funcional a membranei se pstreaz pentru perioade lungi. Aa se explic permeabilitatea superioar a feei interne n raport cu faa extern. Asimetria structural a proteinelor integrate se evideniaz pe imagini electrono-optice ale membranei criofracturate (fig. 16). Tehnica criofracturrii presupune nghearea rapid a membranei la temperatura azotului lichid i fracturarea membranei cu un cuit special. Membrana se cliveaz de-a lungul regiunii hidrofobe a acizilor grai i rezult dou jumti de membran, cu un grad accentuat de asimetrie, conferit de proteinele transmembranare.

Fig. 16. Reprezentarea schematic a localizrii proteinelor membranare. Proteinele periferice sunt n raporturi spaiale strnse cu capetele hidrofile ale fosfolipidelor. Proteinele integrate sunt localizate n dublul strat fosfolipidic ori au domenii care se extind n regiunile hidrofile (dupa Holt si colab., 1998).

2. Proteinele membranare ancorate au un domeniu ce penetreaz dublul strat lipidic, dar nu traverseaz complet membrana. Sunt ancorate de membran prin legtur covalent cu lipidele.

Structura membranei plasmatice este stabilizat prin legturi de H i interaciuni moleculare hidrofobe. Ionii de Mg i Ca realizeaz legturi ionice cu sarcinile negative ale fosfolipidelor i stabilizeaz structura membranei. Lipidele conin esteri ai acizilor grai cu glicerolul. Predomin acizii cu l4-l6 atomi de C, saturai sau nesaturai. Fosfolipidele (fosfogliceride) membranelor biologice sunt molecule amfipatice polare, deoarece au un cap polar (glicerolul) legat cu cozile nepolare ale acizilor grai: glicerolul intr n structura de reea a apei, fiind hidrofil, iar acizii grai formeaz componenta hidrofob a moleculei (fig. 17). Astfel, membrana are dou suprafee polare, hidrofile, datorit resturilor de glicerol.

Fig. 17. a. Structura de baz a dublului strat fosfolipidic. b. Distribuia stabil a moleculelor lipidice n ap, cu formarea unei vezicule membranare.

Intr-o soluie apoas, lipidele se agreg i formeaz spontan structuri n dublu strat: acizii grai la interior, n mediul hidrofob, iar moleculele de glicerol ramn expuse n mediul apos. Agregatul funcioneaz ca o barier impermeabil pentru trecerea liber a moleculelor polare n i din celul. Dublul strat lipidic este o structur ordonat. Catenele de carbon ale acizilor grai sunt constrnse la o aezare paralel i datorit caracterului hidrofob, mobilitatea lor n afara stratului lipidic este foarte limitat. Moleculele fosfolipidice sunt foarte mobile i se deplaseaz n plan lateral (bidimensional), n acelai strat, cu o frecven foarte mare, dar deplasrile dintr-un strat n cellalt (tridimensionale) sunt foarte rare (una la cteva ore).

Squalen

Colesterol

Structura molecular a squalenului (9cu 30 atomi de C), precursorul biosintetic al sterolilor i structura colesterolului (un sterol tipic).

Rolul lipidelor membranare, s-a studiat folosind ca model, veziculele membranare artificiale sau naturale, ce se formeaz spontan dup spargerea celulelor. S-a demonstrat astfel c procariotele i regleaz fluiditatea membranei, prin modificarea proporiei acizilor grai saturai/nesaturai. Cultivarea la temperaturi sczute mrete proporia acizilor grai nesaturai i sporete gradul de fluiditate a membranei. Prin rcire, faza de cristal lichid a lipidelor membranare trece spre o stare solid de gel, situaie n care grosimea dublului strat crete datorit extensiei catenelor de C ale lipidelor. Stratul lipidic este suportul proteinelor i are rolul unei bariere de permeabilitate. Permeabilitatea difereniat a celor dou fee ale membranei se explic att prin asimetria proteinelor, ct i prin compoziia chimic diferit a lipidelor n cele dou straturi ale membranei.

Cu excepia micoplasmelor i a metanotrofelor, membrana procariotelor se deosebete de cea a eucariotelor prin absena sterolilor. Sterolii sunt molecule plane, rigide, iar acizii grai sunt flexibili. Sterolii confer un grad superior de rigiditate membranei plasmatice. Rigiditatea membranei este necesar celulelor lipsite de perete. La eucariote, rigiditatea ar fi necesar pentru a suporta forele fizice care se exercit asupra membranei. Antibioticele polienice (nystatin, candicidin) reacioneaz cu sterolii i destabilizeaz membrana. De aceea ele sunt active fa de celulele eucariote i nu iflueneaz celulele procariote. Micoplasmele ncorporeaz n structura membranei, sterolul disponibil n mediul de cretere i sunt sensibile la antibioticele polienice. La unele bacterii, n structura membranei se gsesc molecule asemntoare structural cu colesterolul i pot avea acelai rol de cretere a rigiditii: hopanoidele. Un compus cu distribuie larg este diploptenul, cu 30 atomi de C Membrana la Archaea Membrana citoplasmatic a Archaea are o structur electrono-optic trilaminar, dar din punct de vedere chimic este unic prin natura lipidelor. Lipidele eubacteriilor i eucariotelor sunt esteri ai acizilor grai cu glicerolul. Lipidele archaea nu conin acizi grai i sunt de dou tipuri: glicerol-dieteri i diglicerol-tetraeteri, cu catene izoprenoidice (fig. 18). La C3 al glicerolului se leag o grupare fosfat, sulfat sau un rest glucidic.

Fig. 18. Lipidele majore la Archaea. a. Glicerol dieterii. b. Digliceroli tetraeteri pentaciclici. Catena de C este ataat totdeauna de glicerol prin legturi eter. d. Comparaia legturii ester din lipidele celorlalte organisme cu legtura eter a lipidelor de la Archaea.

Catenele izoprenoidice au ntre l5 i 40 atomi de C. Membrana plasmatic a Archaea are dou suprafee polare, cea intern i cea extern, datorit resturilor de glicerol, iar interiorul este hidrofob, ca i la celelalte membrane, dar nu conine fosfolipide. Glicerol-dieterii formeaz stratul dublu lipidic, prezent n structura membranelor celulare. La unele Archaea predomin net diglicerol-tetraeterii i membrana este format dintr-un monostrat lipidic. Diglicerol-

tetraeterii sunt echivalentul chimic al dublului strat lipidic, dar diferena const n faptul c cele dou straturi sunt legate covalent. Glicerol-dieterii au catene laterale izoprenoidice de 20 atomi de C, iar diglicerol-tetraeterii au catene laterale de 40 atomi de C. La unele archaea, catenele de C ale diglicerol-tetraeterilor sunt complicate prin existena a 4 inele pentaciclice, dar se pstreaz lungimea de 40 de atomi de C. Glicerol-eterii sunt markeri biochimici ai archaea. Identificarea lor este utilizat pentru a identifica membrii grupului. Diferenele biochimice dintre lipidele archaea i eubacteriilor evideniaz distana evolutiv uria ntre aceste linii filogenetice primare, dei ambele sunt procariote. Funciile membranei plasmatice Membrana plasmatic este bariera major structural i de permeabilitate ntre mediul celular i cel extern. Membrana este n primul rnd bariera de permeabilitate care mpiedic difuzia liber a componentelor citoplasmatice. Permeabilitatea foarte selectiv este asigurat de asimetria sa funcional: este mai permeabil pe faa intern, ceea ce asigur meninerea constanei mediului intern fa de cel extern, foarte variabil. Membrana este sediul sinergonului respirator (constituienii moleculari care realizeaz procesele de respiraie celular si formeaz sistemul de transport al electronilor) i al sinergonului fotosintetizant. La Azotobacter, care are cea mai nalt rat respiratorie, membrana i mrete adaptativ suprafaa formnd numeroase intruzii veziculare(fig. 19).

Fig. 19. Intruzii veziculare la Azotobacter - imagine electrono-optica (original).

Membrana este implicat n sinteza i eliminarea exoenzimelor, iar la bacteriile patogene, n sinteza si eliminarea unor substane toxice (exotoxine). Sinteza acestor molecule are loc la nivelul ribosomilor ataai pe faa intern a membranei plasmatice. Membrana este sediul structural al sarcinii electrice i energetice: protonii (H+) i ionii OH- sunt distribuii separat pe cele 2 fee. Se genereaz o form de energie metabolic asemntoare potenialului energetic al unei baterii. Starea energetic a membranei denumit for proton-motrice este utilizat pentru transport, mobilitate flagelar i biosinteza ATP. Membrana este sediul proteinelor cu rol de chemoreceptori, n special a celor ce au rol n mobilitatea orientat a celulei. Unele proteine membranare au rol de enzime ale sistemului ATP-azic. Altele asigur modelarea peretelui celular: sunt murein-hidrolaze i murein-sintetaze. La nivelul membranei se gsesc proteinele de transport, ce asigur transferul moleculelor din mediu n celul i invers, precum i proteinele enzime ce realizeaz turnover-ul lipidelor i proteinelor membranare. Mecanismele fiziologice ale permeabilitii membranei Creterea i multiplicarea microorganismelor sunt condiionate de disponibilitatea nutrienilor care trebuie s strbat nveliurile celulare i de eliminarea produselor de catabolism. Caracterul hidrofob al membranei i confer acesteia proprietatea de barier de permeabilitate: trec prin difuzie liber unele molecule hidrofobe mici, molecule lineare i cele solubile n mediul lipidic al membranei (antibioticele cu molecula polar). Apa difuzeaz liber printre fosfolipidele membranei pentru c este o molecul mic i lipsit de sarcin. Membrana exclude moleculele mai mari dect glicerolul, dac nu sunt transportate de sisteme membranare sau dac nu se dizolv n lipide. In acelai timp, barierele celulare asigur transportul substanelor nutritive i rein n interiorul celulei substanele necesare, funcionnd ca adevrate pori moleculare,

ce controleaz intrarea i ieirea diferitelor molecule. Datorit structurilor de suprafa, celula bacterian nu este niciodat n stare de echilibru cu mediul nconjurtor, n privina concentraiei diferitelor molecule de o parte i de alta a membranei citoplasmatice. In funcie de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor, transportul moleculelor (electrolii i neelectrolii) prin membran se face prin dou categorii de procese fiziologice: - difuzia pasiv - mecanismele de transfer cu molecul purttor. Difuzia pasiv Difuzia pasiv este cea mai simpl modalitate de ptrundere a moleculelor n celul. Ea caracterizeaz trecerea liber a substanelor prin membrana plasmatic n ambele sensuri i se definete prin urmtoarele particulariti: - trecerea moleculelor se face fr consum de energie; - fora motrice a trecerii este gradientul de concentraie, ceea ce nseamn c transportul substanelor se face din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic a moleculelor; - transferul dureaz pn n momentul n care moleculele substanei care se transfer ajung la aceiai concentraie pe ambele fee ale membranei plasmatice; - dac de o parte a membranei se gsesc mai multe tipuri de substane, difuzia pasiv se face individual pentru fiecare tip de molecul n parte, pn la echilibrul osmotic al fiecrei categorii; - difuzia pasiv se realizeaz lent i nespecific. Factorul determinant al difuziei pasive este dimensiunea moleculei. Prin difuzia pasiv trec moleculele de ap, O2, CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), precum i moleculele liposolubile (care se dizolv n lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina). Membrana este permeabil pentru ap i pentru moleculele organice fr sarcin, pn la dimensiunile glicerolului. Fluxul molecular n oricare direcie este proporional cu concentraia moleculei pe faa de intrare, astfel nct rata net de transfer este proporional cu diferena de concentraie ntre cele dou compartimente, dar depinde i de ali factori: sarcina moleculei transportate, gradul ei de potrivire conformaional cu discontinuitile membranare ce formeaz calea de transport. Moleculele mai mari dect glicerolul necesit sisteme specifice de transport. Sisteme de transport cu molecule purttor Moleculele purttor sunt proteine integrate ale membranei plasmatice, care au proprietatea de a lega substanele dizolvate de o parte a membranei i de a le transporta pe cealalt parte, unde le elibereaz. Denumirea lor generic este aceea de sisteme de transport, transportori, purttori sau permeaze. Sunt cel puin 3 clase de sisteme de transport membranar : - cele care au o component ce traverseaz membrana - cele care au o component ce traverseaz membrana i o protein periplasmic de legare - cele formate din proteine multiple ce coopereaz pentru a media transportul. Sistemele de transport cu molecule purttor ndeplinesc mai multe funcii: - permit intrarea nutrienilor n celul - regleaz concentraia metaboliilor, cataliznd excreia produselor finale ale cilor metabolice; - mediaz eliminarea activ a antibioticelor i a substanelor toxice, favoriznd supravieuirea celulei; - regleaz echilibrul ionic, ce trebuie meninut la concentraii ce difer mult de concentraia din mediul extern; - particip la secreia proteinelor, polizaharidelor i lipidelor; - permit transferul acizilor nucleici prin membran, uurnd schimburile genetice ntre celule; - elimin molecule(antibiotice, toxine) care permit celulei s desfoare competiia biologic, conferindu-i un avantaj selectiv pentru supravieuire. Se cunosc trei modaliti de transport prin intermediul moleculelor purttor: - difuzia facilitat - translocaia de grup - transportul activ. Sistemele de transfer cu molecule purttor prezint urmtoarele caracteristici: - prin intermediul lor se realizeaz o trecere mai rapid a moleculelor de pe o fa pe cealalt a membranei plasmatice;

asigur trecerea simultan a mai multor tipuri de molecule, fr s existe fenomene de interferen; transfer n celule diferite molecule, chiar contra gradientului de concentraie i prin aceasta permit acumularea moleculelor n celul la concentraii ce pot depi de l00-l0000 de ori, concentraia lor n mediu (cu semnificaie deosebit pentru bacteriile care triesc n apele oligotrofe, srace n substane nutritive.

Difuzia facilitat Difuzia facilitat se aseamn ca mecanism, cu difuzia pasiv, deoarece fora de propulsie a transportului este diferena de concentraie a substanei dizolvate, pe cele dou fee ale membranei plasmatice. Procesul nu este cuplat cu consumul de energie metabolic i nu genereaz procese concentrative. Transferul moleculelor se face la vale, din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic. In final, concentraia substanei n celul este egal cu concentraia sa n mediu. Nu se produce acumularea (concentrarea) moleculelor pentru c nu se consum energie. Deosebirea fa de difuzia pasiv const n aceea c intervin molecule membranare care uureaz difuzia moleculelor transportate. Ele sunt proteine integrate, cu domenii extramembranare, att citoplasmatic ct i la suprafaa extern (fig 20).

Fig. 20. Difuzia facilitat. Moleculele proteice purttoare particip la transferul substanelor prin membrana citoplasmatic, dar numai in sensul gradientului de concentraie (de la concentraie mare la concentraie mic). Procesul nu necesit consum de energie (dupa Black, 1996).

Sunt dou modaliti de transport facilitat: de tip canal (sau por) i de tip purttor (carrier). In difuzia facilitat de tip canal, substana dizolvat trece de pe o latur pe cealalt a membranei, printr-un canal sau por. Canalele sau porii sunt proteine oligomerice (n special trimere) de membran care au rolul de a transfera diferite molecule. Denumirea generic este aceea de porine. Porinele prezint structuri de tip beta-pliere i se gsesc n membrana extern a bacteriilor Gram negative, n membrana cloroplastelor i mitocondriilor. Ele pot transporta neselectiv molecule mici (fosfat, pirofosfat, cationi, metale grele, nucleotide, nucleozide, monozaharide, oligozaharide, acizi grai, uree, vitamine, cofactori, oligopeptide) sau pot fi selective pentru o singur clas de molecule. Pereii canalului sunt delimitai de secvene hidrofile, hidrofobe sau amfipatice de aminoacizi, n funcie de proprietile substratului care difuzeaz i favorizeaz trecerea moleculelor, spre deosebire de interiorul hidrofob al stratului lipidic. Moleculele purttor pot fi proteine monomerice sau dimerice, au specificitate stereospecific de substrat i rata de transport este de cteva ori mai mic dect a difuziei de tip canal. Se presupune c molecula purttoare trece prin membran mpreun cu substratul, i schimb conformaia spaial, ceea ce i permite s se prezinte cu suprafaa activ, alternativ, spre faa extern sau spre faa intern a membranei. Fiecare tip de protein purttor are unul sau mai multe situsuri de legare pentru molecula specific. Mecanismul de transport al difuziei facilitate funcioneaz n celulele adaptate la concentraii mari de glucide n mediu (de exemplu, levuri, eritrocite). La bacterii, care trebuie sa preia substanele nutritive din soluii diluate, nu sau evideniat astfel de sisteme de transport. Translocaia de grup Particularitatea fundamental a acestei modaliti de transport const n faptul c, pentru a fi transportat prin membrana plasmatic, molecula este modificat chimic. Orice proces de transport n timpul cruia substratul este modificat chimic, se numete translocaie de grup. Moleculele din mediu nu vor aprea n celul n aceiai form chimic, ci sub forma unui produs modificat. Astfel sunt transportate glucidele (glucoza, fructoza, manoza, lactoza, N-acetilglucozamina), bazele purinice i pirimidinice, acizii grai etc. Moleculele sunt fosforilate prin sistemul fosfotransferazei, cu un rest de acid fosforic. Sistemul enzimatic al fosfotransferazei este alctuit dintr-o reea de proteine citoplasmatice i membranare, care se fosforileaz n cascad (fig 21). Prima protein a reelei (HPr) are localizare citoplasmatic i se fosforileaz din fosfoenol-piruvat, rezultnd HPr-P, cu eliberarea piruvatului. La nivelul membranei, ultima component a catenei de transport, o protein integrat, fosforileaz glucoza prin transferul gruprii fosfat. Glucoza este transferat n celul sub forma esterului glucozo-6-P. La E. coli, sistemul fosfotransferazei este alctuit din 24 de proteine, iar la transportul unui monozaharid particip cel puin 4 componente (fig. 23).

Fig. 21. Mecanismul de aciune al sistemului fosfotransferazei la E. coli. Pentru transportul glucozei, sistemul const din cinci proteine (Enz I, IIa, IIb, Iic, HPr). Transferul secvenial al gruprii fosfat are loc de la fosfoenol-piruvat (PEP), prin intermediul proteinelor pn la Enz IIc, care fosforileaz i transport glucidul (dupa Brock, 1994).

Proteinele membranare care se fosforileaz n cascad au rolul de permeaze i formeaz unul din sistemele de transport prin membrana citoplasmatic. Permeazele sunt proteine de transport foarte eficiente. Ele mresc viteza de transport de cteva ori n raport cu difuzia facilitat i sunt factorii determinani ai ratei excepionale a metabolismului bacterian. S-au identificat mutante bacteriene fr permeaze. Ele devin dependente de ptrunderea nutrienilor prin difuzie i necesit o concentraie extern a moleculelor nutritive de l000 de ori mai mare n raport cu tulpina parental. Din categoria permeazelor fac parte: - sistemele de transport pentru glucide, cu specificitate moderat, deoarece pot fi destinate transportului unei anumite molecule de zahr sau unui grup de molecule glucidice. S-au identificat sisteme de transport pentru monozaharide, pentru dizaharide i chiar pentru oligozaharide (de exemplu, sistemul de transport al maltozei poate transporta maltodextrine); - sistemele de transport pentru aminoacizi au afinitate mai nalt pentru substratul specific (comparativ cu cele ce transport glucide), fapt care se coreleaz cu concentraia diferit a celor dou categorii de molecule n mediu i cu rata lor diferit de metabolizare; - sistemele de transport pentru oligopeptide au o specificitate mai mic de legare. La E. coli s-au identificat trei sisteme de transport ale oligopeptidelor: unul care leag nespecific orice dipeptid, unul pentru tripeptide i altul care leag orice peptid mai mic de 6 resturi. Relativa lips de specificitate a permeazelor face posibil ptrunderea unor molecule pentru care membrana nu este permeabil, prin cuplarea lor cu peptidele. Astfel ptrund agenii chimici antibacterieni, care se leag de peptide prin legturi labile i se elibereaz intracelular, dup hidroliza peptidelor. Transportul membranar prin translocaie de grup se realizeaz cu consum de energie. Este o modalitate de a economisi energia, deoarece energia cheltuit prin fosforilare este folosit att pentru realizarea transportului, ct i pentru prima treapt a metabolizrii glucidului. Translocaia de grup realizeaz acumularea moleculei transportate n celul, la o concentraie net superioar celei din mediu. Transportul activ Transportul activ este modalitatea de transfer intracelular al nutrienilor contra gradientului de concentraie, prin care substanele pot fi concentrate de l000 de ori n interiorul celulei, fa de mediul extern. Procesul este totdeauna energizat de o surs primar de energie(chimic, electric sau solar *) i se evideniaz prin incubarea celulelor n prezena unui compus marcat radioactiv. Pentru a fi atribuit transportului activ, substana trebuie s se acumuleze n aceiai form chimic (i nu sub forma unui derivat al su). Pentru aminoacizi, dovada se obine mai uor, deoarece ncorporarea lor n proteine este anevoioas, dar zaharurile sunt metabolizate rapid i de aceea este necesar blocajul metabolic (prin mutaie sau prin utilizarea unui analog nemetabolizabil). Transportul activ se realizeaz cu consum de energie, prin intermediul proteinelor membranare de transport. Ele sunt proteine transmembranare i au domenii expuse att spre citoplasm ct i spre mediul extern.

Structural, moleculele transportoare formeaz circa 12 helice care se pliaz pentru a forma un canal transportor (fig. 22). Transportul implic o schimbare conformaional a proteinei, dup legarea substratului specific.

Fig. 22. Transportul activ. Ca i n cazul difuziei facilitate moleculele proteice purttoare transport moleculele prin membran. Procesul are loc contra gradientului de concentraie i consum energie pin ATP (Pi = fosfat anorganic). Proteina accesorie condiioneaz funcia proteinei de transport (dupa Black, 1996).

Uneori transportul activ este foarte specific, adic pentru fiecare tip de molecul transportat exist o anumit molecul purttor**, care o preia de pe o fa a membranei i o transfer pe cealalt. Acestea sunt sisteme uniport. Alte sisteme transport simultan, n acelai sens o substan, mpreun cu o alta necesar pentru transport (sisteme simport). A III-a categorie realizeaz concomitent transportul a dou tipuri de molecule, n direcii opuse (sisteme antiport) (fig. 23). Transportul activ al multor glucide i aminoacizi n celula bacterian este dependent de gradientul electrochimic de H+ prin membrana plasmatic.

Fig. 23. Reprezentarea schematica a modului de aciune a proteinelor de transport.

Substana care este transportat se leag specific*** cu o protein membranar purttor, dup care molecula transportat este eliberat nemodificat chimic, n interiorul celulei. Substanele transportate activ sunt unele glucide, aminoacizii, acizii organici, ionii anorganici (K+, Mg2+, SO42- , PO42- ). Glucoza este luat prin procese active la unele bacterii, iar la altele, prin sistemul fosfotransferazei.

Sursa de energie a transportului activ are 3 origini: transportorii cuplai leag transportul la deal al unei molecule cu transportul la vale al alteia; pompele dependente de ATP cupleaz transportul la deal cu hidroliza ATP; pompele dependente de lumin cupleaz transportul la deal cu aportul de energie luminoas (de exemplu, bacteriorodopsina de halofilelor). ** Existena proteinelor membranare de transport a fost dedus din creterea peak-ului electroforetic al proteinelor marcate n prezena moleculei transportate i din dispariia lor n celulele mutante pentru sistemul respectiv de transport. Prima protein purttor, identificat printre proteinele membranare solubilizate este proteina sistemului lac la E. coli. Este o protein inductibil, iar n celulele bacteriene crescute pe mediu cu lactoz, ea reprezint 4% din totalul proteinelor membranare. *** Specificitatea proteinelor membranare de transport s-a demonstrat: o singur mutaie genic anuleaz capacitatea bacteriei de a transporta glucide specifice prin membran.

Transportul activ necesit consum de energie, deoarece transportorii funcioneaz pe principiul pompelor concentrative. La bacterii, energia necesar activrii pompelor este rezultatul separrii ionilor de H, de electroni, n grosimea membranei, ceea ce constituie fora proton-motrice. Se creeaz un gradient de concentraie a protonilor ntre exteriorul i interiorul celulei. Protonii se concentreaz la exteriorul celulei, iar n interior se concentreaz OH-. Potenialul electrochimic are rol esenial pentru transportul activ. La bacteriile Gram negative, transportul moleculelor n celul este rezultatul aciunii a dou mecanisme, ambele consumatoare de energie. Moleculele sunt transportate n spaiul periplasmic prin intermediul porinelor, proteine de transport ale membranei externe. Ele permit intrarea ionilor i a metaboliilor cu molecul mic hidrofob. In spaiul periplasmic, molecula transportat se leag specific cu o protein periplasmic, care faciliteaz transportul n citoplasm, pe calea unei proteine purttoare specifice din membrana celulei. Al III-lea component al sistemului de transport este cel care furnizeaz energia necesar, prin hidroliza ATP. Aceast clas de transportori s-au denumitsisteme ABC(ATP Binding Cassette). Cellalt mecanism de transport este reprezentat de sistemul fosfotransferazei. Adeseori, celulele bacteriene posed dou tipuri de sisteme de transport: - sisteme constitutive, relativ nespecifice, n condiiile unei relative abundene a nutrienilor; - sisteme inductibile, cu specificitate nalt, active n condiii de stres, provocat de deficitul substanelor nutritive sau indus de substane toxice. Sisteme celulare de transport ionic Pentru o molecul fr sarcin, gradientul de concentraie determin transportul pasiv i sensul lui. Dublul strat lipidic este foarte impermeabil pentru moleculele ncrcate electric, mici sau mari. Sarcina i gradul de hidratare le mpiedic s ptrund n dublul strat lipidic. Transportul lor este influenat att de gradientul de concentraie, ct i de diferena de potenial electric a membranei, adic de potenialul membranar. Gradientul de concentraie i gradientul electric, adic gradientul electrochimic, determin fora net de transport pentru fiecare tip de molecul. Diferena de potenial a membranei (negativ pe faa intern) favorizeaz intrarea cationilor, dar se opune accesului anionilor. Membrana citoplasmatic are rol de barier osmotic, prin permeabilitatea foarte selectiv, permind trecerea (ieirea) unor anioni, dar reine cationii eseniali care au acces n i din celul, numai pe calea unor unor sisteme specifice de transport. Ionii de K+, Mg2+, SO42-, PO42- sunt transferai activ n celul, prin intermediul unor molecule purttoare cu specificitate nalt, denumite pompe ionice. Sistemele de transport pentru ionii cu importan nutritriv sunt sisteme de influx, iar cele pentru transportul ionilor toxici sunt sisteme de eflux i reprezint substratul molecular al mecanismelor de rezisten. Aceste pompe au o importan excepional pentru sistemele biologice, deoarece realizeaz i menin pH, gradientele ionice i potenialul de membran. Sistemele de transport pentru Na+, Ca2+, H+ i Cl- sunt sisteme de eflux i au rolul de a menine concentraii intracelulare sczute i de a realiza gradiente ionice transmembranare. Sistemele de eflux pentru cationi consum energie furnizat prin hidroliza ATP. Unii ioni (Cu2+, Zn2+) au rolul de micronutrieni, fiind utili la concentraii mici i sunt concentrai prin sistemele de influx, dar sunt toxici la concentraii mari, fiind eliminai prin sistemele de eflux. Pentru aceti cationi, sistemele de influx i de eflux sunt separate. Sistemele de eflux pentru cationii toxici sunt fie consumatoare de ATP ori sunt cuplate cu un sistem antiport de nglobare a altui cation (H+, Na+, Ca2+).

Aparatul fotosintetic

Aparatul fotosintetic este o structur accesorie, prezent numai la bacteriile fotosintetizante i este reprezentat de complexul de structuri membranare i particulate, care particip la procesul de conversie a energiei luminoase, n energie chimic. Spre deosebire de celulele eucariote, la care aparatul fotosintetic este localizat n structuri specializate, delimitate de membran (cloroplastul), la bacterii aparatul fotosintetic este localizat la nivelul unor diverticuli ai membranei plasmatice, de form tubular, vezicular sau lamelar care, n general pstreaz legatura fizic cu membrana plasmatic de origine. De aceea, membrana plasmatic este considerat ca sediu al sinergonului fotosintetic. La bacteriile verzi (Chlorobiaceae) aparatul fotosintetic este format din vezicule care nu au legtur structural cu membrana plasmatic. Fiecare vezicul este delimitat de o membran monostrat. Coninutul vezicular este omogen. Formarea veziculelor are semnificaia unei modaliti de compartimentare celular a funciei fotosintetice ntr-un organit specializat al celulei procariote (veziculele de Chlorobium). La bacteriile purpurii(roii)(Chromatiaceae i Rhodospirillaceae), diverticulii membranari de form vezicular sau lamelar, sedii ale pigmentului fotosintetic, pstreaz legtura cu membrana. La cianobacterii, aparatul fotosintetic este constituit dintr-un sistem de saci membranari, structural independeni de membrana plasmatic, aplatizai, denumii corpi tilacoizi (tilacos, grec = pung). Aici se gsesc pigmenii fotosintetizani i sistemul transportor de electroni. A II-a structur major cu rol n captarea luminii sunt ficobilisomii, aezai n iruri ordonate pe suprafaa sacilor tilacoizi. Mezosomul Mezosomul (sau corpul din mijloc) este o structur derivat din membran, a crei poziie n celul este adesea median. Se mai numete plasmalemasom (corp derivat din membran). Aceast structur a fost descris de cteva ori sub denumiri diferite (corpi periferici, condrioizi, membrane intracitoplasmatice). Pentru ca o structur membranar s poat fi ncadrat n categoria mezosomilor trebuie s ndeplineasc trei condiii de baz: - sa derive din membrana citoplasmatic, adic s fie rezultatul unor intruzii ale membranei citoplasmatice, cu care structura mezosomal pstreaz permanent legturi de continuitate direct; - s poat fi extruzat n spaiul dintre membrana plasmatic i peretele celular, prin creterea presiunii osmotice a mediului de suspensie; - s fie asociate cu urmtoarele procese importante ale celulei: a) cu replicarea cromosomului i cu distribuia celor doi cromosomi n celulele surori; b) cu procesul de sporulare. S-au descris trei tipuri morfologice de mezosomi: tubulari, veziculari i lamelari. Unii autori consider c aceste forme sunt reciproc reversibile, realiznd un continuum structural. Mezosomii sunt mai frecveni i au o structur mai complex, de tip lamelar, la bacteriile Gram pozitive. La cele Gram negative sunt mai rari i au aspect tubular. In mediile hipertonice, mezosomii se extruzeaz n spaiul dintre membrana citoplasmatic i peretele celular, ca o dovad cert a legturii lor structurale directe cu membrana plasmatic. Structura molecular a membranelor mezosomale este identic cu aceea a membranei plasmatice din care deriv: un strat dublu fosfolipidic, n care sunt inclavate proteinele structurale si enzimatice. Mezosomii sunt structuri foarte dinamice si probabil apar numai n anumite stri fiziologice ale celulei, cnd prezena lor este necesar. Formarea lor este o modalitate de extindere a membranei citoplasmatice spre interior care, datorit rigiditii peretelui celular nu se poate mri pe alt cale (fig. 24).

Fig. 24. Imagine electrono-optica a structurii mezosomale de tip tubular (a) la o bacterie Gram negativ si de tip lamelar (b) la Bacillus subtilis (original).

Funciile mezosomului. Mezosomul este o structur multifuncional: - este asociat cu procesele de biosintez i de cretere celular. Structurile mezosomale sunt foarte numeroase n celulele de B. subtilis, aflate n faza de cretere logaritmic; - la nivelul mezosomului se gsesc situsuri de legare pentru cromosom i pentru plasmide; - este calea de transmitere a semnalului, originar la nivelul membranei, pentru replicarea cromosomului i pentru diviziune, dup ce dimensiunile celulei au atins o valoare critic; - particip la procesul de segregare a celor doi cromosomi ntre celulele surori rezultate din diviziune; deoarece deriv din membran i mpreun cu aceasta este sediul sinergonului respirator (adic la nivelul su se desfoar procese energetice celulare), mezosomul este considerat echivalentul structural i funcional al mitocondriei; - este echivalentul funcional al lizosomului, deoarece la nivelul su se gsesc enzime cu rol degradativ; - este asociat cu funciile secretorii ale celulei. Mezosomii sunt mai numeroi n celulele de B. subtilis productoare de enzime. Particip ntr-un mod necunoscut la sinteza si secreia unor enzime inductibile (de exemplu, penicilinaza, pe care o secret bacteriile rezistente la penicilin). In mediu fr penicilin nu se secret penicilinaza si mezosomii lipsesc, dar apar n celulele care cresc pe mediul ce contine penicilin. In ciuda funciilor multiple care li se atribuie, Nanninga (l985) contest existena mezosomilor, considerndu-i ca structuri artificiale (artefacte), induse ca rezultat al reaciilor brutale, asociate cu tehnica de preparare a materialului examinat la microscopul electronic. Citoplasma Citoplasma celulei bacteriene este un sistem coloidal complex format din proteine, glucide, ap i substane minerale. Electroliii sunt n concentraie mare i sunt reinui n citoplasm datorit permeabilitii selective a membranei. Concentraia mare a substanelor dizolvate organice i anorganice, genereaz o presiune hidrostatic sau presiune de turgor, ce se manifest n raport cu faa intern a membranei. In citoplasm coexist strile de coacervare, de emulsie i de soluie, ntr-o continu modificare a raportului lor cantitativ, care n ansamblu, datorit lipsei curenilor citoplasmatici confer caracterul unui gel fluid. Caracterul de gel este consecina strii apei. Molecula de ap este polar. Proprietatea de polaritate a apei este foarte important, deoarece multe molecule polare se dizolv uor n ap. Apa formeaz o reea tridimensional att cu ea nsi, ct i cu macromoleculele. Polaritatea nalt a moleculei de ap face ca moleculele nepolare s formeze agregate stabile. Faptul c moleculele de ap sunt legate n reea condiioneaz proprietile sale de solvent, tensiunea nalt de suprafa i cldura specific nalt. In celul, apa se gsete n dou stri: - apa liber este cea care se deplaseaz liber n celul i care, la creterea presiunii osmotice a mediului extracelular trece n afara celulei; - apa legat (de hidratare) n structura gelului citoplasmatic. In celula bacterian vegetativ, apa liber (n proporie de circa 70% din totalul apei) creeaz un mediu de suspensie pentru macromolecule. Apa liber este foarte mobil, iar cea din structura gelului este practic imobil. Starea de gel a citoplasmei pstreaz componentele celulare separate spaial. Absena curenilor citoplasmatici are ca rezultat imobilitatea coninutului celular. La celulele bacteriene tinere, aflate n faza logaritmic de cretere, citoplasma este fin granular, intens bazofil, datorit coninutului ridicat de acizi nucleici, este dens i omogen. ARN citoplasmatic este reprezentat de ARNr (80%), ARNt (l0-20%) i ARNm (2%). In citoplasma celulelor tinere, proteina dominant cantitativ este EFTu (Elongation Factor Termounstable), care reprezint circa 5% din totalul proteinelor. Acest factor particip la formarea legturilor dipeptidice, la nivelul ribosomilor. Fiecare complex molecular ARNt-aminoacid ce ateapt recunoaterea codonului este asociat cu EFTu. Abundena EFTu este reflectarea direct a ratei nalte a sintezei proteice. In citoplasma celulelor mbtrnite apar materiale de incluzie i vacuole. Aspectul devine granular neomogen, iar bazofilia diminu datorit scderii pn la 0 a ratei sintezei ARN, precum i datorit reducerii treptate a cantitii existente. Afinitatea pentru coloranii bazici este neuniform.

Echilibrul osmotic al celulei bacteriene In mediile naturale, bacteriile sunt supuse unor variaii ample ale presiunii osmotice a mediului extern. De exemplu, bacteriile din sol supravieuiesc perioadelor de uscciune i umiditate, bacteriile infecioase ale tractului urinar supravieuiesc variaiilor de concentraie a urinii, iar microorganismele industriale tolereaz soluii nutritive concentrate, precum si acumularea extracelular a produselor de metabolism. La schimbarea osmolalitii mediului lor, bacteriile rspund prin mecanisme pasive sau active. Rspunsul este prompt, deoarece membrana citoplasmatic este liber permeabil pentru ap. La creterea presiunii osmotice a mediului extern, bacteriile rspund n trei faze care se suprapun parial: - deshidratarea(pierderea unei pri a apei celulei); - acumularea cosolvenilor; - remodelarea celular(a peretelui, a nucleoidului, reluarea sintezei macromoleculelor, a creterii i a diviziunii celulare). Rspunsul la scderea presiunii osmotice parcurge de asemenea trei faze: - nglobarea apei - eliminarea cosolvenilor - remodelarea funciilor celulare. Cosolvenii sunt molecule solubile n ap, care echilibreaz presiunea osmotic a celulei cu presiunea mediului extracelular. De cele mai multe ori, rolul de cosolvent l au cationii K+, Na+ i cosolvenii organici cu sarcin pozitiv (ectoina, glicin-betaina). Cosolvenii se gsesc n interiorul celulei i la exteriorul ei: NaCl i glucidele predomin n mediul extracelular, iar K+ i cationii organici, care constituie solvenii compatibili sunt intracelulari. Modificrile presiunii osmotice a mediului extern sunt recepionate de osmosenzori, localizai n membrana citoplasmatic i n nucleoidul bacterian. Osmosenzorul este un ansamblu care detecteaz schimbrile n activitatea apei extracelulare (osmosenzor direct) sau schimbrile care rezult n structura celulei (osmosenzor indirect). Spre deosebire de chemosenzor, care se bazeaz pe interaciunea stereospecific dintre ligand i receptor, osmosenzorii sunt macromolecule care sufer modificri ale conformaiei i/sau oligomerizare, ca rspuns la schimbrile solventului. Echilibrul osmotic la bacteriile halofile Microorganismele triesc n medii cu ntregul spectru al concentraiei de sare, de la apa dulce i mediul marin, pn la mediile n care NaCl are o concentraie la saturaie. Bacteriile halofile aparin grupului moderat, adic acelea care cresc la concentraii de NaCl cuprinse ntre 2-15%(0,3-2,5 M) sau sunt halofile extreme, adic necesit cel puin 15% NaCl (2,6 M) pentru cretere. Bacteriile halotolerante cresc n absena NaCl, dar tolereaz concentraii relativ mari de sare. Microorganismele halofile i halotolerante aparin tuturor celor trei domenii: Archaea, Bacteria si Eucarya. Deoarece membranele biologice sunt permeabile pentru ap, celulele nu pot menine o activitate a apei citoplasmatice, mai mare dect a mediului salin nconjurtor, deoarece apa trece rapid n mediu. Microorganismele care triesc n medii cu salinitate foarte mare, pstreaz un echilibru izoosmotic cu mediul extracelular. Meninerea presiunii de turgor* necesit o presiune hiperosmotic. Cu excepia halofilelor Archaea din ordinul Halobacteriales, toate organismele halofile i pstreaz presiunea de turgor.
*

Presiunea de turgor este diferena de presiune osmotic (osmolalitate) dintre interiorul i exteriorul celulei.

Microorganismele evit stresul osmotic determinat de concentraiile saline nalte, prin dou mecanisme: - celulele pot s pstreze concentraii saline intracelulare nalte (strategia salt-in), cel puin echivalente din punct de vedere osmotic cu concentraiile externe. Toate sistemele intracelulare vor fi adaptate prezenei concentraiei saline mari; - celulele pot s-i menin concentraii saline sczute n citoplasm, dar presiunea osmotic nalt a mediului extern este echilibrat de soluii compatibile organice (strategia soluiilor compatibile). Soluiile compatibile sunt compui organici cu molecul mic, solubile la concentraie mare n ap i sunt lipsite de sarcin, sau sunt pozitive la pH fiziologic. Strategia salt-in este utilizat de dou grupuri nenrudite filogenetic: halofilele extreme din Archaea (ordinul Halobacteriales) i halofilele anaerobe (ordinul Haloanaerobiales). Cu o excepie, ele nu conin soluii

osmotice organice, iar concentraia ionic intracelular este similar celei din mediul extern. In mediul extern se gsete NaCl, iar n celul se gsesc concentraii echimolare de KCl. La aceste celule, toate enzimele i componentele structurale sunt adaptate la prezena concentraiei saline mari. Enzimele lor sunt tolerante la condiiile de salinitate. Proteinele lor au aminoacizi acizi n mare exces i cantiti mici de aminoacizi hidrofobi. Cele mai multe proteine ale Archaea halofile depind de prezena concentraiilor mari de sare pentru meninerea conformaiei adecvate activitii. Sursa de energie pentru eliminarea Na+ i acumularea KCl este gradientul electrochimic de protoni prin membrana citoplasmatic, rezultat n procesul respirator. La majoritatea organismelor halofile si halotolerante, echilibrul osmotic este asigurat de molecule organice mici, fie sintetizate de celule, fie preluate din mediu cnd acestea sunt disponibile. Strategia soluiei compatibile nu necesit prezena proteinelor adaptate la mediul salin. Soluiile organice compatibile sunt acelea care, la concentraii nalte, permit enzimelor s funcioneze eficient, deoarece, probabil interacioneaz cu proteinele celulei.

Compui organici compatibili la microorganismele halofile i halotolerante.

Soluiile compatibile detectate la microorganismele halofile i halotolerante includ poliolii (glicerol, arabitol), glucide i derivaii lor (sucroza, trehaloza, glucozil-glicerol), aminoacizi i derivaii lor, amine quaternare (glicin-betaina). Betainele reprezint un grup restrns de substane naturale care rezult din aminoacizi, prin metilarea complet a gruprii aminice. Derivaii quaternari ce se formeaz sunt amfiioni, cu formula general:

Multe bacterii care acumuleaz ori sintetizeaz substane organice pentru stabilizarea osmotic, conin i concentraii mari de Na+ i K+. Procesele vitale n medii saline i hipersaline sunt costisitoare din punct de vedere energetic. Dintre toate soluiile organice compatibile, glicerolul este molecula cea mai simpl i cea mai ieftin pentru celul. Este miscibil cu apa n orice proporie. La Bacteria i Archaea, acumularea glicerolului nu este posibil, datorit absenei sterolilor membranari. Pentru echilibrul osmotic, ele sintetizeaz alte molecule mai costisitoare din punct de vedere energetic. Soluiile care se sintetizeaz cu cea mai mic cheltuial de energie se gsesc la organismele care triesc la concentraiile saline cele mai mari i care necesit cea mai mare concentraie de soluie compatibil. Pentru sinteza unei molecule organice compatibile sunt necesare 23-79 molecule de ATP la heterotrofe, produse n timpul respiraiei i 30-109 molecule de ATP pentru biosintez, la autotrofe. Dar moleculele compatibile pentru soluia osmotic pot s reprezinte i o surs de carbon i energie, utilizabil n condiiile epuizrii resurselor energetice externe. Cnd celulele trec n mediu cu salinitate sczut (de exemplu, n lacurile

srate, cnd apa de ploaie se amestec cu apa sarat), o parte a moleculelor organice cu rol osmotic devin disponibile. Unele molecule (glicin-betaina i ectoina) nu sunt metabolizate, ci sunt excretate dup trecerea celulei n mediul cu presiune osmotic mai mic. In mediul hipoosmotic, la Dunaliella (alg verde unicelular), glicerolul este convertit in amidon (osmotic inactiv). Multe microorganisme halofile si halotolerante menin un amestec de molecule osmotice compatibile i reglarea sintezei lor este condiionat de nevoile celulei. Bacteriile care sintetizeaz molecule organice compatibile posed proteine membranare de transport, care le permit s le incorporeze din mediu, dac sunt disponibile.

Organizarea nucleoidului bacterian Aparatul genetic bacterian este reprezentat de dou tipuri de structuri: nucleoidul, care din punct de vedere structural i funcional corespunde cromosomului, iar cea de a doua categorie de structuri o reprezint plasmidele. Corespunztor celor dou tipuri de structuri, determinanii genetici sunt de dou categorii: gene eseniale (eucromosomale), localizate n structura cromosomului i genele accesorii, cu localizare plasmidial sau n structura elementelor genetice transpozabile i a unor fagi. Cromosomul bacterian, ca structur genetic esenial poart informaia genetic ce asigur desfurarea funciilor eseniale pentru existena celulei, adic setul de determinani minim necesari pentru a codifica arhitectura celulei i pentru a asigura metabolismul energetic i de biosintez, creterea, diviziunea i reglarea diferitelor activiti celulare. Structurile genetice extracromosomale (plasmidele) poart informaia genetic accesorie, de confort, care permite celulei o mai bun adaptare la condiii de mediu noi sau modificate. Genomul E. coli K12 este alctuit din circa 4400 de gene. Pentru creterea n laborator ar fi necesare numai cteva sute. Genomul este rezultatul aciunii forelor selective pentru eficien metabolic i adaptabilitate. Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structur bine definit, delimitat de o membran i coninnd un numr definit de cromosomi, nucleul bacterian reprezint o form primitiv de organizare, lipsit de membran, inclavat direct n citoplasm. Particularitatea structurii nucleare lipsa membranei delimitante este fundamental pentru organizarea celular de tip procariot, cruia i aparin bacteriile. Datorit caracterelor structurale particulare, nucleul bacterian a primit diferite denumiri: nucleoid, material nuclear, nucleoplasm, echivalent nuclear sau chiar nucleu, prin analogie cu nucleul celulei eucariote, lineom sau genofor. Evideniere. Fiind foarte bogat n ARN, citoplasma celulei bacteriene este intens bazofil, fapt ce nu a permis diferenierea materialului nuclear, la fel de bazofil, dup colorarea cu colorani bazici de anilin. De aceea s-a considerat ca nucleul bacterian lipsete sau dimpotriv, c bacteriile ar avea un nucleu imens care ocup ntreaga celul. Datorit bazofiliei citoplasmei, evidenierea materialului nuclear la microscopul optic este posibil dup utilizarea tehnicilor de colorare selectiv, ce constau n ndeprtarea ARN prin hidroliz acid (tehnica Robinow si Feulgen) sau enzimatic (cu ribonucleaz) i utilizarea coloranilor de anilin. Dup hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferic, ovalar, de halter, de bastona, reprezentnd 5-l6% din volumul celulei. Dup tratamentul celulelor cu DN-az, zona corespunztoare materialului nuclear apare golit de coninut. Pe micrografiile electrono-optice, materialul nuclear este localizat, n mod obinuit, n partea central a celulei i se distinge de citoplasma nconjurtoare, prin densitatea sa mai mic la fluxul de electroni, n contrast cu celula eucariot, la care nucleul este mai electronodens, comparativ cu citoplasma. Celula procariot are un contrast invers al structurilor sale, n raport cu celula eucariot, care se datoreaz att faptului ca ADN nu este asociat cu proteine, ct i densitii foarte mari a citoplasmei bacteriene. Pe seciuni ultrafine, zona materialului nuclear este ocupat de fibrile fine, cu diametrul de 2,5 nm, uneori aranjate n iruri ondulate, paralele, asemntoare cu o jurubi de a (fig. 25) i sunt sensibile la hidroliza cu DN-az.

Fig. 25. Imagine electrono-optica a nucleoidului bacterian (original).

Organizarea fizic a cromosomului Materialul nuclear poate fi izolat din celul sub forma unui corpuscul dens i compact. Corpusculul corespunde strii mpachetate a cromosomului. Dup tratamentul moderat cu RN-az i proteaze, din structura compact se izoleaz molecula de ADN sub forma cromosomului circular nchis covalent (60%), ARNm , ARNt (30%) i ARN-polimeraza (l0%). Cromosomul are o lungime de l400 m i diametrul de 2,5

nm, corespunztor diametrului moleculei de ADN dublu catenar. Circularitatea este o condiie a existenei sale. Sub aceast form, molecula de ADN este rezistent la aciunea exonucleazelor citoplasmatice, active asupra moleculelor lineare de ADN. Cromosomul bacterian este cea mai mare molecul biologic. Prin lungimea sa (l400 m), molecula de ADN cromosomal depete de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene. Raportat la dimensiunile mici ale unei bacterii, molecula de ADN este supus constrngerilor topologice* de supraspiralizare (suprarsucire), prin care este mpachetat pentru a forma un corp compact de l500 de ori mai mic.
*

Topologia este o ramur a matematicii care studiaz proprietile corpurilor geometrice, proprieti care rmn nealterate dup rsucirea sau contorsionarea lor.

Pentru a ocupa un volum att de mic, molecula de ADN se mpacheteaz dup norme foarte riguroase, aa nct, n orice moment, din cele 3000-5000 de gene pe care le conine, oricare s fie accesibil sistemelor celulare de transcriere i traducere. Moleculele de ARN au un rol esenial n meninerea strii compacte a ADN. S-au propus mai multe modele de mpachetare a moleculei de ADN. Cel mai acceptat este acela propus de Pettijohn i Hecht (l974), n acord cu care, mpachetarea se face printr-un proces de pliere si supraspiralizare (formare de suprahelice). Se formeaz astfel o structur condensat, meninut prin aciunea asociat a proteinelor din nucleoid. Modelul de mpachetare prin pliere i supraspiralizare ncearc s explice mecanismul molecular al drumului invers, de la structura circular relaxat a macromoleculei de ADN, la arhitectura corpuscului dens existent n celul. Pentru mpachetare, se consider c molecula dublu catenar, circular, iniial se pliaz n 40-60 de domenii egale. Punctele de pliere sunt determinate de molecule de ARN nscnde, legate cu una dintre extremiti de ARN-polimeraz. Moleculele de ARNr i ARNt, mpreun cu ARN-polimeraza particip la formarea i meninerea domeniilor de pliere. Prin pliere, diametrul cromosomului scade la circa 30 m. In interiorul fiecrui domeniu de pliere are loc un proces de supraspiralizare. Supraspiralizarea este o stare fizic n care molecula de ADN se pliaz prin rsucire n jurul propriei axe (fig. 26).

Fig. 26. Diferite stri fizice ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr-o celul spart prin oc hipotonic, rspndite pe suporul reprezentat de o protein bazic. b. Diagrama ADN supraspiralizat. n stnga sunt reprezentate 7 domenii (numrul real este de circa 50) supraspiralizate, meninute astfel de un set de proteine, care stabilizeaz capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecrui domeniu pot fi spiralizate n jurul unui set de proteine nucleosomale, reducnd tensiunea n dublul helix, creat prin supraspiralizare. n dreapta, dou domenii au fost incizate la nivelul unei catene, permind rotaia helixului i relaxarea supraspiralei (dupa Pettijohn i Snider, 1985).

Intr-o etap ulterioar, domeniile suprahelicale se pliaz din nou unul fa de altul, superior i inferior fa de un plan orizontal. Astfel, rezult masa compact a nucleoidului, aa cum se evideniaz la microscopul optic i se poate izola din celul. Spiralizarea ADN are sens pozitiv i negativ.

Spiralizarea primar a dublului helix are sens pozitiv(de dreapta), cu 10,4 pb/tur. Anumite secvene de ADN, mai ales cele care conin resturi alternante de G i C, tind s formeze un helix rsucit spre stnga (forma Z) a ADN, denumit astfel deoarece axa glucid-fosfat are o structur n zig-zag. Spiralizarea secundar (supraspiralizarea) are sens negative (de stnga) i se produce prin rsucirea moleculei de ADN n sens opus spiralizrii primare (pozitive) a dublului helix. ADN bacterian este, n mod normal, supraspiralizat negativ, cu o spiral negativ la fiecare circa 200 pb. Cromosomul bacterian const dintr-un numr mare de bucle supraspiralizate, aranjate pe o regiune central, rezultnd o structur compact i organizat - nucleoidul. Prin supraspiralizarea negativ, ntre capetele domeniului pliat, se creeaz o tensiune de torsiune, direct proporional cu gradul de spiralizare, care se menine atta timp ct molecula este nchis covalent. Tensiunea este anulat prin incizia unei catene i formarea buclelor de ADN. Catena incizat se rotete liber n jurul axei moleculei, se relaxeaz i ia forma circular deschis, fr superhelice. Formarea unei bucle elimin un tur al suprahelicei i diminu tensiunea general a suprahelicei. Formarea suprahelicei i relaxarea ei este condiionat de activitatea unui set de enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care schimb configuraia spaial a ADN prin ruperea i reunirea catenelor. O topoizomeraz este o nucleaz reversibil, care se leag covalent la o grupare fosfat a ADN i rupe legtura fosfodiesteric. Deoarece legtura covalent care unete topoizomeraza la o grupare fosfat a ADN reine energia legturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacia este reversibil, adic incizia este urmat de legarea celor dou capete. Legarea este rapid i nu necesit un aport suplimentar de energie. Topoizomerazele de tip 1 acioneaz prin recunoaterea unui segment de ADN, parial despiralizat, prin incizia unei catene, ceea ce permite celor dou pri ale helicei de ADN, de o parte i de alta a inciziei, s se roteasc liber una fa de alta, n sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta nseamn c replicarea ADN se face numai cu rotaia unei mici pri a helicei, adic a celei situat n aval de bifurcaie. Problema transcrierii se rezolv n acelai mod. Topoizomerazele de tip II se leag covalent, simultan, de cele dou catene ale dublei helice i produc o rupere bicatenar tranzitorie. Aceste enzime se activeaz la situsurile cromosomale la nivelul crora se ntreptrund dou duble helice. Dup fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, etapele aciunii sale sunt urmtoarele: - clivarea uneia din cele dou helice duble; - enzima determin trecerea celei de a II-a catene, prin deschiderea creat; - repar discontinuitatea nainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel s separe cele dou molecule de ADN catenate. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze(produc spiralizarea moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene i bucla se relaxeaz). ADN-giraza (topoizomeraza II) modific configuraia spaial a moleculei de ADN, prin catalizarea suprarsucirii negative a moleculei de ADN, uurnd mpachetarea cromosomului i plasmidelor n spaiul restrns al celulei. Este o enzim alctuit din 4 subuniti (identice 2 cte 2), care utilizeaz energia rezultat prin hidroliza ATP. Este esenial pentru mai multe procese vitale: iniierea, alungirea i terminarea replicrii ADN, transcrierea unor operoni, repararea ADN, recombinarea i transpoziia. ADN giraza elimin rsucirile suprahelicale pozitive care se acumuleaz naintea bifurcaiei de replicare. Aceste activiti sunt rezultatul secionrii coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin ni i restabilirea continuitii catenei. Acest mecanism de aciune este caracteristic topoizomerazei II. Topoizomeaza IV este asemntoare structural cu ADN giraza. Ea separ moleculele surori catenate de ADN, rezultate dintr-un rund de replicare i permite segregarea lor n celulele surori. Starea suprahelical a ADN intracelular este reglat prin aciunea ADN girazei i topoizomerazei I, care anuleaz rsucirile suprahelicale ale ADN. Ryter si Cohen (l975) consider c nucleoidul evideniat la microscopul electronic ca o structur net ar reprezenta fracia de ADN condensat, genetic inactiv, care din punct de vedere topologic reprezint ADN supraspiralizat. Proporia ntre ADN supraspiralizat i ADN relaxat este meninut prin echilibrul dintre ADN-giraza (topoizomeraza II), enzima care produce supraspiralizarea i topoizomeraza I, enzima care produce relaxarea. Topoizomeraza I, prin clivarea unei catene, elimin tensiunea de torsiune i formeaz bucle externe distribuite pe toat suprafaa nucleoidului. Buclele sunt secvenele de ADN care conin genele transcrise la un moment dat. Ele sunt invizibile, extinse n citoplasm i n aceast topografie sunt mai uor accesibile ADNpolimerazei i ARN-polimerazei. Pe seciuni subiri, anticorpii marcai cu aur, specifici fa de ADN monocatenar coloreaz numai periferia nucleoidului, iar anticorpii specifici fa de ADN dublu catenar coloreaz partea central (condensat) a nucleoidului.

Domeniile cromosomului bacterian sunt topografic independente, ceea ce permite rotaia lor liber i relaxarea individual a fiecrei supraspirale, care trece reversibil n starea de bucl, configuraie n care se replic, este transcris sau reparat. ADN bacterian, ca i la eucariote este asociat cu proteine. In celula eucariot, corpii proteici n jurul crora se spiralizeaz dubla caten de ADN se numesc nucleosomi. La bacterii, organizarea molecular a nucleosomilor este puin cunoscut. Se pare c ei conin dou proteine de legare pentru ADN: proteina HU (Helix Unwinding) i proteina I. Ele se gsesc n structura nucleosomului, n proporia de o molecul la l50-200 perechi de baze. Bacteriile au o cantitate mic de ADN neinformaional(genele bacteriene nu conin introni). Secvenele repetate la bacterii pot fi: - homopolimerice (multimeri ai uneia din cele 4 nucleotide: poli-A, poli-G, poli-T, poli-C), cu o lungime de pn la 42 nucleotide; - secvene scurte de 2-6 baze. Dac sunt localizate n interiorul genelor i au o secven diferit de 3 sau 6 nucleotide, modific potenialul codificator al genei. - secvene mai lungi de 8 nucleotide. La numeroase bacterii s-au evideniat cteva sute de secvene repetitive palindromice de 20-40 de baze, cu localizare extragenic, care delimiteaz unele gene i a cror funcie nu este cunoscut. La bacterii nu s-au gsit gene ndite. Comparnd secvenele genelor ce codific proteine bine conservate n evoluie, reiese c intronii au fost prezeni n genele ancestrale, dar s-au pierdut n evoluia organismelor mici, care i-au redus la minimum cantitatea de ADN i s-au adaptat la o cretere foarte rapid (eubacterii i levuri). Genele bacteriene sunt strns mpachetate: se poate estima c circa 30% dintre ele se suprapun parial cu genele nvecinate. In mod obinuit, n celula bacterian se gsete un singur cromoson, dar n culturi tinere, pe medii care ofer condiii optime de cretere, celulele apar multinucleate, avnd 2-4 cromosomi, identici genetic, deoarece provin prin replicarea cromosomului parental, astfel c, n esen, bacteriile sunt organisme haploide. Situaia de celul polinucleat este temporar i este rezultatul lipsei de sincronizare ntre procesele de diviziune nuclear i diviziune celular. Replicarea ADN bacterian Legturile de H nu sunt singurele fore stabilizatoare ale moleculei de ADN. Bazele sunt hidrofobe, se stivuiesc i tind s se separe de mediul apos. Rsucirea helixului aduce bazele mai aproape i apa este exclus mai eficient. Structura dublu catenar este stabilizat prin interaciunile hidrofobe dintre bazele celor 2 catene. Dei bazele sunt hidrofobe i foarte puin solubile n ap, acizii nucleici sunt destul de solubili, datorit hidrofiliei axei glucid-fosfat i n special, datorit concentraiei mari de grupri fosfat ncrcate negativ. Acestea pot avea efect invers, de respingere electric a celor dou catene, dar prezena srurilor n mediu, creeaz un nor de ioni pozitivi care anuleaz respingerea. Replicarea cromosomului bacterian este un proces strict reglat i are loc ntr-o etap bine definit a ciclului celular. Replicarea ADN bacterian este de tip semiconservativ: fiecare din cele dou molecule fiice conine o caten sintetizat de novo i o caten complementar, conservat din molecula parental (fig. 27). Pentru ca replicarea ADN s aib loc, cele dou catene ale moleculei parentale trebuie s se separe fizic, cel puin pe o secven scurt, pentru a permite ADN-polimerazei i proteinelor asociate s citeasc fiecare caten individual cu rol de matri. Reasocierea catenelor separate este blocat prin legarea SSB(single stranded DNA-binding protein).

Fig. 27. Pentru replicarea ADN la procariote, catenele se separ la punctul de origine a replicrii, de unde bifurcaia de replicare se deplaseaz simetric. Fiecare dintre cele dou catene are rol de matri pentru sinteza unei catene complementare. Sinteza noilor catene de ADN are loc n direcia 5- 3. De aceea, sinteza unei noi catene este discontinu, sub forma segmentelor scurte (Okazaki) i apoi reunite.

Cromosomul bacterian este un singur replicon*, deoarece se replic de la o singur origine. Procesul replicrii moleculei de ADN este iniiat la un punct denumit originea replicrii. Aceasta este o secven de 250-300 de baze, recunoscut de complexul de iniiere. La punctul de origine a replicrii, dubla caten de ADN este secionat i replicarea este iniiat pe cele dou catene izolate. Situsul de replicare, denumit bifurcaie de replicare se deplaseaz bidirecional, pe molecula de ADN. Complexul proteic de replicare este format din proteina A (cu rol n legarea cromosomului pe situsul membranar), helicaza B o topoizomeraz I (cu rol de despiralizare a ADN), proteina SSB, cu rolul de a stabiliza cele dou catene separate, ADN giraza (topoizomeraza II), ce limiteaz derularea extensiv a ADN sub aciunea topoizomerazei I i induce supraspiralizarea negativ a ADN nou replicat). Aceste proteine,
*

Cromosomii celulei eucariote au fiecare mai muli repliconi, ceea ce face ca replicarea ADN s se fac ntr-un interval scurt.

mpreun cu G-primaza (cea care sintetizeaz ARN primer) formeaz un primosom (complexul primar care iniiaz replicarea). Sunt necesare dou complexe de replicare: unul se deplaseaz n direcia 3-5 pe un lan, iar cellalt, n direcia 5 3, pe catena opus. Deoarece replicarea moleculei de ADN este bidirecional, exist dou puncte de sintez, denumite bifurcaii de replicare, care se deplaseaz n direcii opuse, ncepnd de la punctul de origine i progreseaz cu 500-1000 nucleotide/sec., pn se ntlnesc. Pe imaginile autoradiografice se observ structuri de forma literei theta. Replicarea ADN are caracter cooperant, adic complexul de proteine implicate n replicare formeaz un ansamblu stabil care se deplaseaz de-a lungul fiecrei catene, fr disociere i reasociere la fiecare treapt, ceea ce contribuie decisiv la viteza foarte mare a replicrii ADN. Enzima care catalizeaz adugarea nucleotidelor este ADN-polimeraza III. Replicarea ADN este semidiscontinu: o caten a ADN este sintetizat continuu, iar cealalt se sintetizeaz sub forma unor fragmente scurte, care ulterior sunt reunite cap la cap. Cele dou catene ale moleculei parentale nu se replic simultan, deoarece sunt antiparalele (una are direcie 5- 3, iar cealalt, 35). Direcia de polimerizare a catenei noi este 5- 3, nici una dintre polimeraze neputnd s adauge dezoxiribonucleotide n direcia 3- 5, la catenele nascente. Catena care crete n direcia 5- 3 (catena leading) se sintetizeaz n mod continuu, deoarece, permanent exist un capt 3OH liber la bifurcaia de replicare, la care se adaug o nou nucleotid. ADNpolimeraza III catalizeaz adugarea unei nucleotide la catena de ADN preexistent, dar nu iniiaz sinteza ADN de novo, dintr-un amestec de nucleotide. Totdeauna este necesar un primer de ARN. La deschiderea dublei catene de ADN, o ARN-polimeraz catalizeaz sinteza unui primer de ARN. ARN-polimeraza specific se numete ARN-primaza. Catena care crete n direcia 3- 5 se sintetizeaz discontinuu, deoarece la bifurcaia de replicare nu exist un capt 3OH liber. Mici fragmente de ARN primer furnizeaz captul 3OH. Aceasta este catena succesoare sau ntrziat (lagging). Ea se sintetizeaz sub forma unor fragmente scurte n direcia opus bifurcaiei de replicare. Dup ce ADN este sintetizat, primerii ARN sunt ndeprtai (probabil sub aciunea RN-azei H). Fragmentele scurte rezultate din sinteza discontinu sunt completate de ADN-polimeraza I i reunite cap la cap sub aciunea catalitic a polinucleotid-ligazei. Deoarece o caten este sintetizat continuu, iar cealalt discontinuu, ntregul proces al replicrii ADN are caracter discontinuu. Pentru un scurt interval dup replicare, catena parental i cea progen difer din punct de vedere chimic, deoarece catena parental este metilat. Aceast diferen de ordin chimic este util pentru corectarea fidelitii copierii catenei matri (funcia de proof-reading). Astfel, catena nou este controlat pentru eventualele mperecheri greite ale nucleotidelor. Eventualele erori de mperechere sunt depistate de sistemul enzimatic de corectare, sunt clivate, dup care o enzim de reparare ncorporeaz nucleotidele corecte. ADN-metilazele metileaz adenina i citozina i inhib astfel aciunea enzimelor de restricie. Cele mai importante schimbri ale ADN n cursul replicrii sunt acelea ale gradului de spiralizare, produs sub aciunea topoizomerazelor. ADN suprahelical se despiralizeaz mai uor dect moleculele cu un grad inferior de spiralizare. Deoarece topoizomerazele regleaz nivelul de supraspiralizare, ele sunt de fapt reglatoare ale proceselor de replicare i transcriere. Transcrierea. Spre deosebire de ADN, care se sintetizeaz ntr-o perioad definit a ciclului celular, sinteza ARNr se desfoar continuu, pe tot parcursul ciclului de cretere a celulei. La eucariote, sinteza ARN n timpul mitozei este stopat, deoarece, cromosomii fiind condensai, transcrierea nu poate avea loc. Informaia genetic este convertit la ARNm. Procesul este catalizat de ARN-polimeraz i este foarte asemntor cu cel al replicrii ADN, pentru c ADN are rol de matri i secvena de baze n noua molecul sintetizat reflect pe aceea a matriei. Intre transcriere i replicare sunt dou diferene majore: a)se sintetizeaz molecule scurte; b)este transcris numai o caten a ADN. Unele gene sunt transcrise de pe o caten, iar altele de pe catena opus, dar n general, o secven a ADN este transcris dintr-o singur caten. ARN-polimeraza iniiaz transcrierea la secvenele de start denumite promotori, iar la captul mesajului se gsesc semnalele care stopeaz polimerizarea, cnd blocul de gene a fost transcris. ARN-polimeraza este alctuit din 5 catene polipeptidice: dou catene identice, i i (sigma). Primele 4 catene formeaz regiunea central a enzimei, dar specificitatea legrii de promotor se datoreaz celei de a 5-a subuniti factorul sigma. Cele 4 catene, mpreun cu factorul sigma, formeaz holoenzima. ARN-polimeraza este mare i intr n contact simultan, cu mai multe baze. Moleculele de ARNpolimeraz interacioneaz aleatoriu cu ADN cromosomal, alunec de-a lungul ei, dar au afinitate mic fa de

majoritatea secvenelor. Polimeraza se leag foarte strns de secvena specific denumit promotor, ce conine situsul de start pentru iniierea sintezei ARN. Dup ce ARN-polimeraza se leag de regiunea promotor, structura iniial dublu catenar nchis a ADN este convertit la forma deschis, n care cele dou catene se separ pe o secven localizat. Deschiderea dublei catene expune bazele lanului codificator, permind mperecherea bazelor ribonucleozid-trifosfai pentru sinteza ARN. Se formeaz prima legtur fosfodiesteric i factorul se disociaz din complex. Pentru extensia catenei de ARN este necesar numai regiunea central a ARN-polimerazei. Transcrierea ARN nu necesit primer i se face n direcia 5- 3, prin adugarea secvenial a nucleotidelor la captul 3. Transcrierea progreseaz pn la un semnal terminal, cnd ARNm i ARN-polimeraza sunt eliberate. Semnalele de terminare a transcrierii. Transcrierea ncepe la situsul de start (promotor) i se termin la sfritul genei, marcat de o secvena terminator (stop), caracterizat prin prezena unei regiuni cu secvene repetate invers (fig 38).

Fig. 28. Ilustrarea mecanismului molecular al terminarii transcrierii ARNm (modificat dupa Dale, 1996).

Secvena terminal va fi transcris n ARN, cu formarea structurii stem-loop (peduncul cu bucla) ceea ce va permite reasocierea celor 2 catene de ADN. Astfel, transcrierea se ntrerupe i ARNm se disociaz. Molecula de ARN conine secvena complementar a secvenei genice, adic secvena catenei care nu a avut rol de matri. La bacterii, promotorii puternici sunt asociai cu gene ce sunt transcrise ntr-un numr mare de molecule de ARN. In faza de cretere logaritmic a culturii bacteriene, la temperatura optim (37 oC), cromosomul este transcris cu o rat de 60 nucleotide/secund. In orice moment, n celul se gsesc 400-800 molecule identice de ARNm, circa l00 molecule diferite de ARNt i circa 700 molecule precursoare ale ARNr. Transcrierea fiecrei molecule de ARN este catalizat de o molecul de ARN-polimeraz. Cele circa l600 molecule de ARNpolimeraz reprezint l% din cantitatea de proteine celulare. La procariote, toate tipurile de ARN sunt transcrise de un singur tip de ARN-polimeraz.

Ribosomii
Ribosomii sunt particule ribonucleoproteice, localizate n citoplasm, care la microscopul electronic au form sferic, cu diametrul de 20 nm. Pe baza constantei de sedimentare* (S) se disting urmtoarele categorii de ribosomi: a) ribosomi 80S, n citoplasma celulelor eucariote; b) ribosomi mitocondriali i cloroplastici, ntre 55S la mamifere i 75S la plantele superioare; c) ribosomii archaea, de 70S, asemntori din punct de vedere funcional cu ribosomii 80S ai eucariotelor, datorit absenei sensibilitii la streptomicin i cloramfenicol i prin sensibilitatea la toxina difteric; d) ribosomii eubacteriilor, de 70S.
*

Simbolul S semnific viteza de sedimentare a unei particule sau a unei molecule prin tehnica ultracentrifugrii. Constanta de sedimentare (viteza cu care o molecul se deplaseaz ntr-un cmp gravitaional) este dependent de dou proprieti fizice ale moleculei: gr. mol. (M): cu ct gr. mol. crete, cu att crete i viteza de sedimentare; aspectul moleculei (o molecul aerodinamic se deplaseaz mai repede dect una sferic). O molecul mai compact ntmpin o for de frecare mai mic i se deplaseaz mai repede. Raportul dintre viteza de deplasare a moleculei i fora centrifug aplicat se numete coeficient de sedimentare(S). S = Viteza/Fora centrifug Valoarea lui S pentru o molecul dat este aceiai n diferite soluii. Pentru majoritatea macromoleculelor, valoarea lui S este cuprins ntre 1 x l0-13 secunde i l00 x l0-l3 secunde. In onoarea lui Svedberg, cel care a inventat centrifuga, l0-13 secunde este echivalentul unui svedberg sau S. -

Numrul ribosomilor n celula bacterian este corelat cu activitatea ei fiziologic: este mic n celulele n repaus, dar crete foarte mult n celulele fiziologic active (n medie 20000 ribosomi/celul, cu variaii ntre l5-l00 000). Ribosomii sunt structuri dinamice, calitate ce se reflect n capacitatea lor de a se disocia n dou subuniti, de 30 S i 50S i de a se reasocia. Disocierea i reasocierea sunt corelate cu variaia concentraiei ionilor de Mg2+: creterea concentraiei ionilor favorizeaz asocierea, iar scderea concentraiei lor produce disocierea. Circa l0% din numrul total de ribosomi sunt asamblai, liberi n citoplasm. Ei sintetizeaz proteinele structurale. Ali l0% se gsesc sub forma subunitilor disociate, iar restul de 80% sunt polisomi. Ribosomii au dou localizri: liberi n citoplasm sau ataai feei interne a membranei citoplasmatice. La nivelul celor ataai se sintetizeaz proteinele de export. Studiul ribosomilor a beneficiat de tehnici din domeniul fizicii (metoda dispersiei neutronilor), care, n asociaie cu tehnicile de chimie au permis nelegerea structurii i funciei ribosomilor. La microscopul electronic, s-a demonstrat c ribosomii au form complex, cea sferic perceput n mod obinuit fiind rezultatul examinrii cu sisteme optice cu putere redus de rezoluie. Subunitatea 50S are o form asemntoare cu aceea a unui fotoliu, iar subunitatea 30S se aseamn cu o halter asimetric, aezat orizontal pe braele i sptarul fotoliului. Intre cele dou subuniti rmne un spaiu prin care trece ARNm (fig. 29).

Fig. 29. Reprezentarea schematic a subunitilor ribosomale 30S i 50S.

Din punct de vedere biochimic, ribosomii bacterieni conin circa 55 de tipuri de molecule proteice i trei tipuri de molecule de ARNr. Studiile privind structura funcional a ribosomilor s-au fcut cu dou metode foarte sensibile: difracia cu neutroni i imunoelectronomicroscopia Subunitatea mic 30 S cuprinde 2l tipuri de molecule proteice (S1-S21), n ordinea descreterii mrimii, cu gr. mol. ntre 60 kDa i 8 kDa i o molecul de ARNr l6S, alctuit din circa l6 000 nucleotide. Subunitatea mare, 50S conine 34 tipuri de molecule proteice (Ll - L34, L= Large), cu gr. mol. cuprins ntre 9-28,5 kD i dou molecule de ARNr, de 23 S i respectiv 5 S. Cele dou tipuri de molecule de ARN provin prin clivarea unui precursor comun, de 30 S. ARNr este transcris din 7 operoni (rrn), fiecare cu doi operoni n tandem (P 1 i P2), din care sunt transcrise copiile 16S, 23S i 5S. Sinteza ARNr este controlat de concentraia aminoacizilor n celul: rata sintezei ARNr este dependent de rata de aprovizionare cu aminoacizi, corelat direct cu capacitatea ribosomilor de a consuma aminoacizii n sinteza proteinelor. Dac un singur aminoacid lipsete, sinteza proteinelor ribosomale este stopat i celula nu mai asambleaz ribosomi. Cele 55 de tipuri de proteine ribosomale se gsesc ntr-un singur exemplar (o singur molecul din fiecare tip). Unele au rol structural, fiind eseniale pentru asamblarea ribosomului, altele au rol funcional, permind legarea ARNm n procesul traducerii i sintezei lanului proteic. La E. coli, n fiecare subunitate ribosomal, raportul ARN-proteine este 2/l, iar la alte bacterii, raportul este 2/3. Moleculele componente au o distribuie fix, riguroas n structura ribosomului. ARNr este pliat ntr-o structur tridimensional ce formeaz regiunea central a ribosomului i determin aspectul su. Proteinele sunt localizate n general la suprafaa ribosomului, n depresiunile pe care le creeaz ARN pliat. Unele proteine conin domenii globulare, localizate la suprafa, ce trimit extensii n regiunea central a ribosomului. Interaciunile fixe ale componentelor condiioneaz procesele de autoasamblare a ribosomilor. Rata sintezei proteinelor ribosomale este controlat negativ de proteinele-r libere: acumularea proteinelor-r libere diminu rata traducerii, scade timpul de njumtire al ARNm i al proteinelor-r. Astfel scade rata sintezei proteinelor-r. Asamblarea ribosomilor. Experimental, componentele ribosomale se disperseaz i se autoasambleaz dup restabilirea condiiilor de mediu, pentru a produce ribosomi activi. S-a reconstituit subunitatea 30 S, dar reasamblarea subunitii 50 S este mai complex deoarece este dependent de temperatur (60o) i proteinele se denatureaz la aceast temperatur. n studiile experimentale s-au utilizat ribosomi de Bacillus stearothermophilus, care are proteine termostabile, rezistente la 60o. Ulterior s-a reasamblat subunitatea 50 S de la E. coli. Reasamblarea urmeaz o cale specific: anumite proteine se leag de ARN i complexul este recunoscut succesiv de alte proteine, pn ce structura devine complet. Ribosomii reconstituii sunt funcionali (fac sintez proteic). Rolul proteinelor pare a fi de stabilizare a ARN, dar ele permit schimbarea configuraiei ARNr, necesare catalizei sintezei proteinelor. Ribosomii reprezint componenta esenial a sistemului de traducere a informaiei genetice. Ei sunt adevratele fabrici de proteine ale celulei. Ribosomii au rolul de a menine att molecula de ARNm, ct i complexul aminoacil-ARNt, ntr-o orientare corespunztoare pentru a permite att citirea mesajului, ct i formarea legturilor peptidice. Ribosomii se asociaz n polisomi (poliribosomi), adic grupri funcionale formate din 4-50 uniti ribosomale. Dimensiunile polisomilor variaz n funcie de lungimea ARNm. Polisomii sintetizeaz concomitent mai multe molecule proteice pe aceiai molecul de ARNm. Particularitile sintezei proteice la bacterii In celula eucariot, transcrierea i traducerea informaiei genetice sunt evenimente separate n timp i spaiu, datorit compartimentrii spaiului celular. In celula procariot, ribosomii au relaii spaiale strnse cu ADN, deoarece transcrierea i traducerea informaiei sunt dou procese intim coordonate, care se desfoar aproape concomitent. Transcrierea moleculei de ARNm dureaz circa 1 minut. Rata traducerii este controlat de rata transcrierii. Cele dou procese sunt intim corelate i se petrec cvasisimultan. La bacterii, traducerea ncepe foarte repede, deoarece ARNm are o durat funcional scurt (l-2 minute), fiind degradat de nucleaze. Pentru a compensa instabilitatea ARNm, traducerea se iniiaz timpuriu: complexul de iniiere se ataeaz la captul 5al mesajului, nainte de transcrierea captului 3. Ulterior se ataeaz succesiv ali ribosomi, rezultnd structuri polisomice. Fiecare ribosom este legat de o molecul proteic nascent, a crei lungime este direct proporional cu lungimea mesajului pe care ribosomul l-a citit.

Dup ce a citit integral informaia ARNm, ribosomul se desprinde din polisom, elibernd sintetizat (fig. 30).

polipeptidul

Fig. 30. Rolul robosomilor n biosinteza proteinelor.

Cuplarea transcrierii cu traducerea are dou consecine: a) accelereaz rata sintezei proteice, n sensul c traducerea nu trebuie s atepte eliberarea ARNm de pe matria de ADN; b) buclele de ADN sunt conectate la membrana citoplasmatic. Pe medii nutritive bogate, cele mai multe celule bacteriene sintetizeaz i secret exoproteine, n special n faza staionar a culturii. Proteinele pentru export se sintetizeaz pe ribosomii atasai membranei plasmatice. Traducerea. Structura ribosomului, capacitatea sa de a determina poziia ARNt pe ARNm, precum i cataliza legturii peptidice sunt determinate de ARNr i nu de proteine. ARNm bacterian nu are o secven semnal (aa cum este secvena TATA n celula eucariot) la nivelul creia s nceap traducerea. Ribosomii se ataeaz la o secven specific a ARNm (secvena ShineDalgarno), parial complementar unei regiuni de la captul 3 al ARNr 16S, astfel c legarea ribosomului poate fi mediat de punile de H ce se formeaz ntre secvenele de baze complementare. ARNm bacterian i un ARNt iniiator se asociaz cu codonul adiacent de iniiere (de obicei AUG, uneori GUG i mai rar CUG). Subunitatea 50 S se ataeaz la complexul de iniiere. Aceste trepte necesit aciunea ctorva proteine neribosomale, denumite factori de iniiere. ARNm este citit n grupe consecutive de cte 3 nucleotide, fr semne de punctuaie. In funcie de punctul de start, el poate codifica 3 proteine complet diferite, adic exist cadre de citire poteniale (reading frames). ARNt. Recunoaterea fiecrui codon triplet este mediat de moleculele de ARNt. Exist cel puin o specie de ARNt specific pentru fiecare aminoacid. Moleculele de ARNt sunt scurte (75-100 nucleotide), pliate i formeaz o structur ca o frunz de trifoi. Braul acceptor al ARNt, format din mperecherea bazelor regiunilor terminale 5 i 3 formeaz situsul atarii aminoacidului, prin acilarea captului 3. Braul anticodon conine bazele ce recunosc codonul triplet al ARN, prin complementaritate. Aminoacidul corespunztor este cuplat cu ARNt de enzima specific, aminoacil-ARNt sintetaza, care are o specificitate dubl: recunoate ARNt, dar i aminoacidul cu care va fi legat ARNt. De exemplu, codonul UGG care codific trp, va fi recunoscut de ARNtrp. Acest ARN va fi recunoscut de triptofanil-ARNt sintetaz, care este specific pentru trp. Sunt 3 elemente care particip la specificitatea procesului: codonul, anticodonul i recunoaterea ARNt specific de ctre aminoacil-ARN sintetaz. Uneori ns, mperecherea este greit, deoarece moleculele de ARNt sunt asemntoare, dup cum unii aminoacizi (izoleucina, valina) sunt asemntori. Erorile au frecven mic (1/103 molecule proteice conin un aminoacid incorect), datorit unui mecanism de editing, prin care sintetaza cliveaz aminoacidul legat incorect cu ARNt. Dac toate cele 3 elemente de specificitate ar fi absolute, ar trebui s fie cel puin 61 specii diferite de ARNt, cte unul pentru cei 64 codoni, minus cei 3 codoni stop, pentru care nu exist ARNt corespunztor. Pentru muli aminoacizi exist specii multiple de ARNt.

Mecanismul sintezei proteice. La bacterii, codonul de iniiere AUG este recunoscut de o molecul specific ARNtfMet. Dup ce ARNt se leag cu Met, aminoacidul este modificat de o alt enzim, pentru a forma N-formil-metionina. Moleculele de ARNt aminoacilate, se leag la un situs ribosomal, denumit situs A (acceptor), iar regiunea anticodon se mperecheaz cu ARNm. Numai dup formarea legturii peptidice, ARNt este apt s se deplaseze la un al II-lea situs pe ribosom, denumit situs P (peptid). ARNt specific, legat cu fMet, este unic prin capacitatea lui de a se asocia direct cu situsul P, iar anticodonul ARNtfMet recunoate codonul AUG. ARNt cu aminoacidul corespunztor codonului urmtor, intr n situsul A pe ribosom i legtura peptidic se formeaz prin transferul restului fMet, la al II-lea aminoacid. ARNtfMet este eliberat i ribosomul se deplaseaz pe urmtorul codon al ARNm, care este nsoit de deplasarea celei de a II-a molecule de ARNt legat cu dipeptidul, de la situsul A la situsul P. Etapa se numete translocaie. Situsul catalitic pentru formarea legturii peptidice este reprezentat de ARN 23 S. Situsul A este liber s accepte ARNt-aminoacil, corespunztor codonului al III-lea al ARNm. Secreia proteinelor extracelulare la bacterii Multe proteine rmn solubile n citoplasm, iar altele sunt secretate prin membrana citoplasmatic. Termenul de secreie semnific trecerea unei molecule de la locul sintezei sale (citoplasma), prin membran, la exteriorul celulei Gram pozitive sau n spaiul periplasmic al celulei Gram negative, iar cel de translocaie semnific transferul extracitoplasmatic al unei molecule care rmne legat de membran. Toate celulele, eucariote si procariote secret (export) proteine n spaiul extracelular. Proteinele pentru export, la bacterii se sintetizeaz pe ribosomii asociai membranei plasmatice. Sinteza ncepe cu o secven semnal, de l8-35 aminoacizi, la captul N-terminal. Prin secvena peptidic semnal, proteinele pentru export se deosebesc de cele citoplasmatice i se orienteaz spre calea de export. Orientarea este rezultatul legrii peptidului semnal, de membrana, fie direct, fie prin intermediul unei proteine citoplasmatice denumit chaperone (engl. = a nsoi, a supraveghea). Unele proteine destinate exportului nu apar niciodat n citoplasm, ceea ce sugereaz c eliminarea lor se face pe msur ce sunt sintetizate. Ele sunt molecule relativ mici (20-40 kDa) i sunt flexibile pentru c nu au legturi S-S i, de cele mai multe ori, nici component glucidic. Pentru aceast categorie de proteine, translocaia este cotranslaional. Secvena semnal hidrofob N-terminal se angajeaz n traversarea membranei, nainte ca restul moleculei s fie sintetizat. Dup ce secvena semnal ajunge pe suprafaa extern a membranei plasmatice, este clivat i digerat, iar proteinele exportate rmn asociate membranei, pn ce plierea este complet. Alte molecule se sintetizeaz complet, nainte de nceperea exportului. Dup terminarea sintezei, moleculele destinate exportului nu dobndesc configuraia teriar n citoplasm, deoarece factori proteici denumii chaperoni*, interacioneaz cu polipeptidele nascente i blocheaz plierea lor, astfel nct proteinele sunt meninute ntr-o configuraie parial nepliat, compatibil cu transferul.
Chaperonii(chaperon, engl = a nsoi, a supraveghea) s-au definit ca o familie de proteine celulare care mediaz plierea corect a altor polipeptide i uneori asamblarea lor n structuri oligomere, dar care nu sunt componente ale structurilor funcionale finale. Multe proteine se pliaz spontan, dar plierea iniial a unui numr mare de proteine celulare necesit asistena chaperonilor. Proteinele care s-au pliat greit sunt degradate proteolitic.
*

Circa 20% dintre proteinele sintetizate nu ajung la destinaia final, datorit erorilor care au aprut n timpul transcrierii, traducerii sau pentru c nu s-au pliat corect. La bacterii, sinteza proteinelor are loc cu o rat foarte rapid: 15-20 aminoacizi/ribosom/secund, ceea ce echivaleaz cu sinteza a 30 000 polipeptide/min. Rata nalt a traducerii necesit un control riguros al calitii proteinelor. Circa 30% din totalul proteinelor, necesit asistena chaperonilor. Decizia destinaiei unei proteine (pliere-degradare) trebuie luat rapid. Chaperonii citoplasmatici particip la cteva ci specifice: - asamblarea structurilor de suprafa ale celulei: flageli, fimbrii, pili - asamblarea OMP - secreia proteinelor n mediu. Chaperonii asist plierea proteinelor n periplasm, cel mai probabil independent de ATP, deoarece existena ATP n periplasm este foarte improbabil. Prevenirea plierii proteinelor este o etap esenial pentru exportul proteinelor, deoarece, dup ce dobndete structura teriar definitiv, proteina nu mai poate fi exportat. Chaperonii au funcii multiple:

asist dobndirea conformaiei corecte a proteinelor care rmn n citoplasm. Ele interacioneaz cu polipeptidul nascent i previn adoptarea conformaiei incorecte, pn este sintetizat proteina complet; - moleculele chaperone pot avea rol important n replierea proteinelor denaturate, constituind un mecanism important de protecie fa de agentul termic sau alte condiii de stress. Unele molecule chaperone sunt sintetizate specific n condiiile care duc la acumularea proteinelor denaturate i se numesc proteine de oc termic. Molecula precursoare este orientat spre situsul su membranar specific, prin intermediul peptidului semnal, al chaperonului sau al ambelor tipuri de molecule. Proteinele structurilor de nveli sunt sintetizate de asemenea, pe polisomii ataai membranei citoplasmatice. Pe msur ce sunt sintetizate, catenele peptidice nascente sunt transferate n grosimea membranei. Unele se termin n membrana intern, iar altele n spaiul periplasmic sau n membrana extern. Chiar i fosfolipidele apar iniial n membrana intern i ulterior difuzeaz spre membrana extern. La bacteriile Gram negative, translocaia este un proces complex, deoarece moleculele trec n spaiul periplasmic, printr-un proces dependent de energie. O protein de translocaie (Sec A) localizat, se pare n membran, leag i hidrolizeaz ATP. Energia eliberat este utilizat pentru iniierea translocaiei prin membrana citoplasmatic. Cele mai multe proteine secretate de bacteriile Gram negative ramn n spaiul periplasmic i au o semnificaie metabolic (sunt enzime degradative). Majoritatea sunt proteaze i furnizeaz nutrieni asimilabili pentru celul. Membrana extern a peretelui celular nu are sursa de energie necesar excreiei. Din aceast cauz, o protein translocat n spaiul periplasmic, printr-un proces dependent de energie nu poate fi translocat printr-un mecanism similar, prin membrana extern. Probabil, intervin proteine specifice de translocaie ale membranei externe. La bacteriile Gram pozitive, proteinele destinate membranei citoplasmatice i peretelui celular se sintetizeaz fr secvene semnal. Prin analogie cu exportul proteinelor la E. coli, proteinele membranei citoplasmatice sunt integrate spontan, prin interaciuni ionice i hidrofobe. Tulpinile g. Bacillus sunt cele mai utilizate pentru producerea industrial a exoproteinelor. De aceea, mecanismul sintezei proteinelor s-a studiat la tulpinile acestui gen. Se secret n special enzime degradative: proteaze, amilaze, RN-aza, levan-sucraza. Proteinele de export se sintetizeaz cu o secven semnal, de l8-35 aminoacizi, cu captul amino ncrcat pozitiv, urmat de o secven hidrofob. Sinteza exoproteinelor are loc pe ribosomii asociai membranei citoplasmatice. Mecanismul de export al exoproteinelor, la B. subtilis este probabil, asemntor cu cel de la E. coli. La B. subtilis, proteinele translocate prin membran sunt supuse clivajului secvenei semnal i rmn legate de peretele celular sau sunt eliberate n mediul extern. Mecanismul de export al exoproteinelor este complicat de faptul c, unele specii de Bacillus (dar nu B. subtilis), la exteriorul peptidoglicanului se gsete un strat proteic. Un astfel de strat proteic nu este tipic numai celulelor Gram pozitive, deoarece este prezent i la numeroase tulpini Gram negative. Stratul proteic este prevzut cu pori, care permit trecerea proteinelor. Unele proteine se sintetizeaz cu o secven suplimentar de aminoacizi, localizat ntre peptidul semnal i proteina propriu-zis, denumit propeptid. Unele propeptide sunt lungi, altele scurte. Cele lungi sunt caracteristice proteazelor. Exoproteazele la B. subtilis sunt sintetizate ca preproenzime, adic au att secvena semnal, ct i propeptidul. Propeptidul pare a avea mai multe funcii: - n excreia moleculei de exoproteaz - mpiedic activarea enzimei n timpul secreiei - leag proteaza de membrana citoplasmatic Datorit secvenei propeptidului, la procariote, proteazele, asemntor celor de la eucariote sunt secretate sub forma inactiv, ca zimogen Propeptidele scurte sunt formate din cteva resturi de aminoacizi. Funcia lor nu se cunoate. Dup translocaie, exoproteinele sunt eliberate n mediu cu propeptidele scurte ataate, dar clivajul lor survine imediat.

Sisteme de secreie
Analiza genetic i biochimic a bacteriilor i a modelului experimental al culturii celulare infectat cu bacterii au ridicat mult nivelul cunoaterii componentelor moleculare implicate n interaciunile patogen-celul gazd. Progresele au conturat domeniul microbiologiei celulare, ca o zon nou a cercetrii microbiologice. Agenii patogeni se disting de cei nepatogeni prin prezena genelor specifice de patogenitate, adeseori organizate n insule de patogenitate, adic aglomerri de gene care par s fi fost dobndite n evoluie pe calea transferului orizontal. Aa se explic faptul c bacterii patogene nenrudite, poart gene de virulen nrudite.

Interacia bacteriilor patogene cu celula gazd se realizeaz prin factorii localizai pe suprafa sau secretai n spaiul extracelular. Proteinele bacteriene secretate sunt numeroase i diverse i ndeplinesc funcii multiple: proteoliz, hemoliz, citotoxicitate, fosforilare i defosforilare proteic La bacteriile Gram negative s-au descris 4 ci de secreie proteic (I-IV). Al V-lea sistem pentru secreia macromoleculelor are rol n transferul conjugal al plasmidelor, n transferul ADN T la A. tumefaciens i n secreia toxinei de B. pertussis. Cile de secreie sec-dependente de tip II i IV Cile de secreie de tip II i IV implic o etap a transportului prin membrana intern, nainte de transportul prin membrana extern. n ambele cazuri, proteinele sunt exportate prin membrana intern, n spaiul periplasmic, prin sistemul de secreie (sec). O caracteristic a exportului sec-dependent al proteinelor este secvena semnal hidrofob N-terminal a proteinei exportate. Secvena semnal mediaz exportul proteinei i este clivat de o peptidaz specific (semnal-peptidaz) periplasmic. La E. coli, calea sec cuprinde un numr de proteine ale membranei interne (Sec D, E, F, Y), o ATP-az asociat membranei (Sec A), care furnizeaz energia de export, un chaperon (Sec B) ce se leag de proteinele presecretoare i semnal-peptidaza. n sistemul de secreie de tip II, transportul prin membrana extern necesit un set suplimentar de proteine ale membranei interne i externe. Cel mai studiat sistem de secreie tip II este al pululanazei la Klebsiella oxytoca. Aparatul de secreie cuprinde 14 proteine, dintre care cel puin 7 sunt localizate n membrana intern, iar Pul S i Pul D sunt proteine ale membranei externe. Secreia de tip II este calea primar pentru sinteza enzimelor extracelulare degradative (enzime pectolitice, celulaze, proteaze) la bacteriile Gram negative. Calea de secreie de tip IV cuprinde un grup de aa numii autotransportori: proteazele care cliveaz IgA1 produse de N. gonnorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae, Str. pneumoniae i de reprezentani ai microbiotei rezidente orale i faringiene, precum i o citotoxin vacuolant secretat de H. pylori. Proteazele sunt enzime proteolitice care cliveaz una dintre legturile peptidice a regiunii balama a catenei H a IgA1. Ca i n calea de tip II, proteinele sunt exportate din citoplasm pe calea sec i implic clivarea peptidului semnal N-terminal. Informaia necesar pentru transportul prin membrana extern rezid n ntregime n proteina secretat. Aparent, proteinele autotransportoare formeaz un por n membrana extern, prin care ies, iar clivajul autoproteolitic elibereaz proteinele n supernatant. Calea de secreie tip I sec-independent n contrast cu cile II i IV, cile I i III sunt independente de sistemul sec i nu impic prelucrarea Nterminal a proteinelor secretate. Calea de secreie de tip I este exemplificat de sistemul de secreie al -hemolizinei la E. coli, al adenilat-ciclazei la B. pertussis, al leucotoxinei la Pasteurella haemolytica, al proteazei la Ps. aeruginosa i Erwinia chrysanthemi. Calea de secreie de tip I necesit 3 proteine: - o ATP-az cu rol de transport, din membrana intern (protein din clasa ABC = ATP binding cassette)., care furnizeaz E pentru secreia proteinelor; - o protein a membranei externe, care este exportat pe calea sec; - o protein de fuziune membranar, ancorat n membrana intern, ce traverseaz spaiul periplasmic. Proteinele secretate pe calea de tip I nu sunt supuse clivajului proteolitic, iar semnalul de secreie este localizat n interiorul secvenei de 60 de aminoacizi C-terminali ai proteinei secretate. Calea de secreie de tip III sec-independent Secreia proteinei pe calea III se face n mod continuu, fr prezena distinct a intermediarului periplasmic i este independent de sistemul sec. Aparatul de secreie de tip III este alctuit din circa 20 de proteine, majoritatea localizate n membrana intern. Acest sistem necesit o ATP-az, probabil asociat membranei. Cele mai multe proteine ale membranei interne sunt omologe cu componentele aparatului de biosintez flagelar al bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Proteinele secretate pe calea sistemului III nu sunt supuse prelucrrii N-terminale n timpul secreiei. Semnalul pentru secreie este localizat n secvena de 15-20 aminoacizi a regiunii N-terminale a proteinei secretate. Proteinele secretate pe calea III necesit proteine mici cu funcie de chaperon, care protejeaz factorii secretai de interacia cu alte componente ale sistemului de secreie.

n contrast cu calea de screie de tip I, care este o cale adevrat de secreie, pentru c enzimele secretate sunt active n spaiul extracelular, sistemul de secreie de tip III pare a fi destinat translocaiei proteinelor de patogenitate, direct n citosolul celulei eucariote. n consecin, secreia proteic, cel puin uneori, este reglat de contactul cu suprafaa celulei int. Unele sisteme de secreie de tip III asambleaz structurile supramoleculare pe suprafaa celulei bacteriene (flageli, fimbrii, pili). Pentru unele bacterii Gram negative, sistemul de secreie de tip III este un determinant de baz al virulenei. Mecanismul secreiei pe calea sistemului III este bine conservat la bacterii nenrudite filogenetic. Multe dintre proteinele secretate interacioneaz direct cu componentele celulei gazd, alternd transducerea semnalului celulei gazd i cele mai multe proteine secretate acioneaz n interiorul citosolului eucariot, n care sunt translocate prin mecanisme de screie de tip III. Sistemele de secreie de tip III s-au evidniat la mai multe bacterii patogene: Yersinia pestis, Y enterocolitica, Y. pseudotuberculosis. Toate cele 3 specii inhib activitatea fagocitelor i n consecin au localizri extracelulare. Efectul antifagocitar este mediat de o protein cu activitate tirozin-fosfatazic (Yop H). La contactul cu macrofagul, proteina Yop H este injectat n citosol, unde catalizeaz o defosforilare rapid i specific a c torva proteine ale macrofagului. Shigella flexneri are localizare predominant intracelular i produce dizenteria bacilar, o diaree sanguin originar n colon. Invazia bacterian a mucoasei colonice este trstura esenial a patogenezei cu Shigella. Ca i ali enteropatogeni, Shigella invadeaz epiteliul la nivelul celulelor M. Dup transcitoza prin celula M, bacteriile nt lnesc macrofagele rezidente ale esutului limfoid i induc apoptoza. Apoptoza macrofagelor duce la eliberarea IL-1, care determin un influx masiv de neutrofile n esutul infectat. Unele bacterii patogene pentru plante folosesc secreia de tip III pentru patogenez, ca i patogenii animali. Sistemele de secreie de tip III sunt conservate la 4 g. majore: Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas. Secreia de tip III este esenial pentru inducerea reaciei de aprare denumit rspunsul hipersensibil la plantele rezistente, care nu sunt gazde pentru patogen. Rspunsul hipersensibil este caracterizat prin necroza tisular localizat, producerea fenolilor i a agenilor antimicrobieni la locul contactului bacterian care previne rsp ndirea ulterioar a infeciei n esuturi. Rspunsul HR este activ: necesit expresia genic de novo i sinteza proteinelor, fluxul Ca i activitate ATP-azic. n condiii naturale, rspunsul HR este microscopic, dar devine macroscopic prin infiltrarea artificial a unui numr mare de bacterii fitopatogene. Proteinele de virulen ale bacteriilor sunt translocate n celula int. Termenul de translocaie semnific transportul proteinelor din celula bacterian prin membrana plasmatic a celulei eucariote, n citosol.

Sporul Sporul este o forma primitiv de difereniere celular, care const n reorganizarea structural i funcional a celulei vegetative i formarea unui nou tip de celul, cu proprieti noi. Diferenierea celular este un proces biologic fundamental. Sporii se formeaz la bacteriile cilindrice: totdeauna la bacilii anaerobi din g. Clostridium i la actinobacterii, facultativ la cei aerobi din g. Bacillus (fig. 28), excepional la coci (Sporosarcina). Toate bacteriile sporulate sunt Gram pozitive. Sporularea este condiionat de existena unui perete mureinic gros. Exist circa l0 tipuri de spori, ce se deosebesc prin modul de formare, prin structur i prin gradul de rezisten la factorii de mediu. Cel mai caracteristic este endosporul, denumit astfel deoarece se formeaz n interiorul unei celule vegetative. La actinobacterii se formeaz cteva tipuri de spori: artrospori (prin segmentare), oidiospori (prin fragmentare), aleuriospori (se formeaz apical sau lateral pe sporofori scuri), zoospori (spori mobili), iar aplanosporii se formeaz prin septarea hifelor i sunt meninui n interiorul unui nveli. La Azotobacter se formeaz chiti. Endosporul sau sporul endogen a fost considerat ca unic tip sporal bacterian, pn la descrierea celorlalte tipuri. Are form sferic sau ovalar. Cei ovalari au dimensiuni cuprinse ntre 0,5 1 m, pentru axul scurt i 1,2 2 m pentru axul lung. Evideniere. Endosporul este o structur reringent i n celula vie, la microscopul optic apare strlucitor. Datorit nveliurilor groase, greu penetrabile pentru colorani (n special cortexul) i datorit coninutului lor chimic particular, sporul se coloreaz prin tehnici speciale. Poziia sporului n celul poate fi terminal, subterminal sau central. Sporii pot fi deformani (diametrul lor este mai mare dect al celulei) i nedeformani (diametrul este mai mic dect al celulei). Intr-o celul bacterian sporulant, sporul este unic, cu rare excepii: n sol apar bacterii bisporulate, iar n intestinul unor vertebrate aquatice, s-au evideniat bacterii polisporulate. Probabil c sporii multipli apar ca rezultat al perturbrii mecanismului de separare a celulelor dup diviziune. Ei se formeaz n celulele n care materialul nuclear s-a replicat, dar nu s-a format septul de diviziune. Sporogeneza este declanat n mod obinuit de lipsa unui nutrient esenial n mediu (sursa de azot sau de carbon). Procesul este foarte complex din punct de vedere genetic, biochimic, structural i funcional. Sporularea implic activarea unui numr de peste 50 de gene sporale, inactive n celula vegetativ. Sub aspect biochimic, sporularea este nsoit de modificri majore ale componentelor moleculare. Se sintetizeaz un set de proteaze care mresc turnover-ul proteic, furniznd aminoacizii necesari sintezei proteinelor noi.

Din punct de vedere structural, la nivel electrono-optic, sporularea la B. subtilis parcurge 7 stadii (numerotare introdus de Ryter, cu cifre romane - I VII), n cursul crora celula sporal se formeaz i se elibereaz (fig. 31). Celula vegetativ n care nu se detecteaz modificri structurale legate de sporulare a fost desemnat cu stadiul 0. Sporularea este precedat de replicarea materialului nuclear. Cei doi cromosomi fuzioneaz, formnd o structur axial alungit, unic (stadiul I). Nucleoidul axial diploid segreg n dou structuri cromosomale: una migreaz spre polul sporal i va deveni nucleoidul sporului, iar cealalt rmne n celula vegetativ.
Celula se divide asimetric, subpolar prin formarea septului sporal i se formeaz dou celule inegale. Septul sporal se iniiaz sub forma a dou mici intruzii simetrice ale peretelui mureinic, spre interiorul celulei. Formarea complet a septului corespunde stadiului II. In timpul diviziunii asimetrice, numai 1/3 din cromosom este prezent n structura presporal. Restul de 2/3 este pompat rapid de o translocaz, rezultnd dou celule inegale, dar cu genomuri identice. Dup diviziunea asimetric, presporul i celula vegetativ sunt celule adiacente, complet separate. n stadiul III, septul polar se subiaz i se lizeaz din zona central spre periferie. Membrana citoplasmatic, dup ce i pierde punctele de legtur cu septul, ncepe s se plieze i acoper progresiv suprafaa sporului. Cnd plierea este complet, cele dou pliuri membranare fuzioneaz la polul celulei i celula sporal este complet nglobat n celula vegetativ. In spaiul dintre cele dou membrane care nconjur presporul se depun cele dou straturi de peptidoglican: peretele celular primordial i cortexul (stadiul IV). Stadiul V corespunde depunerii unei structuri proteice complexe pe suprafaa extern a presporului, denumit nveliul sporal. Maturarea sporului i dobndirea rezistenei la cldur i la radiaiile UV corespunde stadiului VI. Liza celulei i eliberarea sporului matur reprezint stadiul VII.

Schimbrile morfologice profunde care se produc n timpul sporulrii sunt cuplate cu modificarea expresiei genelor, datorit activrii n cascad a factorilor , care modific specificitatea de legare a ARNpolimerazei, de promotorii diferitelor gene. S-au izolat mutante bacteriene care blocheaz sporogeneza n diferite etape. Diviziunea pentru sporulare se aseamn cu cea vegetativ, dar se deosebete prin expresia genic diferit. Diviziunea pentru sporulare, fiind asimetric, necesit relocalizarea aparatului de diviziune celular. Asimetria morfologic a celor dou celule duce la evoluii ulterioare diferite. Diviziunea vegetativ i cea de sporulare se deosebesc prin mai multe caracteristici: septul de diviziune pentru sporulare este mai subire dect septul diviziunii vegetative; cele dou celule rezultate nu se separ, iar celula mam nglobeaz presporul; autoliza peptidoglicanului din septul de diviziune ncepe la centrul septului i progreseaz pn la liza complet a materialului septal. n contrast, autoliza materialului parietal al septului diviziunii vegetative ncepe la periferia septului i progreseaz spre centru, dar nu e complet, deoarece septul va forma peretele polar al celor dou celule rezultate din diviziune; dup diviziunea de sporulare, n cele dou celule se iniiaz programe diferite de expresie genic, controlate de factorii care orienteaz legarea ARN-polimerazei de promotori diferii. Transferul ADN n prespor. n stadiul de filament extins n axul lung al celulei, originile celor doi cromosomi sunt situate lng poli. Diviziunea fiind asimetric, presporul include 1/3 proximal a cromosomului, iar restul de 2/3 rmne n celula vegetativ. Ulterior, restul cromosomului este pompat activ, din celula mam, n prespor. Translocaza ADN este localizat la centrul septului de sporulare, ancorat de cromosom. Translocaza consum energie, prin hidroliza ATP.

Fig. 31. Reprezentarea schematic a etapelor de formare a endosporului.

Structura intern a endosporului La diferite grupe de bacterii exist variaii importante ale structurii sporului, n special n privina nveliurilor, care difer prin numrul i grosimea lor. Exist de asemenea variaii cu privire la relaia sporului cu celula vegetativ n care s-a format: sporul ramne inclus n celul sau se elibereaz curnd dup formare, prin liza acesteia. Sporul este alctuit din protoplastul sporal, care conine sporoplasma i materialul nuclear. Protoplastul sporal este acoperit de urmtoarele structuri: un perete intern subire, originar din membrana intern a presporului. Dup germinare, acesta va forma peretele celulei vegetative; cortexul sporal, cu grosime variabil, electronoclar. Este o structur multilaminar ce se formeaz pe feele adiacente ale celor dou membrane ale presporului i const, n general, din peptidoglican i un lactam muramic specific sporului; stratul extern al cortexului, derivat din membrana extern a presporului; nveliul sporal intern (intina), un strat dens, de natur proteic;

nveliul sporal extern (exina). Uneori, aceste dou nveliuri sunt pluristratificate; exosporul, un rest al celulei vegetative, uneori adiacent de celelalte nveliuri sporale, prin intermediul filamentelor suspensoare. nveliurile sporale cuprind o fracie major a sporului. Aceste structuri sunt de natur proteic, cu o fracie de polipeptide acide solubile n baze, n nveliul intern i o fracie rezistent la baze, datorat legturilor S-S. La unele categorii de spori se gsesc structuri suplimentare denumite apendice sporale. Semnificaia lor funcionala nu este cert, dar ar putea fi implicate n dispersarea sporilor n natur sau ar facilita absorbia substanelor nutritive n perioada premergatoare germinrii sporului.
-

Particularitile biochimice ale sporului Sporularea este iniiat ca rspuns la numeroase semnale externe i interne: epuizarea unui nutrient, densitatea celular. Sporularea eficient necesit o densitate celular mare. Scderea ampl a concentraiei GTP i GDP se coreleaz cu declanarea sporulrii. Schimbarea specificitii ARN-polimerazei este foarte important pentru controlul sporulrii la B. subtilis. Cnd ncepe sporularea, multe gene active n celula vegetativ sunt represate i sunt activate genele specifice. Fiecare stadiu al sporulrii este marcat de schimbarea expresiei unor gene, mediat de factorul , care schimb specificitatea legrii de promotor a ARN-polimerazei. Protoplastul sporal conine toate categoriile de molecule necesare relurii creterii: materialul nuclear i cantiti mici ale fiecrui component al aparatului de sintez proteic (ribosomi, ARNt, enzime). Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm i nucleozid-trifosfaii), dar exist precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- i difosfai). Aminoacizii i enzimele lor de biosintez sunt virtual absente, dar la germinare, ambele tipuri vor fi generate prin hidroliza proteinelor de depozit, solubile, cu molecul mic. Puine enzime sporale deriv din enzimele celulei vegetative prin clivare. Majoritatea enzimelor sporale sunt noi. Sinteza lor este codificat de gene activate n timpul sporulrii. Toate enzimele sporale sunt termorezistente, fapt explicabil prin dimensiunile lor mici, fiind reprezentate numai de situsul activ al moleculei. Lipsesc enzimele fundamentale ale metabolismului celular, ca si sistemele transportoare de electroni. La cele mai multe bacterii, ionii de Ca2+ lipsesc. In stadiile timpurii ale sporulrii se activeaz sistemele de transport activ pentru Ca. Ionii de Ca sunt legai cu o cantitate echivalent de acid dipicolinic (se formeaz din acidul diaminopimelic un precursor al peptidoglicanului) (fig 33) i formeaz dipicolinatul, care poate constitui circa l5% din greutatea uscat a sporului.

Acidul dipicolinic

S-a considerat c sporul este rezultatul unui proces de deshidratare profund. Cercetrile ulterioare au evideniat c deosebirile dintre spor i celula vegetativ nu sunt de ordin cantitativ, ci de ordin calitativ i se refer la starea apei. In celula vegetativ, apa liber reprezint 70% din cantitatea total, iar n spor oscileaz ntre 3-l0%, restul de 90-97% fiind apa legat. Din aceast cauz, sporul este lipsit de metabolism, sau are un metabolism de intensitate foarte mic, nedecelabil. Celula sporal este vie, dar procesele vieii sunt latente. Fenomenul se numete criptobioz (via ascuns). Consecina particularitilor de compoziie chimic, la care se adaug nveliurile groase multiple i pluristratificate, este rezistena deosebit a sporului la caldur, la aciunea substanelor chimice (antiseptice, dezinfectani) i a radiaiilor. Rezistena termic este conferit de dipicolinatul de Ca. Mutaiile care reduc cantitatea de dipicolinat diminu rezistena sporului la agentul termic. Rezistena termic a sporului impune o metodologie costisitoare de sterilizare, la temperaturi foarte ridicate. Uneori, sporii rezist la temperatura de l80 grade, de la cteva minute, la cteva ore. Fierberea nu este o metod de sterilizare, deoarece omoar numai formele vegetative, iar sporii rmn viabili. Germinarea este procesul ireversibil n care sporul se activeaz de la starea dormind, la o stare metabolic activ, ntr-un interval scurt. L-alanina se leag la un receptor specific pe suprafaa nveliului sporal i iniiaz germinarea, care decurge n trei stadii: activarea sporului prin deshidratare, asociat cu mrirea volumului; germinarea, adic modificarea localizat prin gelificare a nveliurilor sporale; emergena celulei vegetative din nveliuri, delimitat de un perete derivat din peretele sporal intern.

Intr-un mediu nutritiv optim, germinarea este rapid: de la iniiere pn la diviziunea celular, procesul dureaz 90 de minute. In medii favorabile, majoritatea sporilor germineaz, dar o proporie mic rmn dorminzi. Pentru iniierea germinrii, sporii necesit un factor suplimentar: un compus cu grupri SH, pH acid. Dup circa o or de la nceputul activrii ncepe sinteza ADN. Semnificaia biologic a procesului de sporogenez Sporogeneza reprezint o form primitiv de difereniere celular i este o modalitate de adaptare a celulei bacteriene la condiiile nefavorabile de mediu, prin criptobioz. Mecanismele criptobiozei sunt necunoscute. Unul dintre ele ar putea fi starea special a enzimelor. Ele ar fi inactivate n mod reversibil. La rndul ei, inactivarea reversibil poate fi determinat de trei factori: prin modificri fizico-chimice ale moleculelor enzimatice; prin aciunea unor inhibitori ai activitii enzimatice; prin lipsa unor metabolii eseniali, care ar condiiona starea normal, activ, a enzimelor. Endosporul este o structur de conservare a viabilitii celulelor dotate cu aceast capacitate de difereniere. Nu este o form de multiplicare, exceptnd cazurile rare ale bacteriilor bi- sau polisporulate. Sporogeneza este asociat, la B. subtilis, cu producerea unor enzime proteolitice, iar la B. thuringiensis, cu producerea cristalelor proteice parasporale. Acestea sunt netoxice n stare nativ (pretoxine), dar devin foarte toxice dupa solubilizarea n mediul alcalin intestinal al larvelor de lepidoptere, coleoptere sau de nar. Endosporul are o longevitate excepional: mii sau chiar sute de mii de ani. Sporii din rocile perioadei quaternare au germinat pe medii nutritive, in vitro. Formarea sporilor de multiplicare la actinobacterii Actinobacteriile sunt eubacterii care cresc sub forma unei reele de filamente ramificate, denumit miceliu coenocitic (fr perei transversali). Sporularea prin fragmentare este caracteristic genurilor Actinomyces, Nocardia etc. In faza staionar a culturii, miceliul filamentos se fragmenteaz prin septuri transversale. Ulterior, fragmentele se elibereaz sub forma unor structuri cilindrice, cu extremitile tiate n unghiuri drepte. In mediu favorabil, structurile germineaz i regenereaz miceliul. Unele sunt incapabile de germinare, deoarece le lipsete materialul nuclear. Sporularea prin segmentare s-a studiat la Streptomyces coelicolor. Procesul se desfoar n cteva faze succesive: - n hifele aeriene ale miceliului, zone succesive de nucleoplasm se condenseaz devenind refringente; n jurul fiecrei condensri se difereniaz structuri parietale i rezult spori. iragul de spori este meninut n interiorul hifei parentale, denumit sporangiu; sporangiul hifal se sparge i elibereaz sporii. Sporii multipli ai actinomicetelor au rol n diseminarea acestor organisme n mediu. Au nveliuri sporale mai simple i sunt mai puin rezisteni, comparativ cu endosporul. Sporularea, la actinobacterii este asociat cu producerea substanelor antibiotice. Vacuolele cu gaz (aerosomii) Vacuolele cu gaz sunt structuri refringente cu aspect ovalar, ce se gsesc la bacteriile fotosintetzante imobile din mediile aquatice. Se identifica usor, deoarece dispar dupa exercitarea unei presiuni asupra recipientului n care se afla suspensia celulara. La nivel ultrastructural s-a evideniat c vacuolele cu gaz sunt structuri compuse, adic sunt compartimentate (fig.32). Att membrana periferic a vacuolei ct i cele de compartimentare au o structur monostratificat (non unit membrane) i conin numai proteine hidrofobe. Lipsesc lipidele si glucidele. Vacuola cu gaz are un aspect striat (cu nervuri) si este formata din cel putin doua tipuri de proteine: a)proteina majora (A), foarte hidrofoba si rigida. Rigiditatea este esentiala pentru ca structura veziculei sa reziste la presiunea care se exercita asupra ei. Moleculele proteinei majore sunt aliniate ca benzi paralele si formeaza o structura impermeabila pentru apa; b)proteina minora (C), cu rolul de a consolida structura veziculei gazoase. Benzile proteinei A sunt consolidate de proteina C, care le leaga transversal. Vacuola cu gaz este liber-permeabil pentru gaze i nu se deformeaz sub presiunea lor. Spaiul plin cu gaz rezult din modul n care se asambleaz moleculele proteice.

Fig. 32. Seciune printr-o celul de Microcystis sp. n curs de diviziune. Veziculele gazoase de form cilindric sunt orientate trasversal i longitudinal (dup Walsby, 1994).

Compartimentele vacuolei se umplu rapid cu gaze, provenite din mediul extern, prin difuzie liber. Membrana unistratificat este impermeabil pentru lichide. Dac presiunea ce se exercit pe suprafaa vacuolei depete presiunea atmosferic (egal cu a gazului din interior), vacuola se sparge i elibereaz coninutul. Semnificaie funcional. Vacuolele cu gaz au rolul unor corpi de flotaie. Cnd compartimentele ei sunt pline cu gaz, densitatea celulei scade sub nivelul densitii apei i astfel celula urc spre straturile superioare. Dup pierderea coninutului gazos, celula devine mai dens i coboar spre straturile mai profunde ale apei. Compartimentarea vacuolei permite eliminarea fracionat a aerului i n consecin, reglarea poziiei celulei pe vertical, n funcie de condiiile de mediu. Astfel se realizeaz deplasarea celulelor fotosintetizante imobile, ce triesc n apele stagnante. Cnd intensitatea luminii scade, celula urc spre suprafaa apei, iar dac intensitatea luminii este prea mare, celula coboar n straturile mai profunde. Vacuolele cu gaz protejeaz celula fa de efectul nociv al radiaiei UV, deoarece formeaz un ecran ce disperseaz energia luminoas. Vacuolele regleaz raportul suprafa/volum celular. Ele sunt foarte numeroase la cianobacteriile care cresc cu o rat foarte mare i produc fenomenul de nflorire a apelor. Incluziile Incluziile sunt structuri inerte, ce apar n celula bacterian la sfritul fazei de cretere logaritmic. Dup compoziia chimic, incluziile sunt de 3 tipuri : - polimeri organici: polizaharidici (amidon, glicogen), incluzii de poli -hidroxibutirat (PHB) conin lipide (2%) i proteine, polimeri de natur proteic (incluzia parasporal la B. thuringiensis) (fig 33); - polimeri anorganici (polimetafosfat denumite incluzii de volutin); - incluzii anorganice simple (de sulf coloidal, CaCO3). Dup criterii structurale se disting : - incluzii delimitate de membrane, ce au ca prototip pe cele de poli--hidroxibutirat. Ca trstur distinctiv, ele relev o structur lamelar concentric, ce corespunde creterii progresive a incluziei. Sinteza se face pe o cale lateral a sintezei acizilor grai ; incluzii lipsite de membrane (cele de glicogen, de sulf, incluzia proteic parasporal). La microscopul optic, n celula vie, incluziile au aspect granular cu form neregulat, refringente, cu dimensiuni de 50-100 nm. Natura chimic a incluziilor se evideniaz prin metode citochimice, cu colorani care le coloreaz specific. Incluziile de amidon (poliglucozid neramificat) se coloreaz n albastru cu soluia Lugol, iar glicogenul

(poliglucozid ramificat) se coloreaz brun. Incluziile de PHB se coloreaz cu negru de Sudan, ca i depozitele lipidice neutre ale celulei eucariote i din aceast cauz au fost identificate incorect ca rezerve lipidice. Incluziile proteice se coloreaz cu amido-schwarz, iar cele de polimetafosfat sunt metacromatice, pentru c dup colorare cu albastru de metilen, dobndesc culoarea roie.

Fig. 33. Incluzii bacteriene. a. Formula structural a glicogenului (molecule de glucoz legate -1,4, cu ramificaii -1,6. b. Polifosfatul. c. Acidul poli--hidroxibutiric. d. Imaginea electrono-optica a celulei de Azotobacter cu incluzii de poli-hidroxibutirat. e. Imaginea electrono-optic a incluziei proteice parasporale la Bacillus thuringiensis (original).

Ca regul general, o specie bacterian formeaz un singur tip de depozit celular. Granulele de volutin (polimetafosfat), denumite astfel pentru c s-au identificat la Spirillum volutans, sunt polimeri lineari de ortofosfai, de lungime variabil. Se sintetizeaz n condiiile deficitului oricrui nutrient major, prin adugarea secvenial a resturilor de fosfat la pirofasfat, dup reacia :

Degradarea polifosfatului urmeaz reacia invers i furnizeaz energie celular sub form de ATP. Incluziile de sulf anorganic pot fi citoplasmatice sau sunt localizate la nivelul unor pliuri ale membranei plasmatice i apar la dou grupe fiziologice de bacterii: - la cele sulfuroase purpurii (Chromatiaceae), care folosesc H2S ca donor de electroni n procesul fotosintezei;hv c - la cele filamentoase chimiolitotrofe (Beggiatoa, Thiotrix), care oxideaz H2S i elibereaz energie. Dup epuizarea H2S din mediu, So depozitat n celul este oxidat la sulfat. Semnificaie biologic. Formarea incluziilor constituie o modalitate a celulei de a depozita cantiti mari de materiale de rezerv. Ele se formeaz n condiiile unui mediu bogat n substane nutritive, sau n cazul unui dezechilibru al compoziiei chimice a mediului, n special al raportului C/N. Materialele incluziei sunt consumate dup epuizarea resurselor energetice din mediu sau cnd raportul C/N revine la normal. Stocarea moleculelor sub forma polimerilor este o modalitate de pstrare a echilibrului osmotic ntre celul i mediu, deoarece prin polimerizare. Moleculele devin inactive osmotic. Prin polimerizarea acidului PHB

se evit acidifierea citoplasmei, consecutiv acumulrii monomerilor. Gruprile libere COOH ale acidului PHB sunt anihilate prin formarea legturilor esterice ntre monomeri. Sinteza incluziilor proteice parasporale este sincronizat strns cu iniierea procesului de sporogenez. Magnetosomii sunt structuri magnetice intracelulare care confer bacteriilor purttoare, capacitatea de a se orienta i de a migra de-a lungul liniilor geomagnetice. Sunt cristale minerale de Fe magnetic, de dimensiuni nano, delimitate de membran. Bacteriile magnetotactice sunt un grup heterogen de procariote, ubicvitare n mediul aquatic marin i dulce. Probabil au rol ecologic important n circuitul Fe. Magnetosomii se pstreaz dup moartea celulelor bacteriene i se depun ca magnetofosile, ceea ce contribuie la magnetizarea sedimentelor. Particulele de Fe mineral, n general, constau din magnetit (Fe3O4). Formula structural este Fe3+ 2+ 3+ (Fe Fe )O4, cu proprieti magnetice. Spre deosebire de magnetita din sistemele anorganice sau produs extracelular prin activitatea metabolic a bacteriilor care fac reducerea respiratorie a Fe, cristalele intracelulare de magnetit au dimensiuni uniforme, cu variaii n limite nguste: 35-120 nm. De obicei, magnetosomii sunt organizai n lanuri, rezultnd un dipol magnetic permanent, suficient de mare pentru a orienta ntreaga celul de-a lungul cmpului geomagnetic. Tulpinile de Magnetospirillum cresc microaerob, pe medii simple cu acizi organici scuri ca surs de C i au metabolism de tip respirator dependent de O2, dei nitratul poate fi acceptor de e- n microaerobie. Mecanismul formrii. Fe III este luat de celul, probabil pe cale reductiv. Se crede c Fe este reoxidat pentru a forma un oxid cu densitate mic i deshidratat pentru a forma un oxid de Fe III. La Magnetospirillum, magnetosomul mineral este acoperit de o membran trilaminar, alctuit din fosfolipide i proteine, dintre care unele sunt unice pentru aceast membran. Compartimentarea prin formarea veziculelor magnetosomului permite ca procesul formrii s fie reglat pe cale biochimic. Membrana poate aciona ca barier de compoziie, pH i pentru meninerea gradientului redox ntre vezicul i mediul cellular.

Glicocalixul Glicocalixul este reprezentat de totalitatea structurilor polizaharidice extraparietale: capsula, cu diferite grade de dezvoltare i glicocalixul comportamental. Capsula (fig. 34) este o structur accesorie, cu o consisten gelatinoas, vscoas, care acoper complet celula bacterian. In funcie de gradul de dezvoltare la diferite specii bacteriene se disting urmtoarele structuri capsulare: - microcapsula, reprezentat de o pelicul fin de material polizaharidic, n jurul peretelui celular (pn la 0,2 m grosime). La microscopul optic se evideniaz numai prin metoda imunofluorescenei, dar este vizibil la microscopul electronic; - macrocapsula, o structur omogen, aderent de celul, mai groas de 0,2 m, vizibil la microscopul optic prin tehnici speciale de colorare negativ, dac este o capsul suficient de compact i rigid, pentru a exclude tuul de India i nigrozina. Dac are o structur lax i flexibil, coloranii o penetreaz. Aderena macrocapsulei de celul este ferm i prin centrifugare se depune concomitent cu celulele; - stratul mucos este o structur capsular cu o grosime neuniform i distribuie dezordonat n jurul celulei. Consistena este mai fluid, iar prin centrifugare, celulele se desprind i se depun, iar materialul polizaharidic ramne n suspensie; - zoogleea o mas de material polizaharidic, n care sunt cuprinse un numar mare de celule bacteriene. Materialul capsular se gsete la bacteriile Gram pozitive i Gram negative din sol, ape (dulci i srate), rumen, la bacteriile patogene ce produc infecii ale vezicii urinare i pulmonare.

Fig. 34. Capsula bacteriana (coloratie negativa, original).

Natura chimic a materialului capsular Materialul capsular este de natur polizaharidic. De cele mai multe ori, n alctuirea sa se gsesc Dglucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rare sunt manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide extracelulare se aseamn cu acizii teichoici deoarece conin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat. Materialul capsular poate fi un homopolizaharid sau un heteropolizaharid. Cele mai cunoscute homopolizaharide sunt dextranii si levanii. Dextranii formeaz o clas mare de polizaharide, alctuii din uniti de D-glucopiranozil, legate l-6, cu puni de ramificare n poziiile 2, 3 sau 4. Lungimea lanului este cuprins ntre 4o-5oo resturi de glucoz. Dextranii sunt produi de Peptococcus (Leuconostoc) mesenteroides, din sucroz. Sinteza lor este abundent n melasa de la fabricile de zahr, unde o cantitate semnificativ de zahr este convertit la dextran, aducnd prejudicii economice importante. In stare purificat, dextranul se folosete n practica transfuziilor, ca nlocuitor al plasmei, fiind solubil n ap, iar sephadexul este un dextran folosit n cromatografia bazat pe principiul sitei moleculare. Levanii sunt poli-D-fructani (fructozizi), sintetizai de unele bacterii patogene pentru plante (Pseudomonas, Xanthomonas), de Streptococcus salivarius, de Bacillus. Au greuti moleculare de l000 kD sau mai mult. Heteropolizaharidele sunt alctuite dintr-un numr variat de uniti diferite: glucoz, fructoz, galactoz, manoz, acid galacturonic, derivai aminai si acetilai ai acestora.

Structura biochimic a heteropolizaharidelor este foarte diferit nu numai n funcie de compoziia chimic global, ci i de secvena diferiilor monomeri n catena polizaharidic (de exemplu, pentru xantan, structura repetitiv este un pentazaharid). Diversitatea monomerilor glucidici confer heteropolizaharidelor o anumit diversitate a structurii chimice i n consecin, o anumit specificitate antigenic. De exemplu, la Str. pneumoniae exist peste 80 de tipuri chimice diferite de material capsular, care corespund nu numai unor diferene de compoziie chimic, dar i de secven a monomerilor. Varianta antigenic a polizaharidului capsular imprim specificitatea anticorpilor n reaciile de aprare fa de diferitele tulpini patogene ale acestei bacterii. Sinteza exopolizaharidelor

Exopolizaharidele se sintetizeaz prin dou mecanisme distincte: dextranii se sintetizeaz extracelular ntr-un proces ce implic enzimele secretate de celula bacterian. La P. mesenteroides, enzimele rmn asociate la nivelul peretelui celular. Sinteza lor este indus de prezena sucrozei n mediul de cretere. Enzima dextran-sucraz cliveaz molecula de substrat. Jumtatea glicozil este adaugat la acceptor, iar fructoza este utilizat n metabolismul celulei; alte exopolizaharide (hetero- sau homopolimeri) se sintetizeaz intracelular.

Biosinteza heteropolizaharidelor are loc n 4 trepte: a) sinteza intermediarului format din nucleotid-difosfat i glucid; b) asamblarea treptat a subunitii oligozaharidice repetitive a polimerului, prin transferul de la nucleotid la gruparea lipidic purtatoare (C55-undecaprenil-fosfat), localizat n membrana celular; monozaharidele sunt transferate secvenial de transferaze specifice; c) adugarea gruprilor piruvat, acetat, succinat, hidroxibutirat, sulfat. Astfel se sintetizeaz unitatea repetitiv a heteropolizaharidelor; d) transferul catenei polizaharidice repetitive de la purttorul lipidic, la catena polizaharidic n curs de polimerizare. Polimerul este excretat n mediul extracelular. Mecanismul polimerizrii este puin cunoscut, dar se presupune c sinteza are loc pe faa intern a membranei citoplasmatice, dup care exopolizaharidul este transferat la suprafaa celulei prin zonele de aderen Bayer, dintre memnbrana extern i cea intern. Sinteza exopolizaharidului necesit enzime specifice pentru legarea fiecrui monomer glucidic de nucleotid, transferaze pentru legarea fiecrui monozaharid de subunitatea repetitiv, una sau mai multe polimeraze pentru legarea subunitilor repetitive i proteine implicate eventual n exportul polizaharidului.

Controlul sintezei materialului capsular. Sinteza polizaharidelor capsulare este controlat genetic. Exist linii de celule bacteriene necapsulate, dar i tulpini care sintetizeaz materialul capsular indiferent de condiiile de cretere. Proprietatea de a sintetiza material capsular poate fi pierdut prin mutaie. La bacteriile care au informaia codificatoare, sinteza materialului capsular este modulat cantitativ de compoziia mediului de crestere. De exemplu, Peptococcus mesenteroides sintetizeaz dextrani numai dac crete pe mediul cu sucroz. Celulele de Azotobacter, cultivate pe un mediu cu N combinat nu sintetizeaz material polizaharidic, dar pe un mediu fr N combinat, produc un strat mucos abundent, cu caracter adaptativ care limiteaz difuzia O2 n celule, protejnd astfel nitrogenaza, sensibil la prezena O2. Bacteriile enterice sintetizeaz polizaharide n condiiile unui exces de glucide i a limitrii surselor de N, P, S, n mediul nutritiv. Pe msur ce cultura bacterian care sintetizeaz polizaharide, se dezvolt, mediul lichid devine tot mai vscos, datorit solubilitii polimerilor n ap. Unele bacterii sintetizeaz continuu exopolizaharide, n timpul fazei de cretere, iar altele, numai n faza logaritmic trzie i n faza staionar. Semnificaie biologic. Capsula este o structur inert, accesorie ce nu face parte integrant din celula bacterian. Cel mai adesea nu ndeplinete o funcie esenial pentru celul. Bacteriile patogene capsulate sunt virulente, deoarece capsula este un material chimiotactic negativ pentru fagocite. Pe mediul solidificat, ele produc colonii netede (S, smooth). Mutantele lor necapsulate produc colonii rugoase (R, rough) i sunt mult mai puin virulente. Materialul capsular este higroscopic (reine apa) i astfel protejeaz celula de desicaie. Materialul capsular ar putea avea rolul de depozit al unor nutrieni din mediu.

Glicocalixul comportamental

La anumite bacterii structurile superficiale sunt acoperite de un glicocalix adevrat, constituit dintr-o reea de filamente polizaharidice i glicoproteice, legate de LPS ale membranei externe la bacteriile Gram negative (fig. 35) sau de mureina celor Gram pozitive. Filamentele formeaz o structur pericelular dezordonat, ca o psl, prin intermediul creia celula se ancoreaz fie pe alte celule, fie pe suporturi inerte. Glicocalixul se gsete numai la bacteriile care triesc n mediile naturale, avnd un caracter adaptativ, adic exist numai n condiiile n care prezena ei confer celulei un avantaj selectiv. Dup cultivare n medii artificiale (bulion, geloza), glicocalixul dispare i din aceast cauz s-a evideniat trziu. Deoarece nu persist la celulele cultivate n mediile artificiale, s-a propus denumirea de glicocalix comportamental.

Fig. 35. Reprezentarea schematic a glicocalixului legat de membrana extern a unei bacterii Gram negative (dup Costerton, 1978).

Glicocalixul a fost studiat la celulele bacteriene din placa dentar. Placa este un depozit de culoare albglbuie, vizibil cu o lup, ce se formeaz pe suprafaa smalului dentar, iniiat de Str. mutans. Celulele sale sintetizeaz un polizaharid glucanic i acizi lipoteichoici, prin intermediul crora ader foarte strns de suprafaa smalului, formnd iniial o microcolonie, iar ulterior, o colonie. Celulele ader ntre ele, dar i de smalul dentar (hidroxil-apatita), prin glicocalix. Dup impregnare cu sruri i glicoproteine salivare se creeaz

un micromediu anaerob, n care bacteriile elimin produsele de catabolism. Micromediul coloniei se acidific i se creeaz condiiile favorabile degradrii smalului. n prezena sucrozei, la pH acid, sinteza ALT este stimulat semnificativ. Astfel se iniiaz formarea cariei. n mediul aquatic, celulele bacteriene lipsite de structur capsular, se asociaz formnd biofilme*. Celulele se ancoreaz de suport, prin intermediul glicocalixului, formnd un consoriu funcional. Biofilmul se definete ca un ansamblu format din celule i din produse extracelulare prin intermediul crora se ancoreaz de suportul viu sau inert, formnd asociaii. Legarea (aderena) celulelor de suport este prima etap a procesului de colonizare. Astfel se iniiaz formarea coloniei bacteriene.
Majoritatea microorganismelor din mediile aquatice nu se gsesc ca organisme libere plutitoare, ci triesc ataate de suprafee, inclusiv la suprafaa apei, unde formeaz un biofilm. Asociaiile naturale de bacterii, n matricea unui biofilm funcioneaz ca un consoriu cooperant. Biofilmele reprezint sisteme biologice cu un nivel nalt de organizare, n care comunitile de bacterii sunt coordonate funcional. Capacitatea lor de a popula ntreaga biosfer se datoreaz versatilitii lor metabolice i plasticitii fenotipice. Un element esenial al adaptabilitii lor este capacitatea de a-i alege poziia ntr-o ni ecologic. Cel mai comun mecanism de poziionare este mobilitatea flagelar i diferitele modaliti de translocaie pe suprafee: rsucire, alunecare, nclinare, roire, dar i ataarea de substrat prin sinteza polizaharidelor, formnd o pelicul ce plaseaz celulele la interfaa aer-ap. Prin intermediul biofilmului, celulele bacteriene se ataeaz de suport i se agreg, amplificnd interaciunile celulare. Prin ataare, bacteriile dobndesc avantajul versatilitii fenotipice. Biofilmele sunt foarte eficiente n epurarea apelor uzate i a celor contaminate cu produse petroliere. Biofilmele se formeaz chiar n condiii extreme, ca de exemplu n apele acide (pH=0) de drenaj al minelor, unde contribuie la circuitul sulfului. Cianobacteriile formeaz biofilme n izvoarele termale i pe suprafaa gheii din Antarctica. Alt tip de comunitate n biofilm este ansamblul bacteriilor asociate cu particulele suspendate, de materie organic sau anorganic. Aceste particule macroscopice formeaz zpada marin i sunt bogate n biomasa microbian i nutrieni, avnd rol n n circuitul carbonului organic particulat n mediul pelagic.
*

In mediile naturale, glicocalixul este structura care mediaz asocierile bacteriene polispecifice. Astfel, n rumen, se formeaz asociaii coloniale polispecifice (colonii polibacteriene). Intre ele se stabilesc relaii metabolice sinergice, prin care bacteriile realizeaz activiti metabolice, pe care speciile separate nu le pot desfura. De exemplu, n rumen se sintetizeaz CH4: unele bacterii produc H2, altele CO2, iar bacteriile metanogene reduc CO2, utiliznd H2 ca surs reductoare. Pentru bacteriile patogene, glicocalixul este structura prin care celulele se ancoreaz de celulele mucoaselor i iniiaz procesul infecios. De exemplu, Neisseria gonorrhoeae ader de celulele uretrale i vaginale prin filamentele glicocalixului. Uneori, legarea mediat de glicocalix are caracter de specificitate pentru un anumit tip de celule ale gazdei (de exemplu, bacteriile care iniiaz procese patologice intestinale se leag cel mai adesea, exclusiv de epiteliul intestinal). Glicocalixul capsular i cel comportamental sunt structuri foarte variabile din punct de vedere fenotipic, avnd grade foarte diferite de dezvoltare la aceiai tulpin bacterian, n diferite condiii de mediu. Dei sinteza reprezint o cheltuial semnificativ de energie, rolul lor funcional n mediile naturale justific existena structurilor polizaharidice. Glicocalixul dispare la celulele cultivate n medii artificiale. Pe medii nutritive bogate, existena acestor structuri nu mai este necesar, dar reapar prin transferul celulelor n medii naturale nefavorabile. Reunirea tuturor structurilor polizaharidice extraparietale, indiferent de gradul de dezvoltare sub denumirea de glicocalix a fost propus de Costerton (l982). Capsula este cea mai important dintre ele, ca grad de dezvoltare, dar toate structurile polizaharidice ndeplinesc aceiai funcie esenial aderena celulei de substrat. Gradul diferit de dezvoltare, dela glicocalix la macrocapsul implic o diversificare corespunztoare a funciilor acestor structuri. Prin gradul lor foarte diferit de dezvoltare n raport cu condiiile de mediu, structurile polizaharidice extraparietale sunt expresia autentic a plasticitii fenotipice structurale a bacteriilor. Teoria plasticitii fenotipice consider c bacteriile rspund modificrilor mediului de via, prin schimbri structurale i funcionale (metabolice) profunde, n cadrul aceleiai norme genetice. Plasticitatea fenotipic a bacteriilor permite adaptarea rapid la schimbri majore ale mediului. Bacteriile sunt primele organisme care se adapteaz la condiiile noi de mediu, n timp ce organismele superioare se adapteaz mult mai lent, prin selecia mutantelor. Bacteriile colonizeaz ecosistemele noi i prin mecanismul genetic al seleciei mutantelor. Aceast dubl capacitate adaptativ prin plasticitate fenotipic i prin selecia mutantelor explic uriaul succes al bacteriilor de a popula chiar cele mai ostile medii.

Flagelul Flagelul (flagelum = bici) este organitul extracelular al mobilitii celulei procariote. Organitele omologe de mobilitate ale celulei eucariote sunt flagelii i cilii. Flagelii se mai numesc i undulipode (undula = und mic; pus, podos = picior). Flagelul bacterin se prezint ca un filament extracelular, filiform, ondulat, cu grosimea uniform pe toat lungimea sa. Lungimea este variabil, de la 4-5 m pn la 70 m, iar diametrul este de 20 nm. Flagelii nu se observ prin examinarea direct a celulelor la microscopul optic. Existena lor se deduce indirect, din mobilitatea celulelor bacteriene pe preparatele din cultura vie. Celulele fr flageli se numesc atrihe. Dup numrul i modul de aezare a flagelilor, bacteriile sunt (fig 36): - monotrihe (cu un singur flagel); - amfitrihe (cu doi flageli asezai la cei doi poli ai unui bacil); Poziia flagelului (sau flagelilor) poate fi polar, subpolar sau ecuatorial.

Fig. 36. Reprezentarea schematic a modului de aezare a flagelilor unei celule bacteriene. Bacteriile fr flageli se numesc atrihe.

Structura flagelului Comparativ cu flagelul celulei eucariote, flagelul bacterian are o structur simpl, cu originea n structurile de nvelis ale celulei i este alctuit din urmtoarele elemente (fig. 37): - corpusculul bazal, localizat n nveliurile celulare; - crligul; - filamentul extern (flagelul propriu-zis). Corpusculul bazal formeaz o structur rotativ unic, att ca alctuire ct i ca funcionalitate n sistemele biologice, asemntoare, n general, cu un buton de cma. La bacteriile Gram negative, structura sa este mai complex, deoarece discurile componente sunt duble, alctuite din proteine diferite i ndeplinesc funcii diferite. Se disting urmtoarele discuri, aezate pe o structur axial, fin: - discul M(mobil) este ancorat n structura membranei citoplasmatice; - discul S (stator) este legat de peptidoglican; - discul P este localizat n spaiul periplasmic - discul L este legat de lipopolizaharidele membranei externe a peretelui. Crligul are rolul de articulaie flexibil ntre corpusculul bazal i filamentul extern. Prin axul su central, crligul se leag de corpusculul bazal.

Fig. 37. Reprezentarea schematic a motorului rotativ al flagelului de E. coli. Rotorul este un disc proteic integrat n membrana plasmatic si se rotete cu circa 100 revoluii/secund, fa de discul stator, sursa de energie gradientul de protoni (dup Todar, 2004).

Micarea de rotaie a discului M (3000-4000 r/min) este transmis crligului i filamentului extern. In alctuirea flagelului intr cel puin 11 tipuri de molecule proteice: cte unul n filamentul extern i crlig i cel puin 9 tipuri de proteine n corpusculul bazal. Cea mai cunoscut este proteina filamentului extern, denumit flagelin (gr. mol. 40 kDa). Moleculele sale sunt aezate dup o simetrie helical, formnd o structur tubular, canalicular. Moleculele de flagelin au proprietatea de autoasamblare: dac moleculele de flagelin sunt dispersate, n condiii adecvate, ele se reasambleaz spontan. Flagelina se sintetizeaz sub forma monomerilor, n interiorul celulei. Moleculele de flagelin strbat axul central* al structurii bazale i se aeaz la captul distal al flagelului, dup o simetrie helical pentru a forma filamentul extern. Flagelul bacterian crete prin regiunea sa apical. Moleculele de flagelin nu sunt eliberate** n mediul extracelular, nainte de a fi asamblate n structura flagelului.
Faptul s-a demonstrat prin examenul electrono-optic al flagelilor, la celulele marcate n puls cu un aminoacid radiomarcat. Marcajul apare numai la captul distal al flagelilor. ** S-a demonstrat indirect printr-un experiment n care Salmonella enterica serovar abortusequi, ce produce flageli buclai (curly) a crescut mpreun cu o tulpin slbatic ce produce flageli normali. Dei se tie c subunitile de flagelin ale celor 2 tulpini copolimerizeaz, fiecare tulpin bacterian i-a pstrat tipul caracteristic de flageli. Nu se gsesc flageli micti.
*

Crligul este format din subuniti proteice identice. Funcia sa nu este cunoscut. Corpusculul bazal are o structur molecular mult mai complex. Cele 9 proteine diferite sunt organizate n discurile care nconjur un ax subire, ce se inser n membrana citoplasmatic. Motilitatea i chimiotaxia Motilitatea bacterian are dou particulariti: este foarte rapid i se face dup o direcie aleatorie. Motilitatea a fost studiat cu ajutorul unui microscop special (microscop de urmrire) la o mutant monoflagelar de E. coli (fig 38). Intr-un mediu neutru (fr atractani i fr repeleni), celula bacterian se deplaseaz dup o traiectorie linear, timp de aproximativ o secund n care parcurge circa 30 m (de 15 ori lungimea celulei) apoi se rostogolete timp de 0,l secunde i reia deplasarea linear dup o direcie ntmpltoare. S-a ncercat s se explice mecanismul alternanei deplasrii lineare i al rostogolirii. S-a reuit imobilizarea extremitii libere a flagelului, cu anticorpi specifici, iar celula a rmas liber. S-a demonstrat astfel, c motorul rotativ imprim flagelului dou tipuri de rotaii: - o micare de rotaie n sens orar - o micare de rotaie n sens antiorar. La o celula peritrih, cnd flagelii se rotesc n sens antiorar, ei formeaz un fascicul coerent, astfel nct imprim o micare de propulsie n linie dreapt. Cnd sensul rotaiei flagelilor devine orar, celula se dezechilibreaz i se rostogolete. Imediat dup rostogolire, rotaia flagelilor devine antiorar. In condiii normale de mediu (fr atractani i fr repeleni), mobilitatea celulei peritrihe este ntmpltoare, n direcii imprevizibile i se face printr-o alternan de delplasri n linie dreapt, ntrerupte de rostogoliri.

Cercetrile de reologie au artat c datorit structurii flagelului, n mediul nutritiv lichid (bulion), deplasarea celulei bacteriene mtmpin o rezisten foarte mare. Cum se explic o vitez aa de mare, constant n timp, ntr-un mediu care opune o rezisten foarte mare? Explicaia rezid n metabolismul foarte intens al celulei bacteriene i n natura particular a sursei de energie utilizat. Pentru mobilitate, celula bacterian nu utilizeaz ATP, ci energia electrochimic, adic fluxul de electroni care strbate regiunea bazal a motorului rotativ. Energia de rotaie a structurii bazale este energia protonic (chemiosmotic) generat de deplasarea protonilor prin membrana celular, care furnizeaz fora inegalabil de deplasare a celulei bacteriene. Motilitatea celulei bacteriene este influenat de prezena n mediu, a substanelor chimiotactic pozitive (atractante) sau a substanelor chimiotactic negative (repelente) (fig. 39). Substanele atractante (aminoacizi, glucide, ioni de Ca si Mg, O2 pentru cele aerobe etc.) determin deplasarea celulei spre zonele n care concentraia lor este mai mare. Substanele repelente (alcoolii, acizii grai, O 2 n form ionic (O2--), OH--, metalele grele etc.) au efect chimiotactic negativ asupra celulelor bacteriene, determinnd ndeprtarea lor din zonele cu concentraii mari. Cnd celula se deplaseaz ntr-o direcie favorabil (n direcia unui atractant, sau se deprteaz de un repelent), deplasarea este preponderent linear i rostogolirile sunt mai puin frecvente, ceea ce semnific o prelungire a perioadei de rotaie antiorar i o scdere a frecvenei de rotaie orar a flagelilor. Dac bacteria se deplaseaz ntr-o direcie nefavorabil sau ntr-un mediu neutru crete frecvena rostogolirilor i scade corespunztor durata deplasrilor lineare. Rostogolirea are rolul de a corecta deplasarea celulei de la o direcie greit. Reglarea frecvenei rsturnrilor este esenial pentru chimiotaxie. Mobilitatea difereniat se datoreaz prezenei, la suprafaa celulei, a unor chemosenzori. Chemosenzorii sunt structuri moleculare specializate, alctuite din chemoreceptor i proteinele de chimiotaxie, care au capacitatea de a accepta grupri metilice. Chemoreceptorul nregistreaz prezena atractantului sau repelentului n mediu i transmite informaiile chimice n celul. Chemoreceptorii sunt proteine de legare din structura membranei plasmatice i din spaiul periplasmic. Extremitatea NH2 a moleculei este extracelular i are rolul de a lega semnalul chimic (atractant sau repelent). Unele molecule (aspartatul) se leag direct de chemoreceptor, iar altele sunt purtate de proteinele de legare. Chemoreceptorii au o specificitate relativ fa de compusul chimic pe care l leag. De exemplu, chemoreceptorul pentru galactoz, leag glucoza i fucoza, iar cel pentru manoza leag i glucoza. Dup legarea semnalului chimic, chemoreceptorul catalizeaz metilarea proteinelor de chimiotaxie, din categoria proteinelor transmembranare. Metilarea proteinei de chimiotaxie activeaz moleculele transductoare, care difuzeaz spre rotorul flagelar i comut rotaia de la un sens la altul. Gradul de metilare a proteinei de chimiotaxie este dependent de cantitatea de chemoefector din mediu. In absena factorilor atractani sau repeleni, proteinele de chimiotaxie sunt demetilate de proteine citoplasmatice i producerea factorilor difuzibili este oprit. Factorul difuzibil nu este cunoscut, dar probabil este o molecul mic.

Fig. 38. a. Poziia flagelilor la E. coli in timpul deplasrii lineare. Cand se rotesc n sens antiorar se strng ntr-un

mnunchi i propulseaz celula. b. Cnd flagelii se

distribuie uniform, sensul de rotatie devine orar i celula se rostogolete. Fig 39. a. ntr-un mediu neutru, deplasarea linear este ntrerupta de rostogoliri, care schimb ntmpltor

direcia de deplasare. b. n prezena unui factor chimic atractant, micarile de rostogolire sunt parial suprimate. Deplasarea este orientat n direcia atractantului.

Dac bacteria vine concomitent n contact cu un atractant i cu un repelent, rspunsul chimiotactic depinde de concentraia celor doi ageni i de afinitatea chemoreceptorilor care l leag (fig 40). Dac concentraia repelentului este mai mare, bacteria se ndeprteaz, i invers, dac atractantul are o concentraie superioar, celula se deplaseaz spre zona cu gradient maxim a acestuia.

Fig. 40. Mecanismul transducerii semnalului chimiotactic la bacterii. Atractanii chimici se leag de receptorii de tip 1 su 2 din membrana plasmatic sau de proteinele periplasmatice, care la rndul lor se leag de chemoreceptorii de tip 3 sau 4. Receptorii de chimiotaxie se activeaz i emit un semnal ce determin continuarea rotirii motorului flagelar n sens antiorar. Celula se deplaseaz preponderent n linie dreapt, iar rostogolirile sunt parial supresate (dup Alberts i colab., 1994).

Chemosenzorul bacterian este primul care apare n lumea vie, dar este foarte sensibil i exact. O proprietate definitorie a proteinelor cu rol transductor este adaptabilitatea la stimul, ce deriv dintr-un grad semnificativ de memorie a chemosenzorului, deoarece percepe modificrile de concentraie a substanelor chimice, att n spaiu (de 20 de ori lungimea celulei), ct i n timp i dispune de un sistem de prelucrare a informaiei care moduleaz deplasarea celulei ntr-un mediu cu atractani i repeleni. Astfel, dac un atractant este adugat n mediul de cretere, rostogolirea celulei este suprimat pentru cteva zecimi de secund. Dup un timp, frecvena rostogolirilor revine la normal, n prezena continu a atractantului. Bacteriile rmn n starea de adaptare la atractant, atta timp ct concentraia acestuia rmne constant. Mrirea concentraiei atractantului suprim din nou micrile de rostogolire, iar ndeprtarea atractantului mrete frecvena rostogolirilor, pn cnd adaptarea se produce din nou. Rolul esenial al chemorecepiei este de a modula deplasarea celulei ca rspuns la schimbrile concentraiei unui component al mediului (i nu de a semmnaliza o concentraie constant a acestuia), orientnd deplasarea ntr-o direcie favorabil. In suspensie, bacteriile flagelate se afl ntr-o micare continu, dup direcii ntmpltoare. Dac n mediu se creeaz gradieni ai factorilor fizici sau chimici, celulele se vor deplasa n acea zon a gradientului, care furnizeaz condiii optime. Deplasarea este rezultatul unui rspuns tactic (taxie). Cele mai cunoscute taxii sunt: - fototaxia asigur deplasarea bacteriilor fotosintetizante spre zonele cu luminozitate optim; - aerotaxia asigur deplasarea celulelor spre zonele cu concentraie optim a O2; - termotaxia. Temperaturile fiziologice sunt atractante, iar cele prea mari sau prea sczute sunt repelente. Studiile de biomecanic i de reologie* consider c mobilitatea celulei bacteriene este un caz particular.
*

Reologia este un domeniu al fizicii care studiaz fora de frecare si rezistena pe care o ntmpin un corp solid n timpul deplasrii n funcie de vscozitatea mediului lichid.

Viteza de deplasare este foarte mare, de 40-l00 de ori lungimea corpului pe secund, fr echivalent n lumea vie. Datorit structurii flagelului, bacteriile ntmpin o rezisten foarte mare n mediul lichid foarte vscos (bulion nutritiv). Explicaia deplasrii rapide const n metabolismul foarte intens al celulei bacteriene i n natura particular a sursei de E utilizat pentru micarea de rotaie a flagelului. Pentru rotaia flagelului, celula bacterian nu utilizeaz ATP, ci energia electrochimic, adic fluxul de protoni care strbate regiunea bazal a motorului

rotativ. Energia protonic (chemiosmotic) furnizeaz fora pentru viteza de deplasare inegalabil a celulei bacteriene. Semnificaia biologic a motilitii. Motilitatea favorizeaz supravieuirea bacteriilor, oferindu-le posibilitatea s se deplaseze spre zonele din mediu n care condiiile de existen sunt mai favorabile. Bacteriile simbiotice fixatoare de N2 (Rhizobium) se deplaseaz spre rdcinile plantelor leguminoase i iniiaz procesul infecios. Dei deplasrile nsumeaz 2 centimetri/zi, distana este foarte semnificativ. Pentru bacteriile patogene, mobilitatea (dac este prezent) favorizeaz penetrarea stratului de mucus ce tapeteaz celulele epiteliale i faciliteaz aderena bacteriilor, flagelul fiind astfel un factor de virulena. Alte tipuri de mobilitate. Mobilitatea flagelar este avantajoas numai pentru microorganismele ce triesc n mediul aquatic. Multe microorganisme triesc n medii cu coninut sczut de ap sau in medii care-i schimb gradul de umiditate: biofilme, sol etc. Unele bacterii flagelate produc un numr excesiv de flageli laterali, care le permite s se deplaseze ntr-un strat subire de fluid pe o suprafa solid. Multe alte procariote se deplaseaz pe o suprafa solid fie prin alunecare, fie prin micri brute discontinui. Mobilitatea prin alunecare se definete ca micarea unei celule neflagelate n direcia axului celular lung, pe suprafaa unor medii solidificate, sau n mediile lichide, la interfaa aer-ap. Este o micare lent, de trre, care nu implic un singur mecanism. Mecanismele mobilitii prin alunecare includ aciunea unor proteine fibrilare contractile, situate n straturile superficiale ale celulei; propagarea direcional a undelor de-a lungul suprafeei celulare; eliminarea orientat a mucilagiului; eliberarea controlat a surfactanilor la polii celulelor etc. Celulele de Proteus (un zeu grec al mrii, care ia multiple nfiri pentru a se face nevzut) pe suprafaa mediului solidificat se deplaseaz prin roire (swarming). Roirea se produce pe o suprafa solid care nu permite mi carea flagelar obinuit n mediul lichid. Studiile de roire pe agar ncep prin uscarea suprafeei agarului pentru a ndeprta umiditatea. Astfel este mpiedicat migrarea prin deplasarea n mediul lichid. Procesul roirii cuprinde urmtoarele evenimente: a) creterea celulelor roitoare; b) migrarea lor pe suprafaa agarului; c) diviziunea lor n celule scurte. Comportamentul cunoscut sub denumirea de roire poate fi descris ca o micare a celulelor alungite i flagelate pe suprafaa mediului solid, n cicluri periodice de micare i consolidare. Celulele care roiesc sufer importante modificri morfologice. Roirea este determinat de apariia celulelor filamentoase (de 20-80 um lungime), cu un numr mare de flageli (500-1000 flageli/celul), denumite celule roitoare. In timpul consolidrii, celulele roitoare se divid pentru a produce celule scurte (2-4 um lungime, cu 1-10 flageli) care cresc i se divid o perioad de timp, apoi se difereniaz pentru a forma o alt generaie de celule roitoare. Celulele roitoare apar la periferia coloniei, pe suprafaa liber, n grupe mici, care se deplaseaz pe o distan scurt i se ntorc din nou la colonie. Pe msur ce perioada de roire crete, celulele se deplaseaz n grupe mai mari, tot mai departe de colonie, nainte de a se rentoarce. Deplasarea n grupe mai mari este mai eficient. La terminarea primei perioade de roire, micarea se oprete i celulele intr ntr-o perioad de consolidare. Din celulele filamentoase, prin diviziune transversal n cteva puncte rezult celule scurte normale. Celulele scurte rezultate prin diviziunea celulelor roitoare cresc i se divid i ciclul se repet cu a II-a band de roire, care ncepe de la marginea primei benzi. Fenomenul se numete zonare i continu pn cnd ntreaga suprafa a plcii este acoperit de cteva benzi concentrice de cretere dens i lax. Micarea poate fi rezultatul chimiotaxiei negative fa de cataboliii care se acumuleaz, sau al chimiotaxiei pozitive fa de substanele nutritive. La spirochete, micarea este rezultatul contraciei i relaxrii unui fascicul de fibrile axiale (axostil), situate ntre corpul celulei i o membran ce acoper celula. Se produc micri pulsatorii prin flexia i extensia celulei, precum i o micare concomitent de rotaie n jurul axului longitudinal. Fimbriile Fimbriile sunt structuri de tipul unor apendice filamentoase, rigide i neuniforme ca lungime, care se extind de la suprafaa celulei bacteriene. Termenul de fimbrii a fost introdus de Duguid (1955) (fimbria -latin fibra, franjuri), iar n 1959 Brinton a folosit termenul de pil(latin, pilus = pr). Apoi s-a sugerat ca termenul de pil s fie folosit pentru structurile filamentoase codificate de plasmidele conjugative, cu rol n procesul de conjugare ce const n transferul unui fragment de ADN de la o celul donor la o celul receptoare. Adeseori, cei doi termeni se folosesc pentru a descrie aceiai stuctur. Fac excepie structurile fimbriale de la Neisseria, pentru care literatura folosete termenul de pil. Fimbriile sunt alctuite din molecule proteice de fimbrilin, cu gr. mol. de 15-30 kDa, aezate totdeauna dup o simetrie helical. Numrul lor este de pn la l000/celul. Daca sunt numeroase, au o dispoziie pericelular. Dac sunt puine, au localizare polar sau bipolar. Lungimea lor este foarte variabil (l-20 m), ceea ce sugereaz c au vrste diferite.

Fimbriile se observ la microscopul electronic, dup coloraia negativ a celulelor ntregi sau se evideniaz indirect prin capacitatea lor de a aglutina hematiile diferitelor specii de animale i pot fi mprite n 3 categorii structurale: - fimbrii rigide, cu diam. de 5-10 nm, cu un lumen de circa 2 nm (la enterobacterii). Regiunea hidrofob este la captul COOH al fimbrilinei; - fimbrii flexibile, cu diam. de de 5-6 nm. Se mai numesc fimbrii N-metil-fenilalanin, deoarece la captul Nterminal al fimbrilinei au un rest de fenilalanin metilat. Se gsesc la Ps. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis. Regiunea N-terminal este hidrofob; - fimbrii flexibile subiri spiralate, cu diam. de 4 nm sau mai puin, fr lumen (K88, K99, la E. coli). Unele fimbrii au att o regiune rigid, ct i una flexibil. Fimbriile sunt comune la bacteriile Gram negative i mai rare la bacteriile Gram pozitive (Corynebacterium, Actinomyces), dar sunt diferite structural. O bacterie posed cteva tipuri de fimbrii, n funcie de grosime, lungime, specificitatea antigenic (determinat de secvena aminoacizilor n molecula de fimbrilin) i de specificitatea receptorilor glicoproteici ai celulelor epiteliale de care ader. Semnificaia biologic. Fimbriile sunt structuri din categoria adezinelor, adic mediaz interaciunea celul-suport. In ceea ce privete capacitatea de legare, cele mai multe adezine fac parte din familia lectinelor*.
* Lectinele sunt glicoproteine care se leag nespecific cu glucidele sau cu gruprile glucidice ale glicoproteinelor. Ele precipit polizaharidele si glicoproteinele sau aglutineaz celulele. Activitatea lor aglutinant i precipitant poate fi inhibat de haptene (monozaharide i oligozaharide).

Cea mai important funcie care li se atribuie ar fi aceea de puni de aderen intercelular sau aderen de suportul inert. La bacteriile din mediile aquatice, fimbriile favorizeaz asocierile dintre celule i astfel se formeaz pelicule fine (filme) de neuston la suprafaa apei, cu rol adaptativ, ce asigur condiii bune de aerare pentru bacteriile aerobe i de luminozitate pentru cele fotosintetizante. Pentru bacteriile patogene, prezena fimbriilor (tulpinile fim+) le confer un grad superior de virulen, deoarece fimbriile ader ferm de receptorii suprafeei celulelor epiteliale ale mucoaselor i ai hematiilor. Receptorul major al suprafeei celulelor eucariote pentru fimbriile bacteriene este o glicoprotein cu manoz. Proteina de aderen localizat pe fimbrii se leag de resturile de manoz ale glicoproteinelor. In funcie de comportamentul n prezena manozei, in vitro, s-au identificat fimbrii manozo-sensibile i manozo-rezistente. La E. coli s-au evideniat fimbrii manozo-sensibile (manoza inhib hemaglutinarea, in vitro, prin competiia cu receptorii suprafeei hematiilor). Fimbriile manozo-rezistente aglutineaz numai eritrocitele tanate. Celulele bacteriene cu astfel de fimbrii ader de celulele endoteliale, de celulele epiteliale ale tractului respirator, urogenital, de membrana bazal a tubilor renali, a capsulei Bowmann. O celul bacterian exprim simultan, fimbrii cu specificiti multiple de legare de suportul celular. Astfel se explic selectivitatea bacteriilor patogene i comensale pentru anumite gazde i esuturi. Elaborarea conceptului adezinelor i a specificitii lor de legare explic tropismul tisular selectiv al bacteriilor infecioase. Caracterul progresiv ascendent al infeciei urinare, de la vezica urinar spre rinichi, mpotriva fluxului urinar, se explic prin fenomenul de aderen, mediat de fimbrii cu diferite specificiti de legare, de celulele epiteliale. Exprimarea fimbriilor pe suprafaa celulei este adaptativ. Ele favorizeaz aderena celulei bacteriene de substraturi celulare diferite. Fimbrilina este codificat de gene cromosomale, ceea ce denot c fimbriile au o importan ecologic deosebit, prezena lor fiind asociat cu anumite condiii favorizante de mediu. Dup sintez, fimbrilina este transferat extracelular i depus la baza fimbriei. Orice linie bacterian poate s existe alternativ n varianta fim+ sau fim- i s poarte simultan mai multe tipuri de fimbrii, cu specificiti diferite de legare. Rata de mutaie a genelor care codific sinteza fimbriilor este foarte mare, astfel nct celulele fim+ trec n varianta fim- i invers, prin retromutaie. Uneori fimbriile sufer fenomenul variaiei de faz i al variaiei antigenice. Variaia de faz nseamn c o structur dat este sau nu este produs. Variaia antigenic semnific faptul c aceiai structur se produce n variante biochimice diferite. Variaia antigenic a fimbriilor bacteriene este rezultatul aciunii mai multor mecanisme. Cel mai simplu este acumularea lent a mutaiilor punctiforme n gena codificatoare. Fenomenul se numete drift antigenic i are loc att la bacteriile patogene ct i la cele nepatogene.

Pilii Pilii sunt apendice filamentoase neflagelare, a cror sintez este codificat de gene localizate n structura unor plasmide denumite conjugoni sau plasmide sex. Celulele purttoare de pili au capacitatea potenial de a dona material genetic (sunt celulemascul). Numrul pililor pentru o celul este cuprins ntre 1 i l0, iar lungimea este de circa 20 m. Diametrul extern este de 6-l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm. Pilii sunt alctuii din molecule identice de pilin, o fosfoglicoprotein de l2-l5 kDa. Se sintetizeaz n celul, de unde este transferat n lumenul piliar i este asamblat dup o simetrie helical, la extremitatea liber a acestuia. Pilii pot fi ndeprtai mecanic, prin agitare i se resintetizeaz. Prin nclzire sau tratament acid, pilii se dezagreg n moleculele componente (pilina). Restabilirea neutralitii i a nivelului termic permite autoasamblarea i formarea unei structuri identice cu pilul original. Rolul pililor. Prezena pililor este asociat totdeauna cu procesul de conjugare bacterian. Pilii ar putea fi structuri eseniale de transfer al materialului genetic de la celula donor la celula receptor. Molecula de ADN ar trece prin lumenul pilului. Dup ali autori, pilii ar avea numai rolul de a aga celula receptoare de material genetic, iar prin retracia sa ulterioar, cele dou celule s-ar apropia. Rolul pililor n conjugare este argumentat de faptul c depilierea (prin agitare cu perle de sticl) este nsoit de pierderea capacitii de conjugare i de restabilire a ei odat cu resinteza pililor. Capacitatea de sintez a pilinei se pierde odat cu pierderea plasmidei de sex i este redobndit odat cu rectigarea plasmidei. Pilii poart receptori de fagi. Pe suprafaa pililor se gsesc receptori pentru fagii ARN masculi. Se numesc fagi masculi deoarece infecteaz numai celulele cu potenialitate de donor de material genetic. Marcajul cu fagii ARN masculi este modalitatea de a-i distinge de alte structuri filamentoase. La extremitatea liber a pililor se gsesc receptori pentru fagii filamentoi.

CAPITOLUL II CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR


Procesele de cretere i multiplicare a celulei bacteriene sunt consecina metabolismului bacterian. Aceste procese au o serie de particulariti, marcate de intensitatea deosebit a metabolismului i de reglarea perfect a acestuia. Creterea n sens biologic este rezultatul mririi coordonate a constituienilor structurali ai unui organism uni- sau pluricelular, ca o consecin a sintezelor specifice, echilibrate, pe baza compuilor nutritivi existeni n mediu. Pornind de la acetia, n cursul creterii se sintetizeaz noi compusi, care sunt asamblai pentru a forma copii fidele ale constituienilor celulari proprii. Creterea celulei bacteriene In mod normal, toi constituienii celulari se dubleaz cantitativ n perioada de cretere, dar afirmaia este valabil n primul rnd pentru ADN. Creterea i multiplicarea bacteriilor sunt procese controlate genetic. O astfel de definiie, ce limiteaz procesul de cretere la ansamblul constituienilor specifici celulei, elimin din cadrul noiunii de cretere, mrirea volumului celular consecutiv acumulrii unei cantiti crescute de ap. Creterea celulei bacteriene implic creterea peretelui celular. De aceea, studiul mecanismelor de cretere a peretelui celular reflect mecanismele de cretere n general. Peretele celular crete prin secionarea legturilor chimice la anumite situsuri caracteristice ale moleculei de murein i prin intercalarea unor constituieni structurali noi. Forma celulelor bacteriene este consecina modului n care are loc creterea (adugarea de substan nou). La bacteriile sferice, creterea este localizat ntr-o band ngust ecuatorial (fig. 41). Dovada a fost adus de experienele n care s-au utilizat anticorpi specifici fa de polimerii parietali, marcai cu substane fluorescente. Calotele celulei i pstreaz fluorescena cteva generaii succesive, n timp ce n zona ecuatorial, fluorescena dispare progresiv, curnd dup marcare. Substana nou se depune, n proportii aproximativ egale, pe toate cele trei directii ale spaiului.

Fig. 41. a. La celulele sferice (coci) sinteza peretelui celular nou este localizat la nivelul zonei ecuatoriale. b. Imaginea electrono-optic de scanning a celulelor de Streptococcus hemolyticus. Sgeile indic zona de iniiere a septului de diviziune. Fig. 42. Reprezentarea schematic a diferitelor modaliti teoretice de cretere a bacilior, prin adugarea constituienilot noi (zona haurat) la structura parietal. (A) Perete celular in faza premergtoare creterii. (B) Cretere limitat la una din extremiti. (C) Cretere la ambele extremiti. (D) Cretere n vecintatea septului transversal. (E) Cretere prin intususcepiune. (F) Cretere prin ntinderea peretelui celular i depunerea de material nou pe suprafaa intern.

Bacteriile cilindrice cresc prin adugarea substanei noi, pe direcia axului lung al celulei (fig. 42). Depunerea substanei noi n peretele celular al bacteriilor cilindrice se poate realiza unipolar, bipolar, ecuatorial (n zona de formare a septului transversal) sau intercalar. Creterea celulei bacteriene este limitat n timp pn la atingerea unui volum critic, cnd nceteaz i este urmat de diviziune. Mecanismul molecular declanator al diviziunii nu este cunoscut. Un rol important se atribuie dezechilibrului ntre suprafaa i volumul celulei, ce apare ca rezultat al creterii. In mod obinuit exist un raport echilibrat, permanent controlat, ntre suprafaa celulei i volumul ei (S/V). Suprafaa reprezint aria celular prin care se realizeaz schimburile cu mediul extern. Mrimea suprafeei condiioneaz rata ptrunderii nutrienilor i a eliminrii substanelor de catabolism. Volumul reprezint masa celular care consum nutrienii i produce cataboliii . In procesul de cretere, suprafaa se mrete cu o rat ptrat, iar volumul, cu o rat cubic. Cnd valoarea raportului S/V atinge o limit inferioar critic, dezechilibrul creat declanseaz diviziunea celular, prin care raportul S/V se reechilibreaz. Multiplicarea bacteriilor se realizeaz prin diviziune direct (simpl), prin nmugurire sau prin formarea sporilor de propagare. Multiplicarea prin diviziune Din punct de vedere structural, mecanismul diviziunii simple i etapele desfurrii sale sunt bine cunoscute. La bacteriile cilindrice, diviziunea simpl se face dup un plan transversal, perpendicular pe axul lung al celulei. Foarte rar, diviziunea poate avea loc dup un plan longitudinal. La coci, diviziunea se poate realiza dup 1, 2 sau 3 planuri perpendiculare unul pe cellalt, rezultnd diplococi, tetrade sau coci aezai n pachete cuboidale. Nu exist un model unic al procesului de diviziune bacterian. Studiile s-au fcut la un numr limitat de specii, aparinnd celor dou grupe majore: Gram pozitive i Gram negative.

Bacilii Gram pozitivi se divid dup urmtorul mecanism: n regiunea ecuatorial a celulei se formeaz un sept transversal, alctuit din membrana citoplasmatic i peretele celular. Septul crete progresiv centripet, ca o adevrat diafragm i separ cele dou celule surori ce vor rezulta din diviziune. La microscopul electronic se evideniaz clar etapele succesive ale creterii centripete a septului ecuatorial. Membrana citoplasmatic, uneori, precede uor septul parietal, dar niciodat nu progreseaz pentru a realiza singur separarea complet a celor doi protoplati (fig 43). La bacilii Gram negativi, diviziunea celular are loc prin constricia (strangularea) treptat a celulei la nivelul zonei ecuatoriale. Constricia implic toate cele trei straturi: membrana extern, stratul peptidoglicanic i membrana intern. Se produce o cretere treptat a curburii spre interiorul celulei i o ngustare a ei n regiunea ecuatorial. Relaia dintre celula care se divide i celulele rezultate din diviziune este, o celul mam dou celule surori. Celula care se divide dispare. Ea i pierde individualitatea n cele dou celule ntinerite. Diviziunea celulei este precedat de sinteza unor proteine, care se concentreaz la situsul formrii septului sau al constriciei.

Fig. 43. Imagini electrono-optice n transmisie a celulelor bacteriene n diviziune. a. La B. subtilis, diviziunea are loc prin formarea unui sept de origine parietal. b. La bacteriile Gram negative diviziunea se face prin constricia treptat a celulei la nivelul zonei ecuatoriale. c. Diviziunea asimetric. La extremitatile ambelor celule de B. subtilis, diviziunea inegala genereaz minicelule (sagei) (original).

Mecanismul molecular al diviziunii Procesul de diviziune este controlat de un set de 7 sau mai multe proteine cu funcie specific denumite proteine de diviziune. Proteinele care regleaz diviziunea, ca i cele care controleaz segregarea cromosomilor,

motilitatea, nu sunt distribuite uniform n citoplasm, ci ocup situsuri speciale: n membran, n spaiul periplasmic etc. Proteinele de diviziune se agreg n zona ecuatorial a celulei i se asambleaz ntr-o ierarhie bine determinat, formnd o structur multimeric inelar - inelul Z, denumit septalsom, divisom sau septator. Diviziunea celulei se produce n zona inelului Z. La bacteriile Gram pozitive, pentru inelul Z este preferat termenul de septalsom (deoarece diviziunea este precedat de formarea septului), iar la bacteriile Gram negative se folosete termenul de divisom, pentru c diviziunea progreseaz prin constricie. Moleculele implicate n diviziunea celular i n segregarea cromosomilor s-au evideniat prin metoda microscopiei cu fluorescen. La E. coli, ele se asambleaz la nivelul situsului de diviziune i formeaz ansamblul funcional de form inelar - divisomul. Toate proteinele reglatoare ale procesului de diviziune sunt proteine termosensibile, deoarece la temperatur nepermisiv, funcia lor este alterat, nu mai controleaz procesul de diviziune i determin apariia mutantelor filamentoase. Celulele filamentoase se formeaz ca rezultat al creterii celulei, noit de replicarea repetat a materialului nuclear, dar celula nu se divide. De aceea, multe proteine i mutantele pe care le genereaz au prefixul Fts (filamente termosensibile). Majoritatea proteinelor Fts au un domeniu ancorat n membrana celulei, iar celelalte domenii se gsesc n citoplasm sau n spaiul periplasmic. S-au identificat funciile biochimice pentru 2 proteine : FtsZ i PBP (penicilin binding protein). Cea mai important cantitativ (de ordinul miilor de molecule), dintre proteinele de diviziune este FtsZ, cu localizare ecuatorial, care n forma polimerizat, localizeaz procesul de diviziune. Fts Z este o protein citosolic i se gsete virtual la toate bacteriile i n organitele celulei eucariote. Este omolog tubulinei i se poate polimeriza ca i tubulina, pentru a forma o structur asemntoare unui inel (inelul Z), la situsul de diviziune. Inelul Z are un rol esenial n constricia membranei celulare i n coordonarea ntregului proces de diviziune. Fts Z este o GTP-az i poate s se polimerizeze att in vitro ct i in vivo. Proteina care leag penicilina (PBP) are rolul de sintez a peptidoglicanului parietal la noii poli ai celulei (pentru organismele care au perete peptidoglicanic). PBP sunt enzime care catalizeaz reacia de legare ncruciat ntre polimerii peptidoglicanului: sunt transpeptidaze care leag ncruciat catenele tetrapeptidice asociate acidului N-acetilmuramic. Legarea antibioticelor -lactamice la PBP implicate n formarea septului de diviziune are ca rezultat formarea filamentelor lungi. Inactivarea altor PBP duce la liza rapid a celulei bacteriene, deoarece celula rmne osmotic neprotejat de perete. Diviziunea celulei parcurge cteva etape : - selecia situsului de diviziune, de obicei la mijlocul celulei, ntre nucleoizii recent segregai; - asamblarea aparatului citoplasmatic, care aproape todeauna implic FtsZ i la majoritatea organismelor, FtsA. Aceste proteine leag i hidrolizeaz nucleozidtrifosfaii, elibernd energia necesar remodelrii celulei. In celulele bacilare gata s nceap diviziunea sunt 3 situsuri la care procesul se poate iniia: unul n zona central a celulei, ntre cromosomii replicai i segregai i cte unul la polii celulei. Evenimentul central al nceperii diviziunii este formarea inelului Z. Localizarea sa la mijlocul celulei este controlat prin dou mecanisme: - mecanismul nchiderii nucleoidului, se bazeaz pe observaia c diviziunea celulei este iniiat n spaiile libere, n care ADN lipsete ; - sistemul min, care controleaz poziia inelului Z, denumit astfel pentru c mutantele acestor gene produc minicelule prin localizarea inadecvat, la polii celulei, a situsului de diviziune. Fora motrice a citochinezei pare a fi depolimerizarea controlat a inelului format de proteinele Fts, deoarece diametrul divisomului scade progresiv n timpul diviziunii, dar i creterea centripet a stratului de peptidoglican. Diviziunea asimetric. De cele mai multe ori, diviziunea este simetric sau izomorf, adic din procesul de diviziune rezult dou celule de dimensiuni egale (fig. 42c). Uneori, diviziunea celular este asimetric, rezultatul fiind formarea a dou celule inegale. Cea de dimensiuni mici este o minicelul. Diviziunea asimetric este caracteristic bacteriilor cilindrice i se produce frecvent la mutante de E. coli i B. subtilis. Minicelulele (bacterii miniaturale) au fost descrise n l967 de Adler ca bacterii foarte mici, care apar la extremitatea celulelor de E. coli, dup diviziune. Minicelulele apar foarte rar la bacteriile din mediile naturale, dar sunt frecvente la liniile mutante, crescute pe mediile artificiale. In general, minicelulele sunt lipsite de material nuclear, sau conin o cantitate foarte mic de

ADN. Nu pot crete i nici nu se divid, dar au activitate metabolic: realizeaz procese oxidative, produc energie sub form de ATP. Adeseori, minicelulele conin plasmide. In cazul n care plasmidele le confer calitatea de donoare de material genetic, minicelulele pot realiza procese conjugative de transfer de material genetic, unor celule receptoare. Ele pot fi infectate de fagi, dar elibereaz un numr mic de fagi progeni. Iniial li s-a atribuit numai o importan de ordin teoretic, minicelulele fiind structuri ce permit analiza unor procese biologice importante: diviziunea celular, studiul fenomenelor de transport celular prin membran. Interesul fa de ele a crescut, legat de posibilitatea de a le folosi n viitor pentru producerea de vaccinuri, chiar n cazul n care provin de la bacterii patogene, deoarece fiind lipsite de capacitatea de diviziune, nu pot iniia procese infectioase. Mecanismul formrii minicelulelor nu este elucidat. Una din teoriile care explic diviziunea asimetric presupune c n fiecare celul bacterian cilindric exist trei situsuri la care se poate iniia formarea unui perete desparitor: unul situat central i celelalte dou, distribuite simetric la cei doi poli. In mod normal, bacteriile cilindrice se divid printr-un perete transversal ce se formeaz la nivelul situsului central. Cele dou celule surori motenesc cte un situs polar. Pe msur ce cresc, situsul polar dobndete o poziie central. Formarea unei minicelule ar fi consecina activrii premature a unui situs polar, la nivelul cruia se formeaz un sept de diviziune, nainte ca procesul de cretere celular s se realizeze complet. Aceast teorie nu explic modul de formare concomitent a minicelulelor n iraguri, ceea ce presupune activarea simultan a tot attea situsuri de diviziune. Formarea minicelulelor pare a fi rezultatul unor mutaii la nivelul genelor reglatoare ale procesului de diviziune. Reglarea procesului de diviziune Diviziunea celular normal este corelat cu procesul de replicare a cromosomului bacterian. Exist un raport temporal strict ntre replicarea ADN i diviziunea celulei. Corelaia este esenial, deoarece astfel este prevenit producerea celulelor anucleate. Rata diviziunii celulare este controlat, n primul rnd, de rata sintezei ADN. Nucleoidul exercit putere de veto asupra diviziunii celulei, ceea ce nseamn c nucleoidul nereplicat sau nesegregat dup replicare, reprezint o barier fizic pentru procesul diviziunii celulare. In celulele care cresc cu o rat normal sau sczut, sinteza ADN se desfoar pe durata a 2/3 din timpul de generaie. La o tulpin de E.coli cu timpul de generaie de 60 de minute, pentru sinteza ADN sunt necesare 40 de minute. In culturile care cresc mai lent, sinteza ADN dureaz mai mult, dar necesit tot 2/3 din timpul de generaie. In astfel de culturi, o celul tnr rezultat printr-un proces de diviziune conine un singur cromosom. In celulele care cresc pe medii optime, rata de cretere este mare i diviziunea celulei se face la intervale scurte de timp. Timpul de generaie (intervalul dintre dou diviziuni) este mai scurt dect timpul necesar pentru replicarea moleculei de ADN. ADN se replic mai lent dect timpul necesar desfurrii unui ciclu de diviziune. Celula bacterian compenseaz decalajul creat, iniiind un al II-lea ciclu de replicare a ADN, nainte de ncheierea ciclului anterior. Astfel, n celulele care cresc rapid, pe molecula de ADN sunt prezente la un moment dat, cteva puncte de replicare. Numrul lor depinde de rata de cretere a celulei. Cnd copiile de ADN sunt distribuite n celulele fiice, ele poart regiuni deja replicate. Ca urmare, informaia genetic localizat n apropierea situsului de origine a replicrii se gsete ntr-un numr mai mare de copii, dect aceea localizat aproape de punctul terminal al replicrii cromosomului. Deoarece cantitatea de ADN/unitatea de mas celular ramne constant, celulele care cresc repede sunt mai mari. La eucariote, sinteza ADN se iniiaz simultan pe toi cromosomii setului. Pe fiecare cromosom exist un numr de situsuri separate, la care sinteza ncepe simultan. Segregarea cromosomilor La bacterii, ncheierea replicrii cromosomului este semnalul disocierii sale de membran i astfel este posibil repartizarea cromosomilor fii n cele dou celule surori. Mecanismul segregrii (distribuiei) celor doi cromosomi nu este cunoscut. Se pare c rolul esenial n acest proces revine structurilor mezosomale. Clivarea structurii mezosomale este corelat n timp, cu replicarea cromosomului. Fiecare dintre cei doi cromosomi rmne legat de cte o structur mezosomal. Creterea membranei plasmatice n spaiul dintre cei doi mezosomi asigur deplasarea acestora spre polii celulei. Fiecare dintre cele dou celule surori va moteni un cromosom legat de propriul mezosom. Dar nveliurile celulei cresc n special prin intercalare la situsuri multiple.

Rezultatele autoradiografice sugereaz c originile replicrii celor doi cromosomi se ndeprteaz n cursul replicrii, ajung la polii celulei i rmn acolo pentru cea mai mare parte a ciclului. Dar replisomul pare a fi localizat la centrul celulei, probabil ataat de membrana celulei, ceea ce sugereaz c pentru un nou ciclu de replicare, originea trebuie s revin spre centrul celulei. Segregarea celor doi cromosomi n celulele fiice merge paralel cu replicarea. Cei doi cromosomi se deplaseaz chiar n timpul replicrii. Secvenele de nucleotide adiacente situsului de origine a replicrii reprezint situsuri de legare pentru proteinele ce particip la separarea ADN (fig. 44). Pe msur ce ADN trece prin replisom, pierde supraspiralizarea i trece n stare relaxat. Dup ncheierea replicrii, cromosomii se recondenseaz separat i se deplaseaz spre poziiile 1/4 i respectiv 3/4 ale celulei. Un rol important n condensarea ADN are proteina Muk B, component a familiei proteinelor care menin structura cromosomului (SMC). Fiecare dintre proteinele familiei, prin cele dou extremiti active se leag la dou situsuri distante ale ADN i le apropie printr-un mecanism de balama, dependent de ATP. Proteinele ce se leag de ADN nu i ntlnesc situsurile de aciune prin difuzie liber n celul, ci prin legare la un situs de intrare i alunecare pe molecula de ADN pn la locul de aciune.

Fig. 44. Ilustrarea schematic a mecanismului segregrii cromosomilor n celulele surori rezultate dup diviziune (cr = cromosom ; m = mezosom ; sd = sept de diviziune).

Dinamica (evoluia) unei culturi bacteriene Cultura bacterian este rezultatul creterii i multiplicrii ntr-un mediu lichid sau solid, a unei mici cantiti iniiale de celule, care constituie inoculul. Microorganismele se cultiv n mai multe scopuri: - izolarea si identificarea lor; - meninerea viabilitii lor n colecie; - studiul sensibilitii la antibiotice n laboratorul clinic sau n scopul cercetrii; - n scop industrial pentru obinerea biomasei, a unor produi de biosintez sau de fermentaie. Exist dou modaliti de cultivare a microorganismelor i tot attea tipuri de culturi: - culturile bacteriene discontinui se obin prin cultivarea n mediul nutritiv lichid sau solidificat, ce nu se renoiete; - culturile bacteriene continui se obin prin cultivarea n mediu lichid renoit permanent, cu o anumit rat. In mod curent, n laborator se obin culturi bacteriene discontinui, ntr-un volum fix de mediu lichid sau solidificat, nerenoit. Odat cu creterea culturii bacteriene, compoziia chimic a mediului se modific: scade cantitatea de substane nutritive i se acumuleaz catabolii, care pot fi toxici. Intr-o cultur discontinu, numrul de celule viabile variaz continuu. Ritmul de diviziune este condiionat de concentraia nutrienilor: este foarte nalt n faza iniial a evoluiei culturii, cnd mediul ofer condtii optime, dar diminu treptat, pn la 0, pe msura epuizrii nutrienilor i a acumulrii cataboliilor. Intr-o cultur discontinu, ciclul celular este sincron numai n primele cicluri de diviziune celular Curnd apar decalaje i ritmul diviziunii devine asincron. Diferite grupe de celule se gsesc n faze diferite ale ciclului de cretere i multiplicare. Vrsta celulelor unei culturi discontinui este diferit. Numrul de generaii celulare este limitat.

Analiza evoluiei numrului de celule ntr-o cultur discontinu se poate face pe o curb de cretere, trasat n coordonate semilogaritmice. Panta curbei reflect valoarea ratei de cretere, variabil n timp. Curba relect variaiile numrului de celule i implicit a masei celulare, n funcie de timp. In raport cu variaiile ratei de cretere, pe curb se disting 6 momente: l) Faza de laten (de lag sau de cretere 0) este greu de delimitat de faza urmtoare (fig. 45). Are o durat foarte variabil: poate s fie foarte scurt (chiar inexistent) sau s dureze cteva ore. Numrul celulelor ramne neschimbat, egal cu cel din inocul sau poate chiar s scad uor. Este caracterizat printr-o intens activitate celular. In cursul acestei faze, celulele se pregtesc pentru procesele de multiplicare care vor urma.

Fig. 45. Curba ideal de cretere a unei culturi staionare. Linia continu reprezinta numrul total de celule, iar linia discontinu ilustreaz numarul celulelor viabile.

Timpul de laten este lung (1-3 ore) pentru inoculul bacterian care provine dintr-un mediu complex, ce conine numeroi compui organici, nsmnat ntr-un mediu sintetic minimal. Latena corespunde timpului necesar sintezei enzimelor celulare pentru biosinteza metaboliilor eseniali. Latena este de asemenea ndelungat, dup inocularea unui mediu sintetic minimal, cu un numr mic de celule care provin din acelai mediu. In acest caz, bacteriile sunt adaptate fiziologic la mediul de cretere, dar creterea ntrzie, deoarece anumite componente toxice (de exemplu, ionii metalici) nu au fost neutralizate. Timpul de laten depinde de starea fiziologic a celulelor din inocul: celulele aflate n faza staionar se adapteaz uor la un mediu diferit. Dac inoculul provine dintr-o cultur aflat n faza de declin, alterarea proceselor fiziologice se reflect n creterea perioadei de laten. Timpul de laten nu influeneaz durata celorlalte faze de evoluie a unei culturi. De cele mai multe ori, celulele bacteriene se adapteaz la noile condiii de mediu datorit plasticitii fenotipice, n cadrul aceleiai norme genetice. Uneori, adaptarea unei culturi la noile condiii de mediu se poate datora seleciei unei populaii mutante i timpul de lag este lung. In acest caz, n inocul se gsete o proporie foarte mic de celule mutante, capabile s metabolizeze aceste surse. Din punct de vedere genetic, mutantele sunt diferite de restul celulelor. Din aceast cauz, perioada de lag este foarte lung. Masa celular a culturii va deveni vizibil numai dup ce celulele mutante s-au multiplicat ntr-o msur suficient pentru a constitui o proporie semnificativ a inoculului. In acest caz, perioada de lag este aparent i nu real, deoarece celulele mutante capabile s creasc, se multiplic exponenial cu mult nainte ca rezultatul multiplicrii s se evidenieze prin creterea masei celulare. Perioada de lag este foarte scurt sau chiar absent, dac inoculul este transferat pe un mediu identic. Celulele posed deja, echipamentul necesar metabolizrii mediului respectiv. 2) Faza de iniiere a creterii este un interval scurt de timp, n care celulele bacteriene cresc i se divid cu un ritm care crete progresiv. Este faza de accelerare a ritmului de cretere. 3) Faza de cretere exponenial. Creterea numrului celulelor bacteriene se face cu o rat exponenial(geometric)constant. Ritmul de diviziune este maxim. Mortalitatea celular este practic nul. Dup fiecare diviziune, numrul celulelor se dubleaz. Daca Xo este numrul de celule/ml la nceputul fazei de cretere exponenial, numrul de celule se dubleaz succesiv astfel: - dup o diviziune: X1 = 2 x Xo;

dup dou diviziuni: X2 = 22 x Xo dup n diviziuni: Xn = 2n x X0. Expresia se poate scrie: logXn = log Xo + n log 2. Creterea unei culturi bacteriene se realizeaz ntr-un interval de timp dependent de timpul de generaie sau timpul de dublare a numrului de celule. Timpul de generaie este intervalul necesar pentru ca o celul tnr rezultat din diviziune, s creasc i s se divid i se msoar n intervalul de timp dintre dou diviziuni. La bacterii, timpul de generaie se exprim n minute sau ore: la B. subtilis, B. megatherium 9-l0 min; la E. coli 20 min; la Lactobacillus l00 min; la levuri 60-l20 min; la parameci 600 min; la Amoeba l400 min; la M. tuberculosis l600 min; la T. pallidum 2000 min. Durata timpului de generaie este diferit de la o specie la alta i este controlat genetic. In funcie de condiiile de mediu, timpii de generaie sunt diferii pentru aceiai linie bacterian. Intr-un mediu optim, timpul de generaie al unei specii se scurteaz, dar crete mult n condiii modificate de mediu. In culturile bacteriene aerobe staionare, n mediul lichid, numrul maxim de celule care se acumuleaz n aceast faz este de 200 milioane/ml. In condiii de agitare, contactul cu nutrienii este favorizat i se realizeaz densiti de l0-20 de ori mai mari. Pentru o celul cu timpul de generaie de 20 de min., dup l32 de diviziuni exponeniale (n mai puin de 48 de ore)va produce 2,2 x 1043 celule progene cu o greutate de 2,2 x l0 31 g, mult mai mare dect greutatea planetei. Aceast capacitate de diviziune ramne numai potenial i se realizeaz numai pentru intervale foarte scurte de timp, deoarece condiiile de mediu devin foarte rapid limitante. Multiplicarea foarte rapid a celulelor bacteriene este o strategie a supravieuirii. In condiii nefavorabile, multiplicarea este nul. In cursul fazei de cretere logaritmic, celulele prezint cateva particulariti: sunt uniforme ca mrime i puin mai mari fa de dimensiunile tipice speciei respective. Se coloreaz omogen deoarece nu conin incluzii i sunt intens bazofile. Intr-o celul care crete, circa 80% din ARN total este ARN ribosomal, iar restul este reprezentat, n cea mai mare parte de ARNt. ARNm, dei ndeplinete funcia de sintez a proteinelor, are o proporie foarte mic din ARN total, deoarece funcioneaz pentru cteva cicluri ale sintezei proteice, dup care, fiind instabil, este degradat. 4) Faza de ncetinire a creterii se caracterizeaz prin diminuarea pregresiv a ritmului de diviziune. Este o faz scurt i la sfritul ei, celulele au ncetat s se multiplice i s creasc. 5) Faza staionar (sau de cretere maximal) este caracterizat prin faptul c numrul total de celule rmne constant, celulele nu se divid, dar numrul celor viabile diminu treptat. Celulele unei culturi n faza staionar nu cresc, nu se divid i sunt considerate ca tipice pentru specia respectiv: dimensiunile lor sunt normale (mai mici dect cele din faza precedent), se coloreaz normal i pe baza comportamentului lor n coloraia Gram sunt atribuite grupului Gram pozitive sau Gram negative. In celule apar substane de rezerv, vacuole spori. Faza staionar corespunde platoului curbei de cretere. Durata ei este variabil: n mediile sintetice este scurt. Oprirea creterii este datorat epuizrii unui compus nutritiv esenial, denumit limitant al creterii. Dac componentele minerale ale mediului sunt n exces, compusul limitant este de obicei energetic. In cazul bacteriilor auxotrofe, n prezena componentelor minerale i energetice, oprirea creterii se datoreaz epuizrii unui factor de cretere. 6) Faza de declin a culturii este ilustrat grafic de panta descendent a curbei. Masa celular scade progresiv datorit fenomenului de liz. Cu o rat similar scade numrul celulelor viabile. Cele care nu sporuleaz, mor i se lizeaz. Morfologia celulelor este alterat. Intr-o cultur de bacili apar forme atipice: sferice, filamentoase, ramificate. Celulele contin substane de rezerv, vacuole. Afinitatea pentru coloranii bazici diminu treptat, odat cu scderea cantitii de ARN. Sunt celule mbtrnite. Numrul lor diminu treptat, iar pentru speciile nesporulate tinde repede spre 0 i cultura se sterilizeaz. Creterea colonial. Bacteriile diseminate individual sau ca grupri elementare pe suprafaa sau n masa unui mediu nutritiv agarizat, se divid i formeaz o colonie bacterian. Fiecare colonie, izolat spaial de vecinele sale, constituie o clon celular. Numrul celulelor ntr-o colonie depinde de talia celulelor i de rata lor de cretere. Numai celulele situate la periferia coloniei, n contact cu mediul nutritiv sunt metabolic active. Dac dup fiecare diviziune, cele dou celule surori se separ complet, colonia va lua o forma regulat: sferic sau de lentil biconvex, pentru cea inclus n grosimea gelozei i o form bombat, neted, pentru cea de pe suprafaa agarului. Acestea sunt colonii S(Smooth). Dac celulele surori ader unele de altele, aspectul coloniei devine neregulat, cu suprafaa ncreit, rugoas, proprie coloniei de tip R (Rough).

Msurarea creterii se face prin determinri cantitative a doi parametri: masa celular i numrul de celule. Ambele msurtori se raporteaz la un volum fix de mediu, de exemplu la 1 ml. Masa celular i numrul de celule nu sunt n mod necesare echivalente pentru c masa celulelor individuale poate s varieze, masa total a celulelor crete continuu, iar creterea numrului de celule este discontinu n cazul culturilor sincrone. De obicei, multiplicarea ntr-o populaie mare de celule este asincron i n aceste condiii creterea masei celulare i a numrului de celule sunt echivalente. Metoda direct de msurare a masei celulare este determinarea greutii uscate a celulelor ntr-un volum fix de cultur. In timpul creterii compoziia chimic a materialului celular rmne constant. Masa celular se poate determina prin metode indirecte: msurarea coninutului n C, N sau n proteine. Metodele indirecte mai sensibile pentru estimarea masei celulare sunt determinrile cantitative ale unei enzime particulare sau rata unui proces metabolic cum este respiraia sau fermentaia(de exemplu, rata producerii de acid lactic este folosit ca parametru al creterii bacteriilor lactice). Metoda optim pentru msurarea masei celulare a unei culturi bacteriene este cea optic, ce const n determinarea cantitii de lumin dispersat de o suspensie celular. Capacitatea de dispersie a luminii este proporional cu densitatea suspensiei celulare. Cnd o raz de lumin trece prin suspensie, reducerea cantitii de lumin transmis permite msurarea densitii celulare. Raportul dintre masa de celule n suspensie i densitatea sa optic, pentru un organism dat, se face empiric prin msurarea direct a greutii uscate a celulelor ntr-o prob cu o densitate optic dat. Determinarea numrului de celule se poate face microscopic, numrnd celulele ntr-un volum determinat. Calculul se face cu ajutorul camerelor de numrat. Astfel se determin numrul total de celule dintro sauspensie. Numrarea automat a celulelor se face cu un instrument electronic (coulter counter). O cantitate de suspensie este trecut printr-un orificiu foarte fin. Detectarea celulelor se bazeaz pe diferenele de conductivitate electric ntre celul i mediul de suspensie. Se nregistreaz numrul de celule/unitate de volum. Metoda se utilizeaz pentru numrarea celulelor mari (protozoare, alge), dar numrarea celulelor mici (bacterii) este dificil, deoarece orificiul trebuie s fie foarte mic, iar mediul nu trebuie s conin particule neanimate mici, care pot fi uor nregistrate ca celule bacteriene. Numrarea microorganismelor unicelulare se face prin metoda cultivrii (plate count), pentru c celulele viabile separate spaial una de alta prin dispersie pe sau ntr-un mediu agarizat, prin cretere dau colonii vizibile macroscopic. Metoda permite numai calculul celulelor viabile, deoarece determin numai celulele care cresc i se divid pe un mediu de cultivare. Culturi continui Bacteriile prelevate n faza exponenial sau n faza staionar i transferate pe un mediu identic se divid fr faza de laten. Aceast observaie a stat la baza realizrii sistemelor de cultur continu, n care bacteriile se multiplic cu o rat constant, ntr-un mediu renoit cu o rat constant. Culturile continui se realizeaz n chemostat sau n turbidostat. Funcionarea chemostatului se bazeaz pe principiul diluiei continue a suspensiei de celule, la un volum constant (fig. 46). Mediul proaspt de cretere este adugat cu o rat constanta in recipientul de cultivare. Cu aceiai rat, suspensia celular este recoltat printr-un sifon de supraplin, astfel nct volumul de mediu din recipient rmne constant. Compoziia mediului nutritiv din chemostat nu este optim, dar se pstreaz constant i condiioneaz rata de cretere a microorganismelor, care nu este maximal. Chemostatul permite controlul densitii celulelor i a ratei de cretere a culturii, n funcie de rata renoirii mediului, precum i modelarea creterii microorganismelor n mediile naturale. Turbidostatul se bazeaz pe principiul meninerii constante a densitii celulare (turbiditii) n mediul nutritiv, nregistrat permanent de o celul fotoelectric. Cnd densitatea celular crete, celula fotoelectric emite un semnal, rezultatul fiind deschiderea unei valve prin care mediul proaspt este trimis n recipientul de cretere. De aici, suspensia este recoltat prin mecanismul de preaplin.

Fig. 46. Reprezentarea schematica a unui chemostat.

Densitatea optic a suspensiei este cu att mai mare cu ct lungimea de und a luminii este mai mic. Pentru a evidenia absorbia, msurarea se face cu o surs de lumin, cu lungimea de unda mai mare de 490 nm. Creterea diauxic. In mediile nutritive care conin dou surse glucidice se observ dou tipuri de cretere: - uneori, curba de cretere este similar celei clasice, obinut cu o singur surs glucidic; - alteori, curba de cretere are o denivelare. Faza exponenial observat n prima parte este urmat de un platou i o a II-a faz exponenial, care debuteaz dup perioada de laten a platoului intermediar. Fenomenul a fost descris de J. Monod, (1942) la E. coli, crescut pe un mediu care conine glucoz i lactoz (fig. 47). Creterea culturii are loc n dou faze exponeniale distincte: una corespunztoare creterii pe glucoz, iar cea de a II-a, corespunztoare creterii pe lactoz. In prima faz este utilizat glucoza. Urmeaz o perioad de lag de circa 4 ore i apoi a doua faz de cretere, n cursul creia celulele metabolizeaz lactoza.

Fig 47. Creterea diauxic a culturii de B. Subtilis pe mediu cu glucoz si arabinoz. Glucoza este utilizat in prima perioad de cretere i arabinoza in cea de a doua. ncetarea temporar a creterii dupa 5 ore (marcat ntre 2 sgei) reflect utilizarea complet a glucozei si corespunde perioadei in care are loc sinteza enzimelor necesare pentru utilizarea arabinozei (dupa Monod, 1958).

Fenomenul diauxiei apare numai pentru zaharuri metabolizabile de ctre enzimele inductibile, i nu se manifest cnd mediul conine un amestec de zaharuri metabolizabile sub aciunea enzimelor constitutive. Perioada de laten care urmeaz primei creteri logaritmice corespunde timpului necesar sintezei enzimelor inductibile. Cea mai net cretere diauxic este dat de amestecul de glucoz sau manitol (grupul A), cu arabinoz, xiloz, sorbitol, maltoz sau lactoz (grupul B). Substraturile de tip A inhib sinteza enzimelor inductibile ce catabolizeaz substraturile din grupul B (fenomenul represiei catabolice). Starea fiziologic a bacteriilor n condiii naturale este mult diferit de aceea a bacteriilor cultivate. Chiar n cele mai productive medii aquatice, bacteriile trec alternativ prin starea de eutrofie i cea de nfometare i scurtele perioade de cretere rapid sunt ntrerupte de perioade de non-cretere. In mediile aquatice, starea normal a bacteriilor corespunde fazei staionare a curbei tipice a evoluiei unei culturi bacteriene. Trecerea de la faza exponenial la faza staionar este asociat cu schimbri ample ale morfologiei celulare, ale ratei sintezei macromoleculelor i degradrii, cu modificri ale peretelui celular. Dup un interval al strii fr cretere, celulele pot s intre ntr-o stare de laten metabolic, cu pstrarea viabilitii, dar cu pierderea capacitii de a fi cultivate pe medii minimale.

CAPITOLUL III NUTRIIA BACTERIAN


Pentru cretere sau supravieuire, bacteriile trebuie s gseasc n mediul ambiant, substane nutritive cu rol energetic, cu rol structural i uneori, nutrieni specifici (factori de crestere), cu rol funcional esenial. Ele trebuie s se

gseasc n concentraii adecvate, deoarece concentraiile mari exercit efecte toxice. Unele substane au numai rol energetic, iar altele au att rol structural ct i energetic. Substanele energetice sunt oxidate in metabolismul celular i elibereaz energia. Ele pot fi minerale sau organice i au rolul de donatori de electroni sau de H, n cursul reaciilor catabolice. Cunoaterea exigenelor nutritive ale diferitelor bacterii este important pentru clasificarea bazat pe natura sursei energetice, pentru prepararea mediilor selective (cele care conin o singur surs energetic, utilizat de unul sau de cteva tipuri de bacterii). De exemplu, un mediu sintetic care conine numai triptofanul ca surs de carbon i energie permite creterea numai a celulelor de E. coli. In funcie de proporia n care substanele nutritive sunt necesare, se disting dou grupe: macronutrieni i micronutrieni. Categoria substanelor macronutritive, cu rol structural i funcional cuprinde: - sursa de azot, sub forma NH3 sau a srurilor de amoniu n soluie, pe care le asimileaz majoritatea bacteriilor. Amoniul este asimilat direct n glutamin i glutamat, donorii eseniali pentru reaciile de biosintez. Din punct de vedere energetic, procesul este cel mai convenabil. Sursele organice (aminoacizii) trebuie s fie mai nti degradate la amoniu, iar sursele anorganice (nitratul, nitritul sau N2) trebuie reduse la amoniu, nainte de a fi asimilate. Puine bacterii folosesc nitratul, nitritul sau un compus azotat organic (aminoacizi, amine); - sursa de carbon. Pentru majoritatea bacteriilor, sursa de carbon asimilabil este un substrat organic. Un numr restrns de specii utilizeaz CO2 ca surs de carbon asimilabil. Compuii organici cu carbon au rol dublu, fiind in acelai timp utilizai ca substrat energetic oxidabil dar i ca surs de carbon asimilabil, o parte fiind degradat pentru a produce energie, iar o alt parte este asimilat pentru biosinteze; - substanele minerale cele mai importante sunt: HPO42-, SO42-, Cl-, K+, Na+, Mg2+. Ionii minerali intr n alctuirea unor enzime sau a unor molecule cu rol de coenzime. Fosforul, sub forma fosfailor este folosit pentru sinteza acizilor nucleici i a fosfolipidelor. Majoritatea microorganismelor utilizeaz fosfatul anorganic (PO4), iar fosfaii organici, dei apar frecvent n natur sunt utilizai numai dup aciunea fosfatazelor, care elibereaz fosfatul anorganic. Sulful are rol structural, fiind component al unor aminoacizi (cisteina, metionina) i a unor vitamine (tiamina, biotina, acidul lipoic). Sulful este preluat sub form de SO42- sau sulfid (S2-). Potasiul are rol n activarea unor enzime, chiar a celor implicate n sinteza proteic. Magneziul stabilizeaz ribosomii, acizii nucleici i este necesar pentru activitatea multor enzime, inclusiv a fosfotransferazelor. Calciul are rol n stabilizarea peretelui celular bacterian i este un component esenial al endosporului bacterian. Sodiul este necesar pentru creterea bacteriilor halofile, n concentraii apropiate de limita solubilitii NaCl n ap. Unele sunt oligoelemente, necesare n concentraii foarte mici (Cu, Ni, Se, Mo, Mn, Fe, Co) i sunt aduse odat cu impuritile altor compui minerali. Ionii minerali intr n alctuirea unor enzime sau a unor molecule cu rol de coenzime. Fierul se gsete in enzimele celulare cu rol n respiraie (citocromi). Cobaltul este necesar numai pentru sinteza vitaminei B12. Dac vitamina se adaug n mediu, Co nu mai este necesar. Zincul are rol structural in molecula unor enzime: anhidraza carbonic, alcool-dehidrogenaza, ARN- i ADNpolimeraza i influeneaz sinteza ARN. Pare s modifice i s stabilizeze membrana celulei, formnd mercaptide cu gruprile thiol ale proteinelor i interacioneaz cu gruprile fosfat ale fosfolipidelor i COOH ale acidului sialic. Molibdenul se gsete n enzimele denumite molibdoproteine, cu rol n reducerea asimilatorie a nitratului. Se gsete in nitrogenaz, enzima care catalizeaz reducerea N2 n procesul fixrii biologice. Cuprul intr n alctuirea unor enzime respiratorii. Manganul este activator al unor enzime ce acioneaz asupra compuilor ce conin fosfat. Se gsete n unele enzime SOD (enzime ce detoxific formele toxice ale O2). Nichelul intr in alctuirea hidrogenazelor, cu rol de producere sau de nglobare a H2, Tungstenul (Wolframul) i seleniul sunt necesare bacteriilor care cliveaz formiatul. Seleniul este parte a enzimei formiat-dehidrogenaz. Apa reprezint 80-90% din greutatea unor bacterii i este o component obligatorie a mediului nutritiv. Tipuri de nutriie a microorganismelor Tipurile trofice sau de nutriie a bacteriilor sunt condiionate direct de capacitile de biosintez. La rndul lor, activitile biosintetice sunt expresia complexitii aparatului enzimatic celular. Pentru a defini tipul de nutriie a unui microorganism trebuie luate in consideraie mai multe criterii: - capacitatea de a face biosinteza metaboliilor eseniali;

sursa dominant de energie utilizat n procesele de biosintez; natura substratului folosit ca sursa reductoare. Dup natura sursei de C, care reflect capacitatea de a face biosinteza metaboliilor eseniali, bacteriile pot fi: - autotrofe - heterotrofe. Microorganismele autotrofe folosesc CO2 ca unic sau principal surs de carbon celular, iar cele heterotrofe folosesc substanele organice, att ca surs de carbon pentru biosinteze, ct i ca surs de energie. Marea varietate a tipurilor nutriionale ntlnite la microorganisme nu poate fi exprimat numai n funcie de natura sursei de carbon, fapt care a impus utilizarea unor noi criterii. In funcie de sursa dominant de energie, bacteriile se pot grupa n dou categorii: - cele fototrofe (fotosintetizante) utilizeaz energia fotonic (luminoas), pe care o convertesc n energie chimic, sub forma legturilor macroergice din ATP; - cele chemotrofe (chemosintetizante) i obin energia prin reacii de oxido-reducere ale substratului chimic organic sau anorganic. In funcie de natura substratului folosit ca surs reductoare (donator de H+ sau de e-), microorganismele chemotrofe prezint dou tipuri de metabolism energetic: - unele sunt litotrofe (litos, grec = piatr), adic utilizeaz ca donori de e-, diferite substane anorganice (H2, H2S, So, S2O32- (tiosulfat), Fe2+, NO2-, NH3), pe care le oxideaz (la ap, sulfat, Fe 3+ i respectiv NO3), n reacii exergonice cuplate cu sinteza ATP; - altele sunt organotrofe, deoarece, ca donori de e- folosesc diferii compui organici. In funcie de natura sursei de carbon, a sursei de energie i a substratului donor de potenial reductor (H sau e-) se disting urmtoarele tipuri de nutriie: - nutriia fotolitotrof; sursa de carbon este CO2, cea de energie este radiaia luminoas, iar donorul de H este un compus anorganic (H2S, S0, H2, H2O). Aceast modalitate de nutriie este caracteristic bacteriilor fotosintetizante din familiile Chromatiaceae, Chlorobiaceae, dar i pentru grupul Cyanobacteria, care fac fotosinteza dup mecanismul molecular al fotosintezei plantelor superioare; - nutriie fotoorganotrof; sursa de carbon este un compus organic (acizi grai, acizi organici sau aminoacizi, glucide, alcooli i chiar compui aromatici), care are rol i de donor de potenial reductor (H+), iar sursa de energie este radiaia luminoas. Acest tip de nutriie este caracteristic bacteriilor purpurii nesulfuroase din familia Rhodospirillaceae. - nutriie chimiolitotrof; sursa predominant de carbon este CO2. Potenialul reductor este furnizat prin reaciile de oxidare a unor compui anorganici (NH3, NO2, H2S, S0, Fe2+, H2), care au rolul de donori de protoni (H+). Nutriia chimiolitotrof este caracteristic exclusiv unor grupe de bacterii: nitrat- i nitritbacterii, ferobacterii, bacteriile acetogene i metanogene sau cele care oxideaz CO; - nutriia chimioorganotrof; sursa de carbon o constituie compuii organici, care au i rol de donor de potenial reductor. Prin oxidarea lor se elibereaz energia necesar proceselor de biosintez. Majoritatea bacteriilor sunt chimioorganotrofe: Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Lactobacillus, precum i toate bacteriile patogene sau potenial patogene. Nutriia autotrof Autotrofia nu se refer la natura sursei de energie folosit, ci la sursa de C. Autotrofia definete capacitatea unor organisme de a face sinteza materiei organice din substane anorganice. Este o modalitate de nutriie a unor microorganisme care utilizeaz CO2 ca unic sau principal surs de C, pe care l reduc la aldehid 3-fosfogliceric. Sursele de azot sunt compui simpli: NH4+, NO2- sau chiar N2 molecular. Bacteriile autotrofe (fotolitotrofe i chimiolitotrofe) au capaciti mari de biosintez. Ele sintetizeaz toi metaboliii necesari, pornind de la surse anorganice de carbon i azot. Energia necesar reducerii CO2 la compui organici este eliberat prin oxidarea unor compui anorganici: CO, NH3, NO2, Fe2+, H2S, So, S2O32-, H2 sau este chiar energia luminoas. Energia eliberat prin oxidarea compuilor chimici anorganici sau cea luminoas este stocat n ATP i utilizat pentru reaciile de reducere. Fotosinteza

Fotosinteza este procesul biologic de transformare a energiei luminoase, n energie de legtur chimic, utilizabil n reaciile de biosintez. Organismele fotosintetizante datoreaz aceast capacitate, prezenei unor pigmeni sensibili la lumin, denumii clorofile. Majoritatea organismelor fotosintetizante sunt autotrofe, capabile s utilizeze CO2 ca singur surs de carbon. Energia luminoas este convertit ntr-o serie de reacii, n energie chimic sub forma ATP i a potenialului reductor sub forma NADPH. Cele dou tipuri de molecule, ntr-o succesiune de reacii, convertesc CO 2 la glucoz, dup urmtoarea reacie global:

Fotosinteza este rezultatul a dou tipuri de reacii: reacii fotochimice la lumin i reacii la ntuneric. Reaciile la lumin. Clorofila absoarbe energia luminoas i o convertete n energie chimic sub form de ATP i de NADPH ca potenial reductor al CO2 (fig. 48). Molecula de clorofil excitat i energizat dup absorbia cuantei de lumin, elibereaz un e-, care este acceptat indirect* de feredoxin sau de bacteriofeofitin (o bacterioclorofil a, fr Mg), ambele puternic reductoare, cu potenial redox sczut. Transferul de electroni de la clorofil, la unul dintre reductori constituie treapta conversiei luminoase n energie chimic.
*

Acceptorul primar de e-, al fotosistemului I nu a fost identificat. Ar putea fi un radical liber al clorofilei a. Acceptorul primar devine un reductor suficient de puternic pentru a reduce feredoxina, care la rndul ei reduce NADP+ la NADP.

Sarcina pozitiv a moleculei de clorofil oxidat (dup pierderea unui e-) este neutralizat de un alt e-, originar dintr-un citocrom situat pe cealalt fa a membranei. Astfel, ntre citocromul oxidat i feredoxina redus se creeaz o mare diferen de potenial electrochimic, a crui energie poate fi utilizat n dou moduri: - pentru a converti ADP la ATP, prin intermediul transportorilor de e-; - pentru reducerea NADP la NADPH, utilizabil n reaciile de biosintez. In reaciile la ntuneric, energia stocat n ATP i NADPH este utilizat pentru a converti CO 2 i H+ n glucoz i H2O:

Fig. 48. Reprezentarea schematic a reaciilor la lumin i la ntuneric.

In fotosinteza plantelor superioare i a cianobacteriilor, e- pierdut de molecula de clorofil este recuperat pe seama oxidrii apei; Rezultatul net al fotosintezei oxigenice este transferul ionilor de H+ din molecula apei, la CO2, printr-un proces de oxido-reducere n care apa este oxidat, iar CO2 este redus. Potenialul redox al apei este + 0,81 V, net pozitiv fa de 0,42 V al acceptorului intermediar necunoscut. De aceea, transferul de e- nu se poate face direct ntre H 2O i CO2. H2O nu poate reduce CO2, dar nici nu poate fi oxidat de CO2. Energia furnizat de o singur cuant de lumin nu este suficient acestui proces. Este necesar energia furnizat de dou cuante, prin excitarea a doi centri de reacie la lumin. Cei doi centri de reacie ai clorofilei fotoactivate sunt legai n serie ca o pereche de baterii electrice i formeaz fotosistemele I i II. Ei absorb radiaii luminoase cu lungimi de und uor diferite. Fotosistemul I al clorofilei, denumit P700, absoarbe radiaiile din domeniul rou ndeprtat, iar

fotosistemul II, (P680) absoarbe radiaiile cu lungime de und mai scurt. Ambele fotosisteme sunt variante ale clorofilei a. Fotosistemul I realizeaz un transport ciclic al e- , n cursul cruia se sintetizeaz ATP i se genereaz NADPH (fotofosforilare ciclic). Circuitul e- este ciclic, adic e- se rentorc pe molecula clorofilian de origine, dup ce au parcurs un traseu format din cupluri redox. Fotosistemul II are ca funcie principal, fotoliza apei i particip la procesul de fotofosforilare neciclic. Electronii neciclici pierdui de molecula de clorofil sunt nlocuii cu e- din ionii OH-, rezultai prin fotoliza apei. Molecula de clorofil P680, excitat de o cuant de lumin, reduce un intermediar necunoscut (probabil feofitina a o clorofil a fr atomul de Mg). Electronii nu se mai ntorc pe molecula de origine a fotosistemului II, ci intr n circuitul fotosistemului I (fig. 49).

Fig. 49. Schema Z a fluxului de electroni n fotosinteza oxigenic a plantelor, algelor i a cianobacteriilor. Cele dou fotosisteme (I i II) sunt legate n serie. I = acceptorul intermediar neidentificat al fotosistemului II ; PQ = plastoquinona ; Cit = citocrom ; X = acceptorul neidentificat al electronilor n fotosistemul I; Fd = feredoxina ;. P680 i P700 sunt centrii clorofilieni de reacie ai fotosistemului II i respectiv I (dup Brock, 1988).

Cianobacteriile realizeaz o fotosintez oxigenic, asemntoare ca mecanism, cu a plantelor superioare. Celulele vegetative posed ambele fotosisteme (I i II), iar heterochitii au numai fotosistemul I (nu fotolizeaz apa). Cele dou fotosisteme, n mod normal funcioneaz corelat. In anumite condiii, unele cianobacterii realizeaz o fotosintez anoxigenic, prin funcionarea numai a fotosistemului I, obinnd potenialul reductor din alte surse dect apa (ca i bacteriile verzi i purpurii). Reducerea CO2 are loc n condiii de anaerobioz. Ca donori de e- folosesc H2S (pe care-l oxideaz la So extracelular) sau folosesc H2 pe care-l oxideaz sub aciunea unei hidrogenaze de nglobare. Potenialul reductor rezultat de oxidarea H2S sau H2 reduce NADP la NADPH. In condiii naturale, H2S este un inhibitor al fotosistemului II i al fotosintezei oxigenice, dar induce sinteza unei enzime care permite cuplarea reducerii fotosintetice a CO2, cu oxidarea H2S la So. Aceast reacie are loc n celulele de Oscillatoria limnetica, care face numai fotosintez anoxigenic. Fotosinteza bacterian

Bacteriile fotosintetizante sulfuroase verzi (familia Chlorobiaceae, g. Chlorobium) sunt strict anaerobe i folosesc H2S ca donor de e-. Rezult So, pe care l oxideaz la sulfat. Nu conin niciodat incluzii celulare de So. Reacia global a oxidrii H2S este urmtoarea: Bacteriile fotosintetizante purpurii sunt sulfuroase (Thiorhodaceae = Chromatiaceae) i nesulfuroase(Athiorhodaceae = Rhodospirillaceae). Bacteriile sulfuroase purpurii (Chromatiaceae) oxideaz H2S, la So elementar, pe care-l depoziteaz n spaiul periplasmic. Dup epuizarea H2S, So este oxidat la SO42-. Ele oxideaz i ali compui ai S, n special tiosulfatul (S2O32-), H2 i chiar substraturi organice (acizi dicarboxilici, acizi grasi, piruvatul). Ultimii au rolul nu numai de donori de e-, ci sunt utilizai si ca surse secundare de carbon, sursa principal rmnnd CO2. Bacteriile sulfuroase purpurii se gsesc n zonele anoxice iluminate ale mediilor aquatice unde se acumuleaz H2S, precum i n izvoarele sulfuroase care conin H2S de origine biologic sau geochimic. Mediile cele mai favorabile pentru dezvoltarea bacteriilor sulfuroase sunt lacurile meromictice (permanent stratificate), datorit densitii diferite a apei: n stratul inferior apa este salin, iar n partea superioar este ap dulce. Dac n stratul inferior este o concentraie suficient de SO 42-, prin reducerea respiratorie (anaerob) se formeaz H 2S, care difuzeaz spre zona iluminat, unde se dezvolt bacteriile sulfuroase purpurii i verzi. Bacteriile purpurii nesulfuroase (Rhodospirillaceae) n absena luminii oxideaz H2, sau diferii compui organici (acizi organici, alcooli, glucide, compui aromatici), pe care i utilizeaz att ca donori de e- ct i ca surse de carbon. In anoxie realizeaz un metabolism anaerob sau de tip fermentativ, iar n aerobioz au un metabolism respirator. S-au denumit nesulfuroase deoarece s-a considerat c nu pot utiliza H2S ca donor de potenial reductor pentru reducerea CO2. Ulterior s-a evideniat c majoritatea speciilor utilizeaz H2S, dar tolereaz concentraii mai mici. La lumin sunt fotoorganotrofe i cresc n condiii de anaerobioz. Pentru nutriia fototrof necesit aceiai compui organici (acizi organici, alcooli, glucide, compui aromatici) Bacteriile fotosintetizante posed un pigment fotosintetic particular, denumit bacterioclorofil, repartizat n mici uniti elementare denumite cromatofori, dispersai n citoplasma bacterian. In fotosinteza bacterian, conversia cuantei de lumin n energie de legtur chimic evolueaz ca o fotofosforilare ciclic, n care se sintetizeaz ATP i se genereaz baze nucleotidice piridinice reduse (NADPH). Sinteza ATP i generarea NADPH implic transportul e- printr-o caten de transport, localizat n membranele suport ale pigmenilor fotosintetizani. Transportorii de e- ai catenei au localizare membranar i sunt cuplai n serie, n ordinea creterii potenialului redox. Unele componente ale catenei de transport al e- n fotosintez se regsesc n catena de respiraie. In fotosinteza bacterian, transportul e- este ciclic. Fluxul de e- i are originea n molecula de bacterioclorofil. Clorofila n repaus are un potenial redox pozitiv i trebuie s reduc o molecul acceptoare cu potenial redox foarte sczut. Este un transfer mpotriva gradientului termodinamic. Absorbia unei cuante de lumin mrete potenialul energetic al clorofilei i o transform ntr-un reductor puternic. Electronul moleculei de clorofil este cedat unui acceptor intermediar neidentificat (probabil, bacteriofitinei a, o bacterioclorofil a fr Mg). Intermediarul este un reductor puternic (cu potenial redox negativ) i transfer e- unor componente cu poteniale redox progresiv mai mici (quinona, citocromi). Transferul este nsoit de eliberarea energiei. Sub aciunea ATP-azei, care cupleaz scderea potenialului redox, cu sinteza ATP, energia este stocat n molecula de ATP. Electronul se rentoarce pe molecula de origine i o readuce la potenialul redox iniial. Centrul de reacie al bacterioclorofilei este echivalent fotosistemului I de la plantele superioare i de la cianobacterii. Pentru fixarea CO2, energia furnizata de ATP sintetizat sub actiunea ATP-azei nu este suficient. Reducerea CO2 necesit un potenial reductor sub forma NADPH. Dar bacteriile nu fac fotoliza apei. NADPH este furnizat prin oxidarea compuilor redui ai S (H2S, Na2S2O32-, So), a H2 sau a compuilor organici (succinat, malat, butirat). Toate aceste molecule au un potenial redox negativ, dar mai puin negativ dect al cuplului NADP/NADPH. Oxidarea lor este cuplat cu generarea NADPH. Electronii rezultai din oxidarea lor intr n catena de transport a fotosintezei, la nivelul citocromilor i reduc NADP la NADPH, cu consum de ATP. Transportul e- de la donorii exogeni la un acceptor (NADP+), cu potenial redox foarte sczut se numete transport inversat. El are loc cu consum de ATP i este necesar fixrii reductive a CO2. ATP necesar reducerii NADP la NADPH corespunde consumului energetic al reducerii CO2. De exemplu, creterea n prezena H2S este nsoit de formarea S elementar, care rmne la exteriorul celulelor bacteriene sulfuroase verzi sau este depozitat intracelular de cele purpurii (fig. 50).

Fig. 50. Fluxul de electroni n fotosinteza anoxigenic a bacteriilor. P870 = centrul de reacie al bacterioclorofilei; Bph = bacteriofeofitina; Q = quinona; Cit = citocrom (dup Brock, 1988)

Fotosinteza bacterian este un proces foarte restrns n natur, dar probabil a fost foarte important in atmosfera primar a planetei, lipsit de O2, bogat n H2 i a contribuit la acumularea substanelor organice. Nutriia chimiolitotrof Nutriia chimiolitotrof, cunoscut exclusiv la bacterii, are un rol deosebit de important n natur, deoarece reoxideaz anumii compui minerali i i reintegreaz n circuitul natural. Procesele de oxidare a unor substraturi anorganice sunt specifice anumitor tipuri de bacterii specializate sub raport fiziologic, Gram negative, adeseori mobile, unele strict aerobe. Substratul anorganic oxidat are rolul de surs de e- (potenial reductor), pentru reducerea CO2, utilizat ca surs de carbon. Acceptorul final de e- este O2. Metabolismul chimiolitotrof de obicei implic procese respiratorii aerobe. Chimiolitotrofele au caten transportoare de e- asemntoare cu acelea ale chimioorganotrofelor i genereaz fora protonmotrice care determin sinteza ATP.

Fig. 51. Reprezentarea schematic a fluxului de electroni i a CO2 la bacteriile chimiolitotrofe.

Bacteriile care oxideaz hidrogenul (hidrogen-bacteriile) H2 este substratul pentru creterea unei mari diversiti de bacterii. Cele H 2-oxidante (Pseudomonas, Alcaligenes etc.) cresc cu H2 i CO2 ca unic surs de energie i respectiv C, n prezena O2. Sunt litotrofe facultative deoarece bacteriile hidrogen-oxidante comut alternativ ntre metabolismul chimiolitotrof i cel chimio-organotrof deoarece cresc pe o gam larg de substraturi organice, pe care le oxideaz i le utilizeaz ca donori de e- i ca surse de carbon, dar totdeauna i pstreaz capacitatea de nutriie chimiolitotrof prin oxidarea H 2 i de a face asimilarea reductiv a CO2 pe calea ciclului Calvin (calea ribulozo-fosfatului), dup urmtoarea reacie global:

H2 este oxidat, iar O2 este acceptorul final de e-, dup reacia global: Cele mai multe hidrogen-bacterii cresc chimioautotrof prin oxidarea H2 n condiii de microaerobie(5-10% O2), deoarece hidrogenazele sunt sensibile la O2. Energia rezultat este folosit pentru reducerea CO2 la compui organici. Organismele care folosesc un compus anorganic ca surs de energie i un compus organic ca surs de carbon se numesc mixotrofe. Cnd cresc autrotrof, hidrogen-bacteriile fixeaz CO2 prin seria de reacii a ciclului Calvin, iar cnd cresc heterotrof, enzimele ciclului Calvin sunt represate i se induce sinteza enzimelor implicate n oxidarea compusului organic. Hidrogen-bacteriile conin totdeauna n echipamentul lor enzimatic, una sau dou hidrogenaze*, enzime care leag H2 i l oxideaz, fie pentru a produce ATP sau l utilizeaz ca potenial reductor pentru creterea autotrof.
*

In funcie de metalele componente ale situsului activ, hidrogenazele sunt clasificate n 3 grupe: cu NiFe, cu Fe si fr metale. Majoritatea hidrogenazelor bacteriene conin NiFe.

Unele sunt hidrogenaze legate de membrana citoplasmatic (sau particulate), iar altele au localizare citoplasmatic (sau solubile). Hidrogenazele legate de membran au rol n metabolismul energetic. Dup legarea H2 la situsul activ al enzimei, molecula este oxidat, protonii sunt transferai pe catena de respiraie pn la O2. Hidrogenazele citoplasmatice au rol n generarea potenialului reductor pentru creterea autotrof. Ele preiau H2 i reduc NAD+ la NADH. Acesta este fosforilat, iar NADPH este utilizat ca reductor n ciclul Calvin. Uneori hidrogenaza este bidirecional: oxideaz H2 i rezult H+ sau reduce H+ i rezult H2 Hidrogenazele oxideaz H2 numai la concentraii mai mari dect cele din atmosfer: n rizosfera plantelor de orez, n izvoarele geotermale, n platformele de material vegetal n descompunere, n nodozitile fixatoare de N 2, pentru c bacteroizii nu au Hup (hidrogenaza de nglobare). Toate bacteriile fixatoare de N2 au o hidrogenaz care oxideaz H2. Ele contribuie la diminuarea pierderii potenialului reductor sub form de H2 n nodozitile fixatoare de N2 ale rdcinilor plantelor leguminoase. Rolul ei este de a readuce n fluxul energetic al celulei, H2 care rezult din activitatea nitrogenazei.

H2 este utilizat ca substrat pentru cretere de diferite bacterii anaerobe, n special metanogene, pentru c este precursor al CH4, n solul anoxic. Multe bacterii heterotrofe oxideaz H2, folosindu-l ca potenial reductor, dar nu ca unic surs de energie (de exemplu, E. coli, Azospirillum). Bacteriile carboxidotrofe. CO este un poluant atmosferic*. Degajarea CO din gazele de ardere ale automobilelor, din arderea incomplet a combustibililor fosili i din catabolismul ligninei se produce n mediul aerob. Contribuia sistemelor biologice la producerea CO este minor.
La om, expunerea la nivelul urban al CO (100 ppm) i formiat provoac simptome variate, interpretate greit ca viroze respiratorii. Toxicitatea acut se produce consecutiv expunerii la concentraii mai mari, prin acumularea produselor de ardere n spaii nchise. CO are afinitate special pentru atomii de metal legai de proteine. Toxicitatea CO pentru om se atribuie afinitii nalte pentru toate proteinele ce conin Fe hemic, scznd capacitatea hemoglobinei de a lega O2. CO este inhibitor al enzimelor cu Fe nehemic, inclusiv hidrogenaza i nitrogenaza. Mamiferele produc CO endogen prin degradarea hemului. Hbg discrimineaz ntre CO endogen i exogen. Fr discriminare, CO de origine endogen s-ar lega cu 20% din proteinele cu hem din organism.
*

Indeprtarea CO este, n primul rnd, rezultatul oxidrii fotochimice, dar este utilizat ntr-o msur semnificativ de ctre microorganisme. Unele hidrogen-bacterii, un grup fiziologic foarte specializat, folosesc CO ca unic surs de energie i l oxideaz sub aciunea carbon-monoxid-dehidrogenazei (enzim cu Mo), la CO2, pe care l fixeaz n reaciile ciclului Calvin. Electronii care deriv din oxidarea CO intr n catena transportoare, la nivelul creia se sintetizeaz ATP. S-au definit dou sisteme microbiene care utilizeaz CO: unul aerob i altul anaerob. Deoarece CO are afinitate mare pentru Fe diferitelor enzime, bacteriile carboxidotrofe aerobe (Ps.carboxydomonas, Alcaligenes carboxydomonas) cupleaz oxidarea CO, cu respiraia insensibil la CO, dup reacia global:

Enzima care oxideaz CO conine Mo. Consumul CO de ctre microorganisme este un proces ecologic foarte semnificativ, deoarece o cantitate mare de CO este generat din diferite surse, dar concentraia sa n aerul atmosferic n-a crescut corespunztor. Bacteriile carboxidotrofe din straturile superficiale ale solului reprezint probabil cea mai semnificativ capcan pentru CO n natur. Alte bacterii care oxideaz CO sunt cele acetogene. Ele catalizeaz aceiai reacie, cu o enzim (COdehidrogenaz) ce conine Ni, enzim care se gsete i la bacteriile sulfat-reductoare. CO este consumat de bacteriile metanogene care au CO-dehidrogenaz cu Ni i de bacteriile fototrofe care hidrolizeaz CO cu H2O i rezult H2 + CO2. In afar de oxidarea bacterian, CO poate fi oxidat de monooxigenaze, fr s fie folosit pentru creterea bacterian. Bacteriile metanogene Unele bacterii metanogene oxideaz H2 i utilizeaz e- i energia rezultat pentru reducerea CO2, la compui glucidici i CH4. Sunt organisme strict anaerobe. Metanul este cel mai redus compus organic i este rezultatul final al reaciilor de reducere pe care le realizeaz bacteriile metanogene. Procesul are loc n mediile anaerobe: rumenul ierbivorelor, intestinul terminal al termitelor, n digestoarele (bazinele instalaiilor n care se face epurarea) de ape menajere, n sedimentele apelor marine i dulci. O trstur fiziologic important a metanogenelor este aceea c folosesc un numr limitat de substraturi simple pentru metanogenez i au necesar crescut de Ni. Unele metanogene, folosesc numai amestecul de H2 i CO2, dar multe oxideaz formiatul, iar cteva oxideaz CH3COOH, CH3OH sau CH3NH2 (metilamina), dar nu folosesc CO2 i H2. Bacteriile metanogene din g. Methanobacterium, Methanosarcina, Methanospirillum) produc metan printr-o reacie definitorie i caracteristic grupului: reducerea CO2 ntr-o reacie n care H2 este utilizat ca donor de e-. H2 este oxidat ntr-o reacie productoare de energie:

Circa l/3 din cantitatea de CH4 produs n natur se formeaz prin aceast reacie, restul avnd originea n grupul metil al acetatului. Metanobacteriile sunt chimiolitotrofe, deoarece se dezvolt ntr-un mediu care conine o soluie mineral apoas i o atmosfer format din CO2 i H2. Mecanismele reducerii CO2 pentru sinteza compuilor organici nu se cunosc.

Bacteriile metanogene produc CH4 nu numai prin reducerea CO2, ci i prin oxidarea unor substraturi organice, precursoare directe ale CH4:

Formiatul este un substrat energetic utilizat de multe bacterii metanogene, rezultnd prin clivarea piruvatului la acetil-CoA i formiat. Formiatul nefiind un precursor direct al metanului, este mai nti oxidat la CO2 i H2 :

In cea de a II-a treapt, CO2 este redus la CH4. Cele mai bune substraturi naturale pentru producerea CH4 sunt CO2, H2 i acetatul. Metanogenele utilizeaz H2 de origine abiogen, component al fluidului geotermal. Alt surs abiogen de H2 este Fe metalic, care sufer spontan reacia chimic: In mediile naturale, CH4 i CO2 se formeaz ca rezultat al degradrii materiei organice n condiii anoxice i cu cantitate limitat de NO3-, SO4- sau Fe3+. Metanogeneza este un proces tipic de acceptare a e- terminali n procesele de descompunere a materiei organice din apele dulci, din mlatini, orezrii, din tractul digestiv al rumegtoarelor. CH4 este rezultatul cooperrii metabolice a cel puin trei grupe fiziologice de bacterii ce formeaz un lan trofic, n care acetatul este principalul intermediar metabolic: bacterii fermentative primare, secundare i dou tipuri de metanogene. Intr-o prim etap, polimerii (polizaharide, proteine, acizi nucleici, lipide) sunt convertii la oligomeri i monomeri (glucide, aminoacizi, purine, pirimidine, acizi grai i glicerol) sub aciunea enzimelor hidrolitice extracelulare, produse de bacteriile fermentative primare. Ele fermenteaz monomerii rezultai, la acizi grai, succinat, acetat, lactat, alcooli. Unele produse de fermentaie (acetatul, H2, CO2 i ali compui C1) pot fi convertii direct de bacteriile metanogene la CH4 i CO2. Degradarea altor produse de fermentaie (acizii organici cu caten mai lung de 2 atomi de C, alcoolii care conin mai mult dect un atom de C i a compuilor aromatici), este catalizat de fermentatorii secundari, reprezentai de bacteriile sulfat reductoare. Ele convertesc substratul la acetat, CO2, H2 i uneori formiat, pe care le utilizeaz metanogenele. Bacteriile metanogene realizeaz treapta final a lanului trofic anaerob, producnd CH4 din, acetat sau din CO2 i H2. Din aceast cauz, n cele mai multe habitate, metanogenele depind de convieuirea n asociaii cu alte bacterii anaerobe care convertesc materia organic complex la precursorii metanului. Degradarea substanei organice cu formare de CH4 este un proces care elibereaz o cantitate mic de energie, comparativ cu respiraia aerob sau anaerob, pentru c metanogeneza este ultima treapt care are loc dup ce au fost redui ali acceptori de e-. CH4 ca produs de fermentaie, depoziteaz o parte important a energiei disponibile n substratul iniial, care este eliberat prin oxidarea aerob a CH4 de ctre bacteriile metan-oxidante. Cantitatea mic de E disponibil pentru conversia materiei organice la CH4, oblig microorganismele participante la o cooperare foarte eficient. Cooperarea lor este att de accentuat, nct nu pot exista unele fr altele i se numete relaie sintrofic. Avantajul este c organismele sunt specializate metabolic, dar eficiena metabolic a asociaiei depinde de eficiena transferului metaboliilor ntre parteneri: fluxul H2 ntre cele care-l produc i metanogenele care-l consum este invers proporional cu distana dintre ele. Transferul optim al metaboliilor se face cnd cei doi parteneri se gsesc n contact strns, adic sunt ataai unul de cellalt i formeaz un agregat celular sau flocon. Astfel de flocoane se formeaz n digestoarele anaerobe ale apelor uzate, n care sunt degradai acizii grai. Importana ecologic a bacteriilor metanogene Bacteriile metanogene realizeaz importante reacii terminale n habitatele anaerobe, modificnd semnificativ proporia produselor finale ale proceselor fermentative. Ele intr n competiie cu alte bacterii consumatoare de H2: cu cele sulfat-reductoare i cu cele acetogene.

Analiza gazelor coninute n stratul de ghea din Groenlanda arat c valoarea concentraiei atmosferice a CH4 a fost stabil (0,7 ppm) pe o perioad de circa l0 milenii, dar a crescut constant n ultimii l50-250 de ani, ajungnd la l,6 ppm. CH4 produce un puternic efect de ser. Dei reprezint numai 0,5% din cantitatea de CO2, CH4 contribuie cu circa 25% din efectul de ser. CH4 are rol n reaciile chimice din stratosfer, care duc la formarea i distrugerea O3. Sursele de CH4 sunt biogene i abiogene. O contribuie deosebit o au bacteriile metanogene din rumenul rumegtoarelor, ca i descompunerea deeurilor menajere i vegetale. Orezriile, ca i inuturile naturale umede (turbriile, tundra) sunt surse importante de CH4. Recuperarea i arderea CH4 rezultat din degradarea materiei organice ar duce la creterea concentraiei atmosferice a CO2, un gaz cu un efect de ser mult mai sczut. Sursele abiogene de H2 stimuleaz producerea biogen a CH4: H2 din ariile geotermale i cel rezultat din reacia chimic spontan a Feo metalic cu protonii: Metanul atmosferic este rezultatul unor activiti umane nebiogene: exploatarea minier a crbunelui. Bacteriile care oxideaz sulful i compuii si Sulful este un element important pentru nutriia microorganismelor, att sub forma sa cea mai oxidat (SO 42-), ct i cea mai redus (S2- din H2S sau din sulfuri), dar i n forma sa intermediar de S elementar (So). Conversia S de la o form chimic la alta este predominant, rezultatul activitii bacteriene. Se disting 2 clase de bacterii chimiolitotrofe care oxideaz compuii redui ai S: - cele care cresc la pH neutru - cele care cresc la pH acid. Unele dintre acidofile pot folosi i Fe2+ ca donor de e-. Compuii cu S cei mai folosii ca donori de e- n nutriia chimiolitotrof sunt:

In aceste reacii se elibereaz cantiti mari de E. O parte genereaz fora proton-motrice, utilizat n sinteza ATP. In reaciile de oxidare a H2S, So i S2O32-, unul dintre produse este H+. Se formeaz H2SO4 i pH scade chiar sub valoarea 1. Prin oxidarea H2S (forma cea mai redus a S) se formeaz So foarte instabil. Unele bacterii care oxideaz H2S depun So sub forma incluziilor citoplasmatice. So constituie rezerva de energie, deoarece dup epuizarea H 2S, celula i obine energia prin oxidarea So din incluzii. So adugat n mediu este utilizat ca donor de e-. Bacteriile sulfuroase cresc ataate pe particula de S, datorit insolubilitii So i i obin energia prin oxidarea atomilor de sulf. Progresiv, pe msur ce este oxidat, particula de sulf trece n soluie. In condiii de autotrofie, bacteriile sulfuroase fixeaz CO2 pe calea ciclului Calvin. Bacteriile sulf-oxidante (Beggiatoa, Thiobacillus )sunt chimiolitotrofe facultative, deoarece se pot dezvolta i organotrof n prezena unor substraturi organice. Beggiatoa oxideaz H2S din apele uzate i acumuleaz granule de So n citoplasm, pe care l poate oxida la SO42-. Sursa de C este reprezentat de compuii organici. Cresc organotrof n rizosfera plantelor din mediile inundate (orez), anoxice, la grania dintre mediul anoxic al solului i mediul aerob al rdcinii, unde oxideaz H2S, avnd rol benefic pentru plant. Plantele favorizeaz creterea bacteriei n rizosfer, datorit producerii catalazei. Beggiatoa, Sphaerotilus formeaz flocoane laxe si produc fenomenul de umflare a nmolului activ atunci cnd devin preponderente fa de bacteriile zoogleale. Unele bacterii sulf-oxidante cresc numai in condiii de mixotrofie. Ca surs de energie folosesc H2S i un compus organic. Bacteriile care oxideaz compuii fierului Oxidarea aerob a Fe, de la starea feroas (Fe2+) la cea feric (Fe3+) este o reacie furnizoare de energie pentru unele bacterii.

Bacteriile din g. Gallionella, Thiobacillus ferrooxidans oxideaz Fe2+ la Fe3+. Cantitatea de energia rezultat din acest proces este mic, fiind folosit pentru fixarea CO2. De aceea, bacteriile ferice trebuie s oxideze o cantitate mare de Fe2+ pentru cretere. Facultativ sunt organotrofe. Fe3+ formeaz un precipitat (Fe(OH)3), insolubil n ap. Bacteriile care oxideaz compuii Fe, oxideaz i compuii S i sunt acidofile obligate, pentru c la pH neutru, n condiii aerobe, Fe 2+ este insolubil i foarte instabil, deoarece se oxideaz spontan la Fe 3+. La pH neutru, Fe2+ este stabil numai n condiii de anaerobioz. La pH acid, Fe2+ este stabil i solubil n ap. De aceea, bacteriile care oxideaz compuii Fe sunt acidofile obligate. Cea mai cunoscut bacterie chimiolitotrof care oxideaz att compuii Fe ct i ai S este Th. ferooxidans, foarte comun n apele acide. Pirita (FeS2) este principala surs de Fe2+ i oxidarea sa este benefic n practica mineritului deoarece reacia elibereaz Fe, dar este dezastruoas din punct de vedere ecologic pentru c acidific mediul. Compuii Fe i ai S sunt oxidai de Sulfolobus (Archaea), n izvoarele termale acide, n izvoarele de min, la temperaturi de pn la l00o. Oxideaz Fe2+, H2S, So i diferii compui organici. Crete autotrof i heterotrof. Bacteriile care oxideaz amoniacul i nitritul Cei mai comuni compui anorganici, utilizai ca donori de e- sunt NH4+ i nitritul (NO2-), fiind oxidai n aerobioz de bacteriile nitrificatoare, cu o larg distribuie n sol. NH3 rezultat n procesul de amonificare este oxidat de microorganisme, la nitrai, forma utilizabil a compuilor cu azot, de majoritatea plantelor i microorganismelor. Oxidarea NH 3 la nitrai este un proces biologic complex, denumit nitrificare, realizat de bacterii chemolitotrofe obligat aerobe, care nu tolereaz prezena substanelor organice n mediul de cretere. Efectul lor pare a fi chiar toxic, deoarece inhib creterea autotrof. Oxidarea biologic a NH3 la nitrai se desfoar n trepte: - n prima etap, NH3 este oxidat la nitrii, de ctre nitritbacterii (Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrosolobus):

In reacie, cei doi e - sunt necesari pentru reducerea unui atom de oxigen, la H 2O. Amoniacul este oxidat de amonium-monooxigenaz (protein membranar). Se formeaz NH2OH (hidroxilamin) i H2O, iar hidroxilaminreductaza (enzim periplasmic) oxideaz NH2OH la NO2-, elibernd 4 e- (nitritarea). n etapa a II-a, nitriii sunt oxidai la nitrai, de ctre nitratbacterii (Nitrobacter):

Cea mai mare parte a energiei este eliberat n prima etap. Oxidarea NH3 i a NO2 furnizeaz potenialul reductor necesar fixrii CO2(sursa major de C) pe calea ciclului Calvin. O2 este acceptorul final de e-. Nitrit- i nitratbacteriile triesc in asociaii strnse n sol i au rol important n fertilitatea acestuia. Bacteriile amonium-oxidante au capacitatea de a oxida i ali compui: CO, CH 3OH, CH4, hidroxil-amina, propilenul, fenolul etc. Cele mai multe din aceste reacii sunt catalizate de AMO sau de metan-monooxigenaz (MMO). Cele dou enzime au proprieti comune. Oxidarea anaerob a NH4+. Organisme neidentificate, care triesc n apa menajer uzat, n condiii de anaerobie i cu un supliment de NO3- pentru stimularea denitrificrii, oxideaz NH4+ la N2:

Reacia anamox este foarte exergonic. Descoperirea anamox a discreditat ideia mai veche c amoniul este stabil n condiii anaerobe i c ar fi oxidat numai de bacteriile aerobe nitrificatoare. Oxidarea unora dintre compuii anorganici (H2, NH3, NO2) este realizat i de unele bacterii chimioorganotrofe (heterotrofe), dar ele nu cresc pe medii anorganice deoarece nu pot utiliza CO 2 ca surs de carbon. Din aparatul lor enzimatic lipsesc enzimele ciclului Calvin. Deoarece moleculele anorganice pe care le oxideaz conin o cantitate mic de energie, microorganismele chimiolitotrofe se dezvolt anevoios i furnizeaz o mas celular srac. Pe de alt parte, fixarea reductiv a CO2 n ciclul Calvin necesit un potenial reductor ridicat, pentru a aduce C din CO2, la nvelul de oxidare caracteristic glucidelor. Chimiolitotrofia este o proprietate fiziologic excepional, prezent numai la procariote. Bacteriile chimiolitotrofe convertesc CO2 la compui organici, n absena procesului fotosintetic.

Fixarea CO2 la chimiolitotrofe. Ciclul Calvin Calea principal prin care CO2 este ncorporat n substane organice a fost descris de Calvin, Benson si Basshan (l946), la algele verzi unicelulare Chlorella pyrenoidosa i Scenedesmus obliquus, utiliznd CO2 marcat cu Cl4. Ciclul lui Calvin este cunoscut i sub denumirea de ciclul ribulozodifosfatului (RuDP). Toate organismele necesit carbon pentru sintezele celulare. Chiar i la heterotrofe, o parte a atomilor de carbon i are originea n CO2. La autotrofe, tot carbonul organic provine din fixarea CO2. Fixarea CO2 n ciclul Calvin are loc ntr-o serie de reacii ciclice, la ntuneric, utiliznd ATP i potenialul reductor sub forma NADPH, generate n reaciile de fotosintez (la lumin) sau n cursul proceselor de oxidare a substratului anorganic. Reaciile ciclului Calvin (fig. 53) sunt cunoscute i sub denumirea de ciclul reductiv al pentozelor. Procesul fixrii CO2 se desfoar n 4 faze (fig. 52):

Fig 52. Reaciile enzimatice eseniale ale ciclului Calvin. a. Reacia catalizat de ribulozo-difosfat-carboxilaza. b. Treptele conversiei acidului 3-fosfogliceric la gliceraldehid-3-fosfat. c. Conversia ribulozo-5-fosfatului la ribulozo-difosfat, catalizat de fosforibulokinaza (dup Brock, 1988).

Enzima cheie a ciclului este ribulozo-1,5-difosfat carboxilaza ce catalizeaz reacia dintre CO2 i ribulozo-difosfat. Se formeaz doua molecule de acid fosfogliceric. Atomul de C al CO2 este ncorporat n una din cele dou molecule de acid fosfogliceric. In faza a II-a acidul fosfogliceric este redus la gliceraldehid-3P:

In faza de regenerare, atomul de C ajunge la nivelul reducerii din glucide:

In faza de sintez a materialului celular se sintetizeaz glucide din acid 3-fosfogliceric.

Fig. 53. Schema ciclului Calvin. Pentru fiecare 6 molecule de CO2 fixate, este produs o molecul de fructozo-6-fosfat.

In reaciile la lumin, ATP i NADPH produse n exces sunt depozitate sub forma amidonului sau a altor compui glucidici. La bacteriile verzi, produsele de rezerv sunt glicogenul i acidul poli--hidroxibutiric. Nutriia organic a chimiolitotrofelor Toate microorganismele autotrofe folosesc aceiai surs de C (CO2), dar sursa de energie este diferit. Unele sunt litotrofe, iar altele sunt fototrofe. Termenul autotrof semnific posibilitatea utilizrii CO2 ca surs de C.

Toate microorganismele presupuse anterior a fi strict (obligat) autotrofe sunt de fapt autotrofe facultative, deoarece se pot dezvolta i heterotrof, prin metabolizarea unor compui organici adugai n mediu (de exemplu, acetatul). Hidrogen-bacteriile utilizeaz ca potenial reductor (donori de protoni), glucidele i acizii organici, n funcie de condiiile de mediu. Faptul ca microorganismele autotrofe sunt facultativ heterotrofe are o semnificaie secundar. Esenial rmne capacitatea lor de nutriie autotrof, ce const n ncorporarea CO2 n compui organici, proces denumit fixarea CO2. Sursa de azot este NH3, NO3- sau N2. Din compuii anorganici simpli, ele sintetizeaz toate moleculele organice caracteristice organismelor vii. Cel puin o parte a carbonului celular poate fi obinut din surse organice, care sunt utilizate preferenial fa de CO2, dac ele constituie un amestec n proporii adecvate. Plasticitatea metabolic adaptativ a microorganismelor merge de la capacitatea de cretere autotrof, pn la cea de cretere heterotrof, n funcie de condiiile de mediu. In vitro, chmiolitotrofele au o capacitate limitat de a utiliza compuii organici ca surs de carbon i energie. Compuii organici pot nlocui numai parial CO2 ca surs de carbon, cel puin pentru izolatele proaspete de bacterii chimiolitotrofe, deoarece sunt inhibitori ai creterii datorit efectelor toxice: piruvatul are efect toxic; acetatul este cel mai bine utilizat dintre compuii organici, iar aminoacizii i zaharurile sunt asimilate ntr-o msur mai mic. Aminoacizii sunt inhibitori ai creterii. Mecanismul inhibitor al creterii, ca i n cazul bacteriilor heterotrofe este dezechilibrul cantitativ al aminoacizilor. Acest mecanism este sugerat de faptul c toxicitatea aminoacizilor individuali pentru chimiolitotrofele obligate poate fi reversat de ali aminoacizi sau de amestecul lor echilibrat. Chimiolitotrofele pstreaz o dependen parial de CO2, care este fixat n ciclul Calvin. Exist ns diferene ale gradului de sensibilitate: un compus organic care la o concentraie prag are efect toxic pentru o specie de microorganisme, poate fi stimulator pentru altele. Capacitatea limitat a chimiolitotrofelor de a asimila compuii organici s-a explicat prin absena mecanismelor ce mediaz transportul diferitelor molecule nutritive. In concluzie, relaiile bacteriilor chimiolitotrofe cu compuii organici sunt complexe i acoper un spectru larg, de la o utilizare minimal pn la susinerea complet a creterii. Nutriia chimioorganotrof (heterotrof) Majoritatea bacteriilor au o nutriie de tip chimioorganotrof. Ele nu au capacitatea de a folosi moleculele anorganice simple ca surs reductoare i potenial reductor. Din punct de vedere fiziologic sunt foarte heterogene. In raport cu bacteriile chimiolitotrofe, cele chimioorganotrofe au numeroase incapaciti de sintez i n consecin sunt dependente de prezena n mediu, a compuilor organici pe care i folosesc ca surs de carbon pentru sinteza propriilor molecule i ca surs de energie n reaciile de catabolism aerob sau anaerob. Mediul de cretere trebuie s asigure prezena metaboliilor eseniali pe care celulele nu-l pot sintetiza. In concepia actual, unificatoare cu privire la metabolismul bacterian, practic toate bacteriile au nevoie de acelai set de metabolii eseniali, deoarece cile metabolice sunt comune. Diferenele ntre autotrofe i heterotrofe constau n gradul diferit de complexitate a moleculelor pe care celulele le iau din mediu. Bacteriile heterotrofe izolate din mediile naturale sunt prototrofe, adic se dezvolt pe un mediu minimal care conine o surs organic de carbon i energie i un compus anorganic cu azot. Din aceti compui, ele i sintetizeaz toi metaboliii eseniali. Experimental, prin mutagenez, din tulpinile prototrofe se obin mutante auxotrofe, care necesit adugarea n mediul nutritiv a unuia sau mai multor factori de cretere, datorit pierderii cilor corespunztoare de sintez. Printre bacteriile heterotrofe, gradul de dependen fa de complexitatea mediului este foarte variabil. La unele bacterii patogene, nevoia de compui organici compleci este foarte mare i de aceea nu pot fi cultivate dect pe medii la care se adaug lichide biologice: ser sanguin, snge, lichid ascitic. Unele microorganisme heterotrofe (patogene sau saprobionte) nu au fost cultivate pe medii inerte, orict de complexe, ci numai pe un substrat viu (culturi de celule, ou embrionat, organisme animale). Heterotrofia este interpretat ca rezultat al unui proces de evoluie, la care echipamentul enzimatic s-a simplificat n sensul pierderii capacitii de a face biosinteza unor enzime, ceea ce se reflect n incapacitatea de a sintetiza anumii metabolii eseniali. Aceti metabolii trebuie adugai n mediul de cretere. In concluzie, echipamentul enzimatic al microorganismelor heterotrofe este mai simplu dect al celor autotrofe. In grupul larg al organismelor heterotrofe exist de asemenea o scar ampl a diversitii capacitilor de sintez, de la cele prototrofe, capabile s creasc pe medii minimale, pn la cele cu incapaciti multiple de sintez a unor substane care trebuie adugate n mediul de cultivare, denumii factori de cretere sau vitamine ale microorganismelor.

Capacitile de biosintez realizeaz un continuum descresctor de la microorganismele autotrofe care i sintetizeaz toi metaboliii eseniali, la cele heterotrofe, dependente de numeroi factori de cretere. Trecerea de la nutriia autotrof la cea heterotrof o realizeaz microorganismele prototrofe, care cresc pe un mediu minimal ce conine un compus organic (glucidic) ca surs de carbon i energie i o surs de azot anorganic. Factorii de cretere Noiunea factori de cretere s-a definit odat cu constatarea c unele microorganisme cresc numai dac, n afar de sursele de azot i de carbon propriu-zise, n mediu se mai adaug o serie de substane eseniale pentru metabolismul lor. Factorii de cretere sunt metabolii eseniali, indispensabili meninerii viabilitii i creterii, pe care microorganismele nu pot s-i sintetizeze. Dat fiind unitatea fundamental a mecanismelor biochimice ale tuturor celulelor bacteriene, necesarul de factori de cretere este unitar n ntreaga lume bacterian. Deosebirea esenial const n originea lor. Bacteriile prototrofe sintetizeaz toi metaboliii eseniali pornind de la o surs organic de carbon i energie. La bacteriile prototrofe, factorii de cretere au origine endogen i nevoia celulei pentru aceste molecule este mascat. Bacteriile autotrofe au cele mai mari capaciti de biosintez. Ele sintetizeaz toi factorii de cretere. Cele prototrofe au capaciti intermediare, iar cele heterotrofe au pierdut diferite capaciti de biosintez: unii factori de cretere pot fi sintetizai, dar cei care nu se sintetizeaz trebuie adugai n mediul de cretere, din surse externe. Nevoia de factori de cretere este individual pentru fiecare tulpin bacterian i de aceea noiunea are un caracter relativ i se definete numai n raport cu un mediu de baz. Factorii de cretere sunt molecule mici, niciodat mari i ndeplinesc urmtoarele funcii: - precursori ai unor molecule cu rol structural (aminoacizi, peptide, baze purinice sau pirimidinice i acizi grai; - factori catalitici cu rol de coenzime, denumite generic vitamine" datorit rolului analog cu acela al vitaminelor celulei eucariote. Factorii de cretere cu rol structural au aciune cantitativ, adic nivelul creterii culturii celulare este proporional cu concentraia factorului de cretere cu care se suplimenteaz mediul unei tulpini auxotrofe. Concentraia de 10 g/ml este optim. Purinele i pirimidinele sunt componente ale nucleotidelor, dar intr i n alctuirea unor coenzime. Ele pot fi adugate n mediu sub forma bazei libere sau sub forma unui nucleozid. Forma nucleotidic (care conine grupul fosfat) nu este accesibil, deoarece n aceast form compusul nu traverseaz membrana celulei. Incapacitatea de a sintetiza un aminoacid este datorat absenei enzimelor necesare catalizei reaciilor corespunztoare. Factorii de cretere cu rol structural condiioneaz desfurarea biosintezei macromoleculelor (proteine, acizi nucleici, lipide). Factorii de cretere cu rol catalitic au aciune oligodinamic i de aceea sunt necesari n cantiti foarte mici (l g/ml). Din aceast categorie fac parte vitaminele, care intr n alctuirea coenzimelor. Majoritatea microorganismelor sintetizeaz toate componentele coenzimelor, dar cele cu una sau mai multe incapaciti de sintez trebuie aprovizionate cu aceste enzime sub forma vitaminelor. Acidul para-amino-benzoic (APAB) este precursorul acidului folic, iar acesta, sub forma acidului tetrahidrofolic are rol n metabolismul compuilor cu un atom de carbon i n transportul grupului formil i metil. Aciunea APAB este inhibat de sulfamide, care se substituie APAB prin competiie. Astfel, sinteza acidului folic i toat calea metabolic dependent de acidul folic este blocat. Biotina este o vitamin purttoare a COO- n biosinteza acizilor grai, n reaciile de -decarboxilare i n cele de fixare a CO2 n reaciile ciclului Calvin. Este un derivat ciclic al ureii. Avidina proteina specific albuului de ou, leag ferm biotina, care este astfel inactivat. Prin nclzire, avidina se denatureaz, se inactiveaz i pierde capacitatea de a lega biotina.

Acidul lipoic are rol n transferul H2 n reaciile de decarboxilare oxidativ a piruvatului i alfa-cetoglutaratului.

Acidul nicotinic este precursorul NAD, la rndul su avnd rol n transferul e- n reaciile de oxido-reducere. Acidul pantotenic este precursorul coenzimei A. Coenzima A activeaz acetilul din diferiii si compui. CoA este factor de cretere pentru L. bulgaricus. Tiamina (vitamina B1) are rol n reaciile de -decarboxilare. Tiamin-pirofosfatul este coenzima decarboxilazelor (fig. 55), avnd rol n decarboxilarea oxidativ a acidului piruvic (n glicoliz) i a acidului -cetoglutaric n ciclul Krebs.

Riboflavina (vitamina B2) este precursorul FMN i FAD, componente ale flavoproteinelor, cu rol n transportul e-. Piridoxina (vitamina B6) este coenzima cu rol n metabolismul aminoacizilor i cetoacizilor (coenzim a reaciilor de dezaminare i decarboxilare). Cobalamina (vitamina B12) catalizeaz reacia de sintez a dezoxiribozei, fermentaia glutamatului etc. Conine Co legat cu mare afinitate. Vitamina K are rol n transportul e- i n sinteza sfingolipidelor. Coenzima M (CoM) este necesar unor bacterii metanogene i are rol n metanogenez. Hidroxamaii sunt compui care leag Fe, l solubilizeaz din compuii si i l transport n celul. Hematina (factorul X) intr n alctuirea hemoproteinelor (citocromi, catalaz) care au rol n transportul e-, pe catena de respiraie celular. Factorii stimulatori de cretere sunt substane neeseniale pentru creterea i multiplicarea unor microorganisme, dup adugarea lor n mediu. Microorganismele sintetizeaz substanele din aceast categorie, dar n cantiti insuficiente, care nu satisfac integral necesitile dezvoltrii optime a culturii. Prin urmare, creterea are loc cu o rat sczut. Adugarea factorului stimulator al creterii, restabilete rata optim de cretere i diviziune a celulelor. Semnificaia biologic a factorilor de cretere. Dup A. Lwoff (l944) nevoia de factori de cretere ar reflecta procesul de evoluie regresiv a unor microorganisme, prin pierderea selectiv a unor capaciti de sintez. Evoluia organismelor ar fi nsoit n mod obligatoriu de pierderea unor funcii, i n special a celor de biosintez. Incapacitatea de sintez poate fi de tip calitativ i se manifest prin dependena total de un factor de cretere sau de tip cantitativ, ca o consecin a diminurii unei activiti funcionale, care continu s se exprime ntr-o msur detectabil. Deficitul cantitativ se compenseaz prin suplimentarea mediului cu un factor stimulator al creterii. Aplicaii practice. Nevoia de factori de cretere a unor microorganisme este att de specific, nct gradul de cretere al culturii unui microorganism auxotrof este proporional cu concentraia factorului n mediu. Tulpinile de microorganisme care manifest o dependen strict i specific fa de un factor al mediului sunt folosite pentru dozarea cantitativ a factorului de cretere. Dozajul microbiologic este adesea singura posibilitate de evaluare cantitativ a unui facor de cretere. Metoda se bazeaz pe utilizarea unui mediu care satisface toate exigenele nutritive ale tulpinii test, cu excepia factorului care se dozeaz. Creterea culturii este proporional cu concentraia factorului n mediu.

Metoda se aplic pentru dozarea aminoacizilor, tiaminei, riboflavinei, acidului pantotenic, acidului nicotinic, vitaminei B12, biotinei, piridoxinei. Dozarea biologic este considerat a fi mai sensibil dect oricare metod chimic. Dependena unor microorganisme de factorii de cretere este util n studiile genetice. Incapacitatea de sintez a unui metabolit esenial este rezultatul unei mutaii. Tulpinile auxotrofe (care necesit suplimentarea mediului cu un factor de cretere) se obin prin mutagenez dintr-o tulpin bacterian prototrof (capabil s creasc pe un mediu minimal). De exemplu, o tulpin auxotrof ce nu sintetizeaz histidina (His -) necesit adugarea acestui aminoacid n mediu. Incapacitatea de sintez poate fi unic (pentru un singur metabolit) sau multipl i constituie un caracter marcant (marker genetic) al tulpinii bacteriene. Tulpinile mutante auxotrofe sunt instrumente eseniale de lucru n domeniul geneticii microorganismelor, deoarece permit studiul modalitii de transmitere n descenden a unei capaciti de biosintez, detectabil prin teste relativ simple de cultivare pe medii cu sau fr factori de cretere.

CAPITOLUL IV METABOLISMUL BACTERIAN


Metabolismul (metabole, grec = a schimba) este reprezentat de totalitatea reaciilor biochimice implicate n activitile biologice ale celulei bacteriene, prin intermediul crora substanele biogene sunt preluate din mediul extern i sunt supuse reaciilor productoare de energie i de biosintez. Substanele sunt preluate din mediul extern, fie sub form simpl, utilizabil direct n metabolism, fie sub form complex. Substanele biogene sunt folosite de celul n urmtoarele direcii eseniale: - pentru sinteza metaboliilor primari (aminoacizi, baze purinice i pirimidinice, enzime, acizi grai), necesari biosintezei constituienilor structurali, rezultatul fiind creterea celulei. Aceti compui se sintetizeaz n faza de cretere primar, denumit i trofofaz; - pentru producerea energiei, n metabolismul energetic i a produselor metabolismului energetic (produi de fermentaie alcoolic, lactic, butiric, propionic, acid etc.); - pentru producerea (uneori) a metaboliilor secundari (antibiotice, alcaloizi, ergotina, giberelina). Se sintetizeaz n faza de cretere secundar, denumit idiofaz, dup epuizarea unui nutrient major (sursa de C sau de N). Metaboliii secundari nu sunt eseniali pentru creterea celulei i sinteza lor este expresia procesului de difereniere biochimic. Reglarea metabolismului bacterian este perfect i este subordonat principiului optimalitii activitii celulare, astfel nct pierderea de energie s fie minim. Reaciile metabolice fundamentale ale celulelor bacteriene nu difer mult de acelea care au loc n celula eucariot. Totui, bacteriile au o serie de particulariti metabolice, n special ale metabolismului energetic, care este mult mai diversificat dect al celulei eucariote. Particularitile generale ale metabolismului bacterian Metabolismul bacterian se distinge de acela al celulei eucariote prin cteva trsturi particulare: l) Metabolismul bacterian are o intensitate neobinuit, de sute i chiar de mii de ori mai mare dect metabolismul organismelor superioare, raportat la unitatea de greutate (gramul). De exemplu, un gram de celule de Micrococcus ureae poate s metabolizeze pn l200 g uree ntr-o or; un gram de bacterii lactice hidrolizeaz ntr-o or pan la l4 000 g de lactoz. Dac organismul uman ar avea o rat metabolic asemntoare ar trebui s ingere cteva tone de alimente pe or. Diferitele ci metabolice i activiti enzimatice la bacterii se desfoar cu o intensitate deosebit de nalt, proprie acestor organisme. Particularitatea deriv, n cea mai mare parte din valoarea nalt a raportului suprafa/volum (greutate celular). La bacterii, suprafaa este foarte mare n raport cu volumul, ceea ce uureaz schimburile ntre celul i mediu. Suprafaa de schimb, prin care substanele nutritive ptrund n celul, iar cataboliii sunt eliminai, este foarte mare n raport cu volumul celulei, care reprezint consumatorul. 2) Natura substratului pe care bacteriile l pot cataboliza este foarte divers. Bacteriile reprezint grupul cel mai omnivor din ntrega lume vie. Ele metabolizeaz substane inaccesibile pentru alte organisme, de la substane anorganice simple, inclusiv substane toxice pentru sistemele biologice, pn la substane organice complexe: cauciucul, asfaltul, fenolii, parafinele, petrolul, lemnul, substanele antibiotice, cheratina, detergenii, masele plastice. Reprezentani ai g. Pseudomonas pot metaboliza pn la 200 substane diferite. Diversitatea chimic a substanelor pe care bacteriile le pot metaboliza a condus la reutilizarea i valorificarea substanelor menajere pentru obinerea biogazului carburant, a biomasei bacteriene.

Aceast particularitate a bacteriilor ca grup, de a metaboliza substraturi foarte diverse nu este estompat de unele bacterii, adevarai specialiti fiziologici, care au exigene nutritive stricte i nu pot folosi dect un singur substrat pentru activitile lor metabolice: nitrit- i nitrat bacteriile implicate n circuitul azotului se dezvolt numai n prezena substratului corespunztor sau bacteriile celulozolitice se dezvolt numai n prezena celulozei. 3) Plasticitatea metabolismului bacterian este fr echivalent n lumea vie i se refer la capacitatea bacteriilor de a folosi, alternativ, diferite surse de carbon i energie. Foarte multe microorganisme, considerate ca strict autotrofe (capabile s utilizeze numai substane anorganice pentru nutriie) sunt de fapt facultativ heterotrofe i pot folosi substanele organice ca substrat generator de potenial reductor. La rndul lor, microorganismele heterotrofe (organotrofe), n absena substanelor organice utilizeaz compui anorganici. Aceast versatilitate metabolic are caracter adaptativ i are o semnificaie ecologic major, deoarece, cel puin n condiii naturale, microorganismele trebuie s-i adapteze tipul de metabolism n raport cu substratul disponibil. 4) Corelat direct cu intensitatea metabolismului, potenialul de sintez al celulei bacteriene este deosebit de mare, ca o consecin a faptului c, transcrierea este simultan cu traducerea informaiei genetice. Dac potenialul de sintez, exprimat n kg/zi, n mod convenional, la bovine l considerm a avea valoarea 1, la soia este l0, la levuri este l0 5, iar la bacterii este l0ll, raportat la unitatea de greutate. O celul de E. coli sintetizeaz circa l000 molecule de proteine/secund, circa 4000 molecule de lipide i 4 molecule de ARN. Acest uria potenial de sintez este numai teoretic i ar putea deveni real numai n condiii optime de mediu. In condiii obinuite de mediu, acest potenial nalt de sintez se manifest o perioad foarte scurt de timp, datorit factorilor limitani ai mediului: diminuarea cantitativ a nutrienilor, acumularea rapid a substanelor toxice i de catabolism, modificarea pH, variaiile de temperatur. 5)Metabolismul bacterian se caracterizeaz prin diversitatea cilor catabolice alternative, prin care poate fi degradat un compus chimic: calea glicolizei, a untului hexozo-monofosfailor, calea Entner-Doudoroff. Toate substanele nutritive utilizabile n metabolism, trebuie s strabat nveliurile celulare: peretele i membrana citoplasmatic. Membrana citoplasmatic are o permeabilitate foarte selectiv, fiind o barier nu numai fizic, ci i chimic i biologic. Metabolismul energetic bacterian Metabolismul celulei bacteriene, ca i al celulei eucariote, are dou compartimente fundamentale: - cile de producere a energiei, denumite catabolice sau degradative; - cile consumatoare de energie, denumite anabolice sau de biosintez. Deoarece cile catabolice i anabolice sunt strns interconectate prin intermediul unor compui cheie ai metabolismului intermediar, adevrate plci turnante ale metabolismului, denumirea comun de ci amfibolice este justificat. La bacterii, datorit ratei foarte nalte a metabolismului, funcioneaz o categorie special de ci, denumite anaplerotice (sau de alimentare), menite s aprovizioneze o cale metabolic ce funcioneaz intens, cu produsul intermediar necesar. Cile catabolice reprezint ansamblul proceselor biochimice prin care are loc degradarea nutrienilor preluai din mediu i eliberarea energiei. Complexitatea reaciilor catabolice este variabil, n funcie de natura i complexitatea substanelor supuse proceselor de degradare. In general, reaciile catabolice degradative ale unei macromolecule se desfoar n trei faze succesive: - n prima faz se desfoar reaciile biochimice catalizate de exoenzime, n cursul crora macromoleculele nutritive sunt scindate n spaiul extracelular, la subunitile specifice: glucide, aminoacizi, oligopeptide, nucleozide, fosfai organici cu molecul mic (glicerol-fosfat). Bacteriile, fungii i protozoarele produc enzime extracelulare (exoenzime), pe care le elimin n mediu sau rmn legate de structurile de suprafa ale celulei. Exoenzimele sunt hidrolaze: polizaharidaze (amilaz, celulaz, pectinaz), mucopolizaharidaze (hialuronidaz, chitinaz, neuraminidaz, lizozim), nucleaze, lipaze, fosfolipaze, proteaze. Ele hidrolizeaz moleculele mari, rezultnd oligomeri sau monomeri, pentru care structurile celulare de nveli sunt permeabile. Pentru microorganismele patogene, exoenzimele reprezint un factor major de virulen, deoarece atac esuturile constitutive ale gazdei. La bacteriile Gram negative, sediul exoenzimelor este spaiul periplasmic, deoarece triesc n medii oligotrofe. In aceast etap se elibereaz numai 1% din energia macromoleculei, care se pierde sub form de cldur; - n cea de a II-a etap, monomerii sunt degradai pe ci specifice i rezult un numr limitat (circa l2) de molecule mici, denumite intermediari metabolici ai cilor centrale, aceiai la diferite tipuri de bacterii. In aceast etap se elibereaz circa 1/3 din energia molecular; - cea de a III-a faz este diferit n funcie de natura reaciilor metabolice: n aerobioz, reaciile evolueaz n sensul metabolizrii integrale a compuilor, pn la CO2 i H2O, cu eliberarea ntregii cantiti de energie. In anaerobioz,

reaciile evolueaz dup modelul respiraiei anaerobe sau al proceselor fermentative i cantitatea de energie care se elibereaz este mic. Reaciile catabolice sunt exergonice: ele realizeaz tranziia unei molecule de la o stare mai puin stabil, cu un coninut mai mare de energie, la molecule mai mici i mai stabile, cu un coninut mai mic de energie. Tipuri de metabolism energetic in funcie de acceptorul final de electroni In funcie de natura acceptorului final de e-, microorganismele pot prezenta trei tipuri de metabolism energetic: - metabolism energetic de tip aerob (oxibiotic) sau metabolism respirator, dependent de citocromii catenei de respiraie celular, propriu microorganismelor al cror acceptor final de e-, la captul catenei de respiraie este O2; - metabolism energetic anaerob (anoxibiotic), caracteristic microorganismelor al cror acceptor final de e- este un compus anorganic oxigenat (nitratul, sulfatul, carbonatul) sau un compus organic (fumaratul). In prezena O2, respiraia este de tip aerob, deoarece catena de respiraie celular este funcional; - reacii metabolice de tip fermentativ sunt acelea care au loc numai n condiii de anaerobioz, dar acceptorul final de e- este un compus organic (de exemplu, piruvatul). La bacteriile fermentative lipsete lanul citocromilor din catena de respiraie, pentru transportul e -. Substratul acceptor este redus la produse de fermentaie (de exemplu, piruvatul, la lactat). Reducerea acceptorului final este cuplat cu reoxidarea coenzimelor. Pentru nevoile curente ale cultivrii microorganismelor n condiii de laborator sunt recunoscute urmtoarele tipuri respiratorii: - bacterii strict aerobe sunt acelea care necesit O2 molecular ca acceptor final de e-. Ele realizeaz metabolism de tip oxidativ i nu cresc n absena O2. Pentru multe bacterii aerobe este necesar aerarea extensiv, pentru c O 2 este puin solubil n ap i nu difuzeaz cu o rat care s egaleze rata utilizrii. Aerarea se face prin agitare viguroas a recipientului sau prin barbotarea aerului sterilizat n mediul lichid, printr-un tub de sticl. Bacteriile aerobe cresc mult mai bine n condiii de aerare forat dect dac O2 difuzeaz liber; - bacteriile microaerofile folosesc O2 ca acceptor final de e-, dar concentraia natural a O2, de 20-21% este prea mare i din aceast cauz nu cresc pe suprafaa mediului expus aerului atmosferic, dar nu cresc nici n anaerobioz; - bacteriile facultativ anaerobe i obin energia pe cale oxidativ, folosind O2 ca acceptor final de e-, dar cresc i n condiii de anaerobioz i i obin energia pe cale fermentativ; - bacteriile anaerobe nu folosesc O2 molecular ca acceptor de e-. In interiorul acestui grup se disting cteva diviziuni fiziologice: a) bacteriile anaerobe aerotolerante cresc puin (dar cresc) n condiii de aerobioz, ntr-o ambian care conine ntre 2-8% O2. Creterea optim are loc n anaerobioz (de exemplu, bacteriile lactice); b) bacteriile anaerobe obligate variaz n privina sensibilitii lor la O2: unele tolereaz cantiti mici de O2, iar altele strict anaerobe nu cresc n prezena unei concentraii mai mari de 0,5% O2. Efectul toxic asupra bacteriilor anaerobe l exercit O2 i nu potenialul redox ridicat al mediului. In prezena O2, bacteriile anaerobe i pierd viabilitatea deoarece nu pot s detoxifice intermediarii toxici ai reducerii O2: H2O2, O2(radicalul superoxid), OH- (ionul hidroxil), OH. (radicalul hidroxil), 1O2 (oxigen singlet*).
O2 se formeaz dup ce molecula de O2 absoarbe o cantitate de energie. In molecule, n general, e- apar n perechi stabilizate, cu spini de direcie opus. O2 este o molecul neobinuit, prin faptul c spinii electronilor au aceiai direcie. Absorbia energiei schimb unul dintre e- pe un orbital cu energie mai nalt i se produce inversia spinului.
*1

Multe bacterii anaerobe obligate sunt bogate n flavine (enzime), care pot reaciona spontan cu O 2 i formeaz produse toxice. Din aceast cauz, cultivarea lor se face n recipiente din care O 2 se elimin complet, pentru a crea un potenial redox sczut. Exist numeroase procedee pentru diminuarea coninutului de O2: - unele simple (umplerea recipientelor cu mediu i acoperirea cu dop de cauciuc), pentru bacteriile care tolereaz o concentraie mic de O2 n mediu; - altele mai complexe pentru cultivarea bacteriilor strict anaerobe: n mediul de cretere se adaug ageni reductori (acidul tioglicolic, cistein) sau alturi de mediu, n atmosfera nchis a recipientului de cultivare (pirogalolul).

Pirogalolul Agenii reductori reacioneaz cu O2 dizolvat n mediu sau existent n atmosfera recipientului i-l reduc la H2O. Reacii de oxidare a substratului energetic Metabolismul energetic este o nlnuire de reacii de oxido-reducere, n cursul crora substratul energetic este oxidat. Reaciile de oxidare sunt de trei tipuri: l. Reacia de oxidare consecutiv pierderii de e-. De exemplu, Fe2+ (feros), forma redus este oxidat la Fe3+ (feric), dup reacia: 2. Reacii de oxidare catalizate de dehidrogenaze, n care molecula oxidat pierde simultan protoni i e-, de exemplu, oxidarea alcoolilor la aldehide: 3. Reacia de oxidare care comport ctig de atomi de oxigen de ctre substratul oxidat; de exemplu, oxidarea aldehidelor la acizi: sau reacia de decarboxilare oxidativ a piruvatului, la acetat i CO2: Aceste reacii de oxidare constau ntr-o dehidrogenare, n care apa are, n acelai timp, rolul de donor de O i de surs de protoni i e-. Toate reaciile de oxidare biologic au comun faptul c, n esen, ele semnific o pierdere de e - de ctre substrat i eliberarea energiei. Electronul cedat de un substrat molecular trebuie obligatoriu sa fie acceptat de un alt substrat, astfel nct reaciile de oxidare biologic sunt cuplate totdeauna cu reacii de reducere, formnd un cuplu de oxido-reducere (un sistem redox), n care o molecul se comport ca donoare de e-, iar cealalt, ca acceptoare. Molecula care cedeaz e- sau protonii (H+) se oxideaz, iar cea care i accept se reduce. Potenialul redox i fora proton-motrice Din punct de vedre chimic, oxidarea semnific pierderea unuia sau mai mulor e- dintr-o molecul, iar reducerea semnific ctigul e-. In biochimie, oxidarea i reducerea nu implic totdeauna transferul e -, ci i al atomilor de H. {n reaciile de oxido-reducere biologic, dehidrogenrile sunt foarte importante i de aceea, termenii de donor de H+ i de acceptor de H+ sunt folosii ca sinonimi cu cei de donor i respectiv de acceptor de e-. Tendina unui compus chimic de a ceda sau de a accepta e- n reaciile de oxido-reducere biologic se exprim cantitativ prin potenialul oxido-reductor (redox) al cuplului. Electronii sunt transportai totdeauna de la un cuplu cu un potenial redox mai negativ, la un cuplu cu un potenial redox mai puin negativ (de exemplu, de la cuplul NADPH+ +H+, la cuplul Fe2+/Fe3+). In natur, mediile bogate n O2 au un potenial redox de + 0,82 V, iar cele bogate n H, au un potenial de 0,42 V. Ca regul general, substraturile cu potenial redox pozitiv (O2, Fe3+) sunt oxidante (acceptoare de e-), iar cele cu potenial redox negativ (H2, NADH) sunt ageni reductori (donori de e-). O substan chimic, cu ct este mai redus, cu att conine o cantitate mai mare de energie i cu att este mai mare tendina ei de a ceda e-. Transferul protonilor (H+) i al e- n sistemele biologice, se face de la substratul energetic la O 2. Dac acest transfer s-ar face direct de la substratul redus la O2, diferena maxim de potenial ar fi de 0,82 (- 0,42) = l,23 V, ceea ce

ar corespunde unei diferene energetice de 57 kcal/mol. Un astfel de transfer ar fi nsoit de o pierdere foarte mare de energie. Microorganismele (ca i celelalte organisme) dispun de mai multe sisteme redox, care transport e- n cascad, permind eliberarea treptat a energiei. Transportorii de e- pot fi mprii n dou clase: - liber difuzibili (NAD+, NADP+). Totdeauna transfer 2 atomi de H spre urmtorul purttor al catenei. Transferul atomului de H se numete dehidrogenare; - ferm ataai de enzimele din membrana citoplasmatic. In dublul strat fosfolipidic sunt inserate sistemele redox proteine cu rol de transport n catena de respiraie celular: flavoproteine, quinone, proteine cu Fe-S, citocromii.

Respiraia aerob bacterian Respiraia aerob este procesul catabolic productor de energie n cursul cruia, compuii energetici organici sau anorganici redui, cu rolul de donori de e- sunt degradai complet pe cale oxidativ pn la CO2 i H2O. In respiraia aerob, O2 este ultimul acceptor de e- (fig. 54).

Fig 54. Catena transportoare de electroni. Transportorii sunt: NAD, FMN (un derivat al vitaminei B2), o protein cu Fe i S, coenzima Q i citocromii a, b i c. Fiecare component al catenei se reduce i se oxideaz succesiv. La captul catenei, electronii sunt acceptai de O2, pentru a forma H2O. FAD deverseaz electronii n aval fa de NAD. Datorit distribuiei diferiilor transportori n membrana celular a procariotelor sau n membrana mitocondrial intern a eucariotelor i pentru c unii transportori accept numai protoni (H+), iar alii numai electroni, protonii sunt pompai din citoplasm in mediul extracelular (sau din matricea mitocondrial n spaiul dintre cele doua membrane) in timp ce electronii sunt transportai pe caten. Gradientul protonic este utilizat pentru sinteza ATP.

Substratul energetic poate fi anorganic (H2, NH3, nitriii, So i compuii si redui, compuii Fe) sau organic. Setul de reacii de importan esenial n respiraia aerob este ciclul Krebs. Protonii (H+) cedai de diferii intermediari ai ciclului Krebs ajung, prin sistemele redox ale catenei de respiraie, la O2. Trstura distinctiv a procesului respirator este prezena enzimelor care alctuiesc catena transportoare de e-. Catena de respiraie aerob este constituit din proteine ce poart grupe prostetice redox, care au rolul de enzime oxido-reductaze (dehidrogenazele) sau de transportori de e- (citocromii). Catena de respiraie funcioneaz n metabolismul aerob, dar anumite componente ale sale s-au identificat la organismele anaerobe.

Electronii eliberai din substrat strbat componentele catenei, pn la acceptorul final, O2 n condiii de aerobioz sau un alt acceptor final, dac O2 nu este disponibil. Concomitent se sintetizeaz ATP. Ansamblul reaciilor de oxidare i de fosforilare poart denumirea de fosforilri oxidative. Componentele catenei respiratorii bacteriene Catena respiratorie bacterian este alctuit din componente transportoare de e-, asociate membranei i diverticulilor ei. Catena ndeplinete dou funcii : - accept e- de la un donor i-i transfer la un acceptor - conserv o parte a E eliberate n timpul transferului de e-, pentru sinteza ATP. Cantitatea mare de energie produs in respiraie rezult din transportul e- din caten, de la un component cu un nivel energetic nalt, la unul cu nivel energetic mai sczut. Energia este captat n legturi macroergice prin combinarea P anorganic cu ADP, cu formarea ATP. Procesul se numete fosforilare oxidativ Componentele catenei sunt reduse de forma redus a purttorului anterior i sunt oxidate de forma oxidat a componentului urmtor. Catena poate fi mprit n trei segmente funcionale, al cror potenial redox crete de la flavoproteine, pn la citocrom-oxidaza terminal. Intrarea protonilor (H+) n catena respiratorie are loc la nivelul primului segment funcional format din urmtoarele componente: - dehidrogenazele cu nucleu piridinic (NAD sau NADP) sunt asociate feei interne a membranei celulare. NAD funcioneaz ca purttor de e- n reaciile catabolice, iar NADP funcioneaz n reaciile de biosintez fixatoare ale CO2. Ele accept atomi de H generai n diferite reacii celulare i i transfer la flavoproteine. Coenzima redus (NADH), format prin oxidarea glucozei, este reoxidat i H + este transferat la grupul prostetic al flavoproteinelor (FMN); - dehidrogenazele cu nucleu flavinic(un derivat al riboflavinei), FAD i FMN. Flavoproteinele sunt proteine care conin un derivat al riboflavinei(vitamina B2). Poriunea flavinic, legat de o protein, este grupul prostetic care accept atomi de H i se reduce sau doneaz e- i se oxideaz. {n celule se gsesc 2 flavine: FMN i FAD. - proteine nehemice cu Fe-S. S-au identificat la Cl. pasteurianum i funcioneaz ca transportori de e- pentru c sufer tranziii reversibile Fe2+- Fe3+. Sunt foarte electronegative (-0,49 V) i conin o grupare prostetic alctuit din Fe nehemic i S acidolabil, care formeaz aglomerri dimerice (Fe-S)2 sau mai frecvent, tetramerice (Fe-S)4, legate de resturile de cistein ale proteinei. Potenialul redox al proteinelor Fe- S variaz mult n funcie de numrul atomilor de Fe i S i de modul de legare de proteine. De aceea, proteinele Fe-S pot funciona n diferite puncte ale catenei transportoare de e-. Ca i citocromii, proteinele Fe-S transport numai e-. Al II-lea segment funcional este constituit dintr-o familie de molecule chinonice liposolubile, denumite lipoquinone sau coenzime Q. Quinonele (ubiquinona = CoQ) sunt molecule foarte hidrofobe, solubile n lipide i au rol n transportul e-. Unele sunt nrudite cu vitamina K (un factor de cretere al animalelor superioare). Ca i flavoproteinele, quinonele funcioneaz ca acceptori de H+ i ca donori de e-. Quinonele difuzeaz liber prin membrane i transport e- de la proteinele cu Fe-S, la citocromi. Coenzimele Q sunt adevratele navete transportoare de e- , ntre flavoproteinele reduse (FMNH) i citocromii oxidai. Al III-lea segment funcional al lanului respirator este format din citocromi. Citocromii sunt proteine de care se ataeaz inelul porfirinic cu Fe - hemul, ca grup prostetic. {n centrul grupului prostetic se gsete un atom de Fe. Gruparea prostetic se numete hem, dac Fe este n stare redus (Fe2+) sau hemin, dac Fe este oxidat (Fe3+). Funcia redox este intim legat de schimbarea valenei Fe hemic (citocrom-Fe2+ citocromFe3+ + e-). Citocromii transport numai e- i se gsesc numai n celulele aerobe. Citocromii bacterieni funcioneaz n transportul fotosintetic al e- i n respiraia aerob, cuplat cu oxidarea substratului redus (substane organice, H2, S redus sau metale). Citocromii au rolul de a transporta e- la alt citocrom cu potenial redox mai pozitiv, pn la acceptorul final. Diferiii citocromi sunt desemnai prin litere: a, b, c. Citocromul terminal al catenei de respiraie a 3 (citocrom-oxidaza) conine Cu. Citocromii unui organism pot s difere de ai altora i variantele sunt desemnate a1, a2, aa3 etc. Deoarece respiraia are loc n membrana citoplasmatic, citocromii sunt adeseori localizai n acest compartiment, dar se gsesc i n spaiul periplasmic, unde funcia lor de transfer al e - este legat cu a citocromilor membranari. Citocromii diferitelor organisme pot s difere ntre ei i sunt desemnai a1, a2, aa3 etc. Proteinele componente ale citocromilor sunt desemnate prin litere, urmate de un indice sau prin cifre, care indic lungimea de und a spectrului lor maxim de absorbie.

NADH i coenzimele Q transport e- sub forma atomilor de H, iar citocromii transport e- ca atare. Nu transport protoni (H+). La trecerea n citocromi, H+ trece n citosol i va fi extras n treapta final reducerii O2, cu formarea apei. Citocromul terminal, care are rolul unei enzime finale acceptoare de e - se numete citocrom-oxidaz. Este singura protein capabil s transfere e- la O2 molecular, dup reacia:

Toate proteinele catenei sunt situate n membrana citoplasmatic a celulei bacteriene. Unele sunt agregate n grupri funcionale complexe. Reducerea unei molecule de O2 la H2O necesit 4 e-. Reducerea O2 cu un singur e- produce O2- (radicalul superoxid), iar reducerea cu 2 e- produce H2O2, ambii avnd efecte distructive. Catena de respiraie celular este format din proteine transmembranare, incluse n stratul lipidic i expun domenii pe ambele fee ale membranei. Transportorii de e- sunt astfel orientai n membran nct, n timpul transportului realizeaz o separare a protonilor de e-. Curgerea e- prin sistemul de transport poate fi considerat ca o cascad cu mai multe trepte. La fiecare treapt, energia electronilor este captat enzimatic i folosit pentru a forma molecula de ATP din ADP + Pi. n cele mai multe transferuri de energie se elibereaz cantiti mici, dar trei dintre ele elibereaz catiti mari de energie utilizat pentru sinteza ATP. Atomii de H, la nivelul transportorilor specifici (NADH, NADPH), pe faa intern a membranei, sunt disociai n protoni (H+) i e-. Electronii se ntorc pe faa citoplasmatic a membranei prin transportorii specifici (citocromii), iar protonii sunt eliminai la exteriorul celulei Gram pozitive i produc o uoar acidificare a mediului extern sau n spaiul periplasmic al bacteriilor Gram negative.

Fig. 53. Structura coenzimei NAD+ i NADP+.

Structura FMN i FAD.

La captul catenei de respiraie celular, e- reduc acceptorul final (O2). O2 redus necesit H+ din citoplasm pentru formarea apei. H+ citosolic provine din disocierea apei n H+ i OH-. Consumul H+ pentru reducerea O2 la H2O i eliminarea H+ determin acumularea OH- pe faa intern a membranei. Deoarece au sarcin electric, H+ i OH- nu trec liber prin membran, iar echilibrul lor nu poate fi restabilit spontan. Excesul de H+ pe faa extern confer membranei o sarcin net pozitiv n raport cu faa intern. Rezultatul net al distribuiei asimetrice a acestor ioni este generarea unui gradient de pH i a unui potenial electric de membran (potenial electrochimic). Faa intern a membranei are sarcin negativ i este alcalin, datorit ionilor OH - (derivat din disocierea apei), iar faa extern are sarcin pozitiv i este acid (datorit protonilor). Transportul e- la O2, aparent produce H2O, dar de fapt, prin disocierea H2O, produce H+ i OH-, care se concentreaz pe cele dou fee ale membranei. Diferena de pH i de potenial electrochimic de pe cele dou fee determin o stare energizat a membranei, asemenea unei baterii, care se msoar n voli i se exprim ca for proton motrice. Sinteza ATP dependent de gradientul protonic Starea energizat a membranei este folosit direct pentru activiti fiziologice (transportul ionic, rotaia flagelului) sau pentru conversia ADP la ATP. Ideea conversiei ADP la ATP, dependent de gradientul protonic a fost propus sub denumirea de teoria chemiosmotic sau chemiosmoz (Mitchell, l961). Procesul este rezultatul unei serii de reacii chimice ce se produc n i pe cele dou fee ale unei membrane. Chemiosmoza are loc att n membrana celulei procariote, ct i la nivelul membranei interne a mitocondriilor celulei eucariote. Gradientul de concentraie protonic pe cele dou fee ale membranei genereaz un gradient electrochimic, o stare energizat a membranei, denumit for proton-motrice*, care se exprim n voli i face ca membrana s devin o baterie biologic.
Reaciile fosforilrii oxidative, productoare de E, sunt cuplate cu reaciile consumatoare, printr-o stare intermediar bogat n E, i nu printr-un compus chimic. Dup Mitchell, starea intermediar este gradientul electrochimic de H+ prin membrana citoplamatic sau prin membrana mitocondrial intern, care cupleaz fluxul de E de la transportorii de e -, cu sinteza ATP. Substratul cuplrii este membrana intact. E liber nmagazinat n gradientul de protoni s-a denumit for proton-motrice.
*

Fora proton-motrice este convertit n energie chimic prin sinteza ATP din ADP, sub aciunea ATP-sintazei (ATP-az). ATP-sintaza, localizat pe faa citoplasmatic a membranei, este considerat cel mai mic motor biologic

cunoscut. Enzima este un complex format din cel puin l0 catene polipeptidice i are aciune reversibil pentru c sintetizeaz ATP din ADP i Pi, dar catalizeaz i reacia invers, de hidroliz a ATP la ADP, Pi, cu eliberarea energiei. ATP-aza este alctuit din subunitatea F1(format din 5 polipeptide: -3 copii, -3 copii, , , ), localizat pe faa intern a membranei i subunitatea Fo, transmembranar, ce formeaz un canal prin care trec protonii. Trecerea H+ prin Fo genereaz o for de rotaie, transmis subunitii F1 prin subunitatea . Subunitatea este rotorul care mediaz conversia ntre curgerea H+ i sinteza ATP, iar F1 este statorul motorului ATP-azei. Energia de rotaie a motorului ATPazei nu este folosit pentru propulsie, ci pentru sinteza ATP. Evenimentele transportului de e- sunt influenate de dou clase de ageni chimici: inhibitori i decuplani. Inhibitorii blocheaz fluxul e- i astfel inhib chiar fora proton-motrice: CO i CN-(cianida) se leag strns de anumii citocromi i inhib funcionarea lor. Decuplanii inhib sinteza ATP fr s afecteze transportul e-: substanele liposolubile ca dinitrofenolul i dicumarolul cresc permeabilitatea membranei i astfel fora proton-motrice este anulat. In compuii fosforilai, grupul fosfat este ataat prin atomul de O legat esteric. Nu toate legturile fosfat sunt macroergice (fosfoenol-piruvatul). Oxidoreductazele care folosesc ali acceptori de eNitrat-reductaza este enzima implicat n respiraia anaerob a nitratului, cupleaz fosforilarea respiratorie cu reducerea NO3-, n absena O2. E. coli are 2 izoenzime nitrat-reductaze: NAR membranar i NAR periplasmic; 2) Nitrit-reductaza (periplasmic), catalizeaz dou reacii de transfer al e-: - reducerea NO2- --- NO (oxid nitric) + H2O - reducerea O2 ---- H2O 3) Reductaza oxidului nitric (NOR) convertete NO --- N2O, n reacia de denitrificare. 4) Dimetil sulfoxid reductaza (DMS), ancorat de membran printr-un citocrom b. 5) Reductazele compuilor cu sulf, implicate n reducerea respiratorie a compuilor cu S. 6) Fumarat-reductaza reduce fumaratul ca acceptor final al unei catene transportoare de e-, rezultnd succinatul. Reaciile de oxido-reducere a componentelor catenei transportoare ndeplinesc dou funcii: 7) accept e- de la un donor i i transfer unui acceptor 8) conserv o parte din energie n procesele de fosforilare oxidativ. Cantitatea mare de energie produs n respiraie rezult din transferul e- prin catena transportoare, de la un component cu nivel redox mai crescut, la altul cu nivel redox mai sczut. Energia este captat n legturi macroergice, prin combinarea Pi cu ADP i formarea ATP. Fosforilrile oxidative au loc concomitent cu transferul protonilor(H+) ntre NADH-dehidrogenaz i flavoprotein, la jonciunea CoQ/citocrom i la jonciunea citocrom-oxidaz/O2. Unele componente ale catenei de respiraie flavoproteinele i quinonele accept numai protoni(H+), iar citocromii accept numai e-. In prezena O2, setul de enzime al catenei de respiraie este abundent la bacteriile strict aerobe i la cele facultativ anaerobe, cnd cresc n condiii de aerobioz. Numeroase bacterii heterotrofe (chimioorganotrofe) realizeaz un metabolism aerob. Ele oxideaz substraturi organice, acceptorul final de e- fiind O2: M. tuberculosis, Bacillus sp., Pseudomonas, Agrobacterium etc. Mecanisme de conservare a energiei Funcia chimic esenial a proceselor metabolice productoare de energie este aceea de a furniza compui organici cu legturi chimice cu coninut energetic ridicat. Metaboliii fosforilai acumuleaz o cantitate variabil de energie liber. Molecula cea mai important cu rol de transportor de energie este ATP, cu un coninut de energie liber de 8 kcal/mol pentru fiecare legtur fosfat. ATP realizeaz un transfer de energie ntre moleculele cu coninut ridicat de energie liber i cele care particip la reaciile consumatoare de energie. Reaciile de fosforilare n cursul crora sunt sintetizate molecule cu coninut energetic ridicat i n special ATP prezint un interes special pentru metabolismul energetic bacterian. Valoarea energetic a unei ci metabolice se estimeaz dup numrul de molecule de ATP sintetizate prin oxidarea unei molecule de substrat (de exemplu, glucoz). Reaciile de fosforilare sunt de trei feluri i au sedii celulare distincte:

1)

reacii de fosforilare la nivelul substratului, catalizate de enzime citoplasmatice; reacii de fosforilare oxidativ, catalizate de enzimele localizate la nivelul membranei citoplasmatice i a intruziilor sale; 3) reacii de fosforilare fotosintetic. Ciclul Krebs este iniiat prin condensarea acetil-CoA cu oxaloacetatul, pentru a forma acidul citric (fig. 55). Intr-o succesiune de reacii ciclice se produce oxidarea aerob a gruprii acetil, care provine nu numai din glicoliz sau din untul hexozo-monofosfatului, ci i din beta-oxidarea acizilor grai, ca i din degradarea catenei de carbon a majoritii aminoacizilor. Ciclul Krebs furnizeaz compuii care iniiaz cile de biosintez.

1) 2)

Fig. 55. Reaciile ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs).

Fiecare tur al ciclului, pornind de la acetil-CoA elibereaz dou molecule de CO2 i 8 H+, sub forma a dou molecule de NADH + H+, una de NADPH + H+ i una de FADH2. Experienele pe preparate mitocondriale denot c n timpul transportului unei perechi de e- ntre NAD i O2 se sintetizeaz 3 molecule de ATP. Randamentul energetic global al oxodrii unei molecule de glucoz prin glicoliz i prin ciclul Krebs este de 38 molecule ATP. La bacterii, numrul real de molecule de ATP sintetizate nu este cunoscut, datorit prezenei ATP-azei. Determinrile indirecte sugereaz un bilan identic, dar msurtorile directe evideniaz l6 molecule ATP/o molecul de glucoz.

Mecanisme moleculare protectoare care permit respiraia aerob Multe reacii biochimice eseniale pentru metabolismul aerob al celulei necesit transferul a 4 e- la molecula de O2 pentru a forma H2O (dup reacia: O2 + 4e- + 4 H+ = 2H2O). De cele mai multe ori transferul are loc simultan, fr formarea altor intermediari ai reducerii. Deoarece O2 este un oxidant puternic i acceptor de mare afinitate al e-, el poate avea rolul de acceptor de e- nu numai la captul catenei respiratorii membranare, ci i n alte reacii de oxidare a substratului, catalizate de enzimele solubile n citoplasm. Aceste reacii pot fi fiziologice, productoare sau neproductoare de energie sau sunt nefiziologice i n anumite condiii sunt letale, deoarece O2 molecular este redus secvenial, univalent, formnd intermediari reactivi cu diferite grade de toxicitate. Reducerea O2 cu un singur e- produce radicalul superoxid (.O2-), care la pH fiziologic se reduce nc odat univalent i formeaz H2O2 (produsul reducerii bivalente) (fig. 56).

Fig. 56. Reducerea complet a unei molecule de O2 la ap, necesit 4 electroni. n acest proces se formeaz compui intermediari (radicalul anionic superoxid (O-2) peroxidul de O (H2O2) i radicalul hidroxil (OH-). Ionul O-2 este eliminat de superoxid dismutaze (SOD), iar H2O2 este ndeprtat de catalaze i peroxidaze.

In consecin, celula bacterian este supus permanent unui stress oxidativ, care, funcional se poate defini ca ca un exces de oxidani* n mediul celular, deoarece n anumite condiii, rata producerii intermediarilor reducerii pariale a O2 depete capacitatea celulei de a-i elimina.
*

Oxidanii sunt molecule care pot s se reduc prin oxidarea altor molecule.

NO . (oxidul nitric) se formeaz prin aciunea nitric-oxid-sintazei (NOS), care oxideaz L-arg la citrulin i NO.. Microorganismele sunt expuse aciunii NO. endogen rezultat prin reacia de denitrificare(reducerea respiratorie a nitrailor) la multe bacterii i fungi. Reacia O2- cu NO formeaz un oxidant puternic - peroxinitritul ONOO-. Reacia este de 3 ori mai puternic dect inactivarea O2- sub aciunea SOD. Peroxinitritul se formeaz cu o rat optim la concentraii echivalente de NO i O2-. Intermediarii reducerii O2 reacioneaz cu toate tipurile de macromolecule i produc leziuni ale moleculelor de ADN, ARN, proteine, iar prin peroxidarea lipidelor apar leziuni membranare. Toate organismele i-au dezvoltat mecanisme protectoare pentru a atenua efectele oxidanilor. Mecanismele de aprare a celulei fa de stressul oxidativ sunt de dou categorii: preventive i reparatorii. Mecanismele preventive acioneaz prompt i previn apariia leziunilor oxidative, prin distrugerea derivailor reactivi ai O2 sau limiteaz durata aciunii unor reacii, ca de exemplu, peroxidarea lipidelor. Peroxidul de H (H2O2) rezult prin transferul a doi e-, la o molecul de O2, catalizat de NADH-oxidaz, dup reacia: H2O2 are o toxicitate moderat. Oxideaz componentele membranare i enzimele, lezeaz ADN i produce mutaii, inhib procesele de transport membanar. H2O2 este ndeprtat, cel mai adesea sub aciunea catalazei, prin conversia la H2O i O2, sau a peroxidazelor, care o reduc la H2O, dup reacia: O molecul de H2O2 se reduce, iar alta se oxideaz.

Catalaza este o enzim neinductibil, cel mai adesea, un homotetramer cu un protohem/subunitate. Este produs abundent de bacteriile aerobe i de cele facultativ aerobe. Cele microaerofile produc cantiti mici de catalaz. Enzima nu este produs de bacteriile strict anaerobe i nici de cele anaerobe aerotolerante. Unele bacterii lactice sintetizeaz totui o catalaz adevrat, dac n mediu se gsete hemina, deoarece ele nu sintetizeaz grupul prostetic hem al catalazei. Peroxidazele sunt flavoproteine fr metale grele i catalizeaz dehidrogenarea unui substrat (AH 2), n prezena H2O2. Cea mai important este NADH-peroxidaza: Glutationul este substratul glutation-peroxidazei (GP) care ndeprteaz H2O2 i peroxizii lipidici care rezult din atacul radicalilor liberi asupra lipidelor. GP este reciclat pe calea glutation-reductazei, pentru a ndeprta alt molecul de H2O2. Glutationul elimin, de asemenea, .OH i peroxizii lipidici care rezult din atacul radicalilor liberi asupra lipidelor. Ionul O2- (superoxid) se formeaz n cantiti mici n timpul procesului respirator normal. Are reactivitate moderat, capabil s acioneze ca oxidant sau ca reductor n sistemele biologice. Este relativ stabil, ceea ce i permite s difuzeze la distane relativ mari nainte de a-i exercita efectele toxice. O2. generat extracelular poate dobndi acces la intele intracelulare pe calea canalelor pentru anioni. La pH acid (n focarul inflamator sau n interiorul fagosomului), O2se protoneaz i formeaz HO2. cu sarcin neutr i de aceea trece mai uor prin membrane i reacioneaz cu sine nsui, formnd H2O2. O2- produce distrugerea oxidativ a lipidelor i a altor componente ale celulei. Are durata de aciune cea mai lung dintre toi intermediarii reducerii O2 i aciunea sa se poate produce succesiv, asupra mai multor molecule. O 2- este eliminat sub aciunea superoxid-dismutazelor (SOD). SOD se combin cu 2 molecule de O2-, dup reacia: Ionul superoxid este eliminat rapid i nu se acumuleaz n celul. Anihilarea .O2- este o strategie esenial de aprare, deoarece nu numai c limiteaz aciunea sa direct, dar previne reducerea Fe mediat de .O2- i generarea .OH. Sunt 3 forme de SOD n natur: eucariotele, unii fungi i puine bacterii produc n special CuZnSOD, homodimere, cu 2 subuniti identice legate necovalent, fiecare cu cte un atom de Cu i Zn. Bacteriile anaerobe obligate produc n special FeSOD(dimeri), iar cele aerobe produc predominant MnSOD(dimeri i tetrameri). Unele bacterii produc ambele tipuri de SOD. Unele bacterii patogene(M. tuberculosis) secret FeSOD n mediul extracelular, ca o cale de rezisten la atacul oxidant. La bacteriile facultativ-anaerobe (E. coli), SOD este periplasmic i nivelul activitii ei crete dup expunerea la O2. Nocardia asteroides are activitate SOD asociat cu peretele celular, care poate fi secretat n mediul extracelular i conine cantiti echimolare de Fe, Mn i Zn. Singurele organisme care nu posed enzime protectoare sunt bacteriile anaerobe stricte. De aceea, O2 exercit efecte toxice letale asupra lor. Radicalul hidroxil liber (OH.) se formeaz prin reducerea trivalent a O2 in vitro, prin reacia H2O2 cu .O2-. Aceast reacie este amplificat de un catalizator metalic (Fe3+). Se formeaz i ca rezultat al aciunii radiaiei ionizante. OH. este cel mai reactiv dintre intermediarii reducerii O 2 , fiind cel mai puternic agent oxidant. Efectele sale oxidante se manifest asupra tuturor categoriilor de molecule organice (proteine, ADN, lipide). Este probabil, unul dintre agenii moleculari care omoar celulele dup iradiere x sau gama. Datorit reactivitii foarte nalte, difuzia .OH este limitat nainte de a ntlni substraturile oxidabile. Mecanismul aciunii sale const n iniierea cascadei radicalilor liberi. Oxidarea acizilor grai nesaturai ntr-o membran lipidic poate produce radicalul peroxil (HO2), care reacioneaz cu alte molecule lipidice nvecinate, genernd ali radicali lipidici. Se iniiaz reacia n lan a radicalilor liberi, care se propag la situsuri ndeprtate de situsul primar al reaciei. Oxigenul singlet (1O2) este o form molecular cu energie superioar i se formeaz cnd cei doi e- pereche dobndesc spini antiparaleli, fie c se afl pe acelai orbital, fie pe orbite diferite. In aceast form, O 2 nu primete un electron suplimentar, ci numai energie suplimentar, care schimb spinul unuia dintre electroni. 1 O2 este un poluant atmosferic. Poate fi produs fie spontan, fie prin sisteme enzimatice. Cea mai comun cale chimic a producerii sale este reacia O2 cu lumina vizibil. Procesul implic prezena unei molecule a unei substane colorate care absoarbe lumina. 1 O2 se genereaz prin aciunea lactoperoxidazei i mieloperoxidazei, prezente n lapte, saliv i n fagocite. In fagocite, 1O2 are rolul de a omor agentul fagocitat. In prezena 1O2 se produc reacii de oxidare, al cror rezultat este distrugerea oxidativ a componentelor celulare vitale, ca de exemplu, fosfolipidele membranei celulare. Mecanismele reparatorii acioneaz tardiv i repar leziunile cauzate de molecule reactive care nu au fost anihilate de sistemele de aprare preventiv. Fiecare condiie de stress induce sinteza unui set de proteine, unic pentru categoria agentului inductor al stressului. Unele proteine induse de stressul oxidativ sunt comune i pentru alte tipuri de stress (stressul hipertermic, infometarea etc.).

Stressul oxidativ altereaz numeroase ci metabolice. Gradul de alterare este dependent de capacitatea de rspuns al celulei la stress. Eliminarea timpurie a stresului oxidativ, prin mecanismele preventive este esenial pentru supravieuirea celulei. Respiraia anaerob Majoritatea organismelor capabile de respiraie anaerob sunt procariote. Unele dintre bacteriile heterotrofe care realizeaz respiraia anaerob au caten de respiraie i sunt facultativ anaerobe. In prezena O2, realizeaz metabolism oxibiotic. Transformrile chimice pe care le realizeaz n timpul generrii energiei, n absena O2 au o deosebit importan ecologic sau industrial. In absena O2, bacteriile heterotrofe facultativ-anaerobe i obin energia din substratul energetic, fie prin respiraia anaerob, fie prin fermentaie. Respiraia anaerob este mai eficient din punct de vedere energetic, comparativ cu fermentaia. In procesul respiraiei anaerobe, e- cedai de substratul organic oxidabil sunt preluai de catena de respiraie celular i sunt transferai unui acceptor final, care este fie un compus oxigenat (nitrat, sulfat, carbonat), fie unui singur compus organic (fumaratul) (fig. 57). Transferul e- de-a lungul catenei respiratorii este cuplat cu fosforilrile oxidative membranare.

Fig. 57. Acceptorii finali de electroni n respiraia anaerob i n fementaii. Catabolismul compuilor organici produce CO2.

Respiraia nitrailor Unele bacterii realizeaz reducerea dezasimilatorie a nitrailor la nitrii, iar altele reduc att nitraii la nitrii, precum i nitriii la oxizi de azot i ulterior pn la N 2. Procesul fiziologic al reducerii nitrailor la N2 se numete denitrificare i are loc att n mediile naturale ct i in vitro. Nitratul, nitritul i respectiv oxizii de azot au rolul de acceptori de e-, care deriv din oxidarea unor compui organici, pentru producerea energiei. La E. coli, n condiii de anaerobioz, sistemul enzimatic al reducerii nitratului este inductibil. In prezena lactatului (substrat nefermentabil) ca surs de carbon i energie i a nitratului este indus sinteza nitrat-reductazei (NAR), o enzim ce conine Mo. De aceea, procesul denitrificrii este strict anaerob. Reducerea nitratului are loc dup reacia:

Reacia este dezasimilatorie, deoarece nitraii sunt redui la nitrii, care, n cazul E. coli se acumuleaz n mediu i au un efect toxic, inhibitor pentru cretere, nitritul nefiind o surs de azot asimilabil. Reducerea dezasimilatorie limitat a NO3- la NO2- se numete respiraia nitratului. La unele bacterii denitrificatoare, n procesul respiraiei anaerobe a nitrailor, este indus tot setul de enzime reductoare, astfel nct reducerea nitrailor este total, pn la N2, n urmtoarele etape:

Reacia (1) este catalizat de NAR(A), treapta a 2-a, de nitrit-reductaz, iar reaciile 3 i 4, de enzime necunoscute. Fiecare treapt de reducere este cuplat cu sinteza ATP. Unele procariote catalizeaz numai o parte a reaciilor cii reducerii nitrailor. Calea incomplet este utilizat n dou situaii:

cnd bacteriile posed echipamentul enzimatic necesar celor 4 trepte, dar n mediu se gsesc numai intermediari mai redui dect nitratul; 2) cnd bacteriile au incapaciti genetice de a cataliza una sau alta din treptele reducerii. In funcie de incapacitile genetice de sintez, variantele biochimice ale denitrificrii sunt urmtoarele: organisme capabile s reduc nitratul la nitrit, crora le lipsesc enzimele pentru treptele 2, 3, 4; 2. organisme capabile s reduc nitratul pn la N2O (oxid nitros), crora le lipsete enzima pentru catalizarea treptei a 4-a; organisme capabile s reduc nitritul, la N2, dar nu au capacitatea de a cataliza reacia treptei l; 4. organisme capabile s reduc nitratul la nitrit i oxidul nitric la N2O, crora le lipsesc enzimele ce catalizeaz reaciile 2 i 4. Majoritatea bacteriilor aparin primei categorii. Nu sunt denitrificatoare, deoarece activitatea lor nu este nsoit de producerea N2 (gazos). Funcia respiratorie a NAR (A) permite bacteriilor s creasc n anaerobioz n prezena nitratului i a unei surse oxidabile, dar nefermentabil, de energie. Intr-un mediu fr substrat fermentabil i fr nitrat, E. coli crete numai n aerobioz. In procesul respiraiei anaerobe, oxidarea substratului energetic este complet, deoarece ciclul Krebs este funcional, ca i n respiraia aerob. Oxidarea complet a unei molecule de glucoz are loc dup urmtoarele reacii globale:

1)

Pentru o molecul de glucoz oxidat se sintetizeaz 24 molecule de ATP, mult mai mult dect n fermentaie, dar mai puin dect n oxidarea aerob. Oxidarea substratului organic n condiiile respiraiei anaerobe a nitratului este complet, singurul produs final fiind CO2. De aceea, bacteriile facultativ anaerobe, n prezena nitratului, au un randament superior de cretere, n raport cu creterea n condiii fermentative. Unele bacterii(Shigella, Salmonella, Escherichia, Proteus, Brucella, Clostridium) reduc nitratul numai n absena substratului care n mod obinuit are rolul de acceptor de e-. In mediu se acumuleaz nitrii toxici care limiteaz creterea. Alte bacterii sunt specializate pentru reducerea dezasimilatorie a NO3- i a NO2- pn la NO sau N2O, care ulterior sunt redui la N2: Pseudomonas, Alcaligenes etc. Cel mai adesea, bacteriile nitrat-reductoare sunt heterotrofe i n prezena O2 sunt aerobe. Ele prefer respiraia aerob, deoarece au caten respiratorie. Catena funcioneaz i n anaerobioz, dar la captul ei, acceptorul final de e- este nitratul. Nitrat-reductazele dezasimilatorii sunt proteine legate de membran. In prezena O2, sinteza lor este represat, dar este indus n condiii anaerobe. Reducerea dezasimilatorie a NO3- este limitat la bacterii, dar cele care catalizeaz acest proces sunt foarte diverse sub raport fiziologic. Reducerea nitratului este o modalitate alternativ de respiraie i pentru bacteriile care oxideaz H2. Oxidarea H2 este cuplat cu reducerea NO3-, pn la N2. Bacteriile sulfoxidante (Thiobacillus) oxideaz So, reacia fiind cuplat de asemenea cu reducerea NO3- la N2, dup urmtoarea reacie global:

Importana ecologic. Bacteriile denitrificatoare sunt foarte rspndite n mediile naturale. Procesul denitrificrii este foarte important, deoarece constituie una dintre treptele circuitului azotului n natur (astfel se formeaz aproape tot N2 atmosferic), dar are efect negativ deoarece diminu randamentul productiv al fertilizatorilor cu azot, obinui pe cale industrial. Astfel se pierde 5-80% din cantitatea de fertilizatori cu azot. Bacteriile denitrificatoare realizeaz scderea concentraiei compuilor azotai din staiile de epurare a apelor uzate, nlturnd pericolul eutrofizrii bazinelor n care se deverseaz. Denitrificarea este calea prin care, compuii cu azot, levigai din sol i transportai n oceanul planetar sunt reciclai la N2 atmosferic, acesta devenind din nou disponibil proceselor biologice prin fixare. Unul dintre produsele reaciei de denitrificare oxidul nitros (N 2O) difuzeaz spre stratosfer, unde, ntr-o reacie fotochimic este convertit la oxid nitric (NO). NO reacioneaz cu O3, formnd nitritul care se ntoarce sub forma ploii acide. Rezultatul este distrugerea stratului de O3 care protejeaz organismele vii de radiaia UV.

Reducerea asimilatorie a nitrailor Cele mai multe bacterii, dar i fungii, algele i plantele superioare au activitate nitrat-reductazic NAR(A), cu funcie asimilatorie, adic enzima reduce nitratul la NH4+. Reducerea nitrailor la nitrii este urmat de o serie de reacii de reducere, consumatoare de energie, al cror rezultat final este formarea NH4:

Reducerea asimilatorie a nitratului nu este productoare, ci consumatoare de energie. Nitrat-reductaza asimilatorie este o protein citoplasmatic (solubil). In prezena NH 4, sinteza ei este represat. La fiecare treapt a reaciei are loc transferul a 2 e-. Treptele reaciei reducerii asimilatorii au loc n condiii de aerobioz. NH4 este sursa de azot asimilabil pentru toate bacteriile chimioorganotrofe. La bacterii, NH4 este asimilat pe dou ci majore: calea glutamin-sintazei (GS) i glutamat-sintazei (GOGAT). O cale alternativ de asimilare, la multe bacterii, inclusiv enterobacterii este calea glutamat-dehidrogenazei (GDH), mai puin eficient energetic dect cile GS/GOGAT. GDH are afinitate mai mic pentru amoniu i este ineficient n celulele care cresc n condiii de limitare a sursei de azot. Reducerea asimilatorie i cea dezasimilatorie a NO3- (denitrificarea) nu par a fi procese fiziologice corelate n mod obligatoriu. Unele bacterii catalizeaz ambele tipuri de reacii. Altele fac numai reaciile reducerii dezasimilatorii ale NO 3 i nu pot s-l asimileze, iar o alt categorie asimileaz NO3, dar nu fac reacia de denitrificare. La organismele capabile s catalizeze ambele tipuri de reacii, distincia dintre cele dou procese se face prin expunerea culturii la O 2. De exemplu, P. aeruginosa poate asimila NO3 n prezenta sau n absena O2, dar denitrificarea are loc numai in condiii de anaerobioz. Respiraia sulfatului Sulfatul, anionul major n apa mrii, este cel mai oxidat compus al sulfului i are rol de acceptor final de e- n procesul oxidrii anaerobe a unor compui organici de ctre organismele unui grup fiziologic special, al bacteriilor sulfatreductoare. SO42- i So au rol de acceptori de e- n condiii anoxice pentru un grup larg de bacterii chimioorganotrofe sau chimiolitotrofe hidrogen-oxidante. Ele posed echipamentul enzimatic care catalizeaz reducerea dezasimilatorie a sulfatului. Produsul final al reducerii SO42- este H2S, care se poate acumula n cantiti mari n mediile naturale. Bacteriile sulfat-reductoare sunt strict anaerobe i oxideaz diferite substraturi organice. Ele constituie un ansamblu fiziologic i ecologic de tipuri morfologice diferite de bacterii anaerobe, care au n comun capacitatea de a activa SO42- i de a-l reduce la H2S. Bacteriile din grupul I (Desulfovibrio, Desulfomonas, Desulfotomaculum) utilizeaz lactatul, piruvatul, etanolul, malatul etc., dar i H2 i reduc SO42- la H2S. Substraturile organice sunt oxidate la acetat, deoarece bacteriile sulfat-reductoare (Desulfovibrio, Desulfotomaculum) nu au echipamentul enzimatic al ciclului Krebs. Acetatul este secretat ca produs final. Bacteriile din grupul al II-lea (Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfonema) oxideaz acizii grai i n special acetatul, pn la CO2 i reduc SO42- la So. Desulfosarcina, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfotomaculum sunt unice printre sulfat-reductori prin capacitatea lor de a crete chimioautotrof cu H2 ca donor de e-, CO2 ca singur surs de C i SO42- ca acceptor de e-. Toate bacteriile sulfat-reductoare sunt strict anaerobe. Reducerea dezasimilatorie a sulfatului este un proces respirator obligatoriu pentru acest grup fiziologic i nu o cale alternativ a respiraiei, aa cum este denitrificarea. Sulfatul este redus la H2S dup urmtoarea reacie; Bacteriile sulfat-reductoare reprezint una dintre formele vechi de via ale planetei i particip la producerea i transformarea depozitelor minerale n natur. Ali compui oxidai ai sulfului (sulfitul SO32-, tiosulfatul S2O32-, tetrationatul S4O62-) pot fi utilizai ca acceptori de e- i sunt redui la H2S n procese dezasimilatorii. Reducerea lor este catalizat nu numai de bacteriile sulfatreductoare, ci i de alte grupe fiziologice. Reducerea bacterian a sulfatului este un proces important pentru mineralizarea materiei organice n mediile anoxice, n special n sistemele marine (cu salinitate de 1-4%, n care cresc Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfococcus) i n mediile hipersaline.

Oxidarea complet a materiei organice la CO2 cu reducerea simultan a SO42- la H2S nu depinde de fermentaiile sintrofice. Pe lng capacitatea de a folosi SO42- ca acceptor de e-, multe bacterii sulfat-reductoare pot folosi NO3- ca acceptor de e-, pe care-l reduc la NH3 sau fermenteaz anumii compui organici pentru producerea E, n absena acceptorilor finali de e- (de exemplu, piruvatul este fermentat la acetat, CO2 i H2). SO42- este un acceptor de e- mai puin favorabil creterii bacteriene, comparativ cu O2 sau NO3-, dar se elibereaz suficient E pentru sinteza ATP. Bacteriile sulfat-reductoare i metanogenele sunt dou populaii care intr n competiie metabolic pentru aceleai substraturi. Ambele tipuri catalizeaz stadiile finale ale mineralizrii anaerobe a materiei organice i ambele depind de microorganismele fermentative care convertesc materia organic complex, la compui mai simpli (H2, CO2 i acetat). Se accept c cele dou grupe se exclud reciproc. Mediile bogate n sulfat selecteaz bacteriile sulfat-reductoare, iar cele fr sulfat selecteaz metanogenele. Totui, cele dou grupe coexist n medii cu sulfat. Reducerea So. Bacteriile care folosesc So ca acceptor final de e- genereaz H2S, dar nu reduc SO42- la H2S. Reducerea asimilatorie a sulfatului Bacteriile i organismele superioare (plante i animale) preiau sulful necesar din sulfat. Sulful are numrul de oxidare 2 n compuii organici i +6 n SO42-, o diferen de 8e-. Asimilarea S implic reducerea SO42- la H2S, nainte de ncorporarea sa n compui organici. Aceiai reacie de reducere are loc n procesul fiziologic al respiraiei anaerobe a SO42-, dar mecanismele enzimatice sunt diferite. Reducerea SO42- pentru a fi folosit ca surs de H2S se numete reducerea asimilatorie a sulfatului. SO42- este activat de ATP. ATP-sulfurilaza catalizeaz legarea ionului SO42-, de un fosfat al ATP i rezult adenozin-fosfo-sulfatul (APS). O alt grupare fosfat este adaugat la APS i se formeaz fosfo-adenozin-fosfo-sulfatul (PAPS), dup care ionul SO42- este redus. Ca i n reducerea dezasimilatorie, primul produs al reducerii SO42- este sulfitul (S2O32-). In reaciile de reducere asimilatorie a SO42-, H2S format este convertit la sulf organic, iar n cele de reducere dezasimilatorie, H2S este excretat. H2S este ncorporat n substratul organic, ca atom de S al cisteinei. La bacterii, substratul organic acceptor al S este O-acetilserina, dup reacia; Ali acceptori finali de eFe3+ are rol de acceptor de e- n metabolismul energetic la o varietate de bacterii chimioorganotrofe i chimiolitotrofe pentru c este abundent n mediile naturale. Potenialul reductor al Fe3+/Fe2+ este foarte electropozitiv (+ 0,77 V la pH 2). Reducerea Fe3+ poate fi cuplat cu oxidarea unor donori de e-, organici sau anorganici. Geobacter metallireducens oxideaz acetatul, odat cu reducerea Fe3+ la Fe2+. Fe3+ este unul dintre cele mai comune metale n sol i roci. Reducerea Fe3+ la Fe2+ este important deoarece furnizeaz o form mai solubil a Fe. Mn metalic are mai multe stri de oxidare, Mn4+ i Mn2+ fiind cei mai stabili i cei mai relevani. Bacteriile chimioorganotrofe fac reducerea anoxic a Mn4+ la Mn2+. Potenialul redox al cuplului Mn4+/Mn2+ este foarte mare, astfel c unii compui organici pot dona e- pentru reducerea Mn4+. Ali compui anorganici care pot funciona ca acceptori de e- n respiraia anaerob sunt Se i As. In natur nu se gsesc n cantiti mari, dar sunt poluani i pot suporta creterea anoxic a unor bacterii. Reducerea SeO 42- (selenat)la SeO3- (selenit)i chiar la Seo (metalic) este o metod important pentru ndeprtarea Se din ap (bioremediere). Respiraia fumaratului In procesul respiraiei anaerobe, rolul de acceptor final de e - l au nu numai compuii anorganici (nitrai, nitrii, sulfatul), ci i fumaratul, un compus organic. n respiraia fumaratului, transferul de e- se face, ca i n procesul respiraiei aerobe, pe calea unei dehidrogenaze, a unei lipoquinone, unul sau mai muli citocromi b si a unei fumarat-reductaze (o feredoxin), legat covalent cu grupul prostetic FAD. Fumarat-reductaza catalizeaz urmtoarea reacie:

Fumarat-reductaza oxideaz NADH, lactatul, formiatul, glicerolul. Sursele de fumarat ale celulei sunt multiple: fumaratul se formeaz din malat, aspartat, piruvat. Reducerea unei molecule de fumarat produce o molecul de ATP. E. coli crete ntr-un amestec de H2 sau formiat i fumarat ca surs de carbon i energie. Trimetil-amin-oxidul (TMAO) este un acceptor organic de e-, fiind i o substan de echilibru osmotic la petii marini, unde are rolul de a excreta excesul de N. O varietate de bacterii reduc TMAO la TMA (trimetil-amin). TMA are un miros puternic i o parte din mirosul degajat de petele marin alterat se datoreaz TMA format prin aciunea bacteriilor facultative care pot folosi TMAO ca acceptor de e-. Un analog al TMAO este DMSO (dimetil-sulfoxid), care este redus de unele bacterii la DMS (dimetilsulfit).

Trimetil amin-oxid Respiraia carbonatului( Reducerea respiratorie a CO2) Carbonatul (CO2 sau HCO3-) este unul din cei mai abundeni anioni anorganici n natur. CO 2 este produsul metabolismului organismelor heterotrofe. Apa mrii este o soluie de carbonat, tamponat cu diferite sruri. Unele bacterii folosesc CO2 ca acceptor de e- n respiraia anaerob. Dintre bacteriile care reduc CO 2, cele mai importante sunt metanogenele. Donorul de e- este H2. Metanogenele cresc n condiii de chimiolitotrofie, ntr-un mediu mineral i o atmosfer gazoas format din amestec de CO2 i H2. O parte a CO2 este asimilat, adic este folosit pentru sinteza compuilor celulari, dar nu este fixat pe calea reductiv a ciclului Calvin, ci printr-un alt set de reacii specifice grupului. O alt parte a CO2 este redus la CH4. Metanogenele sunt frecvente n mediile naturale, deoarece n reacia de oxidare a H2, cuplat cu reducerea carbonatului, se elibereaz o cantitate relativ mare de energie: Alte bacterii care reduc CO2 sunt acetogenele (Cl. aceticum, Acetobacter woodii). Ele produc acetat din CO2 i H2, dup reacia: Cnd cresc ntr-un mediu care conine o atmosfer format din amestecul de H 2 i O2,, att metanogenele ct i acetogenele sunt chimiolitotrofe i sunt strict anaerobe. Ambele grupe se dezvolt i ca heterotrofe pe medii organice.

Fermentaia Denumirea de fermentaie vine de la latinescul fervere, care nseamn a fierbe i semnific degajarea, uneori abundent, a CO2 n timpul fermentaiei i i confer aspectul de fierbere. Fermentaia este un proces catabolic productor de energie n absena O2, n care compuii organici au rolul de donori i de acceptori de electroni. Compuii chimici care ndeplinesc aceste funcii sunt, de regul, metabolii derivai dintr-un substrat fermentabil(de exemplu, un glucid). Procesele redox se produc n absena oricrui acceptor terminal de electroni. Studiul tiinific al fermentaiilor a fost iniiat de L. Pasteur. In perioada l857-l875, el a demonstrat c procesele de transformare biochimic a unor substraturi sunt consecina vieii fr aer a unor microorganisme, cu rolul de fermeni. Fermentaia poate fi definit ca un ansamblu de reacii biochimice anaerobe de oxidare i de reducere care furnizeaz celulei energia necesar prin mecanismul fosforilrilor la nivelul substratului, care au loc n citoplasm. Funcia energetic major sau unic a fermentaiei este producerea ATP. ATP rezult prin transferul grupelor fosfat, din intermediarii fosforilai cu potenial energetic nalt, ce se formeaz n timpul degradrii substratului. Fermentaiile se desfoar n condiii anaerobe. La microorganismele strict anaerobe i la cele aerobe facultativanaerobe, n prezena O2, cile fermentative sunt represate. Cele strict anaerobe nu se dezvolt, iar cele facultativ-anaerobe i schimb calea metabolic de producere a energiei, de la fermentaie la respiraie. Numai bacteriile lactice constituie o excepie: O2 nu modific modul lor de a produce energie, astfel nct fermentaia continu chiar n prezena O 2. Efectul inhibitor al O2 asupra fermentaiei, la microorganismele facultativ anaerobe ar fi datorat inactivrii uneia din enzimele cheie ale cii Embden-Meyerhof, fosfofructokinaza. La microorganismele aerobe-facultativ anaerobe, inhibiia fermentaiei n aerobioz poart denumirea de efect * Pasteur i se manifest prin diminuarea net a cantitii produselor de fermentaie, precum i prin creterea randamentului energetic ce se reflect n producerea unui volum net superior de biomas pentru aceiai cantitate de substrat consumat.
O celul facultativ-anaerob metabolizeaz glucoza pe cale aerob sau anaerob. In anaerobie, glucoza este degradat la lactat, rata degradrii fiind mult mai mare dect n condiii aerobe. Diferena se datoreaz randamentului mai mic de sintez a ATP/molecul, n timpul glicolizei: se produc 2 molecule de ATP/molecul, iar n aerobioz se sintetizeaz 36 molecule de ATP. In anaerobie, pentru sinteza aceleiai mase celulare este necesar de 18 ori mai mult glucoz. Dac suspensia celular anaerob se oxigeneaz, rata de consum a glucozei scade foarte mult, iar acumularea lactatului scade pn spre 0. Fenomenul inhibrii consumului de glucoz i stoparea acumulrii lactatului n prezena O2 se numete efect Pasteur. Efectul sa descoperit pentru fermentaia alcoolic, dar este o caracteristic a tuturor celulelor facultative, inclusiv a celulelor musculare.
*

Substraturile fermentabile sunt compui organici diveri: glucide sau compui nrudii (acizi organici, alcooli), aminoacizi, amine, purine, pirimidine. In procesul fermentaiei, anumii compui organici, de obicei doi metabolii diferii, derivai dintr-un substrat fermentabil au rolul de donor i respectiv, de acceptor de e-. In procesul fermentativ este meninut echilibrul redox. Nivelul mediu de oxidare a produselor finale este egal cu al produsului fermentabil: din glucoz rezult att metabolii oxidabili ct i reductibili. Degradarea substratului n fermentaie este incomplet i de aceea se elibereaz o cantitate mult mai mic de energie dect n procesul de respiraie, n cursul creia oxidarea substratului este complet. Procesele de fermentaie sunt iniiate de fosforilri la nivelul substratului. Rezultatul lor este sinteza ATP, dar i a altor compui cu o legtur bogat n energie, cel mai important fiind acetil-CoA (fig. 58). Diferena esenial ntre metabolismul aerob i anaerob const n soarta acidului piruvic i a NADH. n metabolismul aerob, NADH este oxidat n catena transportoare de e-, cu sinteza ATP prin fosforilare oxidativ, iar n anaerobioz NADH este folosit n reducerea anaerob a compuilor organici.

Fig. 58. Structura moleculara a acetil CoA.

Fermentaia glucidelor Glucidele sunt cele mai importante substraturi fermentabile. Bacteriile fermenteaz polizaharide (amidonul, celuloza, pectina, chitina), dizaharide (lactoza, maltoza, zaharoza), hexoze (glucoza, fructoza, galactoza), pentoze (arabinoza, xiloza), acizi derivai din zaharuri (acidul gluconic i glucuronic), polialcooli (manitol, glicerol). Fermentaia diferitelor glucide are loc n una sau n cteva etape specificice, urmate de o etap nespecific. In etapa nespecific intervin unele dintre enzimele implicate n fermentaia glucozei. Glucoza este fermentat, virtual, de toate bacteriile anaerobe. Fermentaia ei este cel mai cunoscut proces fermentativ i este iniiat printr-o reacie de fosforilare, n urma creia rezult glucozo-6 fosfatul. Procesul poate fi considerat c decurge n dou etape: - n prima etap se desfoar reaciile de oxidare a glucozei. Rezultatul lor este formarea intermediarului central al metabolismului fermentativ al glucidelor acidul piruvic. Acest compus este mai oxidat dect glucoza i diferena de potenial redox este stocat n piridin-nucleotidele reduse; - n etapa a II-a au loc reacii de reducere a compuilor intermediari, prin care se formeaz mai multe produse finale. Glucoza este oxidat pe una din urmtoarele 4 ci: - calea Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP, denumit i calea hexozo-difosfatului sau a glicolizei); - calea hexozo-monofosfatului (HMP, denumit i calea pentozo-fosfatului); - calea fosfocetolazei; - calea Entner-Doudoroff. Calea EMP este calea major de degradare a glucozei, la cele mai multe organisme, precum i n celulele vegetale i animale (fig. 59). Este o cale integral anaerob. Ea cuprinde o secven de l0 reacii enzimatice, prin care o molecul de glucoz este degradat la dou molecule de piruvat, fr participarea O2 molecular. Glucoza este fosforilat la glucozo-6 fosfat, n cursul procesului de transport membranar, sau intracelular, sub aciunea unei kinaze citoplasmatice, cu consum de ATP. Glucozo-6 fosfatul este izomerizat la fructozo-6 fosfat, iar acesta, sub aciunea fosfofructokinazei este convertit la fructozo-1,6 difosfat. Reacia caracteristic a cii EMP este scindarea fructozo-1,6 difosfatului, ceea ce justific denumirea de calea hexozo-difosfatului.

Fig. 59. Calea Embden-Meyerhoff-Parnas (calea glicolizei) de degradare a glucozei la piruvat.

Fructozo-1,6 difosfatul este scindat sub aciunea aldolazei i rezult un amestec de triozo-fosfai (aldehida-3 fosfogliceric i dihidroxiaceton-1 fosfat), reversibil interconvertibili. Numai gliceraldehid-3P poate fi degradat pe calea glicolizei. Intr-o prim etap, gliceraldehid-3 P este oxidat, cu reducerea NAD + i se formeaz dou molecule de acid 1,3 difosfogliceric. Printr-o serie de reacii, acidul l,3 difosfogliceric este convertit la piruvat:

Reacia de clivare a fructozo-1,6 difosfatului i formarea 3-fosfogliceroil-fosfatului. Se esterific fosfatul anorganic i se reduce NAD+.

In aceast reacie, aldehida 3-fosfogliceric este oxidat i adus la nivelul de oxidare al gruprii COOH. Este o reacie exergonic. Nu rezult acidul fosfogliceric liber, ci o anhidrid mixt a gruprii COOH a acidului 3-fosfogliceric i a acidului fosforic, adic 3- fosfogliceroil-fosfatul, un compus macroergic care conserv E potenial a oxidrii gruprii aldehidice la acid. In etapa urmtoare, 3-fosfogliceroil-fosfatul, transfer gruparea fosfat la ADP i se sintetizeaz ATP.

Conversia celor dou molecule de acid l,3-difosfogliceric la dou molecule de acid piruvic i regenerarea ATP. Calea EMP nu explic modul n care pentozele pot fi folosite ca surs de energie i nici formarea ribozei, necesar biosintezei acizilor nucleici. Fosforilrile n anaerobioz sunt puin numeroase, deoarece se produc numai n reaciile de dehidrogenare a substratului, neexistnd caten de respiraie. De exemplu, n fermentaia glucozei, fosforilarea are loc n dou etape : - prin conversia gliceraldehid- 3 P sub aciunea NAD - prin conversia fosfoenol-piruvatului la piruvat. Se sintetizeaz dou molecule de ATP. Reaciile de reducere a intermediarilor oxidai la produse finale (de exemplu, reducerea piruvatului la lactat) nu produc energie. Unele reacii de reducere sunt chiar consumatoare de ATP (de exemplu, formarea acidului piruvic). Producerea limitat de energie n procesele fermentative explic randamentul totdeauna inferior al creterii n anaerobioz, comparativ cu acela al procesului respirator. Piruvatul este intermediarul oxidat cel mai frecvent al diferitelor ci catabolice. Uneori se formeaz acetil-CoA. Reaciile de reducere a compusului oxidat intermediar (piruvatul) conduc la formarea diferitelor produse finale, fie unice, fie n amestec, pe baza crora se difereniaz bacteriile fermentative. In cazul n care rezult un amestec de produse finale, acestea au grade diferite de oxidare, de la CO 2 pn la alcool (mai redus dect glucoza), trecnd prin nivele intermediare de oxidare a cetonelor i aldehidelor. Produsele finale ale fermentaiei nu pot fi degradate n anaerobioz. Proporia lor n amestec influeneaz n mod direct valoarea pH a mediului la sfritul procesului. Analiza cantitativ a produselor finale ale unei fermentaii este util pentru caracterizarea unor grupe taxonomice. Glucoza este fermentat, virtual, de toate bacteriile anaerobe. Fermentaia lactic Fermentaia lactic este procesul biologic prin care microorganismele catabolizeaz glucoza din mediu i o tranasform n acid lactic. In cantitate mic, acidul lactic este produsul de catabolism a unui numr mare de microorganisme, dar unele bacterii furnizeaz acidul lactic, ca produs principal al metabolizrii glucidelor. Bacteriile lactice se mpart n dou categorii: a) bacteriile homofermentative produc numai acid lactic ca produs final al procesului fermentativ: Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus. L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, Streptococcus lactis, S. cremoris, S. thermophilus; b) bacteriile heterofermentative produc, pe lang acid lactic, cantiti mari ale altor produse finale (CO2, etanol, acid acetic, glicerin, manit, in funcie de specie): L. brevis, L. lycopersici, Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum, L. citrovorum. Cantiti mari de acid lactic sunt produse de unii fungi filamentoi (Rhizopus), dar pentru producerea industrial a acidului lactic se folosesc bacteriile lactice. Bacteriile lactice sunt Gram pozitive, nesporulate, anaerobe-aerotolerante sau microaerofile, mobile, nepatogene i cresc n mediu acid.

Acidul lactic (-hidroxipropionic) conine un atom de carbon asimetric i de aceea poate exista sub dou forme optic active: izomerii D(-) i L (+):

Lactat-dehidrogenaza este stereospecific. Izomerul rezultat din fermentaie depinde de natura dehidrogenazei lactice. Bacteriile homofermentative i Rhizopus oryzae (dintre fungii filamentoi) conin L-lactat-dehidrogenaza i produc lactat (L+). Cele heterofermentative conin o D-lactat-dehidrogenaz i formeaz acid D(-) lactic. Bacteriile lactice produc acid lactic optic inactiv, adic amestecul racemic al formelor D(-) i L(+). Racemizarea se datoreaz aciunii enzimei racemaza, existent la majoritatea bacteriilor lactice. Activitatea racemazei depinde de concentraia de acid nicotinic din mediu, un factor de cretere esenial pentru bacteriile lactice. In general, bacteriile lactice necesit prezena n mediu, a vitaminelor grupului B i a unor aminoacizi, care au rolul de factori de cretere. Diferenele dintre bacteriile homofermentative i heterofermentative sunt determinate de prezena sau de absena aldolazei, enzima cu rol esenial n glicoliz. Bacteriile homofermentative au aldolaz i cliveaz hexozodifosfatul la triozofosfai, iar n echipamentul enzimatic al celor heterofermentative, aldolaza lipsete. Din punct de vedere biochimic, fermentaia lactic este cea mai simpl: piruvatul, furnizat pe calea EMP este redus direct, fr decarboxilare, sub aciunea NAD+ - lactat-dehidrogenazei, la lactat. In acest proces fermentativ, acidul lactic este produsul final unic sau dominant cantitativ. In funcie de proporia produselor finale ale fermentaiei se disting trei tipuri de microorganisme: a) Microorganisme homofermentative (lactobacili, streptococi, unii fungi, unele protozoare). Acidul lactic este produsul unic al fermentaiei. Dintr-un mol de glucoz se formeaz doi moli de lactat. Acelai set de reacii are loc n celula muscular, n condiii de hipoxie: Glucoza degradat pe calea glicolizei:

b) Microorganisme heterofermentative (unele specii de Lactobacillus, Peptococcus) realizeaz o fermentaie heterolactic. Procesul ncepe pe calea hexozo-monofosfatului(HMP) i se continu pe calea fosfocetolazei. Calea HMP este o variant a cii glicolitice, activ la unele bacterii, pentru utilizarea hexozelor, pentozelor i a altor glucide. Este o cale de ocolire a cii glicolitice i de aceea se mai numete untul HMP sau calea pentozofosfatului, calea fosfogluconatului sau calea Warburg-Dickens-Horecker. Aceast cale furnizeaz uniti pentozice care sunt convertite la intermediari ai cii glicolitice i la acid piruvic. Prima reacie a untului HMP este fosforilarea glucozei, ca i n calea glicolizei. Glucozo-6 fosfatul este oxidat la acid-6 fosfogluconic.

Acidul fosfogluconic este decarboxilat la ribulozo-5-fosfat:

Ribozo-5 fosfatul este utilizat pentru sinteza acizilor nucleici, pentru glicoliz etc. Calea fosfocetolazei este o cale fermentativ restrns la bacteriile heterolactice. Este o variant a cii hexozomonofosfatului, cu care are n comun primele trei reacii ce conduc la formarea ribulozo-5 fosfatului. Acesta este izomerizat la xilulozo-5 fosfat. Fosfocetolaza, enzima caracteristic a cii, cliveaz xilulozo-5 fosfatul, la aldehida-3 fosfogliceric i acetil fosfat. Aldehida-3 fosfogliceric este metabolizat pe calea EMP, pn la piruvat i n final la lactat, iar acetil-fosfatul este redus n dou trepte succesive, la etanol. In fermentaia heterolactic se formeaz cantiti echimolare de CO2, etanol i lactat (fig. 60).

Fig. 60. Fermentatia heterolactica bacteriana pe calea fosfocetolazei. Produsele finale sunt CO2, acidul lactic si etanolul.

Etanolul se formeaz din acetil-fosfat, prin dou reduceri succesive care echilibreaz cele dou oxidri ce au loc n reacia de conversie a glucozo-6 P la pentozo-P i CO2. Produsele finale ale fermentaiei sunt etanolul, lactatul i CO2. c) Microorganisme aceto-lactice. Bacteriile din g. Bifidobacterium, ntr-o fermentaie mixt aceto-lactic (fig. 61) produc un amestec de acizi lactic i acetic, dup reacia: Glucoza este fosforilat i convertit la fructozo-6 fosfat, ca i n calea glicolitic EMP. Fructozo-6 fosfatul este clivat ntr-o reacie de fosforilare cu fosfat anorganic, ntr-o molecul de acetil-fosfat i eritrozo-4 fosfat. Reacia eritrozo4 fosfatului, cu o molecul de fructozo-6 fosfat iniiaz o serie complex de rearanjri moleculare, din care rezult gliceraldehid-3 fosfat i acetil-fosfat:

Fig. 61. Fermentatia acetolactica a glucozei la Bifidobacterium.

Fermentaia alcoolic produs de levuri Fermentaia alcoolic este foarte asemntoare celei lactice, diferena fiind numai cu privire la transformrile acidului piruvic. Cea mai mare parte a etanolului produs n natur i n industrie rezult prin catabolizarea anaerob a glucozei i a altor zaharuri de ctre S. cerevisiae (fig. 62). Levurile catabolizeaz glucoza pe calea EMP. Dintr-o molecul de glucoz se formeaz dou molecule de piruvat, care nu este convertit la acetil-CoA, ca n metabolismul aerob i nici redus la acid lactic, ci sub aciunea piruvatdecarboxilazei, o enzim cheie n fermentaia alcoolic, este decarboxilat la acetaldehid. Acetaldehida este redus de NAD-reductaz, la etanol. Producia net de ATP n fermentaia alcoolic este de dou molecule, pentru fiecare molecul de glucoz, mult mai puin dect n catabolizarea aerob. Prin transferul celulelor n condiii anaerobe, rata degradrii glucozei se intensific de 3-4 ori. Transferul invers este nsoit de diminuarea ratei de catabolizare a glucozei i oprirea fermentaiei alcoolice. Fenomenul poart denumirea de efect Pasteur.

Fig. 62. Fermentatia glucozei produsa de levuri. Rezulta etanol si CO2.

Fermentaia alcoolic bacterian O alt cale a fermentaiei alcoolice este aceea care se desfoar n celulele bacteriene saprobionte anaerobe, aerotolerante, ce aparin g. Zymomonas. Glucoza este catabolizat pe calea Entner-Doudoroff (ED) (fig. 63). Calea ED a fost descoperit la Pseudomonas saccharophila i la Zymomonas mobilis, dar este funcional i la unii viermi parazii. Primul intermediar al cii este glucozo-6 P, care este oxidat, ca i pe calea HMP, la 6-fosfo-gluconat. Prin reacia de dehidrogenare, 6-fosfo-gluconatul formeaz un compus intermediar 2-ceto-3-dezoxi-6-fosfo-gluconatul, care este scindat sub aciunea aldolazei, la piruvat i aldehida-3-fosfogliceric. Aldehida-3-fosfogliceric poate fi catabolizat de enzimele cii EMP i rezult piruvat sau de enzimele cii HMP i se formeaz precursori pentru biosinteza ADN, ARN, a vitaminelor, aminoacizilor aromatici etc. Calea funcioneaz i la Rhizobium. Lipsete la bacteriile Gram pozitive, cu excepia unora din g. Nocardia. Bacteriile din g. Zymomonas metabolizeaz piruvatul prin decarboxilare, deoarece au o enzim rar la bacterii piruvat-decarboxilaza. Pe aceast cale, dintr-o molecul de glucoz se formeaz dou molecule de etanol i dou molecule de CO2. Multe bacterii lactice, enterobacterii i clostridii formeaz cantiti mari de piruvat n procesul fermentaiei, dar nu au piruvat-decarboxilaz pentru producerea acetaldehidei.

Fig. 63. Fermentatia alcoolica bacteriana (g. Zymomonas). Se formeaza 2 molecule de CO2 si 2 molecule de etanol.

Fermentaiile acide La cele mai multe bacterii, catabolizarea glucozei la acid piruvic se desfoar pe calea EMP. Exist cteva tipuri de fermentaii, care se deosebesc de fermentaia homolactic, prin reacia de reducere a piruvatului, deoarece numai o parte a acestui intermediar este redus direct la lactat, dar majoritatea moleculelor sale sunt supuse unei reacii de decarboxilare, sub aciunea piruvat decarboxilazei. Se formeaz acetaldehida, care este oxidat n trepte succesive, rezultatul fiind un amestec de produse de fermentaie n care predomin acizii. Echilibrul cantitativ al produselor finale depinde de echipamentul enzimatic al speciei bacteriene, dar i de un mcanism general de reglare a metabolismului bacterian, n funcie de pH-ul mediului de cretere. Dac pH-ul scade sub un anumit nivel, datorit producerii iniiale a acizilor tari (acetic, lactic), metabolismul bacterian este reglat spre producerea acizilor mai slabi (propionic, butiric) i n anumite cazuri, a corpilor cetonici (butanediol) sau a alcoolilor (etanol, butanol). Cele mai multe fermentaii bacteriene sunt acide. In funcie de raportul cantitativ al produselor finale se disting urmtoarele tipuri:

Fermentaia acid mixt (fig 64) este caracteristic a unui numr mare de enterobacterii negative pentru reacia Voges-Proskauer. In varianta sa cea mai simpl, fermentaia acid mixt este rezultatul a dou serii principale de reacii: - reducerea direct a piruvatului la lactat - clivarea piruvatului la formiat i acetil, n prezena CoA. Reacia este catalizat de formiat-piruvat-liaz:

Unele grupri acetil din acetil-CoA sunt reduse de dou ori: la acetaldehid i la etanol. Reacia este catalizat de o alcool-dehidrogenaz, legat de CoA:

Alte grupri acetil, care nu sunt necesare pentru oxidarea NADH pot fi folosite pentru a furniza ATP suplimentar. Fosfotransacetilaza catalizeaz transferul reversibil al acetatului, de la acetil-CoA, la fosfat, cu formarea acetil-fosfatului:

Intr-o reacie reversibil, acetokinaza transfer fosfatul de la acetil-P, la ADP pentru a forma ATP i elibereaz acetatul:

Fig. 64. Produsele finale derivate din piruvat prin fermentatie acida mixta.

Produsele finale ale fermentaiei acide mixte sunt: lactatul, acetatul, etanolul i formiatul. Consecutiv clivrii formiatului, la multe enterobacterii (E. coli), din fermentaia glucozei rezult gaze (CO2, H2). Dac din echipamentul enzimatic lipsete formiat-liaza, fermentaia se produce fr gaze. Unele enterobacterii, n special cele care au formiat-dehidrogenaz, produc o cantitate mic de acid succinic, n prezena ATP, prin reacia de condensare a unei molecule de CO 2 cu o molecul de piruvat. Reacia este catalizat de piruvat-feredoxin-oxidoreductaz.

Proporia produselor finale ale fermentaiei depinde de condiiile de cultivare. PH-ul mediului scade datorit acumulrii acizilor rezultai n fermentaie. Fermentaia butiric Fermentaia butiric este caracteristic, dar nu exclusiv, bacteriilor zaharolitice din g. Clostridium (fig. 65). Butiratul se formeaz pe o cale metabolic ce ncepe cu clivarea piruvatului, n prezena CoA, n acetil-CoA, CO2 i H2. CO2 i H2 se formeaz direct, fr faza intermediar a acidului formic:

Dou molecule de acetil-CoA se condenseaz i formeaz aceto-acetil-CoA. Aceto-acetil-CoA este redus la butirat, dup urmtoarea reacie:

O proporie variabil a moleculelor de acetil-CoA este hidrolizat la acetat i regenereaz CoA. Unele specii ale g. Clostridium pot forma alte produse de fermentaie: alcooli (butanol, etanol, izopropanol) i aceton, ce rezult prin reducerea acizilor formai n fermentaie.

Fig. 65. Fermentatia butirica

Conversia piruvatului la acetil-CoA implic sistemul enzimatic al piruvat-feredoxin-oxidoreductazei (PFO), o enzim ce catalizeaz oxidarea piruvatului pentru a forma acetil-CoA i CO 2. Feredoxina este un transportor de e-, care i poate dona unei hidrogenaze, cu formarea H2.

Feredoxinele sunt proteine cu Fe i S, care funcioneaz i n alte reacii: fixarea N2, fotosintez. PFO catalizeaz o reacie rapid de schimb ntre CO2 i gruparea COOH a piruvatului, reacie ce poate fi folosit pentru a diferenia PFO de alte enzime de clivare a piruvatului. In condiii reductoare, reacia poate fi reversat, permind sinteza piruvatului din acetat i CO2. PFO are un rol important n procesele de oxido-reducere ale bacteriilor anaerobe (Clostridium). Enzima permite reutilizarea H2 ca potenial reductor, avnd rol de hidrogenaz de nglobare. Are un potenial redox foarte mic, asemntor cu al H2 (-0,42 V). Funcia de hidrogenaz de nglobare a PFO catalizeaz reducerea produselor primare acide ale fermentaiei mixte, rezultate din acidul piruvic, la molecule neutre: prin reducerea aceto-acetilului rezult butanol, prin decarboxilarea aceto-acetil-CoA se formeaz acetona, iar prin reducerea acetonei rezult izopropanol.

Recircularea H2 i utilizarea sa ca potenial reductor pstreaz echilibrul redox al mediului de cretere a acestor bacterii. Fermentaia butanediolului Fermentaia butanediolului (2,3 butan-glicol) este produs de unele enterobacterii (Vibrio, Aeromonas), de unele specii de Bacillus i de unele bacterii lactice (Streptococcus cremoris, Lactobacillus cremoris). Pe lng sistemul enzimatic al fermentaiei acide mixte, ele au i setul de enzime al fermentaiei particulare, denumit butanediolic sau butilen-glicolic, care furnizeaz ca produs final, o molecul neutr de 2,3-butanediol. Aceast cale metabolic intr n aciune dup ce pH-ul mediului de cretere scade sub 6. Reacia cheie a acestei ci este cea de condensare a dou molecule de piruvat, prin decarboxilare i eliberare a acidului formic. Rezult diacetilul, care este redus la acetoin (acetil-metil-carbinol). Prin reducerea acetoinei se formeaz butanediolul, dup urmtoarea reacie global:

Diacetilul i acetoina dau aroma caracteristic untului. Diacetilul se formeaz din lapte (l g/l). Citratul este scindat n acetat i oxalo-acetat. Oxalo-acetatul este decarboxilat la piruvat. La enterobacterii, butanediolul se formeaz pe calea acetolactatului. Dou molecule de piruvat se condenseaz printr-o reacie de decarboxilare i se formeaz acetolactatul:

Acetolactatul este decarboxilat sub aciunea aceto-lactat-decarboxilazei i se formeaz acetoina, care este redus la butanediol. Calea fermentaiei butanediolice se evideniaz prin reacia Voges-Proskauer* i prin valoarea relativ ridicat a pH.
Reactia Voges-Proskauer evideniaz capacitatea unor microorganisme de a produce prin fermentaia glucozei, acetil-metilcarbinol(acetoina), care n prezena alcalilor este oxidat la diacetil. Diacetilul se combin cu arginina, creatina sau cu creatinina din mediu i determin apariia culorii roii.
*

Fermentaia acidului propionic Acidul propionic este produs pe cale fermentativ de un grup de bacterii nesporulate din g. Propionibacterium. Ele pot fermenta acidul lactic (produsul final al altor fermentaii bacteriene) (fig. 66). Se formeaz acid propionic, acid acetic i CO2. Aceast cale de fermentaie permite generarea ATP prin metabolizarea acidului lactic sau a acidului piruvic, rezultat pe calea glicolizei:

O parte din acidul piruvic este oxidat la CO2 i acetil-CoA. Acetil-CoA este utilizat pentru sinteza ATP i a acetil-P, care ulterior este redus la acid acetic. O alt parte a acidului piruvic este carboxilat la acid oxalo-acetic:

Fig. 66. Reprezentarea schematica a fermentatiei acidului lactic la acid propionic.

Catabolismul piruvatului Piruvatul este catabolizat pe cale aerob sau anaerob. Microorganismele strict aerobe sau cele facultative, n prezena O2 realizeaz decarboxilarea oxidativ a piruvatului i formeaz acetil-coenzima A, care intr n ciclul Krebs, la nivelul oxalo-acetatului:

Dac oxalo-acetatul nu se formeaz cu o rat corespunztoare (datorit faptului c intermediarii ciclului Krebs, acidul alfa-cetoglutaric i acidul succinic sunt precursorii altor constituieni), meninerea ciclului este posibil prin sinteza suplimentar a acidului oxalo-acetic, prin carboxilarea piruvatului sau a acidului fosfo-enol-piruvic:

In anaerobioz, piruvatul este decarboxilat sub aciunea piruvat-decarboxilazei i se formeaz acetaldehid i CO2, redus ulterior la etanol, de ctre bacteriile din g. Zymomonas:

Piruvat-decarboxilaza poate fi asociat cu un sistem transportor de electroni, pan la CO2.

Catabolismul lipidelor Trigliceridele sunt hidrolizate la glicerol si acizi grai, sub aciunea exo- sau endolipazelor. Aceste enzime sunt produse de mucegaiuri (A. flavus, P. roqueforti, Rhizopus sp., Geotrichum), la levuri (Candida lipolytica, Torulopsis, S. cerevisiae), la bacterii (Serratia liquefaciens, Ps. aeruginosa, Alcaligenes sp., S. aureus). Glicerolul intr n calea glicolizei, la nivelul dihidroxi-aceton-fosfatului, trecnd prin dihidroxi-acetona sau prin glicerol fosfat (fig. 67). Ulterior, aceste produse sunt degradate pe calea glicolizei. Procesul este anaerob.

Fig. 67. Caile de catabolizare a glicerolului

Catabolismul glicerolului Acizii grai sunt activai de ATP n prezena CoA i se formeaz acil-CoA. Acesta este oxidat la carbonul beta i prin hidroliz rezult acetil-CoA, care este mai scurt dect cel iniial cu doi atomi de carbon.

Fig. 68. Mecanismul beta-oxidrii unui acid gras care duce la formarea succesiv a acetil-CoA (cu 2 atomi de C).

Catabolizarea compuilor organici azotai Numeroase bacterii (in special din g. Clostridium i Bacillus) secret exoproteaze care scindeaz lanurile polipeptidice n fragmente de civa aminoacizi. Sinteza enzimelor proteolitice este represat dac n mediu se adaug hidrolizat de proteine sau amestec de aminoacizi. Peptidazele hidrolizeaz polipeptidele i le transform n aminoacizi. In funcie de modul de aciune asupra lanului polipeptidic, peptidazele sunt de dou tipuri: endopeptidaze i exopeptidaze. La rndul lor, exopeptidazele sunt de dou categorii : - aminopeptidaze, cele care ncep aciunea lor la extremitatea NH 2 liber a polipeptidului. Activitatea lor depinde de prezena ionilor metalici ; - carboxipeptidaze, cele a cror aciune se initiaz la extremitatea COOH liber a polipeptidului. Aciunea acestor enzime are ca efect formarea di- i tripeptidelor, ulterior hidrolizate n aminoacizi. Majoritatea bacteriilor oxideaz puin sau deloc aminoacizii. Ele sunt mult mai active n sinteza dect n degradarea lor, n special n faza de cretere rapid. Unele bacterii pot degrada aminoacizii, n special dac acetia sunt unica surs de C n mediu. La plantele superioare, ca i la bacterii, dominant este sinteza, deoarece ca i bacteriile, tind s creasc continuu. Exist dou ci principale de catabolizare a aminoacizilor : - prin dezaminare

prin decarboxilare. Dezaminazele microorganismelor sunt foarte diverse. Ele cuprind enzime oxidative i neoxidative. Rezultatul dezaminrii oxidative este formarea iminoacidului, care este apoi hidrolizat n acid - cetonic i NH3:

Dezaminarea neoxidativ poate fi de trei feluri: - dezaminare desaturant, cu formarea acidului nesaturat i a NH3; - dezaminare reductiv, ce const n reducerea aminoacizilor la acidul saturat corespunzator i formarea NH3; - dezaminare prin deshidratare, o cale exclusiv a microorganismelor pentru aminoacizii hidroxilai. Se formeaz acidul cetonic i NH3; Un tip special de dezaminare este dezaminarea cuplat (reacia Stickland) (fig. 69). Reacia se numete dezaminare cuplat, deoarece necesit cel puin o pereche de aminoacizi complementari, unul fiind oxidat, iar cellalt avnd rolul de acceptor de electroni. Reacia global a dezaminrii cuplate este urmtoarea:

Aminoacidul donor este oxidat sub aciunea unei NAD-dehidrogenaze. Rezultatul reaciei este dezaminarea celor doi aminoacizi. Acidul alfa-cetonic este decarboxilat secundar, reacie n cursul creia se produce fosforilarea la nivelul substratului (pentru o pereche de aminoacizi se sintetizeaz o molecul de ATP). Un exemplu tipic este fermentaia alaninei i a glicinei, dup reacia global:

Fig. 69. Mecanismul reaciei Stickland, ca modalitate a metabolismului fermentativ productor de energie. L-alanina are rol de donor de electroni , iar glicina de acceptor. Ambele sunt convertite la acid acetic.

Dup comportamentul lor n reacia Stickland, aminoacizii se mpart n trei grupe: reductori, oxidani i cei care se comport ca reductori sau oxidani, n funcie de condiiile de mediu. Reacia de dezaminare cuplat este catalizat de numeroase bacterii anaerobe (de exemplu, Clostridium). Decarboxilarea aminoacizilor este o cale de catabolizare comun multor microorganisme, proteolitice sau neproteolitice. Se formeaz CO2 i o amin:

Un mediu acid favorizeaz biosinteza decarboxilazelor i pH crete, datorit producerii NH 3, ureii, aminelor, iar ntr-un mediu alcalin este stimulat sinteza dezaminazelor i pH scade. Unele bacterii i obin energia prin catabolizarea unui singur aminoacid (arginina), pe ci fermentative foarte specifice i complexe sau prin fermentarea unor compui aminai (purine, pirimidine). Catabolismul compuilor aromatici In raport cu capacitatea de a metaboliza compuii aromatici, bacteriile se mpart n trei categorii: cele care nu degradeaz astfel de compui; cele care realizeaz o degradare incomplet (de exemplu, enterobacteriile). E. coli scindeaz triptofanul la indol i piruvat, sub aciunea unei triptpofanaze, fr s deschid ciclul benzenic sau pirolic. Reacia de evideniere a indolului n mediile nutritive peptonate este un test de identificare a enterobacteriilor, utilizat frecvent (fig. 70); bacteriile care metabolizeaz complet compuii aromatici, prin ruperea structurilor ciclice. Reacia de clivare a moleculelor ciclice este generatoare de energie.

Fig. 70. Reacia de degradare a triptofanului de ctre E. coli.

Degradarea hidrocarburilor O categorie special de substane organice relativ rezistente la aciunea degradativ a bacteriilor sunt hidrocarburile*. Molecula lor conine numai atomi de C i H. Hidrocarburile se leag ferm de suprafeele solide, inclusiv de granulele solului. Cele uoare i adeseori toxice tind s se volatilizeze i altereaz calitatea aerului, periclitnd sntatea omului i animalelor. Majoritatea moleculelor componente ale petrolului brut i din produsele de rafinare sunt biodegradabile. Microorganismele care degradeaz petrolul sunt ubicvitare, dar un rol major n decontaminarea mediilor poluate cu petrol l au pierderile abiotice prin evaporare, dispersie i fotooxidare. Hidrocarburile cu catena linear sunt degradate de reprezentanii ctorva genuri de bacterii (Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium) i de levuri, dar cele ciclice sunt foarte rezistente la aciunea degradativ.
Petrolul este un amestec de mai multe clase(fracii) de hidrocarburi i ali compui organici, inclusiv organo-metalici, care conin sulf, vanadiu i nickel: - fracia alifatic, reprezentat de alcani i alchene (hidrocarburi cu caten linear, saturate i respectiv, nesaturate) - fracia aromatic (compui aromatici nesaturai, de exemplu, benzenul) - fracia gudronului i fracia asfaltic, alctuite din compui chimici compleci. Ordinea descrescnd a biodegradabilitii hidrocarburilor petrolului este: n-alcani > alcani cu caten ramificat > alchene ramificate > aromatice n-alkil cu gr. mol. mic > monoaromatice > alcani ciclici > aromatice polinucleare > asfaltene.
*

Petrolul brut este supus aciunii degradative energice a bacteriilor. Unele specii de Pseudomonas catabolizeaz hidrocarburile aromatice din petrol. Procesul este aerob, ceea ce explic stabilitatea depozitelor de petrol pentru perioade foarte lungi, dar dup expunerea la aer, hidrocarburile din petrol sunt oxidate. Reacia de degradare a hidrocarburilor este catalizat de metan-monooxigenaz* i implic participarea O2 ca reactant. Unul dintre atomii moleculei de O2 este ncorporat n molecula oxidat. Alcanii sunt convertii la alcool. Alcoolul poate fi oxidat la aldehid i acid, dup care intr n ciclul -oxidrii i n ciclul acizilor tricarboxilici. Hidrocarburile aromatice policiclice mici (cu 1-3 cicluri) i cele mari (cu 4 sau mai multe cicluri naftalen, antracen, fluorantren, piren, crisen) sunt folosite ca unic surs de C de bacterii, cianobacterii, fungi, alge. Oxidarea compuilor aromatici are ca rezultat formarea unor molecule cu un singur ciclu aromatic (catecol, protocatecol, gentisat, homogentisat). Calea degradrii fenil-alaninei i tirozinei trece prin gentisat i respectiv, homogentisat.

Cea mai mare parte a O2 molecular consumat n metabolismul aerob, este redus cu e - transportai pe catena de respiraie, cu formarea apei. Mici cantiti de O2 sunt introduse n substraturile organice, formndu-se gruparea OH. Enzimele care catalizeaz aceste reacii se numesc oxigenaze i sunt de 2 tipuri: monooxigenaze introduc un singur atom de O. Dioxigenazele, denumite oxigen-transferaze, catalizeaz reacii de tipul AH2 + O2 -- A(OH)2 Cele 2 grupri OH rezultate sunt adiacente i produsul A(OH) 2 este adeseori instabil, deoarece legtura C-C care poart cele 2 grupri OH se rupe. Monooxigenazele (hidroxilaze) catalizeaz introducerea unui singur atom de O ntr-un substrat organic, cellalt atom fiind redus la ap. Monooxigenazele necesit al II-lea substrat care s cedeze e- necesari reducerii celui de al II-lea atom de O. Oxigenazele sunt enzime Fe, dar unele conin i Cu.

dioxigenaze, cele care catalizeaz introducerea ambilor atomi de O n substratul organic

In etapa a II-a se produce clivarea ciclului monoaromatic, n orice punct al su. Rezult compui care intr in ciclul Krebs (succinat, acetil-CoA, piruvat). Degradarea fenil-alaninei i tirozinei trece prin gentisat i homogentisat.

Fig. 71. Catabolismul compuilor aromatici este catalizat de oxigenaze. (a) Protocatecolul i catecolul rezult din oxidarea inelului benzenic. (b) Hidroxilarea benzenului la catecol catalizat de o oxigenaz cu funcie mixt n care NADH este al II-lea donor de electroni. (c)Clivarea catecolului la cis,cis-muconat.

Bacteriile din g. Pseudomonas degradeaz numeroase molecule ciclice: naftalenul, fenantrenul, antracenul, toluenul, benzenul, fenolul, salicilatul, triptofanul etc.

Fig. 72. Degradarea fenolului i a benzoatului (conin O n molecula) poate avea loc i n condiii anaerobe prin clivarea reductoare a inelului.

Hidrocarburile aromatice policiclice pot fi metabolizate n condiii anaerobe de ctre bacteriile care reduc Fe la Fe3+, sulfat-reductoare, denitrificatoare. Hidrocarburile sunt toxice i dezagreg structurile membranare pentru c sunt lipofile. Ele se inser n aria hidrofob a membranei, prin asociere cu catenele acil ale fosfolipidelor. Hidrocarburile tind s rmn n aria hidrofob, ntre monostraturile lipidice, n zona cozilor acizilor grai ai fosfolipidelor. Inseria hidrocarburilor altereaz structura membranei, schimbndu-i fluiditatea i configuraia proteinelor. Mecanismele reparatorii compenseaz pierderile integritii structurale a membranei. Fluiditatea membranei diminu prin scderea cantitii de acizi grai nesaturai din compoziia lipidelor membranare. Aceste modificri constituie o barier fa de intercalarea hidrocarburilor n membran, limitnd influxul pasiv al hidrocarburilor n celul. Catabolismul compuilor cu un atom de carbon. Bacteriile metilotrofe i metanotrofe Compuii mai redui dect CO2 care conin unul sau mai muli atomi de C, dar nu conin legturi C-C formeaz grupul C1: CH4, CH3OH, metilamina (CH3NH2), dimetilamina (CH3)2NH, trimetilamina(CH3)3N, tetrametilamoniu (CH3)4N+, trietilamina N-oxid (CH3)3NO, trimetilsulfoniu (CH3)3S+, formiat (HCOO-), formamida (HCONH2), CO, dimetil-eter (CH3)2O, dimetil-carbonat (CH3OCOOCH3), dimetil-sulfoxid (DMSO) (CH3)2SO, dimetil-sulfid (CH3)2S. Organismele care pot s creasc folosind numai compui organici C1 se numesc metilotrofe. Bacteriile care oxideaz compuii C1 trebuie s sintetizeze de novo toi compuii organici obinuii (C-C). Din punctul de vedere al asimilrii C, bacteriile metanotrofe i metilotrofe au asemnri cu cele autotrofe (cele care folosesc CO 2), diferena fiind c primele folosesc compui organici mai redui dect CO2. Metanul este un compus abundent n mediile naturale, fiind produs de bacteriile metanogene n mediile naturale anaerobe: nmolul anaerob, tractul intestinal al ierbivorelor, orezrii, prin degradarea anaerob a deeurilor organice reziduale i menajere, dar i n activiti antropologice nebiogene: exploatarea minier a crbunelui, arderea biomasei. Intre bacteriile metilotrofe i metanotrofe exist deosebiri cu privire la substratul pe care l degradeaz. Numeroase specii de bacterii cresc pe metanol, metil-amin sau pe formiat, dar nu oxideaz metanul. Ele sunt bacterii heterotrofe (Pseudomonas, Bacillus, Vibrio) i metilotrofe facultative, deoarece, pe lng metanol degradeaz i ali compui cu unul sau mai muli atomi de carbon. Degradarea lor este iniiat de metanol-dehidrogenaz. Metanolul din surse endogene(prin oxidarea CH4) sau exogene(degradarea pectinei, ligninei) este oxidat la formaldehid, de o metanol-dehidrogenaz periplasmic, la Gram negative. Bacteriile metanotrofe au caracteristici metabolice particulare, deoarece utilizeaz att compui mai redui dect CO2, cu un singur atom de carbon, ct i metanul i sunt metilotrofe obligate. Ele sunt unice, prin capacitatea lor de a utiliza CH4 ca surs de carbon i energie. Bacteriile care oxideaz metanul au un sistem enzimatic specific: metan-monooxigenaza(MMO), enzima care catalizeaz introducerea unui atom de O n molecula de metan, rezultnd metanolul:

Carbonul este asimilat sub form de formaldehid i CO2, pe calea serinei, n care 2 moli de formaldehid i 1 mol de CO2 formeaz un intermediar 3C al metabolismului central, sau n ciclul RuMP (ribulozo-uridin-monofosfat), n care 3 moli de HCOH formeaz un intermediar metabolic cu 3C. Pe aceast cale, tot C celular este asimilat la nivelul de oxidare al HCOH. Oxidarea metanului la metanol, catalizat de MMO este trstura definitorie a bacteriilor metanotrofe. Cea mai mare parte a potenialului reductor, necesar metabolizrii CH 4, este produs prin oxidarea HCOH, via HCOOH, la CO2. MMO are un spectru larg de aciune asupra alcanilor, alchenelor, hidrocarburilor aromatice i halogenate (de exemplu, diclor-metan). Enzima se gsete sub dou forme: citoplasmatic (solubil) i asociat membranei (particulat). MMO face parte din monoxigenazele clasice (legat de membran sau solubil), care utilizeaz doi echivaleni reductori pentru a rupe legturile O2. Unul dintre atomii de oxigen este redus pentru a forma H 2O, iar cellalt este ncorporat n CH4 pentru a forma CH3OH. Bacteriile metanotrofe sunt aerobe. Triesc la periferia zonei anaerobe, unde CH4 i O2 se gsesc simultan: n metalimnionul lacurilor dimictice (sisteme aquatice stratificate, n care apa circul liber de dou ori pe an, ntre cele dou straturi majore: epilimnion i hipolimnion).

Metanul este cel mai stabil compus al C n mediile anaerobe i este un intermediar foarte important n reaciile de mineralizare a materiei organice. Este format de bacteriile metanogene ca produs final al descompunerii materiei organice n stratul profund al acestor lacuri i difuzeaz pn n metalimnion, unde ntlnete O 2 dizolvat n ap. Metanotrofele localizate n stratul ngust de ap, oxideaz CH4 i mpiedic trecerea lui n atmosfer. Metanul care scap oxidrii de ctre metanotrofe, difuzeaz n atmosfer. Bacteriile care oxdeaz CH4, mpreun cu Mycoplasma sunt singurele procariote, care posed steroli n structura membranei citoplasmatice. Bacteriile metanotrofe au o semnificaie ecologic deosebit, deoarece metanul este un gaz abundent n atmosfer (l,6 ppm), ocupnd locul al II-lea, dup CO2. Concentraia sa a crescut cu o rat de circa l% pe an, n ultimii l50 200 de ani. Deoarece absoarbe radiaia n spectrul infrarou mult mai eficient dect CO2, contribuia sa la nclzirea global a atmosferei (efectul de ser) tinde s o egaleze pe aceea a CO2. Oxidarea anaerob a CH4, dependent de sulfat este o reacie redox important n sedimentele marine anoxice, dar nu se cunosc bacteriile care catalizeaz aceast reacie i nici mecanismul prin care ele activeaz molecula stabil a CH4. Oxidarea metanului dependent de sulfat este exergonic: Chiar bacteriile metanogene par a cataliza reacia de sens opus: CH4 ---- CO2 + H2, o reacie termodinamic posibil dac presiunea parial a H2 este meninut la un nivel sczut de bacteriile hidrogen-oxidante sulfat-reductoare. In testele experimentale, producerea CH4 are o rat de 3-4 ori mai mare dect reacia de oxidare. Catabolismul alcoolului etilic Unele levuri (Debaromyces, Hansenula, Pichia) i unele bacterii metabolizeaz complet alcoolul etilic, pn la CO2 i ap. Reacia are loc n dou trepte: n prima treapt rezult aldehida acetic.

n treapta a II-a, aldehida acetic este oxidat la acetil-CoA i n condiii de aerobioz o ncorporeaz n ciclul Krebs;

Bacteriile acetice (Acetobacter, Gluconobacter) oxideaz incomplet alcoolul etilic, cu acumularea acidului acetic, ca produs final, deoarece acetaldehida este oxidat direct la acid acetic:

Oxidarea acetaldehidei este o reacie aerob i este baza producerii industriale a oetului alimentar, prin diferite metode. Dup epuizarea alcoolului, unele bacterii acetice oxideaz acidul acetic la CO2 i H2O, prin intermediul acetilCoA. Bacteriile acetice sunt aerobe i se deosebesc de bacteriile acetogene anaerobe, prin aceea c nu oxideaz complet sursa lor energetic. Oxidarea alcoolului etilic are loc numai pn la acid acetic, care se acumuleaz n mediu i pH scade. Bacteriile acetice sunt acido-tolerante. Reaciile de anabolism Reaciile de anabolism se desfoar n sensul utilizrii metaboliilor intermediari ai cilor centrale, pentru sinteza constituienilor proprii celulei bacteriene. Procesele anabolice evolueaz n dou faze, care se desfoar n sens invers n raport cu cele catabolice. Rezultatul lor este sinteza constituienilor celulari.

Celulele bacteriene sintetizeaz dou tipuri de macromolecule: - macromolecule informaionale, codificate de mesaje genetice, cu caracter de specificitate, de importan biologic fundamental; - macromolecule de rezerv (de depozit), cu o structur n general uniform, formate prin legarea unor monomeri, n polimeri de diferite mrimi. Sinteza macromoleculelor informaionale se realizeaz cu o mare eficien, deoarece, n procesele metabolice, ntr-o faz iniial, nespecific, sunt furnizate subunitile de construcie: aminoacizi, baze purinice i pirimidinice. In cea de a II-a faza, controlat genetic se desfasoar procesele specifice de biosintez a macromoleculelor informaionale, care poart denumirea generic de diataxie, n cursul creia subunitile specifice sunt polimerizate ntr-o ordine riguros exact, conform mesajului genetic. Cile amfibolice. Sub aceast denumire sunt reunite cile centrale ale metabolismului, care, simultan au rolul de a elibera energie i de a produce molecule precursoare pentru biosinteze. Caracterul amfibolic este conferit de faptul c energia i anumii intermediari ai cilor catabolice sunt utilizai n reacii de anabolism, dup urmtoarea schem general:

Existena cilor amfibolice este expresia interaciunii dintre cile catabolice i anabolice, care funcioneaz simultan n citoplasma necompartimentat a celulei bacteriene. Cile anaplerotice (sau de aprovizionare) sunt cai metabolice auxiliare. Nevoia existenei lor deriv din faptul ca nutrienii din mediu sunt degradai progresiv pentru eliberarea energiei sau sunt folosii n reaciile de biosintez. Calea metabolic principal ce furnizeaz metaboliii intermediari, eseniali pentru catabolism i anabolism trebuie reaprovizionat cu compui care provin din alte ci metabolice, ce se desfoar simultan n celula. Astfel, se asigur funcionarea ndelungat i la o rat optim a cii metabolice principale. Calea anaplerotic a glioxilatului, are ca rezultat final, regenerarea oxaloacetatului, molecula acceptoare a acetatului n ciclul Krebs. Dac oxaloacetatul este intens folosit n biosinteze, funcionarea ciclului acizilor tricarboxilici va diminua. Pentru a evita scderea ratei de producere a energiei, se sintetizeaz suplimentar un compus cu 4 atomi de C. Dac substratul energetic este un glucid, compusul cu 4 atomi de C se formeaz prin carboxilarea piruvatului. Dac substratul energetic este acetatul sau un acid gras, microorganismele aerobe nu reduc acetatul la piruvat. Acetatul intr n ciclul Krebs, dar izocitratul nu este decarboxilat succesiv prin cele dou trepte, pn la succinat. In celula bacterian este indus sinteza a dou enzime care unteaz cele dou reacii de decarboxilare ntre izocitrat i succinat. Izocitratul este scindat de izocitrat-liaz i rezult glioxilat i succinat. Glioxilatul se combin cu o alt molecul de acetat din acetil-CoA i rezult malat, care restabilete ciclul. Procesul ciclic n cursul cruia acetatul nu este convertit la CO2 poart denumirea de ciclul glioxalic. Bacteriile i plantele sintetizeaz acetil-CoA din acetat i coenzima A, ntr-o reacie consumatoare de ATP, catalizat de ATP-sintetaza.

Fig. 73. untul glioxilatului i raporturile sale cu reaciile ciclului acizilor tricarboxilici. Reacia eseniala a ciclului este clivarea izocitratului n glioxilat i succinat. Malataul se sintetiteaz din glioxilat i acetil-CoA. Celelalte reacii ale ciclului sunt aceleai ca i n ciclul Krebs. Ciclului glioxilatului este activ cnd substratul energetic este catabolizat la acetat i nu funcioneaz cnd sunt degradate glucidele, deoarece sunt catabolizate la acid piruvic.

Intr-o a II-a reacie, acidul glioxilic este condensat cu acetil-CoA i formeaz acidul malic.

Acidul malic este oxidat i rezult acidul oxaloacetic:

In concluzie, reaciile metabolice ale celulelor bacteriene, ca mecanism general de desfurare sunt similare cu cele care au loc n celelalte sisteme vii, dar se deosebesc prin faptul c, n special cile catabolice sunt mai diversificate, ca o consecin direct a naturii foarte heterogene a substraturilor degradate. Faptul c n privina mecanismului general de desfurare, cile metabolice sunt similare cu ale celorlalte organisme a permis ca numeroase desoperiri ale biologiei moleculare s se fac pe sistemul bacterian i s se extrapoleze la celula eucariot: - ciclul Krebs - diferitele ci metabolice - procesele de oxido-reducere - mecanismul sintezei proteinelor Din acest punct de vedere, culturile bacteriene au constituit un model ideal de investigare. Ele au avantajul creterii rapide pe medii sintetice (cu compoziie bine determinat). A devenit astfel posibil, determinarea precis a modificrilor chimice ale mediului de cretere, prin evidenierea diminurii cantitative a unor componente i acumularea produselor de catabolism sau prin ncorporarea precursorilor marcai ai mediului nutritiv, n macromolecule.
Deosebirea esenial const n faptul c la bacterii funcioneaz ci catabolice particulare, care nu se regsesc la alte organisme i care permit celulelor bacteriene s catabolizeze substane chimice greu degradabile: cauciuc, asfalt, diferii compui aromatici etc.

CAPITOLUL V INFLUENA FACTORILOR FIZICI I CHIMICI ASUPRA MICROORGANISMELOR Activitatea biologic normal a microorganismelor este profund influenat de condiiile fizice si chimice ale mediului. Activitatea lor este maxim, cnd condiiile mediului sunt optime n raport cu necesitile speciei. Condiiile optime de viaa pentru microorganisme se intlnesc foarte rar n mediile naturale, dar ele compenseaz printr-o mare capacitate de adaptare i printr-o rezisten superioar la condiiile nefavorabile, comparativ cu organismele superior organizate. Cunoaterea influenelor mediului asupra microorganismelor este obligatorie pentru inelegerea distribuiei lor n natur i pentru elaborarea metodelor de control a activitii microorganismelor i distrugerea celor nedorite. Rspunsul microorganismelor la diferite condiii de mediu nu este uniform: unele sunt inhibate, iar altele sunt stimulate. INFLUENA FACTORILOR FIZICI Temperatura Temperatura este unul din cei mai importani factori de mediu care influeneaz creterea i supravieuirea organismelor. Rata reaciilor chimice i enzimatice n celul crete odat cu creterea temperaturii, dar acizii nucleici i alte componente celulare sunt sensibile la temperaturi crescute i pot fi inactivate ireversibil. Temperatura de dezvoltare. Pentru fiecare specie de organism exist o temperatur minim, sub nivelul creia creterea nu mai are loc, o temperatur optim, la care creterea este cea mai rapid i o temperatur maxim, deasupra creia creterea nu mai este posibil. Spectrul termic care permite desfurarea normal a proceselor metabolice i deci creterea i multiplicarea microorganismelor reprezint zona temperaturii de dezvoltare. Temperatura optim de dezvoltare este mai apropiat de valoarea maxim, dect de cea minim. Cele trei puncte termice, denumite temperaturi cardinale sunt, n general, caracteristice pentru fiecare tip de organism, dar nu sunt fixe, deoarece pot fi modificate de ali factori, ca de exemplu, pH i concentraia nutrienilor. Temperatura de dezvoltare poate fi cuprins n limite restrnse (3540o), la microorganismele stenoterme i n limite largi (6-50o) la cele euriterme. In general, temperatura de dezvoltare este cuprins ntre 5o si 70-8oo. Aceast variaie corespunde temperaturii minime, optime i maxime. Organismele stenoterme triesc n habitate cu temperatur relativ constant, iar cele euriterme populeaz mediile n care temperatura variaz considerabil. Temperatura minim de dezvoltare reprezint valoarea termic cea mai scazut la care microorganismele se mai multiplic nc n mod evident. La aceast temperatur, rata metabolismului este sczut, iar rata creterii i diviziunii celulare este mult ncetinit. Limita inferioar a temperaturii minime de dezvoltare este determinat, teoretic, de temperatura de ingheare a apei, dar se situeaz sub 0o (-5o), deoarece punctul de congelare a constituienilor celulari este mai sczut dect acela al apei pure. In condiii particulare, care mresc zona de stabilitate fizic a apei celulare (coninutul ei bogat n diferite substane i presiunea osmotic ridicat), temperatura minim tolerat de microorganisme poate s scad pan la l8 o. Aceasta explic procesul de multiplicare a unor specii specii bacteriene n apa mrii, la temperaturi de 5-ll o, iar mucegaiurile i unele bacterii (Pseudomonas) pot crete la l8o, n soluii concentrate de zahr. Creterea i multiplicarea unei generaii bacteriene dureaz n aceste condiii, sptmni i chiar luni. Chiar n materialele ngheate se gsesc pungi microscopice de apa lichid, unde microorganismele pot s creasc. Temperatura minim de dezvoltare a microorganismelor mezofile ar fi determinat de ncetarea transportului substanelor dizolvate prin membrana celular. Mecanismele biochimice ale inactivrii transportului membranar ar putea fi urmtoarele: - modificarea conformational a moleculelor proteice; - modificarea arhitecturii membranei celulare; - limitarea producerii i utilizrii ATP. Temperatura optim de dezvoltare este definit de nivelul termic la care dezvoltarea unei populaii de microorganisme ale unei specii are loc cu o rat maxim. Aceast valoare nu coincide cu aceea a temperaturii optime pentru alte activiti fiziologice ale celulei. De aceea, numrul maxim de celule vii se acumuleaz nu atunci cnd diviziunea are loc foarte rapid, ci n condiiile unui ritm mai lent de diviziune, probabil datorit diferenelor de temperatur optim necesar diferitelor activiti celulare. La o temperatur mai ridicat crete rata acumulrii produselor de catabolism i implicit efectul lor toxic devine inhibitor pentru creterea celular. In mod similar, viteza de fermentaie sau de acumulare a unui anumit produs de metabolism este maxim la valori termice care nu coincid obligatoriu cu temperatura optim pentru diviziunea celular. De aceea, nu se poate vorbi despre o temperatur optim pentru cretere i diferite activiti biologice, ci de temperatura optim pentru fiecare din activiti, luate in parte.

Temperatura maxim de dezvoltare reprezint valoarea cea mai ridicat la care activitatea biologic a unui anumit organism este nc posibil, iar multiplicarea sa se mai poate face in mod evident. Aceast valoare, limitat de termolabilitatea proteinelor i acizilor nucleici este de obicei cu l0-l5o mai mare dect temperatura optim pentru microorganismul respectiv. In funcie de temperatura lor de dezvoltare, microorganismele pot fi grupate n trei categorii: a) Microorganismele criofile sau psichrofile cresc cel mai bine la temperaturi sczute. Ele triesc n izvoarele reci, n lacuri i mri, n regiunile de altitudine i polare. Aceste microorganisme prezint un mare interes economic, deoarece pot altera produsele alimentare conservate prin congelare. b) Microorganismele mezofile se dezvolt la temperaturi medii (lo-45o). Ele fac parte din microbiota normal a animalelor homeoterme, fa de care se comport ca saprobionte. Din aceiai categorie fac parte microorganismele parazite. c) Microorganismele termofile se dezvolt n apele termale i n platformele de deeuri menajere i din zootehnie. d) Microorganismele hipertermofile a) Microorganisme criofile Organismele care cresc la temperaturi sczute se numesc criofile sau psichrofile. Apartenena unui microorganism la aceast categorie este condiionat de capacitatea lui de a crete la 0o. Se disting dou categorii de organisme psichrofile: obligate i facultative. Organismele obligat-criofile se dezvolt la o temperatur optim de cel mult l5o, iar temperatura maxim, este de o circa 2o . Microorganismele criofile facultative, dei pot crete la 0 oC, cresc cu o rat optim la 25-30o, iar temperatura maxim de cretere este de 35-40 oC. Criofilele obligate sunt stenoterme, iar cele facultative sunt euriterme. Psichrofilele obligate triesc n medii cu temperatura constant sczut. La temperatura de 25-30 oC ele mor rapid, ceea ce ngreuneaz studiul. Organismele psichrofile sunt un grup divers: bacterii, fungi, alge. Cele mai studiate psichrofile obligate sunt algele eucariote, ce formeaz mase dense n interiorul i sub gheaa regiunilor polare. Algele psichrofile se gsesc adeseori, pe suprafaa zpezii i gheii, n numr att de mare, nct determin culoarea roie sau verde a suprafeei. Cea mai comun alg care crete pe zpad este Chlamidomonas nivalis. Celula vegetativ este pigmentat verde. Odat cu topirea zpezii, are loc sporularea. Sporii au culoarea roie. Organismele psichrofile facultative se gsesc n solul i apele din regiunile cu climat temperat. Temperatura optim de cretere este de 25-30 oC, iar cea maxim, de 35 oC. Deoarece mediile din regiunile temperate se inclzesc in sezonul cald, ele nu sunt favorabile creterii organismelor psichrofile obligate. Microorganismele psichrofile facultative sunt implicate n alterarea calitii produselor alimentare de origine animal i vegetal, conservate prin rcire sau ngheare. Cu ct temperatura de conservare este mai sczut, cu att multiplicarea microorganismelor este mai lent sau chiar imposibil. Creterea la temperaturi sczute a microorganismelor psichrofile este explicat prin proprietile enzimelor lor, capabile sa catalizeze mai eficient la temperaturi sczute. Probabil, din aceast cauz, psichrofilele sunt foarte sensibile la temperaturi mai mari, fiind inactivate rapid la 30-40 oC. Procesele de transport activ funcioneaz optim la temperaturi sczute, iar coninutul membranei celulare n acizi grai nesaturai este mai crescut dect la alte organisme. Consecina este c la temperaturi sczute, membrana rmne semifluid. Membranele cu coninut ridicat de acizi grai saturai sunt mai rigide i la temperaturi sczute devin nefuncionale. Inghearea. Temperatura de ngheare a diferitelor medii este dependent de compoziia i concentraia substanelor dizolvate. Inghearea oprete creterea microorganismelor, dar moartea celular nu survine totdeauna. Celulele mari sunt mai sensibile la ngheare, iar cele cu perete celular gros sunt mai rezistente. Inghearea este una din cele mai bune metode de conservare a culturilor de microorganisme. Prin ngheare, unele celule sunt omorte, dar dac supravieuiesc, ele rmn viabile pentru perioade lungi de timp. Procesele vitale sunt suspendate (funciile celulare sunt oprite) i sunt reluate dup restabilirea regimului termic. Leziunile celulare ce rezult din nghearea apei intracelulare sunt consecina efectului fizic al cristalelor de ghea, n special asupra membranei celulare. Inghearea rapid produce cristale mici i leziunile pot fi minime. De aceea, nghearea trebuie fcut rapid. Astfel, levurile rmn viabile ntr-o proporie optim, dac rcirea se face cu l0 o/minut, iar pentru hematii, rcirea cu 20o/minut ofer cea mai bun protecie. Severitatea efectelor deshidratrii este limitat de glicerol i dimetilsulfoxid, adugate n proporie de 0,5M la mediul de suspensie. Ele sunt miscibile cu apa i penetreaz n celul. Moleculele mari (albumina seric, dextranul, polivinil-pirolidona) la concentraia de l0-5- l0-3 M nu penetreaz n celule. Efectul lor protector se realizeaz prin combinarea cu molecule ale suprafeei celulei i astfel este prevenit lezarea membranei celulare.

Rezistena celulelor la ngheare este folosit pentru conservarea lor ntr-un mediu adecvat. Cu ct temperatura este mai sczut, cu att condiiile de pstrare sunt mai bune. Temperatura de 70 o este mai bun dect cea obinuit de 20o, iar temperatura de l95o a azotului lichid este cea mai bun. b) Microorganisme mezofile Microorganismele mezofile au temperatura optim de dezvoltare, cuprins ntre 25 i 40 o. Cele care au temperatura de cretere mai mare de 30o se dezvolt n cavitile macroorganismelor homeoterme, ca saprobionte sau parazite. De exemplu, E. coli se dezvolt optim la temperatura de 39o. Bacteriile mezofile asociate organismelor homeoterme sunt relativ stenoterme. Aceast proprietate este evident la microorganismele patogene. Microorganismele mezofile cresc cu o rat scazut la o temperatur mai mic de 20 o. Sub l0o, creterea lor este oprit, deoarece se blocheaz iniierea sintezei proteice, dar sinteza celor deja initiate nu este afectat. La o temperatur sczut este inhibat i funcia enzimelor. Inhibitorul este probabil, un metabolit obinuit, care la temperatur sczut se leag foarte strns de enzim. Odat cu creterea temperaturii, inhibitorul se disociaz i enzima i reia funcia. Acest mecanism de aciune este sprijinit de existena a dou categorii de mutante: mutantele sensibile la rece i cele rezistente la rece. Mutantele sensibile la rece nu cresc la l5o (la care tulpina salbatic crete), deoarece enzima mutant leag inhibitorul feed-back mai ferm dect enzima de tip slbatic. Mutanta rezistent la rece produce o enzim mai puin sesibil la inhibiia prin feed-back, dect tipul slbatic. La E. coli s-au izolat mutante termo-sensibile, care nu cresc la temperatura la care crete tulpina salbatic. Aceste mutante produc o protein mai sensibil la denaturarea termic, dect proteina omolog de tip salbatic. Dei s-au izolat mutante cu limite termice superioare sau inferioare fa de tipul slbatic, temperatura lor optim de dezvoltare rmne aceiai, deoarece este condiionat de un numr mare de proteine. S-a studiat rspunsul microorganismelor mezofile la ocul hipo- sau hipertermic. Expunerea microorganismelor mezofile la temperaturi mai nalte determin reacia de rspuns la ocul termic. Rspunsul la ocul termic const ntr-o cretere rapid i trectoare a ratei de sintez a unor proteine din categoria chaperonilor, care au rolul de repliere a proteinelor denaturate, denumite proteine de oc termic. Ele au rolul de a proteja celula de cldur i de alte condiii de stress. Creterea ratei sintezei lor este rapid n decurs de ordinul secundelor dup expunerea culturii bacteriene la o temperatur superioar. Trecerea culturii de E. coli, de la 37o la 46o induce o cretere de l00 de ori a ratei sintezei proteinelor de oc termic, ns rata global a sintezei proteinelor scade. Proteinele de oc termic sunt factori de rezisten fa de temperaturile letale. Ele fac parte din categoria chaperonilor. Chaperonii sunt proteine constitutive normale, a cror rat de sintez crete brusc dup ocul termic. Raspunsul la ocul termic s-a evideniat nu numai la bacteriile mezofile, ci i la cele termofile, la cele psichrofile i la Archaea. Invers, prin scderea temperaturii la l0o, unele bacterii sintetizeaz un set de circa l4 proteine, denumite proteine de oc la rece, dei rata global a sintezei proteinelor scade. Unele proteine de oc la rece au rolul de a stabiliza capacitatea de transcriere a ADN i de traducere a mesajului n proteine. Stressul nfometrii determin un rspuns ce const n sinteza a 30-50 de proteine cu rol adaptativ. Infometarea celulelor bacteriene are ca rezultat creterea rezistenei lor la diferite stressuri, inclusiv la temperaturi sczute. Reactivitatea celulei la diferite stressuri este codificat de genele de stress. Ele codific factori activatori ai setului de gene ce codifia sinteza proteinelor de adaptare la stress. c) Microorganisme termofile Microorganismele termofile cresc la temperaturi mai mari de 45-50o i au o rspndire limitat n mediile naturale. Solul expus luminii solare se nclzete la temperaturi mai mari de 50o, iar solurile de culoare nchis se nclzesc la 70o. Materialele care fermenteaz (deeuri menajere, materiale vegetale) ating temperaturi de circa 70 o. Cele mai ridicate temperaturi n natur sunt asociate cu fenomenele vulcanice. Adeseori, izvoarele termale ating temperatura de fierbere. Pe msur ce apa se ndeprteaz de surs, se realizeaz un gradient termic, cu o distribuie a speciilor de microorganisme, dependent de nivelul termic. Organismele procariote sunt capabile s creasc la temperaturi mai mari, comparativ cu organismele eucariote. Cele nefotosintetizante tolereaz temperaturi superioare, n raport cu cele fotosintetizante. In interiorul grupului microorganismelor termofile sunt diferene ale temperaturii optime de dezvoltare: speciile termofile cresc optim ntre 50 i 80o, iar cele hipertermofile cresc optim la temperaturi ntre 80-110o. Mecanismul biochimic al toleranei la temperaturi crescute nu este bine cunoscut. Enzimele microorganismelor termofile conin lipide membranare bogate n acizi grai saturai, care permit membranelor s rmn stabile i funcionale

la temperaturi ridicate. Acizii grai saturai formeaz legturi hidrofobe mai puternice dect acizii grai nesaturai, ceea ce explic stabilitatea membranei. Absena microorganismelor eucariote la temperaturi mai mari de 60o se poate datora termolabilitii inerente a membranelor, n special a membranei nucleare, mitocondriale sau cloroplastice. Membranele mitocondriale sunt deosebit de sensibile la caldur. Prin nclzirea celulelor cu cteva grade peste temperatura maxim, mitocondriile dispar. Membranele organitelor celulei eucariote sunt suficient de fluide pentru a permite trecerea macromoleculelor. Membrana nuclear este permeabil pentru ARNm i pentru subunitile ribosomale, care trec n citoplasm. La temperaturi crescute, membrana nuclear i pierde funcionalitatea. d) Microorganismele hipertermofile Bacteriile hipertermofile se dezvolt foarte bine la temperaturi cuprinse ntre 80-ll0o. Nu cresc la temperaturi mai mici de 60-80o. Ele se gsesc n regiunile hidrotermale submarine anaerobe, bogate n H2S, H2, So i SO32- i cu o concentraie salin caracteristic apei marine, precum i n emanaiile de gaze fierbini din cratere vulcanice ce conin vapori de ap, CO2 i H2S. In 1999 erau descrise peste 70 de specii care cresc optim la 110o i mai mult. Puine sunt eubacterii(Thermotogales i Aquificales), restul fiind Archaea: Sulfolobales, Pyrococcales, Thermococcales. Comunitile hipertermofile sunt productori primari i descompuntori ai materiei organice. Productorii primari hipertermofili sunt organisme chimiolitotrofe: - cele aerobe oxideaz So cu O2 i produc acid sulfuric (hipertermofile acidofile -Sulfolobales); - cele anaerobe reduc So cu H2 i produc H2S. Coninutul n materie organic al mediului submarin este foarte mic. Cele heterotrofe i obin energia din peptidele derivate prin descompunerea productorilor primari. Mecanismul molecular al hipertermofiliei nu este cunoscut. Deoarece proteinele i acizii nucleici sunt inactivate la temperaturi de 60-70o se consider ca hipertermofilia s-ar datora existenei unor factori termostabilizatori (necunoscui), prezenei unor enzime cu structur globular particular, existenei unor proteine de tip histonic cu rol termoprotector, precum i configuraiei mai strnse a dublei helice a ADN, care ar ngreuna separarea catenelor componente. Enzimele izolate de la hipertermofile au activitate optim, de obicei ntre 70-125 o, uneori net superioar temperaturii optime de cretere a organismului i de obicei sunt foarte stabile. Termostabilitatea este multifactorial: a) enzimele ar fi mai rigide dect omologele lor mezofile. Rigiditatea excesiv ar putea explica inactivitatea lor la temperatura de 20-37o. Unele enzime sunt active chiar la 37o. Explicaia este c enzimele hipertermofile combin flexibilitatea local a situsului activ cu rigiditatea global a moleculei. b) La temperaturi crescute proteinele se denatureaz prin depliere, datorit ruperii interaciunilor necovalente (legturi de H, ionice, hidrofobe i interaciuni Van der Waals). Starea pliat a moleculei este rezultatul efectului hidrofob. Efectul hidrofob este fora major a stabilitii proteinelor. Interaciunile hidrofobe care confer structura secundar sunt asemntoare cu ale enzimelor mezofile omologe, dar proteinele hipertermofile au interaciuni stabilizatoare suplimentare. c) Buclele rezultate prin pliere i capetele C i N ale moleculei sunt regiunile cu cei mai nali factori termici (regiuni calde) i sunt cele mai sensibile la denaturarea termic. La hipertermofile, buclele sunt fie mai scurte, fie sunt mai bine ancorate de restul moleculei. d) Metalele (Co, Mg, Mn, Ca) stabilizeaz enzimele. Dificultatea cu care ele se ndeprteaz din molecula de enzim este dovada indirect a rolului metalelor n stabilizarea acestor molecule. Alfa-amilazele leag specific Ca. Unele enzime termofile i hipertermofile conin atomi de metal, care lipsesc la mezofile. Feredoxina de Sulfolobus conine Zn. e) Srurile anorganice stabilizeaz proteinele.Foarte puine proteine hipertermofile sunt glicozilate. f) Temperatura maxim de cretere a acestor microorganisme ar depi puin ll3o, la care biomoleculele termosensibile ar putea fi sintetizate cu o rat suficient de mare pentru a nlocui pe cele denaturate termic.

Organismele termofile i hipertermofile Organismele termofile sunt acelea care necesit pentru cretere, o temperatur optim cuprins ntre 50- 80 0, iar cele HT cresc cu o rat optim la 80-1100. Organismele HT (70 de specii la sfritul lui 99) s-au izolat din sulfurete continentale, straturi profunde geotermale care conin petrol, sedimente marine de mic i de mare adncime, izvoare hidrotermale la 4000 m adncime,

precum i din medii industriale (apa de rcire a uzinelor termice, instalaiile de nclzire a apei, instalaiile de epurare a apelor uzate), la temperaturi de 80-1150. Cel mai termofil este Pyrolobus fumarii (1130). Probabil c peste 1130, viaa nu este posibil. Thermus aquaticus s-a izolat din instalaiile de nclzire a apei(Brock, 750). HT triesc n medii cu coninut nalt de S i sunt chimiolitotrofe facultative sau obligate : - reduc So cu H2 --- H2S (anaerobe); - oxideaz So cu O2 --- H2SO4 (aerobe). Peste 1100, moleculele (aminoacizi, metabolii) devin foarte instabile. ATP se hidrolizeaz spontan n soluie apoas la 0 140 , iar interaciunile hidrofobe slbesc semnificativ. Macromoleculele procariotelor termofile prezint cteva adaptri : - enzimele, dar i alte proteine sunt mai stabile dect ale organismelor mezofile. Substituia unui aminoacid ntr-una sau n cteva poziii eseniale ale unei enzime, permite o pliere compatibil cu stabilitatea termic; - un coninut mai mare de Ala, participant la formarea helixului; - conin o proporie mai mare de resturi hidrofobe i aromatice (dect cele mezofile); - punile S-S stabilizeaz proteinele, mai ales prin efectul antientropic*, scznd entropia fa de valoarea entropiei proteinei depliate. Efectul antientropic al punilor S-S crete proporional cu numrul de resturi de aminoacizi care se gsesc n interiorul punii S-S;
*

Conform celui de-al II-lea principiu al termodinamicii (ramur a fizicii care studiaz energia i transformrile ei), toate procesele fizice i chimice sunt nsoite de creterea dezordinii sau ntmplrii, adic a entropiei.

creterea numrului de legturi ionice ntre cationi i sarcinile negative ale unor aminoacizi ; creterea proporiei acizilor grai saturai n lipidele membranare, permindu-le s rmn stabile i funcionale la temperaturi crescute. Acizii grai saturai formeaz un mediu hidrofob mai puternic dect cei nesaturai i favorizeaz stabilitatea membranei; - hipertermofilele (majoritatea sunt Archaea) nu conin acizi grai n membran, dar au catene lungi de C i H (C 40), alctuite din uniti repetitive de phytan cu 5 atomi de C, legate prin legtur eteric cu glicerol-fosfatul. Structura acestor membrane este un monostrat lipidic, mult mai stabil dect dublul strat lipidic al Eubacteria i Eucarya. Enzimele HT au stabilitate intrinsec. Unele i dobndesc termostabilitatea de la factorii intracelulari: sruri, concentraia proteic nalt, coenzime, substraturi, poliamine. Srurile anorganice stabilizeaz proteinele pe dou ci: prin efectul specific (un ion metalic interacioneaz cu o protein ntr-o manier conformaional; prin efectul general de sare, care modific activitatea apei. K+ i NH4+ sunt stabilizatori eficieni). Organismele HT din marile adncuri suport presiuni de 200-360 atm. Unele sunt barotolerante, altele sunt chiar barofile. Absena eucariotelor la temperaturi de peste 600 se datoreaz instabilitii membranelor organitelor, care trebuie s rmn destul de permeabile pentru a permite trecerea moleculelor mari (ATP, ARN).
-

Mecanismele inactivrii proteinelor Proteinele sunt meninute n stare nativ (funcional) prin echilibrul forelor necovalente: legturi de H, fore ionice, interaciuni hidrofobe, van der Waals. Odat cu creterea temperaturii, interaciunile necovalente se rup i proteinele se depliaz. Deplierea proteinelor se detecteaz prin diferite tehnici; calorimetrie diferenial, fluorescena, spectroscopia cu dicroism circular, evaluarea vscozitii, tipul de migrare n cmpul electric. Cisteinele sunt aminoacizii cei mai reactivi ai proteinelor. Autooxidarea, catalizat de cationi metalici (Cu2+), duce la formarea punilor S-S intra- i intermoleculare sau la formarea acidului sulfenic. Mecanismele termostabilizrii proteinelor Efectul hidrofob este considerat a fi fora major a plierii proteinelor i implicit, a stabilitii lor. Hidrofobia induce proteinei o structur colapsat, definitorie pentru structura nativ, meninut prin forele necovalente. Proteinele termofile au urmtoarele caracteristici : - perechile de ioni (prezente n numr mic n moleculele proteice) nu reprezint o for pentru pliere, dar interaciunile electrostatice constituie o for important de stabilizare a proteinei pliate. Perechile de ioni sunt mai puternice n molecula proteic dect n solveni pentru c se formeaz ntre sarcini fixe. Buclele i capetele N i C, de regul, au cei mai nali factori termici, ntr-o structur proteic cristalin. Buclele proteinelor hipertermofile au trsturi structurale care pot stabiliza proteinele. Buclele sunt fie scurtate, fie mai bine ancorate de restul proteinei;

metalele stabilizeaz enzimele: unele enzime termofile i HT conin ioni metalici (Co 2+, Mg2+, Mn2+), cu rol catalitic i structural, care nu se gsesc la omologele mezofile; modificarea posttraducere prin glicozilare. Puine proteine HT sunt glicozilate. Glicozilarea poate cauza stabilizarea termic i poate preveni agregarea proteinelor parial pliate sau nepliate. Sterilizarea

Temperaturile supramaximale moderate i datoreaz efectul letal, procesului de intoxicaie metabolic, deoarece ridicarea temperaturii accelereaz reaciile metabolice. Temperaturile supramaximale omoar majoritatea microorganismelor, prin efectul lor denaturant asupra proteinelor celulare i n special asupra enzimelor. Concomitent se produce topirea membranelor lipidice. Efectul letal al temperaturilor supramaximale are o aplicaie practic major: sterilizarea. Creterea temperaturii peste un nivel maxim produce efecte letale. Moartea celulelor prin inclzire se produce dup o curb exponenial i este mai rapid la temperatur crescut. De aceea, pentru distrugerea prin sterilizare a unei populaii celulare, la temperaturi inferioare este necesar un interval de timp mai mare. Pentru sterilizarea unui material se alege temperatura i, n functie de nivelul termic, procesul are o durat corespunztoare. Tratamentul termic nu are efect cumulativ asupra celulei. Durata de timp n care celula a fost expus la caldur, nainte de a muri nu are efect perceptibil. La organismele pluricelulare, tratamentul termic pare sa aiba efect cumulativ. Se consider ca moartea microorganismelor sub aciunea cldurii este un eveniment de ordinul 1 (adic lipsete efectul cumulativ al aciunii factorului termic) i este rezultatul inactivrii unei singure entiti moleculare critice. Moartea termic a celulei procariote se datoreaz efectului asupra membranei. La temperatur crescut, lipidele membranare se dizolv i discontinuitile de dimensiuni critice determin pierderea constituienilor celulari si moartea. Rezistena microorganismelor la caldur este diferit. Cele psichrofile sunt mai sensibile, iar cele termofile au cea mai mare rezisten. Natura mediului n care se face nclzirea influeneaz rezistena celulelor vegetative i a sporilor. Moartea survine mai rapid la pH acid i de aceea alimentele acide sunt mai uor de sterilizat, comparativ cu cele neutre. Concentraiile mari de glucide, proteine i lipide mresc rezistena organismelor la aciunea cldurii. In mediu uscat, celulele sunt mai rezistente dect n mediul umed. De aceea, sterilizarea termic a obiectelor uscate necesit temperaturi mai nalte i intervale de timp mai lungi dect sterilizarea umed. Endosporul bacterian are o termorezisten net superioar, comparativ cu a celulelor vegetative, conferit de trei factori: termorezistena proteinelor, deshidratarea i mineralizarea. Factorul major al rezistenei termice este cantitatea i starea fizic a apei (apa lagat) din endospor. In timpul sporulrii, protoplasma se reduce la un volum minim. Se acumuleaz cantiti mari de Ca2+ i de acid dipicolinic (prezent numai n spor). Citoplasma dobndete o stare de gel. Cortexul sporal gros condiioneaz indirect rezistena termic, deoarece impiedic mbibarea sporului cu ap, dar sporii fr cortex sunt la fel de rezisteni ca i sporii obinuii. Proteinele sporale pot avea o rezisten intrinsec la caldur sau termostabilitatea le este conferit de asocierea cu dipicolinatul de Ca2+. In celula sporal se gsesc proteine specifice, de dimensiuni mici, acidosolubile, asociate cu ADN, dar i proteine neasociate cu macromoleculele sporului. Principiile sterilizrii termice i dezinfeciei Principiile sterilizrii se ilustreaz cel mai bine, utiliznd caldura ca agent de aciune, ale crei efecte sunt bine cunoscute. Rata morii bacteriilor care contamineaz un material este logaritmic, dar mult accelerat. Principiul 1: o proporie definit din totalul celulelor mor ntr-un interval de timp dat. Dac la o temperatur dat, n primul minut mor 30% din totalul celulelor, n cel de al II-lea minut mor 30% din rest .a.m.d. Cnd numrul celulelor bacteriene dintr-o prob supus sterilizrii, rmne foarte mic, de exemplu l00, dup primul minut rmn 70 viabile, dup al II-lea rmn 49, dup al III-lea 34, iar dup l2 minute o celul. Probabilitatea de a gsi un singur organism viu rmne foarte mic. O prob este steril, atunci cnd probabilitatea de a gsi un organism viu nu depete l/l000. Principiul 2: cu ct o prob conine mai puine microorganisme, cu att timpul necesar sterilizrii este mai scurt. Curirea ct mai avansat a obiectelor, nainte de a le steriliza este o aplicaie practic a acestui principiu. Materia organic diminu eficiena multor ageni chimici.

O specie bacterian are o sensibilitate diferit la aciunea unui agent, n funcie de faz de cretere. Cea mai sensibil faz, pentru cele mai multe microorganisme este cea de cretere logaritmic, deoarece n aceast faz sunt active toate reaciile de biosintez i interferena cu o singur enzim poate s omoare celula. Sporii sunt foarte rezisteni. Principiul 3: microorganismele difer n privina sensibilitii lor la aciunea agenilor antimicrobieni. Presiunea osmotic Presiunea osmotic n interiorul celulelor bacteriene este ceva mai mare dect aceea a soluiei reprezentate de un mediu uzual de cultivare. Aceasta se datoreaz faptului c celula conine n stare solvit, concentraii mai mari de substane minerale i organice pe care le poate reine datorit permeabilitii selective a membranei ei citoplasmatice. Ca urmare, apa din mediu tinde s ptrund n celul pentru egalizarea concentraiilor intra- i extracelulare de substane dizolvate. De aceea, n condiii normale, celula bacterian se afl ntr-o stare de turgescen determinat de forele intracelulare de distensie, caracteristice tuturor celulelor vii. Dezvoltarea bacteriilor decurge n condiii optime, dac mediul lor de via are o presiune osmotic aproximativ echivalent celei intracelulare, reprezentnd pentru ele o soluie izoton. Spre deosebire de celulele animale, foarte sensibile la variaiile presiunii osmotice, bacteriile protejate de un perete celular elastic dar rezistent suport relativ usor modificrile presiunii osmotice, dac abaterile de la izotonie survin lent, treptat, permind funciilor compensatoare de adaptare a membranei citoplasmatice s intre eficient n aciune. Dac ns, echilibrul izotonic se deregleaz brusc, aciunile care tind s refac brusc echilibrul osmotic determin liza mecanic a peretelui celular, ceea ce expune celula la degradri profunde cu efect letal. Abaterile mari de la izotonie ale unui mediu de suspensie a bacteriilor, genereaz dou tipuri de modificri celulare caracteristice: l) In medii hipertone (de exemplu, n soluii saline concentrate), bacteriile sufer fenomenul de plasmoliza, n cursul cruia, datorit pierderii apei, care trece n mediu volumul celulei se micoreaz, iar citoplasma se retract sub forma unei mase sferice sau ovalare, desprins de peretele celular; 2) In medii hipotone (de exemplu, n ap) se produce fenomenul de plasmoptiz. Datorit ptrunderii apei din exterior, turgescena celulei crete pn cnd presiunea intracelular, depind capacitatea de distensie a peretelui celular, determin dezagregarea unor structuri parietale. Peretele se sparge i coninutul celular este eliberat n mediu. Pentru dezvoltarea optim, bacteriile necesit ca n mediul de cretere, presiunea osmotic s fie mai mic dect cea intracelular. O excepie o constituie microorganismele osmofile, care se dezvolt numai n medii cu presiune osmotic ridicat. Ele sunt halofile (obligate sau facultative), dac cresc pe medii cu salinitate mare, sau zaharofile, dac se dezvolt pe medii cu concentraii mari de zahr (50 -70%). Spre deosebire de marea majoritate a microorganismelor, care tolereaz sarea n anumite limite, microorganismele halofile se dezvolt normal n condiiile unui mediu cu salinitate crescut. Halofilele facultative se dezvolt n condiii obinuite de izotonie, dar cresc bine i pe medii cu concentraii mai mari de sare (pn la l0 -l2% NaCl). Halofilele obligate se dezvolt numai n medii nutritive care conin concentraii mari de sare, care ating l6-35% NaCl i 2% MgSO4. Microorganismele halofile fac parte din microbiota normal a marilor i oceanelor, a lacurilor srate i a salinelor. Halofilele se gsesc, de asemenea, uneori, n alimentele srate (msline, pete srat, anchois), pe care le pot altera, dar n general au aciune util, participnd la procesele de maturare a unor alimente ca brnzeturi, carne sarat etc. In raport cu limitele relativ restrnse ale salinitii care favorizeaz creterea optim a microorganismelor, gama concentraiilor de sare pe care microorganismele le tolereaz este mult mai larg: de la nivelul salin infim din apa bidistilat (cu un coninut organic de 70 g/l), la care este posibil supravieuirea unor bacterii heterotrofe, pn la concentraia enorm de circa 500 g de sruri/litru, la care pot crete unii fungi (Aspergillus oryzae i A. terricola). Bacteriile halofile extreme cresc n condiii saline suprasaturate. Ele supravieuiesc chiar pe cristalele de sare rmase dup evaporarea apei. Osmoreglarea (ajustarea presiunii osmotice intracelulare n funcie de presiunea osmotic a mediului extracelular) se realizeaz prin procese active ce au loc in timpul adaptrii la stressul osmotic al mediului. Multe specii de bacterii rspund la presiunea osmotic crescut a mediului, acumulnd molecule cu greutate mic, la concentraii intracelulare mari, pentru a echilibra concentraia crescut a ionilor n mediul extracelular. Substanele acumulate n citoplasm, n condiiile unui mediu hipertonic i care nu sunt inhibitorii pentru activitatea enzimelor, chiar la concentraie nalt, adic sunt compatibile cu metabolismul celular se numesc soluii compatibile sau osmoprotectoare. Moleculele cu greutate mic echilibreaz osmoliii externi, astfel nct este mentinut presiunea de turgor a celulei. Substanele osmoprotectoare se acumuleaz n celul, prin transport din mediul extracelular, iar alteori numai prin sinteza de novo: aminoacizi i derivaii lor, trehaloza (un dizaharid), glicin-betaina, prolin-betaina etc.

Microorganismele osmofile i osmotolerante au o deosebit importan economic, deoarece pot altera alimentele conservate n soluii concentrate de sare (saramuri) sau de zahr (siropuri), soluii care, fa de microorganismele obinuite exercit un efect microbiostatic. Presiunea hidrostatic In mri i oceane, presiunea hidrostatic are valori diferite, n funcie de adncime i atinge valori foarte nalte n zonele abisale. La fiecare l0 m adncime, presiunea hidrostatic crete cu circa o atmosfer, corespunztoare coloanei de ap. Microorganismele care cresc la presiuni hidrostatice mari sunt barotolerante i respectiv barofile. Unele suport (adic cresc i se divid) diferene mari de presiune (l-l600 atm) i se numesc euribare, iar cele care se dezvolt n limite restrnse ale variaiei presiunii hidrostatice sunt stenobare. Sub aciunea presiunii hidrostatice mari, la E. coli se produce ntrzierea creterii, precum i modificri morfologice ale celulelor ce constau n apariia celulelor filamentoase. O specie izolat din adncurile abisale (11 034 m) Pseudomonas bathycetes crete la 3o i la l000 atm, cu durata unei generaii celulare calculat la 33 de zile. Creterea presiunii hidrostatice i scderea temperaturii produc modificri asemntoare ale lipidelor membranare. Ambii factori mresc vscozitatea lipidelor membranare i produc astfel o tranziie de la starea fluid lichid cristalin la faza mai solid, cea de gel. In compoziia lipidelor membranare, la bacteriile barofile crete cantitatea de acizi grai nesaturai, ceea ce pare s condiioneze meninerea unei fluiditi membranare compatibil cu funciile sale, contracarnd efectele presiunii hidrostatice nalte. Energia radiant Radiaiile electromagnetice au un spectru larg al lungimii de und i include radiaiile herziene (undele radio), infraroii, ale spectrului vizibil, ultraviolete (UV), X i gama. Ele sunt fenomene ondulatorii i fascicule discontinue de mici cuante de energie. Iradierea reprezint propagarea orientat a unui fascicul de cuante de energie asupra unui material, iar efectele asupra acestuia sunt consecina absorbiei energiei radiaiilor i depind de energia cuantei i de natura materialului absorbant. Radiaiile herziene, ca i cele infraroii, cu lungime de und mare (lambda, mai mare de l2 000 A o) au un potenial energetic att de sczut, nct nu produc modificri chimice ale substanelor de care sunt absorbite i de aceea, energia lor este convertit integral i imediat n caldur. Radiaiile cu lungimea de und cuprins ntre l2 000 Ao (infrarou apropiat) i 2000 Ao (ultraviolet ndeprtat) au un potenial energetic suficient de mare pentru a produce modificari fotochimice ale moleculelor de care sunt absorbite. Radiaiile cu lungimea de und mai mic de 2000 Ao (radiaiile X, gama i cosmice) au un potenial energetic att de mare nct produc ionizarea moleculelor pe care le ntlnesc, de unde i denumirea lor de radiaii ionizante. Efectele biologice ale radiaiilor depind de lungimea lor de und i de cantitatea total de energie incident (doza de iradiere). In funcie de aceti doi factori, iradierea poate avea dou efecte distincte asupra celulelor: - efectul letal ntr-o dinamic logaritmic, adic n fiecare interval succesiv de timp, celulele mor ntr-o proporie care rmne constant; - efectul mutagen, care const n modificarea unor caractere genotipice a unei pari din celulele expuse i se manifest prin apariia la aceste celule, a unor nsuiri fenotipice noi: rezistena la infecia cu un bacteriofag, dobndirea sau pierderea capacitii de a sintetiza un anumit metabolit etc. Deinococcus radiodurans este o bacterie recunoscut pentru rezistena sa la radiaia ionizant. Unul dintre factorii rezistenei este probabil, peretele celular, n structura cruia s-au identificat 6 straturi. Dei structural aparine celulelor Gram negative, adeseori se coloreaz Gram pozitiv. La nivel nalt de iradiere (1,75 megarazi), mecanismele reparatorii ale ADN la D. radiodurans (prin excizie, reparare prin recombinare) sunt foarte eficiente: celulele reconstituie genomul din 1000-2000 fragmente rezultate prin ruperi dublu catenare, spre deosebire de E. coli care i restabilete genomul din 10-15 fragmente cu ruperi dublu catenare. Se sintetizeaz Rec A, EFTu i Kat A. Radiaiile luminoase acioneaz asupra celulelor prin intermediul unor reacii fotochimice cu constituienii celulari. Cele mai studiate sunt reaciile implicate n procesul de fotosintez i n fenomenele de fototaxie, ntlnite la microorganismele fototrofe (bacterii, cianobacterii, alge). Lumina solar direct este bactericid, probabil datorit nu att aciunii radiaiilor UV, ct mai ales inclzirii sub efectul deshidratrii consecutive a celulelor expuse: dei soarele este o surs puternic de raze UV, stratul de ozon din patura superioar a atmosferei absoarbe majoritatea radiaiilor cu o lungime de und mai mic de 2900 A o. In plus, lumina

vizibil exercit i efecte cu caracter mai specific, indiferent de componenta caloric sau ultraviolet a luminii solare, dintre care unele sunt ns condiionate de o iradiere ultraviolet concomitent sau prealabil. l) Fotosensibilizarea reprezint fenomenul de intensificare a efectului biologic al radiaiilor luminoase, ca urmare a prezenei n mediul extracelular, a unor substane inactive la ntuneric, care se activeaz n prezena luminii. De exemplu, n prezena unor colorani fluoresceni (albastru de metilen, rou bengal), lumina vizibil puternic denatureaz proteinele i astfel omoar celulele bacteriene i inactiveaz virusurile. Aceti colorani rein un timp mai ndelungat o cuant absorbit, timp n care energia este transferat altei molecule, n loc s fie emis ca fluorescent. Transferul de energie determin reducerea unor aminoacizi (histidina, triptofan) i a bazelor azotate din acizii nucleici. 2) Fotoprotecia constituie rezultatul biologic al aciunii antagoniste a radiaiei luminoase faa de efectele unei iradieri simultane cu ultraviolete. Modificarile celulare caracteristice pentru iradierea cu UV sunt atenuate sau chiar prevenite printr-o expunere concomitent la radiaiile din spectrul luminii vizibile. 3) Fotoreactivarea este procesul de restaurare, de revenire la normal unor celule expuse prealabil la radiaii UV, realizat sub aciunea luminii vizibile, care este capabil s repare alterrile celulare, consecutive iradierii cu UV. Dintr-o populaie bacterian iradiat letal cu UV, un numr de celule renvie dup expunerea la lumin, n urmtoarele trei ore. Radiaiile ultraviolete au aciune inhibitorie net asupra creterii microorganismelor. Efectul lor depinde i de durata iradierii. Dozele mici, de scurt durat au efect mutagen i de inducie litic a celulelor lizogene sau blocarea temporar a multiplicrii celulare. Dozele mari produc modificri profunde, ireversibile, cu efect letal. Radiaiile UV, cu lungimea de und cuprins intre 2300 i 2800 Ao sunt cele mai active din punct de vedere biologic. Efectul letal maxim l au radiaiile cu lungimea de und de 2600 Ao (2537 Ao), corespunztor spectrului maxim de absorbie a UV de ctre ADN. Purinele i pirimidinele din acizii nucleici absorb radiaiile de 2600 A o, iar inelele aromatice ale triptofanului, tirozinei i fenilalaninei din proteine, pe cele cu lungimea de und de 2800 Ao. Radiaiile UV produc modificri ale moleculei de ADN, ce constau n formarea dimerilor de timin, ntre resturile adiacente situate pe aceiai caten, sau pe cele dou catene. Consecina este oprirea procesului de replicare sau alterarea secvenei bazelor n catena nou sintetizat. Restul aparatului celular rmne funcional, astfel nct, iradierea celulelor, urmat de infecia fagic, restrnge sinteza ARNm i a proteinelor, la cele codificate de fag. Cele mai multe alterri celulare induse de radiatiile UV pot fi reparate, dac microorganismele i virusurile sunt expuse aciunii luminii cu lungime de und mai mare, fenomen denumit fotoreactivare (reparare sub aciunea luminii). Din aceast cauz, eficiena sterilizrii cu raze UV este foarte mic. Radiaiile UV sunt emise de lmpi cu vapori de Hg la presiune mic (peste 90% din radiaii au lungimea de und de 2540 Ao) i sunt folosite pentru diminuarea contaminrii aeriene din diferite incinte. Radiaiile UV penetreaz foarte ptin prin corpurile solide, astfel c o pelicul fin de grsime pe sursa emitoare poate reduce mult efectul letal. Cele mai multe tipuri de sticl i materiale plastice absorb extensiv lumina UV. Sterilizarea are loc numai la doze nalte de iradiere. Lumina UV poate cauza leziuni ale pielii i retinei i favorizeaz apariia cancerului tegumentar. Faza de cretere a microorganismelor influeneaz eficacitatea iradierii cu UV. Celulele care cresc i se multiplic sunt cele mai sensibile, iar endosporii sunt rezisteni. Lumina solar are efect letal asupra microorganismelor, datorit componentei UV, dar i pentru c induce procesul de fotooxidare. In procesul fotoxidrii, energia luminoas cu lungimea de und mai mare dect a radiaiei UV este absorbit de pigmeni sau de ali compui chimici ai celulei i determin oxidarea letal a unor molecule de importan vital. Procesul are loc numai n prezena O2 atmosferic. Lumina solar poate inactiva prin fotooxidare, chiar sporii de B. anthracis, dup expunere prelungit. In contrast, efectul letal produs de UV nu necesit prezena O2. In celula vegetativ se activeaz mecanisme de reparare a leziunilor induse de UV: - fotoreactivarea este procesul n cursul cruia, n celulele iradiate cu UV i expuse razelor de lumin cu lungimea de und mai mic de 500 nm se induc enzimele de fotoreactivare, ce monomerizeaz dimerii de timin i o mare proporie din celulele iradiate rmn viabile; - excizia secveelor dimerice i a nucleotidelor nvecinate. Procesul este catalizat de o endonucleaz care incizeaz ADN, o exonucleaz care excizeaz secvena, o ADN-polimeraz care repar secvena prin ncoporarea corect a bazelor i o ADN-ligaz, care reunete cele dou capete ale catenei reparate; - repararea la ntuneric prin recombinare postreplicativ. Replicarea ADN progreseaz pn ajunge la un dimer neexcizat. Pe catena opus dimerului este lsat o discontinuitate i replicarea este reluat la un nou situs de iniiere, situat cu 80-l000 de baze n aval. Asemenea discontinuiti apar pe ambele catene nou sintetizate, deoarece dimerii de T se gsesc pe ambele catene parentale. Discontinuitile vor fi reparate prin inseria recombinatorial a ADN parental din catena opus. Radiaiile corpusculare (, , protonii), ca i radiaiile electromagnetice i x sunt ionizante. Radiaiile sunt atomi de He, cu for sczut de penetraie i nu se folosesc pentru sterilizare. Radiaiile sunt electroni cu vitez nalt.

Razele i x au lungimi de und foarte mici i sunt generate de surse radioactive (Co 6o) i electronii accelerai sunt sursele principale de radiaii ionizante. Unitatea de radiaie folosit n microbiologie a fost radul, care cuantific energia absorbit din radiaia ionizant, de materia prin care trece radiaia. Unitatea de msur mai modern a radiaiei este gray (Gy), definit ca un aport de 1 J Kg-1 energie n esut. 1 Gy = l00 razi. Cel mai rezistent organism la radiaiile ionizante este Deinococcus radiodurans. Radiaiile ionizante scot electronii din atomii prin care trec. Toate schimbrile chimice ce au loc n celula bacterian se datoreaz electronilor mobilizai, care initiaz un lan de reacii chimice. Ionizarea se produce mai nti n apa din citosol i rezult radicali foarte reactivi cu via scurt: OH . si H+. Se genereaz astfel coloanele de ionizare, prin deplasarea n cascad a electronilor de pe orbitele lor, care determin alterarea sau distrugerea unor molecule eseniale pentru celul. Se produc ruperi monocatenare sau dublu catenare ale moleculei de ADN si stoparea sintezelor si diviziunii celulare. Datorit efectului lor specific, aceste radiaii sunt denumite generic ca ionizante, spre deosebire de alte radiaii (de exemplu, UV) care nu transform atomul n ion, deoarece nu pot s-i smulg un electron, ci determin numai excitarea atomului, adic trecerea lui la un nivel energetic superior, prin deplasarea unui electron satelit pe o orbit mai indepartat de nucleul atomic. Razele x sunt cele mai active, n special cele moi, cu un intens efect bactericid. Dozele neletale opresc diviziunea i produc modificri de ordin morfologic i fiziologic. Razele x tari, ca i razele i , mai penetrante, deci mai puin absorbite, au un efect antimicrobian mai atenuat. Radiaiile i x se folosesc pentru sterilizarea conservelor alimentare, dei le confer un miros particular, care poate fi numai parial ndeprtat. De asemenea, ele sunt folosite pentru inactivarea vaccinurilor, avnd avantajul c nu modific structura chimic i antigenic a produsului tratat. Rezistena la iradiere este mult mai mare la microorganisme dect la mamifere. Astfel, n timp ce doza mortal pentru om este de circa 500 r, pentru E. coli este de l0 000 r, pentru levuri este 30 000 r, iar pentru Paramecium, de 300 000 r. S-au izolat bacterii viabile din apa de rcire a unei pile atomice, care primise l00 milioane r, ntr-un interval de 8 ore. Starea ADN n celul este important n raport cu sensibilitatea la iradiere. Sporii sunt mai rezisteni dect celulele vegetative, deoarece, probabil conin substane radioprotectoare, nveliul sporal pare a fi protector, iar ADN sporal se gsete ntr-o stare mai rezistent la rupere. Unele microorganisme au o rezisten deosebit la radiaia ionizant i la UV, deoarece posed enzime capabile s repare avaria ADN. Mecanismele reparatorii s-au studiat la D. radiodurans i la E. coli, la care funcioneaz mecanisme rapide de recombinare reparatorie, codificate de gene rec multiple (A, B, C). Aciunea laserului Laserul este un fascicul foarte concentrat de cuante luminoase sau fotoni, generat de obicei n interiorul unui cristal de rubin (cristal de oxid de aluminiu, n care sunt dispersai atomi de crom), ca urmare a excitaiei atomilor de crom din cristal, podus prin modificarea strii energetice sub aciunea luminii emise de o lamp cu xenon (blitzul fotografilor). Denumirea de laser vine de la iniialele cuvintelor engleze care l definesc: light amplification by stimulated emission of radiation (amplificarea luminii prin emisie stimulat de radiaii). Spre deosebire de o surs de lumin de tipul becului electric (cu lumin incandescent), care emite lumin incoerent sub form de radiaii dispersate i de numeroae lungimi de und diferite, laserul emite o lumin coerent, sub forma unui fascicul de radiaii foarte apropiate ntre ele, cu o lungime de und practic uniform, cuprins ntre 3000 i 9000 Ao. Datorit proprietilor sale particulare, laserul poate aciona extrem de intens i foarte localizat, concentrnd o cantitate enorm de energie, pe o suprafa infim, strict circumscris. Aplicat asupra microorganismelor, laserul determin distrugerea lor instantanee i de aceea poate fi folosit pentru sterilizarea unor medii care se degradeaz prin expunere la temperaturi ridicate. Aciunea ultrasunetelor Dintre diferitele vibraii mecanice, infrasunetele (sunt neaudibile) i sunetele percepute de urechea uman (l6-l6 000 herzi) nu influeneaz microorganismele. Vibraiile ultrasonice i cele supersonice produc moartea celulelor prin ruperea pereilor celulari i dezintegrarea structurilor intracelulare. Eficiena vibraiilor sonice depinde mai mult de amplitudinea dect de frecvena lor. Ca atare, vibraii cu frecven relativ joas, dar cu intensitate mare sunt mai eficiente dect cele cu frecven nalt i intensitate mic. Sensibilitatea bacteriilor la ultrasunete variaz cu specia i, pe de alt parte este mult mai mare la formele vegetative, dect pentru spori.

Moartea i liza bacteriilor se datoresc fenomenului de cavitaie: pereii celulari sunt intens bombardai de bule foarte mici de gaz, care se formeaz n lichidul de suspensie, ca rezultat al agitaiei produs de vibraiile cu frecven nalt (ultrasonice i hipersonice). Aciunea ultrasunetelor este folosit n practic pentru dezintegrarea celulelor bacteriene, separarea enzimelor sau altor constituieni chimici sau antigenici, ca i pentru sterilizarea anumitor produse.

MECANISMELE DE ACIUNE MICROORGANISMELOR

ALE

ANTISEPTICELOR

SI

DEZINFECTANILOR

ASUPRA

Substanele chimice din compoziia unui mediu de cretere a microorganismelor pot exercita, n funcie de natura i concentraia lor, trei tipuri de efecte asupra acestora: - un efect favorizant asupra dezvoltrii i multiplicrii celulare, prin aportul substanelor nutritive i realizarea echilibrelor fizico-chimice necesare; - un efect microbiostatic, prin blocarea potenial reversibil a proceselor de multiplicare celular, determinnd inhibiia procesului de multiplicare, dar bacteriile rmn viabile i i reiau creterea i multiplicarea dup ce sunt transferate pe medii adecvate; - un efect microbicid, prin alterarea profund i ireversibil a unor procese metabolice eseniale. Particularitile fiziologice ale microorganismelor influeneaz aciunea substanelor chimice. De exemplu, CO2 i H2S sunt toxice pentru majoritatea microorganismelor aerobe, al cror metabolism respirator l inhib, dar pentru unele specii bacteriene aceste substane reprezint o surs de energie. Una i aceiai substan poate aciona n moduri diametral opuse, n funcie de concentraia ei: n concentraie de 1%, zaharoza este o bun surs de carbon i energie, iar la concentraia de 40% are efect bacteriostatic. Substanele folosite n metabolismul microorganismelor au rolul de surse de carbon, de azot i de energie sau acioneaz ca factori de cretere. La concentraii foarte mici ale unei substane nutritive n mediu, creterea bacterian este foarte slab, dar se intensific odat cu creterea concentraiei substanei nutritive, pn cnd aceasta atinge un nivel prag, dup care, rata de cretere a populaiei celulare devine constant, independent de concentraia substanei nutritive. Cnd concentraia substanei atinge limita de toleran pentru celul, se produce inhibiia creterii celulare, iar dincolo de aceast limit, substana nutritiv poate avea un efect bactericid. Unele substane exercit efecte de chimiotaxie sau chimiotropism pozitiv, fiind atractante pentru microorganisme, n timp ce altele exercit un chimiotactism negativ asupra celulelor, efectul lor fiind repelent. Efectele duntoare ale unor compui chimici pot fi de tip microbiostatic, alteori, compuii chimici au efect microbicid, adic determin moartea microorganismelor expuse. Imprirea substanelor chimice n microbiostatice i microbicide este arbitrar, deoarece o substan poate fi microbiostatic la concentraie mic sau cnd aciunea ei este de scurt durat, dar poate fi microbicid la concentraie mare sau dup aciunea prelungit a unei concentraii mici. Caracterul bacteriostatic sau bactericid este dependent de urmtoarele dou criterii: - concentraia la care se manifest un anumit efect; - timpul de aciune pentru producerea efectului. O substan este microbicid (bactericid, fungicid) dac efectul ei se produce ntr-un interval scurt de timp i se manifest la concentraii foarte mici i este microbiostatic, dac efectul ei rmne ca atare i la concentraii relativ mari de substan activ, iar rata efectului microbicid este foarte sczut, astfel nct cel puin o parte din celule pot supravieui timp foarte ndelungat. In practic, n afara celor doi termeni se folosesc denumirile de antiseptice (AS) i dezinfectante (DF). Antisepticele sunt substane chimice care, aplicate pe esuturile vii impiedic creterea i multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice i pot fi aplicate pe esuturi umane i animale. Termenul de dezinfectant este restrns la substanele cu efect microbicid rapid, la concentraii mici. Ele se aplic pe obiecte neanimate, n scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substane dezinfectante sunt toxice i nu pot fi administrate la om i la animale. Antisepticele i dezinfectantele cuprind o larg varietate de ageni chimici (tabel nr. 2) i poart denumirea generic de biocide. Biocidele, n general, au un spectru mai larg de aciune dect antibioticele i spre deosebire de acestea, care au inte intracelulare specifice, biocidele au inte multiple. Majoritatea substanelor dezinfectante acioneaz fie prin dizolvarea lipidelor din membrana citoplasmatic (detergeni, solveni lipidici), fie prin modificri ale proteinelor, acizilor nucleici etc. Unele biocide se folosesc pentru conservarea unor produse biologice (farmaceutice, alimentare). Conservarea semnific prevenirea multiplicrii microorganismelor. Altele se folosesc pentru curire, care semnific ndeprtarea unui material strin de pe o suprafa.

Tabel nr.2: Structurile chimice i utilizrile biocidelor antiseptice i dezinfectani. Compui Reprezentani Formula chimic chimici Alcooli Etanol CH3 CH2OH Izopropanol

Aciune Antiseptic Dezinfectant Agent de conservare Dezinfectant

Aldehide

Glutaraldehida O=C - CH2CH2CH2 C=O Formaldehida H2C O

Anilide

Structura general Triclorcarban

C6H5-NH-COR

Agent de sterilizare Agent de conservare Antiseptic

Biguanide

Clorhexidina

Antiseptic

Alexidina Biguanide polimerice Bifenoli Triclosan

Dezinfectant Agent de conservare Agent antiplac dentara Antiseptic Agent antiplac dentara

Hexaclorofen

Odorizant Agent de conservare

Diamidine

Propamidina Dibromopropamidina Compui cu Cl Compui cu I Cloroxilenol (PCMX) OCl-, HOCl, Cl2 I2

Antiseptic Agent de conservare

Compui halogenai Halofenoli

Dezinfectant Antiseptic Agent de curire Antiseptic Agent de conservare

Compui metalici Peroxizi

Compui cu Ag Compui cu Hg Peroxid de H Ozon

Ag Hg H2 O2 O3

Agent de conservare Antiseptic Dezinfectant Dezinfectant Agent de sterilizare

Acid peracetic Fenoli crezoli i Fenol

CH3COOOH

Agent de sterilizare Dezinfectant

Cresol

Agent de conservare

Sruri cuaternare de amoniu

Structura general
R1 R
2

Dezinfectant Antiseptic

R3 N R
4

X-

Cetrimid, clorura de benzalkonium

Agent de conservare Agent de curire

Faza vapori

de

Etilenoxid
H2C

O CH2

Agent de sterilizare Dezinfectant Dezinfectant

Formaldehida Peroxidul de H

H2CO H2 O2

Mecanisme de aciune a substanelor antibacteriene Metodele de studiu privind mecanismele de aciune ale AS i DF sunt: - studiul dinamicii nglobrii; - determinarea efectelor litice sau de pierdere a constituienilor celulari; - studiul efectelor asupra modelului membranar; - detectarea inhibiiei activitii enzimelor; - studiul efectelor asupra proceselor de biosintez macromolecular; - examinarea microscopic a celulelor expuse aciunii biocidelor. Efectele nocive ale substanelor antibacteriene se exercit pe mai multe ci: - prin modificri de permeabilitate la nivelul peretelui celular i membranei citoplasmatice; - prin denaturarea unor constituieni celulari eseniali (proteinele); - prin blocarea gruprilor funcionale active ale enzimelor i interferena cu metabolismul productor de energie; - inhibiia competitiv prin analogie steric, a reaciilor de biosintez. Uneori, aceiai substan i poate exercita aciunea, pe una sau pe mai multe ci, dar una dintre acestea reprezint calea principal de aciune. Oricare ar fi tipul de celul microbian, aciunea substanelor antimicrobiene se desfoar dup o secven comun de evenimente. Interaciunea cu suprafaa celulei poate modifica semnificativ viabilitatea (de exemplu, glutaraldehida), dar cei mai muli ageni antimicrobieni sunt activi dup ce ptrund n celul. Mecanismele aciunii antisepticelor i dezinfectanilor asupra protozoarelor nu au fost investigate, datorit dificultii cultivrii unor protozoare n condiii de laborator (de exemplu, Criptosporidium). Diferitele stadii ale ciclului

de dezvoltare (de exemplu, trofozoiii i chitii) ilustreaz modul n care schimbrile fiziologice i citologice influeneaz rspunsul la antiseptice i dezinfectani. Antisepticele i dezinfectantele se folosesc pe scar larg n spitale i n alte locaii, pentru aplicaii locale i pentru dezinfectarea suprafeelor expuse. Ele constituie o parte esenial a practicilor de control al infeciilor i contribuie la prevenirea infeciilor nosocomiale*.
Infeciile nosocomiale sunt produse de tulpini de microorganisme cu circulaie limitat n mediul spitalicesc, rezistente la tratamentul cu antibiotice i cu ageni chimioterapeutici, ca rezultat al unei presiuni selective constante.
*

Substane antibacteriene active prin modificri de permeabilitate Substanele din aceast categorie (spunurile, detergenii) produc modificri fizico-chimice, care duc la pierderea permeabilitii selective a membranelor celulare, astfel nct membrana citoplasmatic nu mai reine n interiorul celulei, moleculele utile (aminoacizi, nucleotide, coenzime, ioni) i nici nu poate opri ptrunderea din exterior a unor substane nocive. Spunurile i datoresc efectul antimicrobian, aciunii acizilor grai nesaturai (oleic, linoleic, linolenic) din compoziia lor. Aciunea lor se exercit asupra constituienilor lipidici ai membranelor celulare, care astfel devin mai permeabile. Datorit capacitii lor emulsionante, spunurile determin, prin splare, o reducere masiv a numrului microorganismelor pe suprafaa tegumentului. Detergenii sunt compui organici tensioactivi, obinui prin sintez chimic, din materii prime derivate din petrol. Molecula lor este asemntoare aceleia a spunurilor, dar au proprieti fizice i chimice superioare. Molecula agenilor tensioactivi este asimetric: conine o regiune hidrofil i una hidrofob (lipofil sau liposolubil). Molecula detergenilor se leag att de ap, ct i de moleculele organice nepolare. Molecula amfipatic a detergenilor se orienteaz cu captul hidrofob, spre materialul organic, iar cu captul hidrofil, spre ap. Efectul detergenilor este udarea, desorbia, emulsionarea, suspensionarea i stabilizarea particulelor dizlocate de pe o suprafa (Fig. 74). Rezultatul este detergena (sau curirea). La contactul cu o suprafa lipidic sau cu interfaa ulei-ap, moleculele detergentului se adsorb pe aceast suprafa, prin gruprile lor hidrofobe, iar cele hidrofile rmn n ap.

Fig. 74. Molecula de detergent se orienteaz cu gruparea hidrofob spre materialul organic

Astfel orientate, moleculele detergentului formeaz un strat (o soluie) de continuitate ntre cele dou medii insolubile (lipide-ap), ceea ce determin efectul de udare, ca rezultat al scderii tensiunii superficiale. Pe baza sarcinii sau absenei ionizrii gruprii hidrofile, detergenii sunt de patru tipuri: cationici, anionici, neionici i amfoterici. Cei neionici nu au caliti dezinfectante, iar uneori pot chiar s favorizeze creterea bacteriilor i fungilor.

Monoglicerida acidului stearic Lauratul de sodiu (detergent neionic) (detergent anionic) Detergenii anionici sunt sruri de Na i K ale acizilor grai superiori. Au efect bactericid sczut, deoarece prin disociere elibereaz un anion organic, cu toxicitate redus, respins de sarcina net negativ a suprafeei bacteriene. Sunt mai eficieni fa de bacteriile Gram negative.

Detergenii cationici (Cetavlon, Cetazol, Bromocet) sunt sruri de amoniu quaternar, care conin patru grupri organice legate de un atom de azot.

Cetilpiridinium clorid (detergent cationic) Prin disociere, detergenii cationici elibereaz un cation organic toxic. Compuii amoniului quaternar acioneaz asupra structurii membranei, pe care o dezorganizeaz. Bacteriile i pierd sarcina electronegativ, prin adsorbia ionilor pozitivi. Substanele lipidice din peretele celular i cele din membran sunt solubilizate. Numeroi constituieni citoplasmatici prsesc celula, iar substana activ ptrunde n interior i denatureaz proteinele i acizii nucleici. Srurile quaternare de amoniu lizeaz sferoplatii i protoplatii suspendai n soluie de sucroz. Sunt sporostatici (inhib dezvoltarea celulei vegetative din sporul germinat, dar nu procesul de germinare propriu-zis). Au efect micobacteriostatic, dar nu micobactericid. Compuii amoniului quaternar se folosesc pentru dezinfecia preoperatorie a tegumentului intact, se aplic pe membranele mucoase. Detergenii cationici sunt bactericizi fa de toate categoriile de bacterii, chiar i fa de M. tuberculosis, deoarece dizolv nveliul lipidic al suprafeei lor. Eficiena lor este diminuat de materialele fibroase, de ap, de ionii de Ca 2+ i Mg2+. Oxideaz obiectele de metal, dac nu se adaug un agent antioxidant (nitritul). Viabilitatea sporilor nu este afectat. Nu sunt toxici pentru organismul uman i nu irit esuturile. Se folosesc ca antiseptici tegumentari. Aciunea lor este neutralizat de spunuri i fosfolipide. Detergenii neionici (polieteri i esteri poliglicerici) nu au aciune bactericid. Adaugai n mediile nutritive sunt chiar metabolizai de unele microorganisme. Unii dintre ei (Tween 80) sunt folosii ca ageni de dispersare ai celulelor bacteriene, pentru a favoriza creterea i multiplicarea lor. Concentraiile mici de polisorbat (Tween) modific permeabilitatea membranei externe a bacteriilor Gram negative.

Tween 80 Agenii amfoterici cumuleaz proprietile de detergent ale compuilor anionici, cu proprietile antimicrobiene ale compuilor cationici. Activitatea lor rmne constant la o variaie larg de pH. Din aceast categorie fac parte compuii din seria Tego. Substane care acioneaz prin denaturarea proteinelor Substanele din aceast categorie produc modificri fizico-chimice ale coloizilor citoplasmatici, stopeaz activitatea enzimelor i precipit sau coaguleaz proteinele celulare. Fenolul (acidul carbolic) este cel mai vechi dezinfectant cunoscut (Lister l-a folosit in l867). La concentraii mici este bactericid, deoarece produce denaturarea i chiar precipitarea proteinelor celulare. Este iritant i produce coagularea proteinelor tisulare. Aceleai efecte le produc i derivaii si (crezolul, crezil-acetatul). Agenii antimicrobieni de tip fenolic s-au folosit pentru proprietile antiseptice, dezinfectante sau conservative, n funcie de compus. Adeseori s-au denumit otrvuri protoplasmatice generale (McDonnell, 1999), dar sunt activi i fa de membran. Fenolul induce pierderea progresiv a constituienilor intracelulari, inclusiv eliberarea K +, indiciul major al leziunii membranare. Se consider c fenolul acioneaz la punctul de separare a celulelor fiice pereche. Celulele tinere sunt mai sensibile. Fenolii sunt antifungici i antivirali. Aciunea antifungic se datoreaz lezrii membranei plasmatice i pierderii constituienilor citoplasmatici.

Fenolul i crezolii au proprieti analgezice (fig. 75). Se folosesc sub form de spray ca antiseptice i analgezice pe membranele mucoase (ale urechii, nasului, gtului). Sunt foarte stabili la nclzire i uscare i i pstreaz activitatea n prezena materialului organic. Fa de sporii bacterieni au o eficien moderat. In diluie de 5%o, fenolul este folosit ca prezervant pentru diferite preprate biologice. Prin convenie internaional, activitatea fenolului este considerat ca etalon, n raport cu care se apreciaz activitatea antibacterian a diferitelor substane.

Fig. 75. Structura agenilor antibacterieni care aparin grupului fenolic.

Fenolii sunt mai activi n amestec cu spunurile, care mresc solubilitatea lor i favorizeaz penetrarea n substrat. Adugarea unui halogen (clor) sau a unui compus organic stimuleaz activitatea microbicid a fenolilor. Difenolii sunt derivaii hidroxi-halogenai a dou grupri fenolice conectate prin diferite legturi. Au spectru larg de eficacitate, sunt sporostatici, dar au activitate sczut fa de Ps. aeruginosa i fungi. Triclozanul i hexaclorofenul sunt cele mai folosite biocide din acest grup: n spunurile antiseptice i n soluiile dezinfectante pentru mini. Ambele au efecte cumulative i persistente asupra tegumentului. Triclosanul are activitate n special fa de bacteriile Gram pozitive. Eficiena fa de bacteriile Gram negative i levuri poate s creasc prin efectul de formulare: de exemplu, n asociaie cu EDTA, determin creterea permeabilitii membranei externe. Efectul primar se produce, probabil, asupra membranei citoplasmatice, deoarece inhib nglobarea nutrienilor, iar concentraiile mari bactericide produc creterea ampl a permeabilitii i eliberarea rapid a componentelor celulare. Hexaclorofenul (difenol halogenat) este bacteriostatic la diluii foarte mari. In combinaie cu un spun este un dezinfectant eficace al pielii. Dac este absorbit pe cale tegumentar este toxic. Nu are miros iritant, este un bun deodorant, ceea ce explic utilizarea sa ca deodorant comercial i pentru producerea spunurilor, nainte de a fi interzis, datorit neurotoxicitii la copii. Mecanismul de aciune const n inhibiia catenei transportoare de electroni, al crei sediu structural este membrana citoplasmatic, efectul fiind bactericid.

Hexaclorofenul Clorhexidenul este probabil cel mai folosit biocid n scopul producerii antisepticelor utilizate pentru curirea minilor, dar i ca dezinfectant i conservant. Este un nlocuitor eficient al hexaclorofenului. Are eficien cu spectru larg. Activitatea antibacterian este dependent de pH i este mult diminuat n prezena materiei organice.

Clorhexidenul Clorhexidenul este un agent bactericid, deoarece traverseaz peretele celular sau membrana extern, prin difuzie pasiv i acioneaz asupra membranei citoplasmatice, perturbnd-i permeabilitatea. Nu este sporicid. Efectul asupra germinrii este minim, dar inhib creterea. Micobacteriile sunt, n general, foarte rezistente la clorhexiden. Alexidina difer chimic de clorhexiden, pentru c are grupri terminale etil-hexil. Are aciune mai rapid bactericid, deoarece altereaz mai rapid permeabilitatea. Esterii alkilai ai acidului hidroxibenzoic sunt conservani ai alimentelor i medicamentelor. Nu sunt toxici, deoarece sunt hidrolizai rapid. Evaluarea potenialului antibacterian al agenilor chimici Potenialul sau eficiena unui agent chimic antimicrobian este influenat de temperatur, pH, concentraie i timpul de aciune. Creterea temperaturii cu l0oC dubleaz rata reaciilor chimice i mrete potenialul agentului chimic. La o valoare a pH-ului care mrete gradul de ionizare a unui agent chimic crete i capacitatea sa de a penetra n celul. Valoarea pH poate altera chiar coninutul celulei. Concentraia influeneaz decisiv efectele agentului antibacterian. Concentraiile mari pot fi bactericide, iar cele mici pot fi bacteriostatice. Alcoolul etilic i izopropilic sunt excepii notabile de la regula concentraiilor. Ei sunt mai activi la concentraia de 70% dect la concentraii mai mari. Alcoolii acioneaz prin coagularea (denaturare permanent) a proteinelor, iar apa este necesar reaciei de coagulare. Amestecul alcool-ap n proporia 70% penetreaz mai profund dect alcoolul pur, n materialul supus dezinfectrii.

Coeficientul fenolic
Efectul dezinfectant al fenolului este unitatea etalon, cu care se compar ali dezinfectani, n aceleai condiii de aciune. Comparaia se exprim n coeficientul fenolic (CF). Microorganismele test pentru determinarea coeficientului fenolic sunt S. typhi i S. aureus. Un dezinfectant care are CF egal cu 1, are aceiai eficien antibacterian ca i fenolul, iar un CF mai mic dect 1 semnific o eficien mai sczut. Coeficientul fenolic se determin astfel: - se prepar cteva diluii ale agentului chimic i se repartizeaz volume egale n tuburi test; - se prepar un set identic de tuburi test cu diluii de fenol; - ambele seturi de tuburi se aduc la acelai nivel termic prin nclzire n baie de 20o, timp de 5 minute; - n fiecare tub din cele dou seturi se transfer 0,5 ml din cultura unui microorganism test (S. typhi sau S. aureus); - dup 5, l0, l5 minute se transfer, cu ansa calibrat, un volum din fiecare tub, ntr-un tub cu bulion nutritiv. Tuburile se incub; - dup 48 de ore se evalueaz turbiditatea tuburilor inoculate i se gsete cea mai mic concentraie (cea mai mare diluie a agentului care a omort toate organismele n l0 minute, dar nu n 5 minute);

se stabilete raportul diluiei agentului chimic, la diluia fenolului ce are acelai efect. De exemplu, dac diluia l/l0 a unui agent chimic are acelai efect ca i diluia l/l00 a fenolului, CF al agentului chimic este l0. Determinarea CF este o modalitate adecvat de a aprecia eficiena agenilor chimici derivai din fenol, dar este mai puin adecvat pentru ali ageni dezinfectani. Evaluarea potenialului antibacterian a unui agent chimic se poate face mai simplu, prin metoda discurilor de hrtie de filtru: - fiecare disc de hrtie este mbibat cu soluia unui agent chimic diferit; - discurile se aeaz pe suprafaa unei plci cu mediu agarizat, inoculat cu un organism test; - fiecare organism test se nsmneaz pe o plac diferit; - dup incubare, efectul inhibitor al unui agent chimic asupra organismului se identific printr-o zon clar de inhibiie a creterii n jurul discului. Diametrul zonei de inhibiie a creterii este proporional cu potenialul antibacterian al agentului chimic.
-

Acizii i bazele
Cele mai multe bacterii pot fi cultivate n medii al cror pH este cuprins ntre 6 i 9, diferena de concentraie a ionilor de H fiind echivalent cu diferena de la l la 1000. Tolerana la variaia larg a pH se datoreaz faptului c bacteriile sunt puin permeabile pentru ionii de H+ i OH-, ceea ce le permite meninerea neutralitii interne. Aa se explic faptul c, deseori, tocmai acizii slabi i bazele slabe, care se disociaz puin, au un efect antibacterian evident. Efectul lor nu se datoreaz ionilor de H+ sau OH-, ci este legat de prezena unui numr mare de molecule nedisociate, acizi sau baze care pot ptrunde n celul mai uor dect ionii corespunztori. De aceea, activitatea lor antimicrobian este dependent de pH-ul mediului. Aa se explic faptul c ntr-un mediu uor acid, acidul acetic este toxic pentru bacterii, pe cnd HCl are un efect antibacterian slab. La un pH relativ sczut al mediului, acizii slabi, aflai sub forma nedisociat pot ptrunde n celula bacterian i i modific pH, n timp ce acizii tari, intens disociai rmn n afara ei. In mediul neutru sau uor alcalin, moleculele de acid acetic sunt aproape complet ionizate (disociate), ceea ce le ngreuiaz accesul n celul i, ca urmare, toxicitatea lor este anulat. Acelai mod de comportare este caracteristic i bazelor slabe: NH 3 este toxic n mediu slab alcalin i inofensiv pentru bacterii, n mediu neutru sau slab acid. Pentru acizii tari, eficiena aciunii antimicrobiene este proporional cu concentraia ionilor de H+ n soluie. HCl este sporicid i se folosete pentru dezinfectarea pieilor de animale, infectate cu B. anthracis. Unele bacterii sunt acidotolerante i chiar acidofile. Lactobacillus sp. se dezvolt la pH 4, iar Thiobacillus thiooxidans, chiar n prezena H2SO4, 0,1 M. Aciunea antimicrobian a acizilor este folosit n practic pentru conservarea alimentelor cu acid acetic 5%, cu srurile acidului propionic (CH3- CH2 COOH), parahidrobenzoic, benzoic, sorbic sau cu esterii metil, etil, propil, butil, ori prin fermentaie lactic natural. Micobacteriile sunt relativ rezistente la aciunea acizilor i alcolilor, practica obisnuit fiind lichefierea sputei nainte de cultivare, prin expunere pentru 30 de minute, la NaOH 1N sau H2SO4 1N. Acidul boric este un antiseptic de valoare medie. Activitatea antimicrobian a alcalilor tari este dependent de concentraia ionului OH- n soluie. NaOH are proprieti alcaline puternice: la concentraia de 5% omoar celulele vegetative, iar la concentraii mai mari omoar sporii de B. anthracis. Ca(OH)2 rezult din reacia CaO + H2O. Soluia 20% de Ca(OH)2 omoar majoritatea bacteriilor nesporulate. Alcoolii sunt cei mai utilizai ageni chimici pentru dezinfecie. Ei sunt activi prin efectul denaturant asupra proteinelor i prin solubilizarea lipidelor. Produc ruperea membranelor i inactivarea enzimelor. Omoar bacteriile nesporulate, inclusiv pe cele acidorezistente. Inhib sporularea i germinarea sporilor, dar efectul este reversibil. Efectul dezinfectant al alcoolilor crete odat cu lungimea catenei (metilic, etilic, izopropanol etc), pn la 8-l0 atomi de C, dup care solubilitatea n ap scade progresiv. Cei mai folosii alcooli sunt CH 3OH (metanol), C2H5OH (etanol) i CH3CHOHCH3 (izopropanol). Ultimul este un bactericid mai eficace, la concentraia de 99%. Etanolul se folosete n soluii apoase. Cele mai eficiente sunt cele cu concentraia de 60-70%. Prezena apei este esenial pentru activitatea antimicrobian a etanolului. Concentraiile mai mari de 90% i mai mici de 5% sunt relativ ineficiente ca ageni dezinfectani. Aciunea lor dezinfectant, ca i efectul denaturant asupra proteinelor implic participarea apei. Eficiena aciunii lor scade n prezena materiei organice. Expunerea timp de o or este letal pentru formele vegetative, dar nu modific viabilitatea sporilor, dar inhib sporularea i germinarea lor. Contactul de scurt durat nu are efect sterilizant, ci numai reducerea populaiei bacteriene. Alcoolii au activitate antibacterian rapid, cu spectru larg fa de formele vegetative (inclusiv micobacterii), antifungic, neutralizeaz infeciozitatea virusurilor.

Pentru c omoar sporii, alcoolii nu se folosesc pentru sterilizare, dar se folosesc pentru dezinfectarea suprafeelor i ca antiseptice tegumentare. Alcoolul izopropilic este mai eficient fa de bacterii, iar alcoolul etilic este mai eficient fa de virusuri. Fenil-etanolul este activ faa de bacteriile Gram negative i se folosete drept conservant al soluiilor de uz oftalmic. Ali solveni organici (eter, benzen, aceton) omoar bacteriile dar nu sunt ageni dezinfectani. Adugarea ctorva picturi de toluen sau cloroform n soluii apoase inhib dezvoltarea fungilor i bacteriilor. Glicerolul este bacteriostatic la concentraii de peste 50%. Este folosit pentru conservarea vaccinurilor, deoarece nu este iritant pentru esuturi. Substane care acioneaz prin interferen cu gruprile active ale proteinelor-enzime Unele substane acioneaz direct asupra unor grupri reactive (amino, carboxil, sulfhidril, amido, indol) din structura enzimelor, combinndu-se cu ele i blocnd astfel sau modificnd activitatea enzimatic. In funcie de stabilitatea legturii formate ntre aceste substane i gruprile reactive ale enzimelor, efectul este microbiostatic sau microbicid, iar reacia este reversibil sau ireversibil. Formaldehida (HCHO) i glutaraldehida (OCH(CH2)3CHO) omoar celulele prin denaturarea nespecific a proteinelor i acizilor nucleici i au spectru larg de aciune antimicrobian. Formaldehida (CH2O) este o monoaldehid, foarte reactiv, care interacioneaz cu proteinele, cu ADN i cu ARN. Concentraiile de 25 g/ml pot fi bactericide. Ele nlocuie atomii labili de H din gruprile NH 2, -OH, -COOH, -SH ale proteinelor i formeaz puni metilenice (R-CH2-R), care leag, n general ireversibil, moleculele proteice i le inactivez. Reaciile formaldehidei sunt, parial, ireversibile. Se folosete n soluie apoas (34 - 38%) sau 20% n alcool metilic 65-70% (pentru a ntrzia polimerizarea) sau prin vaporizare la cald, pentru dezinfectarea i sterilizarea suprafeelor uscate. Este bactericid, fungicid, sporicid i inactiveaz virusurile. In concentraie de 4% o este folosit ca prezervant pentru vaccinuri i preparate de diagnostic. Soluiile de formaldehid, apoase sau alcoolice sunt netoxice i neiritante. Ele omoar celulele vegetative n 5 minute, M. tuberculosis n l0 minute, sporii n 3-l2 ore i inactiveaz virusurile n l0 minute. O-ftalaldehida are aciune bactericid i sporicid. Este un compus aromatic cu dou grupri aldehidice. Glutaraldehida are spectru larg de activitate fa de bacterii, spori, fungi i inactiveaz virusurile. Se leag de structurile de suprafa ale celulei, inhib transportul membranar i enzimele periplasmice, inhib sinteza macromoleculelor. Glutaraldehida interacioneaz puternic cu lizina, dar i cu ali aminoacizi. Este mai activ la pH alcalin. Pe msur ce pH extracelular se modific la valori alcaline, suprafaa celulei expune mai multe situsuri reactive i efectul bactericid este mai rapid. Are efect letal asupra micobacteriilor. La concentraii mici inhib germinarea sporului, iar la concentraii mari (2%) este sporicid. Datorit efectului denaturant asupra proteinelor, glutaraldehida se folosete ca fixator n tehnica de preparare a materialului biologic pentru examinarea la microscopul electronic. Etilen-oxidul (CH2-O-CH2) este cel mai folosit gaz sterilizant. Molecula de etilen-oxid nlocuie H din proteine, din acizii nucleici i probabil din alte molecule. Legarea etilen-oxidului se numete alkilare i efectul este blocarea gruprilor reactive ale macromoleculelor. Este solubil n ap i foarte exploziv. Este folosit pentru sterilizarea gazoas a obiectelor termosensibile: echipamente chirurgicale, lenjerie de spital. Are aciune toxic remanent (este vezicant). Ionii unor metale grele (Hg, Ag, Cu, Zn, Fe) sunt toxici pentru microorganisme datorit aciunii lor oligodinamice, adic sunt activi la concentraii foarte mici. Cu, Zn, Fe intr n componena unor enzime i au rolul fiziologic de microelemente, dar la concentraii supraoptimale, n compoziia substanelor antimicrobiene, ionii metalelor grele acioneaz prin precipitarea enzimelor sau a altor proteine eseniale ale celulei. Ionii metalici pot fi aezai n serii cu activitate antimicrobian descresctoare: Hg, Ag, Zn, Cu. Sunt activi la concentraii foarte mici (o parte la un milion), datorit afinitii lor pentru gruprile SH. Hg este utilizat sub forma srurilor anorganice (HgCl2, sublimat coroziv, cu CF = 827 i oxicianura de Hg) sau sub form organic (mertiolat, mercurocrom). Aciunea srurilor de Hg se datoreaz formrii de mercaptide cu gruprile SH ale proteinelor. Iniial, reacia este reversibil i efectul este microbiostatic. Efectul HgCl 2 este neutralizat prin adugarea n exces a compuilor cu grupri SH (glutation, tioglicolat). Din aceast cauz, utilizarea ei este considerat a fi perimat. Dup contactul prelungit sau prin utilizarea unor concentraii mari de HgCl 2, reacia devine ireversibil i efectul este microbicid. HgCl2 este folosit curent n laborator, la concentraii de 1/l000 pn la 1/l0 000, care omoar toate microorganismele. La diluii mari (1/20 000 sau mai mari), efectul este bacteriostatic. Compuii organici cu Hg se folosesc pentru dezinfectarea rnilor superficiale i pentru conservarea serurilor i vaccinurilor. Argintul i compuii si au fost folosii mult timp ca ageni antimicrobieni.

Ionii de Ag au efect microbiostatic, la concentraii foarte mici i microbicid, la concentraii mai mari. Se pare c unele proteine au afinitate mare pentru ionii de Ag i i fixeaz chiar la concentraii mici. Bacteriile omorte sub aciunea ionilor de Ag conin n medie l06 ioni/celul, ceea ce corespunde aproximativ numrului de molecule de proteine-enzime dintr-o celul. Cel mai important compus este Ag-sulfadiazina (AgSD), dar se folosesc i ali compui: acetatul i nitratul de Ag. AgNO3, n soluie de 1% (Argyrol) se folosete pentru a inhiba posibilele infecii gonococice ale ochiului la noul nscut. Se instileaz n ochi imediat dup natere, deoarece infecia nosocomial poate determina orbirea. In locul AgNO 3 s-a folosit penicilina, dar odat cu preponderena bacteriilor rezistente la penicilin, AgNO3 a fost reintrodus n uz. Ionii de Ag interacioneaz cu gruprile thiol (-SH), dar probabil i cu alte inte, iar la nivel membranar produce eliberarea ionilor de K+. Aminoacizii, ca cisteina i ali compui (tioglicolatul de Na) care conin grupri tiol, neutralizeaz activitatea AgNO3 fa de Ps. aeruginosa. Aminoacizii care conin legtura S-S (disulfid), aminoacizii fr S i compuii cu S ca acidul cisteic, L-metionina, taurina, tiosulfatul de Na, nu neutralizeaz activitatea Ag +. Faptul sugereaz c interaciunea Ag+ cu gruparea tiol a enzimelor i proteinelor. Joac rol esenial n inactivarea bacteriilor, dar pot fi implicate i alte componente celulare. Srurile de Ag i ale altor metale grele (Cu) acioneaz prin legarea de gruprile funcionale ale enzimelor fungice. Ag+ produce eliberarea ionilor de K+ din celula microorganismelor. Membrana citoplasmatic - sediul activitii multor enzime este o int important pentru activitatea Ag. Ag+ este activ nu numai asupra enzimelor: produce inhibiia marcat a creterii la Cryptococcus neoformans i este depozitat n perete i n vacuol citoplasmatic. Ag + inhib diviziunea celular i lezeaz membrana extern la Ps. aeruginosa. Volumul celulei crete semnificativ, iar componentele sale exprim anomalii structurale. Ag+ interacioneaz cu acizii nucleici, cel mai probabil cu bazele. Sulfadiazina este o combinaie a doi ageni antibacterieni: Ag+ i sulfadiazina (SD). Efectul antibacterian este rezultatul unui singur compus sau este rezultatul interaciunii sinergice. AgSD are un spectru larg de activitate, dar spre deosebire de AgNO3 induce formarea protuberanelor membranare la bacteriile sensibile (dar nu i la cele rezistente). AgSD se leag de macromoleculele celulare, inclusiv de acizii nucleici. Zincul se folosete sub forma unui amestec al srii (ZnCl2), cu acizi grai cu lan lung. Se folosete ca pulbere antifungic sau ca unguent. ZnCl2 este astringent i se utilizeaz n tratamentul leziunilor superficiale. Pasta de ZnO se folosete pentru tratamentul infeciilor fungice i bacteriene. Aciunea substanelor dezinfectante asupra microorganismelor se desfoar ca un proces treptat, n cursul cruia, numrul bacteriilor viabile scade progresiv: n fiecare unitate de timp va fi distrus un procent constant din numrul celulelor viabile. Efectul antimicrobian este dependent de sensibilitatea microorganismului, de faza sa de cretere, de forma de existen (vegetativ sau spor), de natura i concentraia substanei bactericide, de durata aciunii ei, de compoziia chimic a mediului i de pH. Prezena unor substane organice supraadaugate, alcalinitatea i temperaturile sczute diminu efectele toxice ale substanelor chimice. Halogenii i compuii lor. Halogenii clorul i iodul - se folosesc ca dezinfectani sub form organic i anorganic. Majoritatea compuilor organici ai halogenilor au efect letal asupra celulelor, prin oxidarea proteinelor, ruperea membranelor i inactivarea enzimelor. Iodul se combin ireversibil cu proteinele, prin iodurarea tirozinei i este un agent oxidant. Tinctura de iod (27%), adic iodul metalic (I2), dizolvat n soluie alcoolic concentrat de KI, este antiseptic i se aplic pe suprafaa pielii, nainte de procedeul chirurgical i pe rnile mici. Soluiile apoase sunt instabile: n soluie cel puin 7 specii molecule de iod se gsesc n echilibru cu I2. Cel mai activ este iodul diatomic (I2), avnd efect microbicid rapid fa de bacterii, levuri, microfungi, spori. Folosirea iodului este limitat de toxicitate i de culoare. Este iritant i poate determina chiar reacii alergice. De aceea se utilizeaz iodofori complexe formate din iod i un agent soloubilizant (purttor), care acioneaz ca rezervor de iod activ, liber. Iodul este solubilizat de ageni tensioactivi: detergeni neionici cu proprieti dezinfectante i polivinil pirolidona, cu proprieti antiseptice. Iodul se leag uor cu aceti compui organici, de unde este eliberat lent, fapt ce condiioneaz o dezinfecie eficient. Iodoforii sunt microbicizi la variaii mari de pH i i pstreaz activitatea n prezena materiei organice. Iodul se fixeaz de un grup important de proteine (n special cele care nu conin aminoacizi cu S), de nucleotide i acizi grai, producnd moartea celulei. Clorul liber are culoare caracteristic (verde) i miros ptrunztor. In oricare din variatele sale forme, clorul este deodorant i dezinfectant. Clorul este un agent bactericid foarte puternic (CF = 200). Adugat n ap, clorul formeaz acidul hipocloros, produs instabil care degaj O2 n stare nscnd, un oxidant foarte puternic, dup reaciile:

In soluie apoas (apa de clor), clorul este bactericid la concentraia de 0,02%, dup maxim 5 minute. Se folosete pentru tratarea apei potabile (clorinare), la concentraia de 1-3 mg/l. Clorul i compuii si sunt inactivai n prezena materiei organice i a catalizatorilor metalici. Soluiile de hipoclorit sunt folosite pentru dezinfectare i ca deodorante. Sunt inofensive pentru esuturile umane, uor de manevrat, incolore, dar decolorante. Se folosesc n spitale pentru dezinfectarea camerelor, a suprafeelor, a instrumentelor nechirurgicale. Agenii care elibereaz clorul sunt cloraminele (derivai clorurai ai aminelor (R-NHCl), din care face parte cloramina-T), hipocloritul de Na, dioxidul de clor. Sunt compui mult mai stabili dect hipocloriii, cristalini, solubili n ap, cu care dau prin hidroliz, hipoclorit de sodiu i anionul hipocloros. Sunt active la concentraii de 0,5-l,5%, exprimate n clor activ. Hipocloritul de Na se folosete ca nlbitor al esturilor. In ap, ionizeaz i elibereaz Na+ i ionul hipoclorit (OCl ), care stabilete un echilibru cu acidul hipocloros (HOCl). La pH 4-7, clorul exist predominant ca HClO, iar la pH peste 9, predomin OCl-. Se folosete pentru dezinfecia obiectelor contaminate cu snge infectat cu HIV sa cu virusul hepatitei B (VHB). Agenii care elibereaz Cl sunt oxidani foarte activi i denatureaz proteinele celulare. La pH sczut, activitatea compuilor care elibereaz Cl este maxim. {n concentraii mari, agenii care elibereaz Cl sunt sporicizi. Acidul hipocloros perturb fosforilarea oxidativ. Civa compui organici clorurai se folosesc pentru dezinfectarea apei. Cel mai utilizat este compusul halazon sau acidul parasulfon-dicloraminobenzoic. La concentraia de 4-8 mg/l dezinfecteaz, n 30 de minute, apa ce conine bacili tifici. Succin-clorimidul - o clorur organic stabil n form de tablet, devine activ n contact cu apa. Este ineficient fa de chitii de Entamoeba hystolitica.

Halazon (Acid parasulfondiclor-aminobenzoic)

Succin-clorimidul

Iodul este mai puin reactiv dect clorul, dar are efecte bactericide, fungicide, sporicide, tuberculocide i inactiveaz virusurile. Tincturile (soluiile) apoase i alcoolice se folosesc de peste 150 de ani ca antiseptice, sunt iritante i colorante. {n soluie se gsesc mai multe variante de iod, n echilibru cantitativ, dar activitatea antimicrobian principal este produs de iodul molecular. Iodoforii sunt complexe alctuite din iod i un agent de solubilizare, cu rol de purttor al iodului, pe care-l elibereaz sub forma sa activ. Iodoforii sunt mai puin activi fa de fungi i spori, comparativ cu tincturile. Iodul ptrunde rapid n celul i reacioneaz cu gruprile eseniale ale macromoleculelor: cu aminoacizii cu S (cisteina i metionina), cu nucleotidele, cu acizii grai. Efectul este letal. Virusurile nude sunt cele mai sensibile, iar cele nvelite sunt mai rezistente. Ca i n cazul bacteriilor, iodul denatureaz proteinele capsidei sau ale nveliului. Alti ageni oxidani. Permanganatul de potasiu (KMnO4), n concentraie de 1:l0 000 este un antiseptic puternic, dar aciunea sa este neutralizat de prezena substanelor organice. Peroxizii. Peroxidul de H, perhidrolul sau apa oxigenat (H2O2) este un antiseptic eficient i netoxic. Se folosete pentru dezinfecie, sterilizare i antisepsie. Este un lichid incolor, disponibil ntr-o varietate de concentraii, de la 3 la 90%. Molecula este instabil i se descompune repede n H2O i O2, dup reacia:

Dei soluiile pure sunt n general stabile, cele mai multe conin stabilizatori care mpiedic descompunerea.

H2O2 are un spectru larg de eficacitate fa de bacterii, spori bacterieni, levuri i inactiveaz virusurile. Este mai activ fa de bacteriile Gram pozitive, dar prezena catalazei sau altor peroxidaze poate s le fac tolerante la concentraiile mici de H2O2. Pentru efectul sporicid sunt necesare concentraii de 10-30% i timp mai ndelungat de contact. H2O2 acioneaz ca oxidant, producnd radicalul OH. liber, reactiv fa de gruprile cu S i fa de dublele legturi ale macromoleculelor. In timpul generrii O2 se formeaz O2- (radicalul superoxid), n prezena ionilor de metal din citoplasm. Radicalul O2- reacioneaz cu gruprile ncrcate negativ ale proteinelor i inactiveaz enzimele. Concentraia de 6-25% H2O2 se folosete pentru sterilizarea unor materiale (implante chirurgicale, lentile de contact). Nu are toxicitate remanent. Concentraia de 0,1% H2O2 n lapte, la temperatura de 54o, diminu numrul total de bacterii cu 99,99%. La concentraia de l0%, distruge sporii i inactiveaz virusurile. Soluia comercial de 3% se folosete pentru dezinfecia rnilor, deoarece bacteriile anaerobe sunt foarte sensibile la prezena O2. Peroxidul de sodiu (Na2O2), ca past, se folosete pentru tratamentul acneii. Peroxidul de zinc (ZnO2) se folosete n suspensie cu ZnO i Zn(OH) 2 pentru tratamentul infeciilor tegumentare cu bacterii microaerofile i anaerobe. Benzoil-peroxidul se folosete pentru tratamentul acneii i se adaug n soluiile de curire a pielii. Acidul peracetic (CH3 CO O OH) este un agent oxidant puternic i se folosete sub form gazoas pentru sterilizarea la temperatur sczut, a camerelor destinate creterii animalelor germ-free, a aparaturii medicale pentru hemodializ i ca sterilizant al suprafeelor. Este bactericid, fungicid i inactivator al virusurilor la concentraii mai mici de 0,3%. Se descompune la acid acetic i O2, dar nu este sensibil la aciunea peroxidazei i rmne activ n prezena materiei organice. Acidul peracetic denatureaz proteinele i enzimele, rupnd legturile SH i S-S. Coloranii antiseptici O categorie special de colorani manifest aciune bacteriostatic: derivaii acridinei i coloranii de rozanilin. Acriflavina este un amestec format din doi derivai ai acridinei. Are toxicitate sczut i nu sensibilizeaz tegumentul. Are un spectru larg de aciune i se folosete pentru tratamentul infeciilor tractului urinar. Mecanismul de aciune pare s conste n capacitatea acridinelor de a se insera ntre nucleotidele moleculei de ADN. Cristal-violetul este un derivat metilic al colorantului rosanilin. Este colorantul utilizat n reacia Gram, dar are i efect bacteriostatic asupra bacteriilor Gram pozitive.

Cristal violet Cristal-violetul a fost folosit pentru tratamentul vaginitei cauzat de Trichomonas. Agentul etiologic al candidozei vaginale, C. albicans este foarte sensibil la aciunea colorantului. Mecanismul de aciune a acestui compus fa de bacteriile Gram pozitive este foarte asemntor cu acela al penicilinei, ce const n blocarea treptei finale a sintezei peretelui celular. Quinonele sunt colorani naturali, care confer culoare multor forme de via, plante i animale. Unele quinone sunt fungicide de importan agricol: cloranil i diclone. Ageni sterilizani n faz de vapori Multe instrumente medicale termosensibile pot fi sterilizate prin aciunea sterilizanilor lichizi (glutaraldehid, acidul peracetic, H2O2) sau a agenilor sterilizani n faza de vapori. Cei mai folosii ageni n aceste sisteme reci sunt oxidul de etilen, formaldehida, iar mai recent se folosesc H2O2 i acidul peracetic. Etilen-oxidul i formaldehida sunt ageni alkilani* cu spectru larg. Activitatea lor este dependent de concentraia activ, temperatur, durata expunerii, umiditatea relativ.
Agenii alchilani sunt substane care adaug gruparea alchil (ca de exemplu, -CH3), la alte molecule. Adugnd un grup alchil la o baz azotat, i modific dimensiunile i determin o eroare de mperechere. Agenii alchilani acioneaz asupra ciclurilor
*

purinice azotate, la nivelul O6 al guaninei sau O4 din bazele pirimidinice, producnd leziuni mutagene, dar i la nivelul legturilor fosfodiesterice ale catenei de ADN.

Agenii alchilani se formeaz prin prepararea multor produse alimentare, n gazele de eapament prin combustia intern a N2 atmosferic, formdu-se nitrai i nitrii. Prin arderea tutunului, a produselor petroliere i prin prepararea alimentelor, din resturile de guanin se formeaz hidrocarburi policiclice aromatice, cu efect alchilant asupra ADN. Fiind ageni alkilani, etilen-oxidul i formaldehida reacioneaz cu proteinele, acizii nucleici, fiind foarte reactivi fa de gruprile sulfhidril (-SH) ale proteinelor. Etilen-oxidul are dezavantajul c este exploziv i mutagen. H 2O2 i acidul peracetic n faz de vapori sunt ageni oxidani mai activi, la concentraiile inferioare, dect cele n form lichid. Ambele au toxicitate sczut, aciune rapid la temperatur sczut, dar au penetran sczut. Rezistena microorganismelor la aciunea antisepticelor i dezinfectantelor poate fi natural (intrinsec) sau dobndit. Rezistena intrinsec sau natural este proprie bacteriilor Gram negative, sporilor, micobacteriilor. Este o proprietate controlat de gene cromosomale i permite depirea aciunii unui antiseptic sau dezinfectant. Moleculele de antiseptic sau dezinfectant trebuie s strbat straturile externe pentru a atinge inta celular. Structura chimic a acestor straturi depinde de grupul de microorganisme i poate constitui o barier eficient de permeabilitate, limitnd difuzia agentului chimic. Mult mai rar este posibil ca enzimele sintetizate constitutiv s degradeze compusul antiseptic sau dezinfectant. Sporii de Bacillus spp. i Clostridium spp. sunt cei mai rezisteni la antiseptice i dezinfectante. Sporii de Bacillus spp.(dei, n general, nu sunt patogene), sunt folosii ca indicatori ai sterilizrii eficiente. Sporii de Clostridium sunt patogeni semnificativi: Cl. difficile este cauza comun a diareii de spital. Multe biocide sunt bactericide sau bacteriostatice la concentraii mici, pentru formele vegetative, dar pentru efectul sporicid sunt necesare concentraii mai mari (de exemplu, glutaraldehida i agenii care elibereaz clor). Alcoolii, fenolii, srurile quaternare de amoniu i clorhexidina nu au efect sporicid, dect la temperaturi superioare. Rezistena superioar a sporilor se datoreaz structurii complexe a nveliurilor sporale multiple. nveliurile sporale cuprind o fracie major a sporului. Aceste structuri sunt de natur proteic, cu o fracie de polipeptide acide solubile n baze, n nveliul intern i o fracie rezistent la baze, datorat legturilor S-S. Sporularea ete procesul n care celula vegetativ se difereniaz n spor i implic 7 stadii. Celula vegetativ (stadiul 0) sufer schimbri morfo-funcionale, care culmineaz cu eliberarea sporului matur (stadiul VII). Pentru dezvoltarea rezistenei la biocide, stadiile IV (dezvoltarea cortexului) pn la VII, sunt cele mai importante pentru dezvoltarea rezistenei la biocide. Studiul mecanismelor rezistenei sporale se studiaz prin tehnica parcurgerii retrograde a treptelor sporulrii, care const n ndeprtarea secvenial a nveliului sporal. {n acest scop se folosesc mutante de sporulare, care nu progreseaz dincolo de stadiile determinate genetic ale sporului, ceea ce permite o sporulare cu un grad nalt de sincronizare. Se adaug antisepticul sau dezinfectantul la nceputul sporulrii i se determin gradul de progresie a sporulrii. Unele microorganisme au un grad intermediar de rezisten la antiseptice i dezinfectante, ntre cele sporulate i nesporulate. La micobacterii, rezistena se datoreaz peretelui celular complex, care constituie o barier eficient fa de ptrunderea agenilor chimici: peptidoglicanul este legat covalent cu un copolimer polizaharidic (arabinogalactan), alctuit din arabinoz i galactoz, esterificate cu acizi micolici. Antisepticele i dezinfectantele care au activitate asupra micobacteriilor sunt fenolul, acidul peracetic, H2O2, alcoolul i glutaraldehida. Ali ageni bactericizi clorhexidina, srurile amoniului quaternar, sunt bacteriostatice fa de Mycobacterium spp., chiar la concentraii mari. Biocidele hidrofile nu penetreaz nveliul lipidic consistent hidrofob al celulelor de Mycobacterium, la concentraii suficient de mari, pentru a fi letale. Activitatea lor poate s creasc sub efectul diferitelor variantelor de formulare. Peretele Gram pozitiv al bacteriilor din g. Staphylococcus este format din peptidoglican i acizi teichoici. Nici unul dintre componente nu are rolul de barier eficient fa de antiseptice i dezinfectani. Plasticitatea structurii mureinei este bine cunoscut: grosimea i numrul de legturi transversale ale peptidoglicanului sunt influenate de condiiile de mediu i de starea fiziologic a celulei, ceea ce modific gradul lor de sensibilitate la antiseptice i dezinfectante. De exemplu, S. aureus poare s existe n varianta mucoid, celulele fiind nconjurate de un strat mucos. Tulpinile nemucoide sunt mai sensibile dect cele mucoide, la aciunea agenilor chimici. Bactriile Gram negative, n general, sunt mai rezistente dect bacteriile Gram pozitive nesporulate: concentraia minim inhibitorie a dezinfectanilor i antisepticelor este mai mare la bacteriile Gram negative, deoarece membrana extern acioneaz ca barier limitant a ptrunderii agenilor antibacterieni. Rezistena intrinsec este consecina adaptrii fenotipice, foarte evident n cazul formrii biofilmelor. Biofilmele rezult prin asocierea microorganismelor cu suprafeele solide. Biofilmul este un consoriu (o asociaie) de microorganisme, organizate ntr-un exopolimer polizaharidic foarte bine exprimat. Biofilmele pot s conste din culturile ctorva specii sau din fenotipuri diferite ale unei specii bacteriene. Biofilmele sunt importante pentru biocoroziune, diminuarea calitii apei i constituie focare pentru contaminarea

diferitelor produse. Colonizarea se produce de asemenea, pe biomaterialele implantate i pe dispozitivele medicale, rezultatul fiind creterea ratei de infecie i de recuren a infeciei. Fenotipul organismelor sesile n biofilme difer semnificativ de al celulelor planctonice sau de cele crescute pe medii artificiale, n laborator. {n diferite zone ale biofilmului, bacteriile au disponibiliti diferite ale nutrienilor, iar proprietile fiziologice sunt modificate. {n profunzimea biofilmului, limitarea nutrienilor reduce rata de cretere a bacteriilor, ceea ce modific sensibilitatea la aciunea agenilor antimicrobieni. Bacteriile cu o rat mic de cretere sunt deosebit de rezistente. Biofilmele sunt cele mai ilustrative exemple referitoare la modul n care adaptarea fiziologic (fenotipic) are rol important n conferirea rezistenei intrinsece. Sensibilitatea redus a bacteriilor ntr-un biofilm se datoreaz mai multor factori: - accesului redus al dezinfectantului sau antibioticului la celulele din biofilm; - interaciunii chimice ntre dezinfectani i biofilm; - producerii enzimelor degradative i/neutralizante ale substanelor chimice; - schimbului genetic dintre celule n biofilm. Bacteriile din biofilm, recultivate n mediul lichid, nu sunt mai rezistente dect celulele planctonice ale speciei respective. Rezistena dobndit. Ca i n cazul antibioticelor i al altor ageni chimici, rezistena dobndit la antiseptice i dezinfectante poate s se produc prin mutaie sau prin dobndirea unei plasmide sau a unui Tn (caset transmisibil de ADN cromosomal sau plasmidial, cu proprieti de integrare). Cu excepia Ag, a compuilor organomercurici, plasmidele induc nivele semnificative ale rezistenei la antiseptice i dezinfectani. Compuii Hg nu se mai folosesc ca dezinfectani, dar srurile fenil-mercurice i tiomersalul se folosesc ca ageni conservani pentru unele produse farmaceutice. Rezistena la Hg este plasmidial, inductibil i poate fi transferat prin conjugare sau transducie. Izolatele clinice de S. aureus care sintetizeaz -lactamaz sunt rezistente la Hg2+ anorganic i la agenii organomercurici.

AGENI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZA Utilizarea substanelor de sintez chimic sau produse de diferite organisme, n scop terapeutic, este veche. Indienii din Peru mestecau scoara arborelui de chinin pentru tratamentul malariei. In secolul 15, n Europa se foloseau compuii cu mercur pentru tratamentul sifilisului, iar chinezii utilizau cultura de fungi microscopici crescut pe seminele de soia, pentru tratamentul furunculelor. Fenomenul de antibioz (inhibiia dezvoltrii unui microorganism de ctre altele) a fost descris de Pasteur (l877). Conceptul chimioterapiei a fost formulat de P. Ehrlich (l904) n Germania. El a presupus c este posibil gsirea unor substane chimice cu efecte toxice selective asupra paraziilor, dar nu pentru om. Ideia a fost denumit pastila magic, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Ehrlich a descoperit para-rosanilina, cu efecte antitripanosomiale i a sintetizat compusul arsenic arsfenamina (salvarsan) pentru tratamentul sifilisului.

Salvarsan Gelmo (1908) a sintetizat sulfanilamida pentru tratamentul pacienilor infectai cu Treponema pallidum, agentul sifilisului. Eisenberg(1913) a studiat proprietile bactericide ale azo-coloranilor cu grupri sulfonamidice. Gratia i Dath (1924)au studiat microorganismele din sol i au descoperit actinomicetina, produs de actinomicete. Fleming (l928), n cutarea unor compui cu potenial antibacterian, a observat inhibiia creterii coloniilor de Staphylococcus aureus n vecintatea coloniilor fungice de Penicillium notatum. Apoi a artat c mediul lichid al culturii de P. notatum, diluat de 800 de ori, a inhibat creterea culturii de Staphylococcus. A descoperit medicamentul miracol pe care l-a denumit penicilina, dar n-a izolat-o, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Calitile ei de medicament miraculos au fost evideniate de ctre Ernst Chain i Howard Florey (1939), care au izolat-o i au folosit-o n tratamentul infeciilor bacteriene n timpul celui de al II-lea rzboi mondial. Producia industrial a nceput n l943. Noul medicament a fost introdus n circuitul clinic general n 1944 i a avut un impact uria asupra strii de sntate a populaiei umane. In acelai timp, Gerhard Domagk (1935) (medic german) a remarcat activitatea antimicrobian in vitro a compusului prontosil, primul dintr-o serie lung de substane sintetice denumite sulfonamide. Prontosil a fost introdus n clinic n anii 30 pentru tratamentul infeciilor tractului urinar, pneumoniei i altor stri patologice. In vivo, prontosil este convertit la sulfanilamid activ, analogul acidului paraaminobenzoic (APAB). In 1939, el a demonstrat valoarea terapeutic a sulfonamidelor (gruparea S a compuilor) pentru tratamentul infeciilor cu Streptococcus i activitatea antimicrobian cu spectru larg. Multe sulfonamide au eficien inferioar antibioticelor naturale, dar se folosesc pe scar larg. R. Dubos (1939) a izolat gramicidina i tirocidina din Bacillus brevis, active fa de bacteriile Gram pozitive. In 1945, farmacologii aveau la dispoziie, pentru uzul clinic, 5488 derivai ai sulfanilamidei (sulfonamidei). S. Waksman (1944-45) a izolat streptomicina din Str. griseus, un microorganism izolat din sol, pentru care a primit premiul Nobel. Streptomicina este activ fa de unele bacterii Gram pozitive i fa de Mycobacterium tuberculosis. El a propus denumirea de antibiotic, cu sensul de compus chimic produs de un microorganism, care la concentraie mic, inhib creterea sau omoar alte microorganisme. Creterea unui organism depinde de integritatea aparatului su enzimatic de sintez. Mediul influeneaz creterea celulelor, n primul rnd prin alterarea activitii enzimelor. Inhibiia activitii enzimelor este o modalitate important de tratament al infeciilor bacteriene. Caracteristicile unui agent antimicrobian sunt urmtoarele: - solubilitatea n fluidele organismului i o farmacocinetic favorabil pentru a fi transportat la situsul infeciei, unde trebuie s ating o concentraie nalt. Chiar agenii care se administreaz local trebuie s se dizolve n fluidele esutului lezat, dar nu trebuie s se lege prea strns de proteinele serice. Farmacocinetica semnific aciunea medicamentului n organism pentru o perioad de timp i include: absorbia, distribuia, localizarea n esuturi, biotransformarea (modificarea biochimic), excreia; - s ptrund n celula bacterian prin structurile de nveli; - toxicitatea selectiv: agenii chimioterapeutici trebuie s fie mai toxici pentru microorganisme dect pentru celulele gazdei. DL50 (doza letal 50)s fie nalt, iar concentraia minim inhibitorie(CMI) i/sau concentraia bactericid minim (CBM)s fie ct mai sczut. DL50 msoar toxicitatea/letalitatea fa de gazd. CMI msoar concentraia antibioticului, necesar pentru a inhiba creterea patogenului int, iar CBM

msoar concentraia antibioticului necesar pentru a omor agentul patogen int. Idealul este s existe o diferen mare ntre concentraia minim toxic pentru microorganisme i concentraia ce lezeaz celula gazd; - s aib un spectru de activitate adecvat (larg sau ngust), corelat cu diagnosticul. Un antibiotic cu spectru larg este indicat ntr-o infecie polimicrobian (de exemplu, o infecie anaerob intraabdominal), iar un antibiotic cu spectru ngust este recomandat pentru o infecie produs de un singur agent patogen (de exemplu, o infecie stafilococic tegumentar); - s-i pstreze toxicitatea standard i s nu devin mai toxic sau mai puin toxic dup interaciunea cu substanele nutritive, cu alte medicamente sau n condiii patologice (diabet, insuficien renal etc.); - s nu determine efecte secundare (de exemplu, s nu fie alergic pentru organismul gazd); - s fie stabil dup administrare, adic s-i pstreze concentraia terapeutic constant n snge i n fluidele organismului; - s fie degradat i excretat lent; - s nu induc fenomenul de rezisten a microorganismelor; - s fie stabil n condiiile pstrrii (refrigerare, ntuneric); - s fie ieftin. Principiul fundamental al chimioterapiei antiinfecioase const n utilizarea unor substane cu toxicitate selectiv care s stopeze creterea i multiplicarea agentului patogen infectios, dar s nu altereze funcionalitatea celulelor organismului uman i animal. Agenii chimioterapeutici interacioneaz selectiv cu sistemele metabolice active ale microorganismelor, dar nu cu acelea ale celulelor organismului gazd. Aciunea selectiv nseamn capacitatea unui agent chimic de a inhiba dezvoltarea microorganismelor (i prin extindere, a celulelor maligne), la concentraii ce pot fi tolerate de organismul gazd. Agenii antimicrobieni interfer cu procese specifice, eseniale pentru creterea i diviziunea agenilor patogeni: bacterii, fungi, protozoare. Ei pot fi grupai n inhibitori ai peretelui celular bacterian i fungic, inhibitori ai funciei membranei citoplasmatice, inhibitori ai sintezei acizilor nucleici i inhibitori ai funciei ribosomale. Agenii antimicrobieni pot fi bactericizi (omoar inta bacterian sau fungic) sau bacteriostatici, adic inhib creterea celulei int. Agenii bactericizi sunt mai eficieni, iar cei bacteriostatici pot fi benefici, deoarece modific intensitatea metabolismului celular i permit mecanismelor de aprare ale gazdei, s distrug agentul patogen. Clasificarea mecanismelor de aciune ale agenilor antimicrobieni

I. Inhibitori ai sintezei peretelui celular bacterian


Medicamente inhibitorii ale enzimelor de biosintez Fosfomicina Cicloserina Medicamente ce se combin cu moleculele purttor Bacitracina Medicamente ce se combin cu precursorii peretelui celular Vancomicina Medicamente ce inhib polimerizarea i legarea peptidoglicanului nou la peretele celular Penicilina Cefalosporina Carbapenem Monobactam Inhibitori ai funciei membranei citoplasmatice Medicamente care dezorganizeaz membrana citoplasmatic Tirocidina Polimixina Medicamente ce produc pori n membran Gramicidina Medicamente ce altereaz structura fungilor Poliene (amfotericina) Imidazolii (ketoconazol, fluconazol) II. Inhibitorii sintezei acizilor nucleici Inhibitori ai metabolismului nucleotidelor Adenozin-arabinozida (antiviral)

Acyclovir (antiviral) Flucytosina (antifungic) Inhibitori ai funciei de matri a ADN Ageni de intercalare Cloroquina Inhibitori ai replicrii ADN Quinolone Nitroimidazoli Inhibitori ai ARN-polimerazei Rifampin

III. Inhibitori ai funciei ribosomale


Inhibitori ai subunitii 30S Streptomicina Kanamicina, gentamicina, amikacina Spectinomicina Tetraciclina Inhibitori ai subunitii 50S Cloramfenicol Clindamicina Eritromicina Acidul fusidic IV. Inhibitori ai metabolismului acidului folic Inhibitori ai acidului pteroic Sulfonamidele Inhibitori ai dihidrofolat-reductazei Trimetoprim Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv Sulfonamidele sunt ageni chimioterapeutici foarte importani din punct de vedere practic. Nu sunt antibiotice, deoarece termenul de antibiotic este rezervat substanelor sintetizate de organisme, de cele mai multe ori, bacterii sau fungi, care n concentraii foarte mici inhib sau omoar microorganismele. Descoperirea lor are caracter empiric i pragmatic (tabel nr. 3). Domagk (cercettor i medic german) a descoperit c prontosilul (un colorant rou), dei in vitro nu are efecte inhibitorii, in vivo este foarte eficient fa de S. aureus. Explicaia este urmtoarea: n organism, molecula de colorant a fost scindat enzimatic i s-a eliberat o molecul mic sulfanilamida foarte activ fa de S. aureus, dar inactiv n forma legat de colorant. Sulfonamidele reprezint primul grup de substane microbiostatice introduse cu succes n clinic, avnd ca prototip sulfanilamida (para-amino-benzen-sulfonamida). Mecanismul aciunii sulfonamidelor a fost clarificat cnd Woods a demonstrat c acidul para-aminobenzoic (APAB) are o aciune antagonist fa de aceste substane, n sensul c anihileaz efectul lor antimicrobian: dublarea concentraiei de inhibitor adugat n mediu necesit dublarea concentraiei de APAB, pentru a relua creterea. Toxicitatea selectiv a sulfonamidelor deriv din faptul c organismul uman preia acidul folic din surse externe, dar multe bacterii i sintetizeaz propriul acid folic.

Acidul para-aminobenzoic (APAB).

Tabel nr.3: Ageni chimioterapeutici care acioneaz prin inhibiie competitiv (adaptare dup Topley i Wilsons, 1998). Clasa de ageni inta specific Structura chimic chimioterapeutici Sulfonamide Inhibarea dihidropteroid sintetazei (DHPS)
H2N SO2NH2 sulf onamide

Diaminopirimidina (Trimetoprim)

Inhibarea dihidrofolat reductazei


H2N

NH2 N CH2 N trimetoprim

OCH3

OCH3

OCH3 N

Nitroimidazoli

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN)


O2N N

CH3

CH2 CH2OH metronidazol

Nitrofurani (Nitrofurantoil)

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN).


O2N CH O N N

O C NH C O

H2C nitrof urantoil

Aciunea antagonist a APAB nu este direct, ci se exercit prin intermediul metabolismului bacterian. APAB este un nutrient esenial, fiind precursorul acidului folic, un factor de cretere pentru bacterii. Acidul folic i formele sale reduse acidul dihidrofolic i tetrahidrofolic transfer fragmente cu 1C derivate din serin, pentru sinteza metioninei, purinelor, timinei, tiaminei, pantotenatului. Datorit marii asemnri a structurii chimice a celor dou substane(APAB i sulfanilamida), ntre ele are loc un fenomen de competiie pentru intrarea n calea sintezei acidului folic (Fig. 5).

Acidul folic Enzima bacterian implicat n conversia APAB la acid foli c (pteridin-sintetaza), adeseori greete i se combin cu sulfanilamida, n loc de APAB. Astfel, sinteza acidului folic i toat calea metabolic dependent de acidul folic este blocat. Sulfanilamida intr n competiie cu APAB pentru situsul activ al enzimei (fig. 76). Acest tip de inhibiie este reversibil: dac sulfanilamida este ndeprtat, enzima funcioneaz normal. Cu ct raportul moleculelor de sulfanilamid/APAB este mai mare, cu att inhibiia metabolismului bacterian este mai ampl.

Fig. 76. Ilustrarea schematic a competiiei dintre molecula de sulfonamid i acidul para-aminobenzoic (APAB) pentru substrat, datorit omologiei structurale.

Sulfonamidele au afinitate mai mare dect APAB pentru pteridin-sintetaz. Trimetoprimul (un analog al acidului dihidrofolic) are afinitate foarte mare (de 10000-100000 de ori) pentru dihidrofolat-reductaza (DHFR) bacterian dect pentru cea mamalian, enzima care catalizeaz conversia dihidrofolatului la acidul tetrahidrofolic (Fig. 77). Astfel sunt blocate cile metabolice dependente de acidul folic. Acidul folic acioneaz ca purttor al gruprilor C1 i este necesar pentru sinteza ADN, ARN, etc. Spre deosebire de mamifere, bacteriile i protozoarele parazite nu au sistem de transport care s preia acidul folic preformat din mediul extern. Majoritatea acestor organisme trebuie s sintetizeze acidul folic, dei unele pot s foloseasc timidina exogen, acoperind necesarul metabolic de acid folic.

Fig. 77. Ilustrarea mecanismului aciunii agenilor terapeutici prin inhibiie competitiv: sulfonamidele blocheaz competitiv conversia pteridinei i APAB n acidul dihidrofolic, pe calea sintezei acidului folic.

Deoarece, n privina trsturilor sale eseniale, metabolismul este acelai la toate bacteriile, rezult c toate speciile utilizeaz acidul folic, chiar dac nu toate l pot sintetiza.

Sulfamidele sunt toxice pentru bacteriile capabile s sintetizeze acidul folic, pornind de la molecule mai simple. Bacteriile care nu sintetizeaz acidul folic, ci necesit aportul exogen al moleculelelor preformate, nu sunt sensibile la sulfonamide. Efectul sulfonamidelor este antagonizat necompetitiv de un amestec de intermediari ai cii acidului folic, adic efectul lor antagonic nu poate fi depit prin creterea concentraiei de sulfonamid. Sulfanilamida inhib sinteza acidului folic prin inhibiie competitiv cu sintetaza acidului dihidropteroic. Enzima catalizeaz condensarea dihidropteridinei cu acidul para-aminobenzoic, n stadiul timpuriu al sintezei acidului folic. Deoarece acidul folic i pstreaz activitatea n celulele bacteriene, efectul inhibitor al sulfonamidelor devine evident dup cteva generaii de celule, cnd cantitatea de acid folic s-a diminuat sub un nivel critic, prin distribuie n celulele fiice. Toxicitatea selectiv deriv din faptul c bacteriile sensibile sintetizeaz acidul folic de novo, iar omul absoarbe cofactorul preformat. Cele mai cunoscute sulfonamide sunt sulfadiazina i sulfametoxazol (cotrimoxazol), bine absorbite dup administrare oral i excretate n urin.

Sulfametoxazol (Cotrimoxazol) Aciunea derivailor sulfanilamidei este bacteriostatic fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Se folosesc n tratamentul infeciilor vezicii urinare, cauzate n marea lor majoritate de E. coli. Circa 5% dintre pacieni sufer efecte secundare, mai ales reacii alergice, cu febr i eritem tegumentar. Ca i sulfamidele, acidul para-aminosalicilic (APAS) i dapsone, obinui prin sintez chimic sunt inhibitori competitivi ai metabolismului APAB i inhib sinteza acidului folic.

Dapsone

APAS (Acid para-aminosalicilic)

Rezistena bacterian la sulfonamide este mediat de plasmide, dar i de gene cromosomale, prin hiperproducia de acid p-aminobenzoic. Familia derivailor diaminopirimidinici cuprinde trimetoprimul i tetroxoprimul. Trimetoprim este un analog al acidului dihidrofolic, component esenial al sintezei aminoacizilor i nucleotidelor. Agentul chimic blocheaz metabolismul dependent de acidul folic, dar la alt nivel dect sulfonamidele, a cror eficien o ridic foarte mult. Agentul inhib competitiv dihidrofolat-reductaza, enzima care convertete dihidrofolatul la cofactorul activ acidul tetrahidrofolic. Trimetoprim blocheaz regenerarea acidului tetrahidrofolic, precursorul acidului folinic i ulterior al purinelor i al sintezei ADN, fiind un inhibitor al creterii bacteriilor mai eficient dect sulfonamida.

Acidul tetrahidrofolic Blocajul secvenial al aceleiai ci de biosintez, sub aciunea sulfonamidelor i trimetoprim, determin un grad nalt de activitate sinergic fa de un spectru larg de microorganisme. Omul nu sintetizeaz acidul folic, dar necesit aportul exogen i sinteza purinelor n celula uman nu este influenat semnificativ de trimetoprim. Are aciune selectiv deoarece este de 50 000 100 000 de ori mai activ fa de dihidrofolat-reductaza bacterian, comparativ cu cea uman. Trimetoprim are spectru larg de aciune: coci Gram pozitivi i majoritatea bacililor Gram negativi, cu excepia Ps. aeruginosa i Bacteroides. Rezistena la trimetoprim poate fi mediat de gene cromosomale ori plasmidiale, mobile prin intermediul Tn7, este consecina dobndirii unei gene a dihidrofolat-reductazei (DHFR), mult mai puin sensibil la trimetoprim. Rezistena poate fi datorat altor mecanisme: supraproducia DHFR, mutaii ale genei structurale a DHFR sau dobndirea unei gene care codific o enzim rezistent la DHFR. Genele ce codific enzimele modificate se gsesc frecvent pe plasmide autotransferabile. Enzimele modificate sunt produse n celule care produc concomitent i o dihidrofolat reductaz de tip slbatic, dar cantitatea enzimei alterate depete blocajul sintezei acidului folic mediat de efectul trimetoprimului asupra enzimei de tip slbatic. Rezistena la sulfonamide se produce printr-un mecanism asemntor. Datorit rezistenei la sulfonamide, trimetoprim a fost introdus ca un poteniator al sulfonamidelor, n asociaie cu care s-a administrat mult timp, considerndu-se c are proprieti antibacteriene slabe. Acum se administreaz pe scar larg, ca agent terapeutic unic. Quinolonele Quinolonele (denumite i 4-quinolone) sunt primele substane antimicrobiene obinute pe cale sintetic i formeaz o familie de compui care se aseamn prin existena nucleului quinolinic. Primul compus din acest grup, folosit n terapie este acidul nalidixic (Fig. 78). Quinolonele, alturi de lactamice i macrolide, reprezint una dintre cele trei familii principale de ageni antimicrobieni folosii n terapeutica uman. Importana lor terapeutic este n continu cretere ncepnd din 1968, data comercializrii primei quinolone reprezentat de acidul nalidixic. Acidul nalidixic este un produs intermediar de sintez a quinolonelor. Ulterior quinolonele s-au diversificat prin introducerea unui atom de fluor (F) n poziia 6 i a unui heterociclu n poziia 7 (piperazine, pirolidina, etc.) care au generat fluoroquinolonele. Aceste molecule posed un spectru antibacterian foarte larg i pot fi divizate n molecule metabolizabile i nemetabolizabile (grupele III i IV). Quinolonele se pot clasifica n dou grupe : - cele de prim generaie, ca acidul nalidixic, active asupra bacililor Gram-negativi; - fluoroquinolonele.

Acid nalidixic

Norfloxacin

Ciprofloxacin

Ofloxacin

Pefloxacin

Enoxacin

Amifloxacin

Flerofloxacin

Lomefloxacin

Temafloxacin

Tosufloxacin
Ageni antimicrobieni fluoroquinolonici.

PD 127, 391

Gama derivailor quinolonei s-a diversificat prin modificarea nucleului de baz, 4-quinolona. La atomul C6 s-a adugat unul de fluor, ceea ce a crescut semnificativ spectrul i potenialul lor antimicrobian. Avand n vedere spectrul lor de activitate antibacterian, limitat la bacterii Gram negative i n principal la enterobacterii, acidul nalidixic i derivaii si au fost folosii pentru tratamentul infeciilor urinare. Modificrile structurii au dat natere la quinolone, denumite noile quinolone sau fluoroquinolone (norfloxacin, pefloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin etc.), al cror spectru de activitate antibacterian se extinde la alte specii Gram negative (de ex. Pseudomonas aeruginosa), dar i la anumite specii Gram pozitive (S. aureus, micobacterii). Totui, activitatea noilor quinolone fa de alte specii, aa cum sunt cele natural-sensibile la acidul nalidixic, rmne modest, ceea ce corespunde unui anumit grad de rezisten intrinsec a acestor specii. Mecanismul de aciune a quinolonelor este foarte complex. Aceste molecule ptrund n celula bacterian prin difuzie pasiv i acioneaz asupra intelor specifice reprezentate de topoizomeraze*: ADNgiraza (topoizomeaza II) i topoizomeraza IV. Aciunea celor dou enzime este inhibat. Ambele sunt proteine heterotetramerice, alctuite din 2 subuniti A i 2 subuniti B. Quinolonele se leag i stabilizeaz complexele giraz-ADN (quinolona singur nu se asociaz cu ADN), dup clivarea lanului, mpiedicnd aciunea catalitic a ADN-polimerazei la nivelul bifurcaiei de replicare. Complexul genereaz o rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repar eficient.
Formarea suprahelicei moleculei de ADN al cromosomului bacterian i relaxarea ei este condiionat de activitatea unui set de enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care modific conformaia spaial a ADN prin ruperea i reunirea catenelor. Bacteriile posed patru clase de topoizomeraze (I - IV). O topoizomeraz este o nucleaz reversibil, care se leag covalent la o grupare fosfat a ADN i rupe legtura fosfodiesteric. Deoarece legtura covalent care unete topoizomeraza la o grupare fosfat a ADN reine energia legturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacia este reversibil, adic incizia este urmat de legarea celor dou capete. Legarea este rapid i nu necesit o surs suplimentar de energie.
*

Topoizomerazele de tip 1 acioneaz prin recunoaterea unui segment de ADN, parial despiralizat, prin incizia unei catene, ceea ce permite celor dou pri ale helicei de ADN, de o parte i de alta a inciziei, s se roteasc liber una fa de alta, n sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta nseamn c replicarea ADN se face numai cu rotaia unei mici pri a helicei, adic a celei situat n aval de bifurcaie. Problema transcrierii se rezolv n acelai mod. Topoizomerazele de tip II se leag covalent, simultan, de cele dou catene ale dublei helice i produc o rupere bicatenar tranzitorie. Aceste enzime se activeaz la situsurile cromosomale la nivelul crora se ntreptrund dou duble helice. Dup fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, etapele aciunii sale sunt urmtoarele: - clivarea uneia dintre cele dou helice duble; - enzima determin trecerea celei de a II-a catene, prin deschiderea creat; - repar discontinuitatea nainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel s separe cele dou molecule de ADN catenate. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze(produc spiralizarea moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene i bucla se relaxeaz). Fluoroquinolonele formeaz complexe stabile cu topoizomeraza II, efectul fiind moartea celulei. S-a sugerat c quinolonele nu se leag cu ADN-giraza nsi, ci probabil chiar la situsuri specifice pe ADN, create de ADN-giraz Studiile comparative ale sensibilitii la fluoroquinolone i de dezvoltare a rezistenei, au relevat c ADN-giraza este inta primar a fluoroquinolonelor la bacteriile Gram negative, iar topoizomeraza IV este inta primar la bacteriile Gram pozitive. Excepia o constituie S. pneumoniae, la care fie giraza, fie topoizomeraza pot fi inte primare, n funcie de fluoroquinolona folosit. Activitatea antibacterian este dependent ntr-o msur semnificativ de atomul de fluor din poziia 6 i de nucleul piperazinic din poziia 7. Configuraia spaial a quinolonei determin nivelul activitii. Astfel, enantiomerii stereochimici (care difer unul de altul numai prin poziia n spaiu a unei grupri particulare), ce implic grupul metil ataat la inelul al III-lea de ofloxacin, au activiti antibacteriene foarte diferite, care difer n proporie de 1/10. Celulele eucariote conin topoizomeraze care au omologie limitat a aminoacizilor cu ADN-giraza i cu topoizomeraza IV. Cele 2 enzime au localizare citoplasmatic i quinolonele trebuie s traverseze structurile de suprafa ale celulei bacteriene. Quinolonele sunt ageni bactericizi. Ele stopeaz rapid sinteza replicativ a ADN i ntrerup progresia bifurcaiei de replicare. Inhibiia activitii ADN-girazei sub aciunea fluroquinolonelor induce moartea rapid a celulei bacteriene. Inhibiia rapid a sintezei ADN nu explic moartea celulei bacteriene. Pentru efectul letal sunt necesare alte evenimente suplimentare: inhibiia sintezei ARN i a proteinelor. La concentraiile de quinolone care depesc un anumit prag, activitatea bactericid diminu, probabil pentru c este inhibat numai sinteza ARN i a proteinelor. Tratamentul cu quinolone, probabil induce efecte pleiotrope, ce pot fi consecine secundare ale inhibiiei sintezei ADN-girazei: leziuni ale ADN bacterian, deoarece quinolonele sunt inductoare ale sistemului reparator SOS, dependent de Rec A. ADN giraza sau topoizomeraza II este o protein heterotetrameric format din dou subuniti A(gyr A) i dou subuniti B(gyr B). (La E. coli proteinele gyr au 97 kDa). Situsul catalitic a ADN girazei este situat la tirozina din poziia 122 a subunitii A. Subunitatea B cuprinde situsul de hidroliz a ATP, hidroliz care furnizeaz energia necesar activitii enzimatice. Subunitile A i B ale topoizomerazei II sunt codificate de genele gyrA i gyrB. Dup purificarea ADN-girazei de E. coli, structura acestei enzime a fost investigat pentru numeroase alte specii bacteriene, evideniindu-se un grad nalt de omologie ntre subunitile A pe de o parte i a subunitilor B pe de alt parte. Cu toate acestea, secvena situsurilor catalitice din proteinele gyr A i aceea a situsului de hidroliz a ATP n proteinele gyr B sunt foarte conservate. Genele gyr A i gyr B sunt gene structurale ale subunitilor A i B ale ADN-girazei. Subunitatea A a fost desemnat ca inta preferenial a aciunii quinolonelor. Subunitatea B este inta altor antibiotice: cumermicina i novobiocina. ADN-giraza purificat introduce rsuciri suprahelicale negative ale moleculei de ADN circular nchis i separ reversibil moleculele circulare catenate. Aceste activiti sunt dependente de energia eliberat prin hidroliza ATP i constau n clivarea ambelor catene ale moleculei de ADN, trecerea altui duplex de ADN (sau alt segment al aceluiai duplex) i reunirea catenelor. Activitatea ADN-girazei este inhibat de quinolone. ADN-giraza este o topoizomeraz, singura enzim care supraspiralizeaz molecula de ADN, adic modific configuraia spaial a moleculei, prin catalizarea suprarsucirilor negative ale ADN cromosomal i plasmidial, uurnd mpachetarea cromosomului bacterian n spaiul restrns al celulei. ADN-giraza este singura enzim care influeneaz gradul de spiralizare al ADN, fiind esenial pentru meninerea strii suprahelicale a cromosomului bacterian. Inhibiia

activitii acestei enzime de ctre fluoroquinolone este asociat cu moartea rapid a celulei bacteriene. Proteina se leag de ADN ca un tetramer, n care cele 2 subuniti A i 2 subuniti B mpacheteaz ADN prin supraspiralizare negativ. ADN-giraza utilizeaz energia rezultat prin hidroliza ATP i este esenial pentru mai multe procese vitale: iniierea i progresia bifurcaiei de replicare, terminarea replicrii ADN, transcrierea unor operoni, repararea ADN, recombinarea i transpoziia. Aceste activiti sunt rezultatul secionrii coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin ni i restabilirea continuitii catenei. Mecanismul de aciune este caracteristic topoizomerazei II. ADN giraza elimin rsucirile suprahelicale pozitive care se acumuleaz naintea bifurcaiei de replicare. Topoizomeraza IV a fost descris recent, iar funcia sa principal este decatenarea, adic separarea copiilor ADN circular dublu catenar dup replicarea cromosomului bacterian i a plasmidelor. Topoizomeaza IV este omolog structural cu ADN giraza. Este o enzim de separare a catenanilor (a moleculelor surori catenate de ADN), rezultai dintr-un rund de replicare bidirecional i permite segregarea lor n celulele surori. ADN-giraza i topoizomeraza IV acioneaz asupra dublei catene, dar efectele sunt diferite: giraza mpacheteaz ADN prin inducerea supraspiralizrii, iar topoizomeraza IV separ moleculele reunite prin legturi intermoleculare. Topoizomeraza IV este format la fel ca ADN-giraza din dou subuniti denumite Par C i dou subuniti Par E, cu aceeai repartiie funcional ca i a subunitilor ADN-girazei. Proteinele Par C i Par E sunt foarte asemntoare prin structura lor primar cu proteinele Gyr A i Gyr B (40% din secvena aminoacizilor este identic) i sunt codificate de genele parC i parE. Topoizomeraza IV modific ntr-o msur mult mai mic topologia ADN dublu catenar: rolul su este important pentru separarea catenelor de ADN dup terminarea replicrii. Rolul topoizomerazei IV, ca int specific a quinolonelor a fost recent demonstrat la E. coli (Koto, 1990), S. aureus (Ferrero, 1994) i N. gonorrhaeae (Belland, 1994). Noile quinolone au reprezentat un real progres terapeutic avnd n vedere caracteristicile lor antibacteriene (spectru larg, activitate bactericid i farmacocinetic). Aceasta explic spectaculoasa cretere a utilizrii lor n ultimii 10 ani. Dar utilizarea extensiv a noilor quinolone s-a tradus prin emergena ngrijortoare a tulpinilor rezistente a unor specii bacteriene de mare importan medical (enterobacteriile, P. aeruginosa, S. aureus, M. tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae) i a tulpinilor multirezistente la alte antibiotice. Mecanismele rezistenei bacteriene la fluoroquinolone sunt de trei categorii: - modificri ale enzimelor int ale medicamentelor - alterri care limiteaz accesul medicamentelor la int - activitatea pompelor de efux. Rezistena la quinolone este, predominant, consecina modificrilor enzimei int, la situsurile active ale enzimei. La bacteriile Gram negative, ADN-giraza pare a fi inta primar pentru toate quinolonele. La bacteriile Gram pozitive, quinolonele, n funcie de compusul chimic, acioneaz asupra topoizomerazei IV sau ADN-girazei. Structura quinolonei determin specificitatea intei de aciune asupra bacteriilor. Rezistena speciilor Gram pozitive la quinolone se datoreaz n special mutaiilor ntr-o regiune specific (quinolone resistance determining region - QRDR) a subunitii A a ADN-girazei. QRDR este regiunea N-terminal a proteinei, omolog cu regiunile GyrA i ParC de la E. coli. Regiunea cuprins ntre codonii 67 - 106 ai GyrA la E. coli, este determinant pentru rezistena la quinolone. Mutaiile genei gyrA induc schimbri ale situsului de legare/sau ale sarcinii, care condiioneaz interaciunea ADN-girazei cu quinolona. Quinolonele interacioneaz n primul rnd cu subunitatea A, dar s-au identificat mutaii ale subunitii B care confer rezisten la quinolone. ADN giraza i topoizomeraza IV sunt localizate n citoplasma bacterian. Pentru a-i atinge inta, antibioticele fluoroquinolonice trebuie s traverseze nveliul celular. Modificrile structurale ale membranei externe a bacteriilor Gram negative asociate cu diminuarea nglobrii sunt factori importani ai rezistenei la fluoroquinolone. Variantele Gram negative rezistente la quinolone care se selecteaz, se datoreaz modificrii porinelor din membrana extern, asociat cu scderea permeabilitii. Rezistena la quinolone nu este transferabil prin intermediul plasmidelor. La bacteriile Gram pozitive, scderea ratei nglobrii nu s-a demonstrat a fi un mecanism al rezistenei. Atat bacteriile Gram pozitive, cat i cele Gram negative pot dobandi un nivel sczut al rezistenei, mediat de activitatea pompelor de eflux, cu rol de transportori multipli, a cror activitate este dependent de gradientul electrochimic (fora proton motrice). Nu s-au identificat enzime cu efect inactivator fa de quinolone, aa cum -lactamaza inactiveaz penicilina sau cefalosporinele. Ciprofloxacinul are un potenial antibacterian mult mai ridicat dect acidul nalidixic.
Ciprofloxacinul se folosete n special pentru tratamentul infeciilor respiratorii, ale tractului urinar, gonoreii, pentru tratamentul infeciilor diareice cu tulpinile enterotoxice de E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella. Este activ, in vitro, fa de M. tuberculosis. Este parial metabolizat de ficat i excretat de rinichi. Medicamentele antiacide (Maloox) blocheaz absorbia
*

ciprofloxacinului i nu vor fi administrate concomitent. Administrat mpreun cu teofilina, poate duce la acumularea unor nivele sanguine nalte ale teofilinei. Teofilina se folosete ca bronhodilatator n tratamentul astmului. Nivelul crescut al teofilinei poate produce atacul cerebral i tulburri de ritm cardiac.

Ionii de Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ pot s lege ciprofloxacina i diminu mult absorbia medicamentului. Multe antibiotice, inclusiv ciprofloxacinul, pot altera microbiota normal a colonului, favorizand dezvoltarea bacteriilor care produc inflamaia mucoasei (colita pseudomembranoas) i determin tulburri diareice. Colita pseudomembranoas se datoreaz creterii n exces a bacteriei Cl. difficile i poate induce stri febrile, durere abdominal, tulburri ale tranzitului intestinal i chiar starea de oc. Tratamentul cu ciprofloxacin poate s duc la creterea n exces a levurii C. albicans, cu localizare vaginal (vaginit) sau intestinal (disbioza). Manifestarea efectelor secundare este prevenit prin administrarea probioticelor: Lactobacillus casei, L. acidophilus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisiae. Derivaii quinolonici se folosesc pentru tratamentul infeciilor cilor urinare, unde, dup administrare oral, se acumuleaz n concentraii inhibitorii. Fluoroquinolonele ptrund n esutul prostatic la concentraii care echivaleaz sau depesc de cteva ori pe cele din plasm. Cele mai sensibile la aciunea quinolonelor sunt enterobacteriile, dar compuii grupului sunt activi fa de chlamidii i micobacterii. Efectul bactericid al ciprofloxacinului este rapid, cu o pierdere de 90% a viabilitii, ntr-un interval de l9 minute. Quinolonele au efect antimicrobian prelungit dup administrare, ceea ce se reflect n continuarea supresiei creterii bacteriene, dup eliminarea agentului antimicrobian din organism. Dac un medicament are un efect persistent dup administrare, nseamn c poate fi eficient chiar n intervalele dintre doze, cnd nivelul seric i tisular au sczut sub nivelul concentraiei minime inhibitorii. Quinolonele i pstreaz activitatea fa de multe bacterii rezistente la antibiotice, inclusiv fa de bacilii Gram negativi cu rezisten multipl, fa de S. aureus rezistent la meticilin, fa de N. gonorrhoeae rezistent la penicilin, fa de H. influenzae productor de -lactamaze. Ciprofloxacina, ofloxacina i tosufloxacina sunt active fa de Chlamydia trachomatis i Mycoplasma hominis. Quinolonele sunt de asemenea active fa de Rickettsia spp. Acidul nalidixic inhib numai speciile de bacterii Gram negative aerobe. In molecula de ciprofloxacin, fluorul confer activitate fa de bacteriile Gram pozitive. Grupul piperazinic crete activitatea fa de enterobacterii, iar gruparea piperazin i ciclopropil confer activitate fa de speciile de Pseudomonas. Ali ageni chimioterapeutici Hidrazida acidului nicotinic (izoniazida, INH), introdus n clinic nainte de 1950, mpreun cu rifampina, formeaz baza chimioterapiei antituberculoase. Izoniazida este un derivat al nicotinamidei. Mecanismul de aciune al izoniazidei nu este cunoscut, dar influeneaz sinteza lipidelor, acizilor nucleici i acidului micolic la M. tuberculosis.

Izoniazida Piridoxina (vitamina B6) Se presupune c izoniazida este activ prin competiie cu piridoxina (vitamina B6) necesar creterii celulelor de M. tuberculosis, sau inhib sinteza acizilor micolici (acizi grai specifici acestor bacterii). Este bactericid fa de celulele care cresc i se divid i are aciune bacteriostatic fa de celulele care nu se multiplic. Toate cele trei (PASA, dapsone i izoniazida) se folosesc pentru tratamentul infeciilor cu Mycobacterium. Etambutolul, pirazinamida i etionamida blocheaz reaciile enzimatice n celula bacterian, deoarece sunt similare dar nu identice cu vitaminele bacteriene. Etambutolul inhib arabinozil-transferaza, enzim implicat n biosinteza arabinogalactanului i lipoarabinomananului. Alte efecte atribuite aciunii etambutolului sunt inhibiia metabolismului ARN i sintezei fosfolipidelor, inhibiia transferului acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular mureinic, sinteza spermidinei i inhibiia unei trepte timpurii a conversiei glucozei n monozaharidele utilizate pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) i a peptidoglicanului. Este un medicament foarte specific i

eficient, utilizat n asociaie cu izoniazida, pentru tratamentul tuberculozei. Are efect bacteriostatic. Nu se cunoate mecanismul care determin rezistena la etambutol (J. A. Musser, 1995).

Etambutolul Pirazinamida este un derivat sintetic al nicotinamidei. Nu se cunoate mecanismul de aciune, nici baza molecular a rezistenei. Unele tulpini sensibile la pirazinamid au o enzim specific (pirazinamidaza), ce metabolizeaz pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian. Tulpinile rezistente la pirazinamid au pierdut activitatea pirazinamidazic. S-au identificat i tulpini foarte rezistente la pirazinamid, care au i activitate pirazinamidazic. Aceasta sugereaz c, n plus fa de pierderea capacitii de sintez a pirazinamidazei, exist i alte mecanisme de rezisten.

Pirazinamida Etionamida, derivat a acidului izonicotinic, este activ fa de M. tuberculosis i alte micobacterii. In vitro, celulele tratate cu etionamida, celulele de M. tuberculosis i pierd acidorezistena. Se crede c mecanismul su de aciune implic inhibiia sintezei acizilor micolici.

Etionamida Nu se cunosc mecanismele rezistenei la etionamid i la izoniazid. Metronidazolul a fost introdus n clinic n 1959 pentru tratamentul infeciei cu Trichomonas vaginalis. Ulterior sa demonstrat eficiena sa fa de infeciile cu bacterii anaerobe i fa de alte infecii parazitare. Difuzeaz bine n esuturi, inclusiv n sistemul nervos. Are cea mai bun activitate bactericid, dintre toate medicamentele active fa de bacteriile anaerobe. Aciunea sa const n activarea reductiv a grupriii nitro. Metronidazolul acioneaz ca acceptor preferenial de electroni(e-), fiind redus de proteinele transportoare de e- cu potenial redox sczut. Reducerea scade concentraia sa, ceea ce menine un gradient ce favorizeaz ncorporarea medicamentului n celul i generarea produselor intermediare ale reducerii, cu efecte toxice pentru celul. Toxicitatea se datoreaz compuilor intermediari sau radicalilor liberi ce interacioneaz cu ADN i probabil cu alte molecule, producnd leziuni. Intermediarii citotoxici se descompun n produse finale netoxice i inactive: acetamida i acidul 2-hidroxietil oxamic. Efectul asupra microbiotei intestinale este minim, deoarece medicamentul este redus n condiii anaerobe. Methenamina este produsul ciclic de condensare a formaldehidei i amoniului. Are activitate antibacterian slab, dar la pH acid, fiecare molecul hidrolizat genereaz 4 molecule de amoniu i 6 molecule de formaldehid:

Este excretat n urina acid, unde este hidrolizat i formaldehida eliberat este bactericid. Este disponibil ca sare a acidului mandelic sau hipuric pentru acidifierea urinii. Nu s-a descris rezistena la formaldehid, dar tulpinile de Proteus, care produc frecvente infecii urinare sunt rezistente, deoarece ureaza lor cliveaz ureea la CO2 i NH3 i alcalinizeaz urina.

Derivaii nitrofuranului (furazolidon, nitrofurantoina, nitrofuratel, nitrofurazon) au efect bacteriostatic fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Cel mai utilizat este nitrofurantoina. Derivaii nitrofuranului se folosesc pentru terapia infeciilor tractului urinar, deoarece realizeaz concentraii suficient de mari n urin. Nu au aciune sistemic. Un intermediar redus al nitrofuranilor produce ruperea catenei de ADN, ceea ce explic efectele mutagene ale acestor compui in vitro. Sunt activate mecanismele de reparare a ADN. Metaboliii reactivi redui ai nitrofurantoinei interfer nu numai cu ADN, ci par a fi capabili s se lege cu proteinele ribosomale i inhib sinteza proteinelor. Inhib respiraia bacterian i metabolismul piruvatului. Nitroimidazolii au spectru larg de aciune (bacterii, fungi, protozoare, helmini). Cei cu activitate antibacterian sunt 5-nitroimidazolii: 2-metronidazolul, furazolidonul i tinidazolul. Furazolidonul este unul din numrul foarte mare de compui (de ordinul miilor) de nitrofuran, introdui n clinic dup descoperirea acestei clase de compui n anii 40. Este activ fa de Klebsiella, E. coli, Campylobacter spp., S. aureus, Giardia lamblia. Efectul lor antibacterian este dependent de reducerea gruprii nitro n condiii anaerobe. Compuii capteaz e- din feredoxina redus, generat n reacia de decarboxilare a piruvatului. Produsul reducerii are efect letal, probabil prin ruperea catenei de ADN. Unele bacterii microaerofile sunt deosebit de sensibile, dar mecanismul morii lor nu se cunoate. Aceste substane au spectru antibacterian redus, limitat la bacterii anaerobe, cu doar dou excepii: Helicobacter pylori i Gardnerella vaginalis, bacterii microaerofile sensibile la nitroimidazol. Condiia esenial pentru ca nitroimidazolii s acioneze, este reducerea parial a gruprii nitrat prin sistemul intracitoplasmatic transportor de electroni. Bacteriile aerobe sunt incapabile s realizeze aceast reducere, ceea ce explic rezistena lor natural. Nitrofuranii sunt ageni antibacterieni a cror structur i mod de aciune sunt similare cu cele ale nitroimidazolilor. Activitaea lor este legat de reducerea gruprii NH2. Intreaga cantitate administrat, pe cale oral sau parenteral rmne disponibil aciunii antimicrobiene. Perioada de njumtire permite administrarea a dou doze/zi. Datorit mecanismului unic de aciune, nu exist fenomene de rezisten ncruciat. Bacilii Gram negativi posed rezisten intrinsec pentru c au pompe de eflux eficiente fa de Linezolid. Un parametru esenial al unui agent chimioterapeutic este indexul terapeutic, adic raportul dintre doza toxic minim i doza cu eficien maxim. Valoarea mare a acestui raport este caracteristic agenilor chimioterapeutici foarte eficieni. Oxazolidinonele reprezint o clas unic de ageni antimicrobieni sintetici. Utilizarea lor n clinic a fost impus de necesitatea tratrii infeciilor produse de stafilococii rezisteni la meticilin, de pneumococii rezisteni la penicilin, de enterococii rezisteni la vancomicin. Aceti ageni au un mecanism unic de aciune, ceea ce elimin riscul rezistenei ncruciate cu agenii antimicrobieni disponibili. Deoarece nu sunt molecule naturale, genele de rezisten specific nu preexist n genofondul natural. Oxazolidinonele au fost iniial utilizate n terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei, dar ulterior s-a descoperit c au i activitate antimicrobian. Primul agent al acestei clase a fost produs de compania DuPont de Nemours, la sfritul anilor 70 pentru controlul bolilor foliare bacteriene i fungice la diferite plante, inclusiv la tomate. Modificarea chimic a oxazolidinonei a dus la descoperirea a doi ageni - eperezolid i linezolid, cu activitate in vitro i toxicitate diminuat. Linezolid are activitate in vitro, fa de N. gonorrhoeae i N. meningitidis i are o eficien bun fa de multe bacterii Gram pozitive anaerbe (Bacteroides fragilis). Bacteriile Gram negative sunt probabil intrinsec rezistente, deoarece posed pompe de eflux, eficiente fa de linezolid. In vitro, linezolid are o eficien relativ bun fa de M. tuberculosis i foarte bun fa de Nocardia.

Linezolid

Concentraiile subinhibitorii de linezolid diminu producerea hemolizinei i coagulazei la S. aureus i inhib sinteza streptolizinei O i DN-azei la streptococi. Mecanismul de aciune i rezisten. Oxazolidinonele sunt inhibitorii sintezei proteinelor ribosomale la bacterii, dar spre deosebire de ali ageni antimicrobieni cu aciune asupra ribosomilor, oxazolidinonele au un mecanism unic de aciune deoarece blocheaz prima treapt a asamblrii ribosomilor din subunitile disociate. Oxazolidinonele se leag de un situs al subunitii 50S, la interfaa sa cu subunitatea 30S i previn formarea complexului de iniiere 70S, care cuprinde ARN-fMet, ARNm i cele dou subuniti ribosomale. Linezolid se leag de subunitatea 50S, la sau lng situsul care leag cloramfenicolul i lincomicina, deoarece cele 3 molecule intr n competiie pentru situsurile de legare din domeniul V al ARN 23S al subunitii 50S. Domeniul V este centrul peptidil-transferazei, care catalizeaz formarea legturii peptidice. Spre deosebire de cloramfenicol i lincomicin, linezolid nu inhib formarea legturilor peptidice i ntre ele nu exist rezisten ncruciat. Asemntor majoritii inhibitorilor sintezei proteinelor ribosomale, activitatea linezolidului fa de bacterii in vitro este considerat bacteriostatic, deoarece bacteriile sunt omorte mai ncet decat de agenii bactericizi. Linezolid este metabolizat prin oxidarea inelului morfolino i se formeaz doi metabolii: acidul aminoetoxi-acetic i hidroxi-etil glicina. Linezolid este un agent antimicrobian cu spectru larg de activitate, virtual fa de toate bacteriile Gram pozitive. Intreaga cantitate administrat, pe cale oral sau parenteral rmne disponibil aciunii antimicrobiene. Perioada de njumtire permite administrarea a dou doze/zi. Datorit mecanismului unic de aciune, nu exist fenomene de rezisten ncruciat. Bacilii Gram negativi posed rezisten intrinsec pentru c au pompe de eflux eficiente fa de Linezolid. Un parametru esenial al unui agent chimioterapeutic este indexul terapeutic, adic raportul dintre doza toxic minim i doza cu eficien maxim. Valoarea mare a acestui raport este caracteristic agenilor chimioterapeutici foarte eficieni.

Antibioticele
Antibioticele (anti + bios = cu efecte nefavorabile) sunt un grup heterogen de substane chimice cu greutate molecular mic, produse de microorganisme prin procese de biosintez, care omoar sau inhib creterea altor specii de microorganisme. Definiia iniial s-a completat ulterior, deoarece antibioticele sunt substane chimice obinute prin biosintez, semisintez sau prin sintez chimic, care n concentraie mic inhib multiplicarea sau omoar microorganismele. Definitorie pentru noiunea de antibiotic, rmne capacitatea de a fi produs prin biosintez de ctre microorganisme. Fenomenul de antibioz (inhibiia dezvoltrii unui microorganism de ctre alii) a fost descris de Pasteur (l877). Gratia i Dath (1924)au studiat microorganismele din sol i n filtratul acelular al culturii de actinomicete au evideniat efectul inhibitor al unei substane pe care au denumit-o actinomicetin. Fleming (l928), n cutarea unor compui cu potenial antibacterian, a observat inhibiia creterii coloniilor de Staphylococcus aureus n vecintatea coloniilor fungice de Penicillium notatum. Apoi a artat c mediul lichid al culturii de P. notatum, diluat de 800 de ori, a inhibat creterea culturii de Staphylococcus. A descoperit medicamentul miracol pe care l-a denumit penicilina, dar n-a izolat-o, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Calitile ei de medicament miraculos au fost evideniate de ctre Ernst Chain i Howard Florey (1939), care au izolat-o i au folosit-o n tratamentul infeciilor bacteriene n timpul celui de al II-lea rzboi mondial. Producia industrial a nceput n l943. Noul medicament a fost introdus n circuitul clinic general n 1944 i a avut un impact uria asupra strii de sntate a populaiei umane. R. Dubos (1939) a izolat gramicidina i tirocidina din Bacillus brevis, active fa de bacteriile Gram pozitive. S. Waksman (1944-1945) a izolat streptomicina din Str. griseus, un microorganism izolat din sol, pentru care a primit premiul Nobel. Streptomicina este activ fa de unele bacterii Gram pozitive i fa de Mycobacterium tuberculosis. El a propus denumirea de antibiotic, cu sensul de compus chimic produs de un microorganism, care la concentraie mic, inhib sau omoar alte microorganisme. Antibiotice au fost eseniale n lupta cu maladiile infecioase i au contribuit esenial la creterea speranei de via n secolul 20. Dup introducerea penicilinei n clinica general (1944), infeciile grave (faringita streptococic) pn atunci, au devenit vindecabile. Azi, dependena omului de antibiotice este total. Numai n SUA, n 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dac se adaug cele administrate n hrana animalelor i n agricultur, se apreciaz c n ultimii 50 de ani s-au produs i s-au utilizat peste un milion de tone. Antibioticele sunt produse de trei grupe de microorganisme: actinomicete, bacili Gram pozitivi i fungi filamentoi microscopici. Actinomicetele sunt cele mai bune productoare de antibiotice i ali metabolii secundari cu activitate biologic. Genul cel mai reprezentativ Streptomyces - s-a izolat din tubul digestiv al unui pui de gin.

Cephalosporium a fost izolat din apa mrii, lng un canal de deversare a apelor menajere, iar Bacillus, dintr-o ran tegumentar a unei fetie (Tracy) i de aici s-a dat denumirea antibioticului bacitracina. Estimrile numrului de substane antibiotice variaz: unii au inventariat circa 5000 antibiotice identificate, iar alii evalueaz cifre net superioare de ordinul a 10 000. Actinomicetele produc peste 2/3 din totalul antibioticelor, iar speciile g. Streptomyces produc 70-80% dintre metaboliii secundari. Pentru terapia infeciilor umane i animale se folosete un numr restrns (circa l00), produse de reprezentanii a 5 genuri de microorganisme: Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului sau sunt lipsite de selectivitate. Izolarea microorganismelor productoare de antibiotice este foarte laborioas. Din l34 700 tulpini bacteriene izolate din circa 5000 de probe diferite de sol, o singur tulpin a prezentat interes practic. In perioada descoperirii celor mai multe antibiotice (anii 1950-60) s-au identificat tetraciclina, eritromicina i kanamicina, agenii antifungici candicidina i nistatinul, precum i substane cu efect antineoplazic (adriamicina). Marea majoritate a antibioticelor se obine n procese industriale, pe cale microbiologic. In prezent, numai poriunea major a moleculei de antibiotic este sintetizat de microorganisme, iar restul moleculei este sintetizat pe cale chimic. Se obin astfel antibiotice de semisintez sau prin metode de bioconversie. In unele cazuri (de exemplu, cloramfenicolul), ntreaga molecul se sintetizeaz pe cale chimic, datorit structurii sale moleculare simple. Convenional, n categoria antibioticelor sunt incluse i substanele de semisintez sau cele sintetizate artificial, dar pe care microorganismele le pot sintetiza total sau parial. Aceast meniune (c microorganismele le pot sintetiza total sau parial) este necesar, pentru ca din categoria antibioticelor s se exclud compuii cu efect antibacterian sintetizai numai pe cale chimic (sulfamidele) sau cei produi n organismele superioare (lizozimul). Structurile moleculare complexe ale antibioticelor combin derivai a dou sau mai multe grupe de metabolii: aminoacizi, glucide, bazele acizilor nucleici, intermediari ai sintezei lipidelor. Acetil-CoA i propionil-CoA formeaz catene lungi (ca n sinteza acizilor grai) i rezult poli- cetone (RCO CH2 CO CH2 - ), care se condenseaz pentru a forma inelele macrolidelor, polienelor, tetraciclinelor sau poriuni ale moleculei altor antibiotice.

Antibioticele metabolii secundari


Substanele biogene preluate de celul sub o form simpl, sunt folosite de celul n urmtoarele direcii eseniale: - pentru sinteza metaboliilor primari (aminoacizi, baze purinice i pirimidinice, enzime, acizi grai), necesari biosintezei constituienilor structurali, rezultatul fiind creterea celulei. Aceti compui se sintetizeaz faza de cretere primar, denumit i trofofaz; - pentru producerea energiei, n metabolismul energetic i a produselor metabolismului energetic (produi de fermentaie alcoolic, lactic, butiric, propionic, acid etc.); - pentru producerea (uneori) a metaboliilor secundari (antibiotice, alcaloizi, ergotina, giberelina). Metaboliii secundari se sintetizeaz n faza de cretere secundar - idiofaz - dup epuizarea unui nutrient major (sursa de C sau de N), nu sunt eseniali pentru creterea celulei i sinteza lor este expresia procesului de difereniere biochimic. Metaboliii primari i secundari pot fi denumii generali i speciali. Metabolismul primar implic activitatea unei serii de ci interconectate de anabolism, de catabolism i amfibolice, catalizate de enzime care furnizeaz intermediari de biosintez i energie i convertesc precursorii n macromolecule eseniale: ADN, ARN, proteine, lipide i polizaharide. Metabolismul primar este acelai pentru toate organismele vii. Pe lng metaboliii generali, unele organisme ale diferitelor grupri taxonomice sunt capabile s sintetizeze metabolii de tip special, folosind fie aceleai enzimele metabolismului general, sau sintetaze speciale produse de celule n condiii nutriionale speciale. De exemplu, acizii grai se sintetizeaz pe o cale comun la toate celulele vii, iar anumite grupe taxonomice de microorganisme i plante sintetizeaz poliketide din aceiai precursori, utiliznd enzime asemntoare. Metaboliii secundari au fost denumii idiolii, deoarece se sintetizeaz n idiofaza (faza de producie) culturii staionare. Metaboliii secundari au structuri chimice particulare, nu sunt eseniali pentru creterea organismului productor, dar probabil au rol n asigurarea supravieuirii n mediile naturale. Diversitatea chimic i structurile neobinuite ale metaboliilor secundari sunt ilustrate de numrul mare de clase crora le aparin: aminozaharuri, quinone, cumarine, epoxizi, alcaloizi ergot, glicozide, derivai indolici, lactone, macrolide, naftalene, nucleozide, peptide, poliacetilene, poliene, piroli, terpenoide, tetracicline etc. Metaboliii secundari includ legturi chimice neobinuite: inele -lactamice, peptide ciclice alctuite din aminoacizi normali i modificai, legturi nesaturate de poliacetilene i poliene, inelul macrolidelor.

Metaboliii secundari sunt produi numai de unele specii ale unui gen, ca familii de compui strns nrudii: cel puin 10 peniciline naturale, 10 bacitracine, 25 actinomicine etc. Proporia diferitelor componente n amestec depinde de factori genetici, de factorii de mediu i se datoreaz relativei lipse de specificitate a enzimelor implicate n metabolismul secundar. {n contrast, procesele de biosintez ale metaboliilor primari sunt totdeauna catalizate de enzime cu specificitate nalt: enzima recunoate un singur substrat i se formeaz un singur produs. Specificitatea aciunii enzimelor care catalizeaz sinteza metaboliilor primari se datoreaz faptului c erorile de biosintez ale componentelor celulare eseniale sunt, n general, letale, iar erorile care survin n metabolismul secundar nu au consecine semnificative pentru celula productoare, deoarece metabolitul secundar modificat i pstreaz, de regul, activitatea biologic. Metaboliii secundari se sintetizeaz pe o varietate mai mare de ci, dect cei primari. Dei au structuri chimice foarte diversificate i se sintetizeaz pe ci variate, metaboliii secundari se asambleaz dintr-un numr limitat de metabolii intermediari. Antibioticele sunt metabolii secundari a cror sintez ncepe trziu n timpul fazei de cretere, la intrarea n faza staionar. Experienele de autoradiografie cu aminoacizi marcai au evideniat c n perioada n care miceliul crete cu o rat nalt, aminoacizii se ncorporeaz n proteinele celulare, dar nu se sintetizeaz actinomicin. Dup ce microorganismul a ncheiat faza de cretere, rata ncorporrii aminoacizilor n proteine scade considerabil. Waksman (1961) a intuit c proprietatea anumitor microorganisme de a sintetiza antibiotice nu este corelat cu nici un mecanism esenial al nutriiei i creterii celulei. {n general, sinteza metaboliilor secundari din categoria antibioticelor este supresat n timp ce celulele se gsesc n faza de multiplicare activ i este cea mai rapid dup ce cultura intr n faza staionar. Comparativ cu metaboliii primari, antibioticele au specificitate redus de biosintez, deoarece acelai organism sintetizeaz, de multe ori, un grup de molecule nrudite. Cele dou faze, trofofaza i idiofaza, sunt bine separate la o cultur bacterian productoare de antibiotic, dar nu sunt clar delimitate pentru microorganismele filamentoase (actinomicete i fungi). Criteriul evalurii creterii masei celulare este determinarea greutii uscate. {n numeroase procese de biosintez industrial cu microorganisme filamentoase, greutatea uscat continu s creasc semnificativ n idiofaz, dar cu o rat mai mic dect n trofofaz. Determinarea greutii uscate nu este un criteriu optim pentru evaluarea creterii. Masa celular const din totalitatea structurilor necesare diviziunii celulare (organitele celulare) i din materialele de rezerv (polioli, lipide, polifosfai i glucide nestructurale), care pot s reprezinte 50-60% din greutatea uscat a celulei la sfritul procesului de biosintez. Creterea greutii uscate n idiofaz este rezultatul acumulrii substanelor de rezerv, o cretere cu caracter nereplicativ (nu este asociat cu diviziunea celular),. De aceea, parametrul optim pentru msurarea creterii masei replicative a celulei, este determinarea cantitativ a ADN. {n acest caz, creterea celulei poate fi disociat de producerea de antibiotic. Sfritul fazei de cretere replicativ este marcat de ali parametrii: scderea ratei activitii respiratorii i scderea ratei sintezei ARN. Cele dou faze sunt bine delimitate n cazul fermentaiei antibioticelor (cloramfenicol, colistin, penicilina, bacitracina) n mediile organice complexe, care favorizeaz creterea rapid a culturii discontinui *, dar se suprapun ntr-un grad semnificativ, n mediile chimic definite (sintetice), care favorizeaz creterea lent.
*

Culturile bacteriene discontinui se obin prin inocularea unui mediu nutritiv lichid sau solidificat, ce nu se renoiete.

Factorul care controleaz declanarea biosintezei antibioticelor este deficiena unuia sau mai multor componente nutriionale care limiteaz creterea. Epuizarea unui astfel de factor oprete creterea i iniiaz biosinteza idioliilor. {n mediile definite chimic, favorizante ale creterii lente, unul sau mai muli factori nutriionali pot fi limitani ai creterii chiar de la nceputul cultivrii, dar favorabili sintezei antibioticelor. Momentul sintezei produsului nu este un criteriu totdeauna valid pentru a defini metabolitul secundar. Microorganismele par a fi programate s produc antibiotice numai cnd rata specific de cretere scade sub un anumit nivel. Fenomenul s-a stabilizat n evoluie, ca rspuns la presiunile competitive. {n mediile bogate n substane nutritive, ca de exemplu intestinul mamiferelor, producerea antibioticelor nu este necesar, deoarece resursele satisfac necesitile metabolice ale ntregii asociaii. {n mediile naturale majore (sol, ap), nutrienii sunt totdeauna limitani pentru creterea diferitelor asociaii de microorganisme heterotrofe i sinteza antibioticelor devine avantajoas pentru supravieuire. Microorganismele evit efectul letal al antibioticelor pe care le produc (sinuciderea) prin urmtoarele mecanisme : - modificarea i detoxificarea antibioticelor de ctre enzime sintetizate de organismele productoare; - alterarea intei antibioticului n celula productoare; - scderea permeabilitii pe faa extern a membranei, dup ce antibioticul a fost excretat. Unele antibiotice au rol n dinamica proceselor de sporulare (de exemplu, polimixina, produs de Bacillus polymyxa). Altele sunt produse secundare, rezultate din degradarea peretelui celular, corelat cu sporularea, deoarece peretele conine D-aminoacizi i glucide care se regsesc n compoziia chimic a unor antibiotice.

Producerea antibioticelor a evoluat ca un mecanism ecologic de inhibiie a creterii altor microorganisme, cu care intr n competiie pentru resursele energetice. Fenomenul se numete antibioz i are o semnificaie funcional opus simbiozei. Dar microorganismele productoare de antibiotice reprezint o proporie foarte mic din totalul microorganismelor din sol. Faptul c antibioticele se sintetizeaz la sfritul fazei de cretere, pare s nu le confere un avantaj competitiv real. Condiiile de mediu necesare sporulrii i secreiei metaboliilor secundari sunt adeseori asemntoare i chiar mai stringente dect acelea necesare creterii vegetative. S-a crezut c sinteza metaboliilor este obligatorie pentru sporulare, dar unele tulpini fungice sporuleaz chiar n absena producerii metaboliilor secundari. Cei mai muli metabolii secundari sunt sintetizai de organisme cu cretere filamentoas i cu morfologie relativ complex. Sinteza metaboliilor secundari, la microorganisme, este asociat cu procesele de sporulare. Se disting 4 categorii de metabolii secundari a cror sintez este declanat de procesul de sporulare: - metabolii care activeaz sporularea (acidul linoleic, la Asp. nidulans); - pigmenii structurilor de sporulare (melaninele necesare formrii sau integritii sporilor sexuai i asexuai). Melaninele sunt pigmeni de culoare nchis care se formeaz prin polimerizarea oxidativ a compuilor fenolici, se sintetizeaz n timpul sporulrii i sunt depozitai n peretele celular, avand rol protector fa de radiaiile UV, dar sunt i factori de virulen; - metabolii toxici secretai la timpul sporulrii (micotoxinele); - antibiotice. Metaboliii secundari sunt substane neeseniale pentru organismul productor, crora li se atribuie urmtoarele activiti biologice: - inhibiia creterii sau chiar efectul letal asupra altor organisme din mediu; - efecte toxice fa de organismele multicelulare (nevertebrate, plante) ; - stimuleaz diferenierea microorganismelor; - au rol n transportul ionilor metalici. Metaboliii secundari au semnificaie adaptativ pentru microorganismele productoare, deoarece sinteza lor este determinat genetic, iar pe de alt parte, multe clase de compui prezint o adaptare remarcabil de a interaciona cu intele lor. Unii metabolii au activitate biologic chiar la concentraiile mici produse n mediile naturale. Antibioticele produse de Streptomyces se sintetizeaz n cantiti mici, n faza de tranziie, cnd creterea miceliului vegetativ ncetinete, ca rezultat al epuizrii nutrienilor i miceliul aerian este gata s se dezvolte pe seama nutrienilor eliberai prin degradarea hifelor vegetative. Astfel de antibiotice ar avea rolul de a proteja organismul productor, de alte microorganisme care tind s consume resursele nutritive din mediu. Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au aciune sinergic: de exemplu, antibioticele lactamice i acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus). Acidul clavulanic este un inhibitor natural al -lactamazelor, care confer rezisten la -lactamice. Antibioticele -lactamice i ale inhibitorilor -lactamazei sunt eficiente fa de bacteriile rezistente la -lactami. Efectul sinergic al asociaiei este reflectat de denumirea dat combinaiei acidului clavulanic cu meticilina: augmentin. Coproducerea cefamicinei (un antibiotic -lactamic) i acidului clavulanic este constant: nu exist prodctori cunoscui de acid clavulanic, care s nu produc cefamicine (Challis, Hopwood, 2003). Multe specii de Streptomyces produc dou sau mai multe antibiotice, cu aciune sinergic fa de un organism competitiv care domin numeric asociaia natural. Astfel, Str. avermitilis sintetizeaz doi compui antifungici cu structuri diferite: oligomicina i un macrolid polienic. Cele dou antibiotice au inte moleculare distincte: oligomicina inhib o sintaz mitocondrial, iar macrolidul polienic se leag ireversibil de membrana celulelor fungice, alternd permeabilitatea lor. Oligomicina i macrolidele polienice pot aciona sinergic fa de fungi. Probabil c un competitor fungic al lui Str. avermitilis, l-a selectat pe ultimul pentru sinteza acestor antibiotice.

Oligomicina Multe produse naturale de importan medical (antibiotice), alimentar, industrial sau agricol sunt metabolii secundari. Creterea fungic i sinteza antibioticului sunt rezultatul interaciunii dintre miceliul fungic, substrat i condiiile de mediu. Sinteza este influenat de condiiile mediului de cretere al fungilor. Multe antibiotice sunt metabolii secundari, produi n condiii suboptimale de cretere sau n prezena unor cantiti limitante de nutrieni. Temperatura, umiditatea, aeraia, pH-ul, rata de cretere influeneaz masa fungic i sinteza antibioticelor. Sinteza proteinelor neribosomale* Cele dou categorii de proteine celulare i antibiotice polipeptidice se sintetizeaz dup mecanisme diferite. Dovezile experimentale au fost aduse utiliznd inhibitori metabolici. De exemplu, cloramfenicolul i puromicina inhibitori ai sintezei proteinelor celulare stimuleaz ncorporarea aminoacizilor n actinomicin. In abena sintezei proteinelor celulare, rezerva de aminoacizi poate fi folosit exclusiv pentru sinteza antibioticelor. Nu toate proteinele se sintetizeaz pe ribosomi. Unele polipeptide, cu mai puin de 50 de aminoacizi pot fi asamblate de peptid-sintetaze, ca i ali compui, ca de exemplu acizii grai, a cror sintez este catalizat de alte sintetaze. Produsele peptidice de sintez neribosomal includ ciclosporina (cu aciune imunosupresoare) i antibiotice ca gramicidina S, tirocidina A i surfactinele. O structur modular a peptid-sintetazelor determin alungirea secvenial a catenei peptidice, prin adausul de aminoacizi specifici.
Sinteza neribosomal a peptidelor are loc la procariote i la eucariotele inferioare i se bazeaz pe principiul matriei cu S (thiotemplate), catalizat de complexe enzimatice mari multifuncionale, denumite peptid-sintetaze, care sunt organizate n module (un modul de iniiere a sintezei i mai multe module de alungire a catenei peptidice). Fiecare modul este alctuit din mai multe domenii, care determin alungirea catenei polipeptidice prin adugarea succesiv a aminoacizilor.
*

Modulele au un model comun de organizare care le permite activarea aminoacidului fixat i realizarea unei legturi peptidice, ca i modificarea aminoacidului fixat prin reacii de epimerizare sau N-metilare. S-a demonstrat experimental c un modul de alungire trebuie s posede cel puin 4 domenii: - un domeniu de adenilare (A) cu activitate de peptid-sintetaz care fixeaz aminoacidul i l activeaz printr-o reacie de adenilare; - un domeniu de tioesterificare (T sau PCP-peptidyl carrier protein) care menine peptidul nascent asociat cu sintetaza, pe ntreaga durat a sintezei prin intermediul unei legturi tioesterice; - un domeniu de condensare (C) prin care sintetaza catalizeaz formarea legturilor peptidice; - un domeniu specific (Te) cu activitate de tioesteraz care permite eliberarea peptidului de complexul sintetazei, dup terminarea sintezei. Spre deosebire de calea de sintez proteic clasic (ribosomal) care utilizeaz doar 21 de aminoacizi (20 eseniali i selenocisteina), sinteza non-ribosomal poate utiliza peste 300 de aminoacizi (de exemplu, D-aminoacizi, aminoacizi Nmetilai etc.), ns peptidele sintetizate nu pot depi 48 de aminoacizi. Peptid-sintetazele, ca i alte complexe enzimatice (de exemplu, poliketid-sintetazele) sunt interesante datorit posibilitii utilizrii lor n biosinteza produselor nenaturale.

Majoritatea peptidelor neribosomale sintetizate de microorganisme sunt clasificate ca metabolii secundari, adic rareori au rol n metabolismul primar, n cretere sau n reproducere, dar sinteza lor a evoluat cu un oarecare beneficiu pentru organismul productor.

Clasificarea antibioticelor n funcie de structura chimic


Din punct de vedere chimic, antibioticele sunt un grup de substane foarte heterogene. Se disting urmtoarele categorii: l. Antibioticele -lactamice constituie unul dintre cele mai mari i importante grupe de antibiotice. Toate cuprind n structura lor, inelul -lactamic i sunt foarte diverse: penicilinele, cefalosporinele i cefamicinele. Penicilina este produs de Penicillium chrysogenum. Molecula nativ (benzil-peniclina sau peniclina G) este alctuit din inelul -lactamic i inelul tiazolidinic. La C6 este ataat grupul fenil-acetamido. La cefalosporine, inelul tiazolidinic are un atom de C suplimentar, cu o legtur nesaturat ntre C3 i C4 i rezult o structur denumit cefem. Cefamicinele sunt similare ca structur chimic, dar inelul -lactamic conine un grup metoxi, care-i confer stabilitate la multe enzime -lactamazice. Alte variante structurale ale compuilor -lactamici utilizai n clinic sunt: carbapenem, carbacefem, oxacefem, clavam (acid clavulanic), sulfone, monobactam. Penicilinele semisintetice se obin din acidul 6-aminopenicilanic, care se condenseaz cu orice acid carboxilic. Rezult astfel un numr mare de peniciline: oxacilina i derivaii si, meticilina, ampicilina, amoxicilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina. Acidul 6-aminopenicilanic, pentru penicilinele semisintetice, se obine prin tratamentul penicilinei cu o amidaz sau prin cultivarea organismului productor, ntr-un mediu fr donorul gruprii acil. Acidul 6-aminopenicilanic este un dipeptid ciclic, format prin condensarea L-cisteinei i D-valinei i de aceea penicilinele, cefalosporina i cloramfenicolul aparin grupului antibioticelor oligopeptidice. Cloramfenicolul este un antibiotic simplu, sintetizat de Streptomyces, dar n cea mai mare parte se obine prin sintez chimic. Are un spectru larg de aciune: bacteriile Gram pozitive i Gram negative, dar i bacteriile parazite obligat intracelulare (chlamidii, rickettsii). Cloramfenicolul conine o grupare nitro i un grup diclor-acetil. El se leag de subunitatea ribosomal mare i blocheaz transferul peptidil, la ribosomii care alungesc catena. 2. Antibiotice polipeptidice: bacitracina (produs de B. subtilis), gramicidina (sintetizat de B. brevis), cicloserina (produs de Streptomyces), actinomicina, polimixina (sintetizat de B. polymyxa). Bacitracina este un peptid ciclic ce mpiedic defosforilarea purttorului lipidic ce transfer noul peptidoglican, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Bacitracina deriv dintr-o protein a celulei vegetative, care este degradat parial n timpul sporulrii. Este toxic pentru a fi aplicat sistemic, dar se gsete n formulri pentru aplicaii locale. Polimixinele sunt o familie de antibiotice produse de specii de Bacillus. O parte a polipeptidului are o configuraie ciclic, cu o coad hidrofob de acid octanoic. In clinic se folosesc polimixina B i polimixina E (colistina), precum i derivaii lor sulfometilai. Polimixinele sulfometilate au activitate antibacterian redus, dar se cliveaz spontan i rezult compui mai activi. Tyrocidina i gramicidina S sunt polipeptide ciclice. Ele produc dezorganizarea membranei, rezultatul fiind pierderea moleculelor mici i liza protoplatilor. Nu se folosesc pentru administrare sistemic, deoarece sunt toxice. 3. Antibioticele aminoglicozidice a cror denumire se termin cu mycin deriv direct sau indirect de la Streptomyces, iar cele care se termin cu micin deriv de la Micromonospora. Toate aminoglicozidele au un inel format din 6 uniti, cu grupri amino i de aici deriv denumirea de aminociclitol. Molecula lor polar, policationic, conine un aminociclitol, de care se leag dou sau mai multe glucide, dintre care cel puin unul este aminat. La streptomicin, aminociclitolul este diguanidin-inozitolul (streptidina). Majoritatea aminoglicozidelor au grupul aminociclitol reprezentat de deoxistreptamin. Ele se mpart n derivai ai neomicinei, kanamicinei, gentamicinei. Aminoglicozidele sunt active fa de numeroase bacterii infecioase Gram pozitive i Gram negative, dar i fa de M. tuberculosis. Legarea unei singure molecule este suficient pentru inactivarea ribosomului bacterian. Aceste antibiotice nu traverseaz uor membranele celulare. Se absorb cu dificultate din intestin, dar pentru modificarea microbiotei intestinale, administrarea oral este calea optim. Sunt ineficiente fa de bacteriile cu localizare intracelular. Anaerobia i prezena cationilor bivaleni diminu eficiena aminoglicozidelor. Se administreaz numai n cazul infeciilor

severe (tuberculoza, bruceloza, tularemie, plaga bubonic). Sunt sinergice cu antibioticele beta-lactamice i se folosesc n septicemiile cu bacterii Gram negative. Pentru a-i exercita efectul bactericid, aminoglicozidele necesit sinteza proteic. 4. Antibioticele polichetide (acetogenine) sunt substane naturale derivate din acizi poli--cetonici, care la rndul lor se formeaz din acetil-CoA i mai multe molecule de malonil-CoA, dup decarboxilare: griseofulvina (produs de Penicillium patulum), tetraciclina (sintetizat de Streptomyces). Tetraciclinele sunt un grup de substane naturale sau de semisintez, a cror formul cuprinde un nucleu tetraciclic linear fuzionat, de care se ataeaz o varietate de grupri funcionale: clor-tetraciclina (produs de Streptomyces aureofaciens), oxitetraciclina (produs de S. rimosus). Tetraciclinele sunt ageni chelatori puternici i proprietile lor farmacochinetice sunt influenate de chelarea ionilor de metal. Sunt cel mai important grup de antibiotice, datorit spectrului antibacterian foarte larg. Sunt active fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative, fa de protozoarele parazite (Entamoeba), fa de chlamidii, micoplasme i ricketsii. Acioneaz prin inhibiia sintezei proteinelor, deoarece inhib ataarea aminoacil-ARNt la situsul acceptor ribosomal. Sunt larg utilizate n terapia antiinfecioas uman i animal, deoarece nu produc colaterale majore. Se adaug ca supliment n furaje n doze subterapeutice, pentru stimularea creterii. 5. Antibioticele macrolide. Denumirea de macrolid desemneaz o structur chimic caracterizat prin prezena unui ciclu lactonic cu complexitate variabil, la care se ataeaz componenta glucidic. Ciclul lactonic rezult prin nchiderea unui lan lung de acizi grai hidroxilai. Antibioticele macrolide sunt foarte diverse, datorit att variaiei inelului macrolidic, ct i a complexului glucidic. Cele mai cunoscute sunt eritromicina i oleandomicina. 6. Antibioticele steroidice au o structur chimic asemntoare colesterolului. Acidul fusidic (fusidina) este produs de fungii filamentoi din g. Fusarium. Este activ prin legarea de factorul de elongaie G (EFG). 7. Antibioticele polienice se caracterizeaz prin prezena, n molecula lor, a unui anumit numr de legturi duble: nistatina, amfotericina B, candicidina (produse de membri ai g. Streptomyces), iar fumigalina este sintetizat de Aspergillus fumigatus. 8. Antibiotice glicopeptidice In clinic se folosesc dou glicopeptide: vancomicina i teicoplanina. Vancomicina este o molecul mare, complex, produs de Streptomyces orientalis. Utilizarea ei este limitat, datorit toxicitii asupra rinichiului. Vancomicina este un heptapeptid rezultat din aminoacizi aromatici modificai i condensai ntr-o structur triciclic, de care se ataeaz un dizaharid. Activitatea sa antimicrobian se datoreaz legrii la catenele laterale de Dalanil-D-alanil ale peptidoglicanului, blocnd formarea legturilor ncruciate ale catenei polipeptidice i este limitat, n esen, la bacteriile Gram pozitive, deoarece, la bacteriile Gram negative mureina acoperit de membrana extern, nu este accesibil antibioticelor glicopeptidice. Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune Antibioticele au aciune selectiv: ele nu produc leziuni asupra celulelor organismelor superioare, dar inhib creterea sau omoar agentul infecios. Selectivitatea aciunii este o condiie ideal, pentru c, de exemplu, penicilina produce o stare alergic, independent de aciunea antibacterian i implic o alt parte a moleculei dect cea efectoare a aciunii antibacteriene. Unele antibiotice produc efecte toxice nete la om i animale i folosirea lor este limitat pentru tratamentul infeciilor la care riscul administrrii este mai mic dect consecinele procesului infecios. Antibioticele i datoreaz aciunea selectiv, reactivitii lor chimice mai nalte sau exclusive fa de unele componente ale celulei bacteriene sau fungice, n raport cu celulele umane i animale. Sensibilitatea diferitelor organisme la antibiotice, ca i la agenii chimioterapeutici, variaz n limite largi. De obicei, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile, deoarece peretele mureinic este o barier mai permeabil pentru moleculele de antibiotic i n plus, sinteza mureinei este o int important pentru aciunea unor antibiotice. Bacteriile Gram negative sunt mai puin sensibile, deoarece membrana extern este hidrofob, iar moleculele de LPS stabilizate de ionii bivaleni formeaz o structur dens, greu permeabil.
Moleculele de LPS formeaz baza structural a integritii membranei externe. LPS este polianionic datorit sarcinilor negative ale lipidului A i leag cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivaleni (Ca2+, Mg2+) i formeaz o structur compact ca un acoperi de igl, pe suprafaa membranei externe. Situsurile LPS care leag cationii sunt eseniale pentru integritatea membranei externe, dar n acelai timp ele reprezint clciul lui Ahile al
*

acestei structuri. Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern.

Antibioticele se clasific n funcie de spectrul de activitate, adic de diversitatea microorganismelor asupra crora acioneaz: - antibiotice cu spectru restrns de activitate, fa de bacteriile Gram negative: de exemplu, penicilina G este activ fa de cocii Gram pozitivi; - antibiotice cu spectru intermediar de activitate: sunt active fa de bacteriile Gram pozitive, dar i fa de unele bacterii Gram negative: streptomicina, neomicina, gentamicina, kanamicina, cefalosporina; - antibiotice cu spectru larg, active fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative: tetraciclina, cloramfenicolul; - antibiotice antifungice, active fa de infeciile fungice superficiale (de exemplu, griseofulvina) sau fa de infeciile profunde (amfotericina). Nistatinul (stamicin) este activ fa de infeciile tegumentului i ale epiteliilor mucoaselor digestive i vaginale, produse de Candida. Antibioticele active asupra bacteriilor Gram pozitive i Gram negative sunt de spectru larg. Acestea au o utilitate clinic mai larg dect cele active fa de un singur grup de microorganisme, denumite antibiotice cu spectru ngust. Ultimele se folosesc pentru controlul infeciilor care nu rspund la alte antibiotice. De exemplu, vancomicina (un glicopeptid) este activ fa de bacteriile din g. Staphylococcus, Bacillus i Clostridium. In unele cazuri, antibioticele interacioneaz cu molecule caracteristice microorganismelor i de aceea indexul lor terapeutic este foarte nalt. De exemplu, penicilina este activ fa de sinteza mureinei, componenta specific a peretelui bacterian. Penicilina reacioneaz i cu moleculele proprii organismului uman i animal, la concentraii de cteva mii de ori mai mari dect cele necesare pentru a omor bacteriile. Majoritatea antibioticelor sunt bacteriostatice sau bactericide. Efectul bacteriostatic semnific inhibiia reversibil a creterii, iar cel bactericid are semnificaia unei aciuni letale ireversibile. Excepie fac griseofulvina i antibioticele polienice, care sunt antifungice. Mecanismele de aciune a antibioticelor sunt diferite, consecin a diversitii structurii lor moleculare (fig. 78). Cele mai multe sunt molecule complexe, cu regiuni hidrofobe, ce uureaz difuzia n celule. Cea mai simpl modalitate de a le clasifica, este n funcie de situsul de aciune n celula bacterian: - antibiotice ce acioneaz asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular (penicilina, cefalosporina, bacitracina, cicloserina, fosfomicina); - antibiotice active asupra sintezei proteinelor bacteriene (aminoglicozide, cloramfenicol, tetraciclina, macrolide, streptogramina); - antibiotice active asupra sintezei acizilor nucleici (rifamicina, novobiocina); - antibiotice active asupra membranei celulare (polimixina, gramicidina, tirocidina, valinomicina, monensina ultimele dou nefolosite n clinica uman). In celul, inhibiia unui proces poate duce la inhibiia sau la stimularea indirect a altor procese, prin alterarea sistemelor feed-back sau a altor mecanisme de control. De aceea, nu se pot trage concluzii ferme din studiul efectelor unui antibiotic asupra unui singur proces celular.

Fig. 78. Ilustrarea schematic a situsurilor majore ale aciunii antibioticelor

Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular Peretele acoper membrana citoplasmatic, confer forma specific i rigiditate celulei bacteriene, asigur meninerea integritii structurale. Structura chimic unic a peretelui bacterian condiioneaz sensibilitatea lui la cteva grupe de antibiotice, care includ -lactamii (peniciline, cefalosporine, carbapenemi i monobactami), acidul clavulanic (un inhibitor al -lactamazelor), antibioticele glicopeptidice (vancomicina, teicoplanina i avoparcina stimulator al creterii animalelor). Sunt de asemenea active asupra peretelui, fosfomicina i cicloserina, dei acestea sunt active asupra cii metabolice a sintezei monomerilor peretelui celular. La bacteriile Gram-negative stratul peptidoglicanic este foarte subire i este acoperit de o structur secundar, membrana extern, care reprezint o barier important de permeabilitate, n special fa de ptrunderea antibioticelor. Sinteza peretelui celular este inhibat de antibioticele -lactamice (peniciline, cefalosporine), inhibitoare ale polimerizrii peptidoglicanului i de vancomicin (tabel nr. 4).
Tabel nr. 4: Antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian (adaptare dupa Topley si Wilsons, 1998). Clasa de inta specific Structura chimic antibiotice PLP/PBP -Lactaminele HO O H CH3 (Penicilin Binding (Peniciline, Protein); C ON R1 C N Cefalosporine H3C Transglicozilaze; , CH3 S Transpeptidaze; Carbapenem) O NH Carboxidaze.
O COO
-

N R2 COOH

carbapenem

cefalosporina

Bacitracina

Cicloserina Fosfomicina

Lipidul transportor al precursorilor nucleotidici Inhibarea dipeptidsintetazei Inhibarea PEP ??sintetazei

H C H3C C

H PO3H2 O fosfomicina

Vancomicina

Dipeptidul terminal D-Ala-DAla


AA1 R1 R2 N+ R3 O NH O NH O X2 O X3 OS2 O AA3 NH O NH X1

HO HO

OH

CO2O NH NH O OS1

HO

vancomicina

Familia antibioticelor -lactamice cuprinde un numr mare de molecule, reprezentantul cel mai vechi fiind penicilina G (Duval, 1989); ele se pot clasifica n patru grupe: - peniciline - cefalosporine - carbapeneme - monobactami. Antibioticele -lactamice inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanului, adic formarea punilor interpeptidice. Aceti compui prezint o analogie structural cu dipeptidul terminal D - Ala - D - Ala, care face parte din pentapeptidul mureinic. Problema funciei fiecrei proteine care leag penicilina (PBP Penicillin Binding Proteine) a fost studiat n detaliu E. coli. La aceast specie s-au identificat patru PBP cu greutate molecular mare (PBP 1a, 1b, 2 i 3), cu rol de enzime bifuncionale: catalizeaz transpeptidarea i transglicozilarea peptidoglicanilor. Peretele celular este una dintre intele primare pentru antibiotice. Efectul lor se realizeaz prin inhibiia sintezei unui component parietal sau prin inhibiia polimerizrii componentelor chimice ale mureinei. Antibioticele -lactamice interfer cu reacia final de transpeptidare, ce formeaz legturile transversale ntre catenele adiacente de peptidoglican, cele care confer rigiditatea structurii parietale. Antibioticele -lactamice sunt bactericide, dar mecanismul aciunii lor este diferit, asupra bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Bacteriile produc 4 tipuri de proteine care leag penicilina (PBP), asemntoare serin-proteazelor. Unele catalizeaz reaciile de transpeptidare(formarea legturilor ncruciate n peptidoglican) i de carboxipeptidare (modificarea peptidoglicanului) ale asamblrii peretelui celular. PBP, dup legarea penicilinei, transmit un semnal transmembranar pentru inducerea sintezei -lactamazelor. Beta-lactamazele sunt PBP ce catalizeaz hidroliza inelului -lactamic i inactivarea antibioticului. PBP sunt proteine legate de membran (1% din totalul proteinelor de membran), eseniale pentru viabilitatea celulei, cu excepia -lactamazelor care pot fi legate de membran sau secretate. Antibioticele -lactamice se leag covalent cu PBP prin acilarea restului de serin din situsul activ. La bacteriile Gram pozitive, antibioticele -lactamice difuzeaz liber spre PBP. La bacteriile Gram negative, porinele membranei externe limiteaz ptrunderea antibioticelor n celul, care se acumuleaz n spaiul periplasmic. Cnd concentraia devine eficient, antibioticele sunt legate de PBP de pe suprafaa extern a membranei celulare. Stratul extern al peretelui bacteriilor Gram negative este format din lipopolizaharide (LPS) a cror structur este foarte compact i hidrofil la suprafa, datorit acizilor grai saturai i sarcinii electrice negative. Rezistena se manifest dac concentraia antibioticului n periplasm este mai mic dect cea necesar pentru legarea i inhibiia activitii PBP. Mecanismele rezistenei bacteriene la antibioticele -lactamice sunt: - nglobarea sczut a antibioticului prin porine - hidroliza sub aciunea -lactamazelor (la Gram negative sunt localizate n spaiul perilasmic) - aciunea pompelor de eflux; - mutaii ale PBP care reduc afinitatea pentru antibioticele -lactamice. In absena sintezei mureinei, celulele lipsite de perete celular sufer fenomenul lizei osmotice. La cocii Gram pozitivi, antibioticele -lactamice determin pierderea acizilor lipoteichoici parietali. Absena lor elimin controlul procesului autocatalitic, care n mod normal este limitat i dezagreg peptidoglicanul la situsuri strict localizate.

Antibioticele -lactamice sunt active numai asupra celulelor bacteriene tinere, aflate n faza de cretere. Penicilina poate fi administrat n doze mari fa de cele terapeutice, singurul risc fiind manifestrile alergice. Administrat oral, este degradat n cea mai mare parte, de HCl din stomac. De aceea se injecteaz intramuscular sau intravenos. Se absoarbe rapid n snge i este excretat rapid. Din acest motiv se asociaz cu procaina, care diminu excreia i i prelungete aciunea. Penicilina G se folosete pentru tratamentul infeciilor cu streptococi, meningococi, pneumococi, spirochete, bacili aerobi Gram pozitivi, Clostridium. Ii pstreaz activitatea n urin i se folosete pentru tratamentul infeciilor tractului urinar. Carbapenemii reprezint un grup de antibiotice cu efect bactericid, ce conin un antibiotic -lactamic i un compus ce mpiedic degradarea medicamentului n rinichi. Bacitracina (un peptid ciclic) mpiedic defosforilarea moleculei lipidice purttoare, ce transfer molecula de peptidoglican nou sintetizat, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Este toxic pentru rinichi i de aceea nu se administreaz sistemic, dar se aplic local pentru tratamentul leziunilor tegumentare i ale membranelor mucoase. Mecanismul aciunii vancomicinei const n blocarea creterii celulei, deoarece formeaz un complex cu D-ala-Dala din peptidul mureinic. Este activ numai fa de multe bacterii Gram pozitive, pentru c la Gram negative, peptidoglicanul nu este accesibil antibioticului. Nu selecioneaz mutante rezistente. Cocii Gram pozitivi (Leuconostoc) i Lactobacillus sunt rezistente pentru c lanul lateral al peptidoglicanului const din D-alanil-D-lactat, care are afinitate mai mic pentru antibioticele glicopeptidice. Cicloserina inhib competitiv formarea D-Ala din L-Ala i astfel stopeaz sinteza dipeptidului D-Ala-D-Ala. Este relativ toxic i se folosete pentru tratamentul infeciilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte medicamente. Fosfomicina este un inhibitor al piruvil-transferazei i astfel blocheaz sinteza acidului N-acetil-muramic. Cicloserina i fosfomicina se comport ca analogi ai precursorilor peptidoglicanului. Sunt molecule foarte hidrofile i ptrund n citoplasm pe calea sistemelor de transport pentru metaboliii nrudii: fosfomicina este anolog structural cu fosfo-enol-piruvatul, iar cicloserina este analog D-alaninei:

Fosfo-enol-piruvatul Cicloserina i fosfomicina inhib sinteza peptidoglicanului.

D-Cicloserina

D-Alanina

Alanina este un compus major al peptidoglicanului i al acizilor teichoici din peretele celulelor bacteriene Gram pozitive. O parte a alaninei parietale se gsete ca izomer D. Prezena D-aminoacizilor (D-Ala, acidul D-Glutamic) n peretele bacteriilor infecioase este considerat ca un mecanism protector fa de mediul intern al organismului gazd. Compuii analogi ai D-aminoacizilor au activitate antibacterian. Antagonitii D-alaninei (D-cicloserina i Ocarbamil-D-Serina) inhib selectiv ncorporarea D-alaninei n peptidoglican. D-alanina rezult din L-alanin sub aciunea racemazei. Incorporarea D-Alaninei este catalizat de D-Alanin-D-Alanin ligaz. Creterea E. coli n prezena Dcicloserinei i a sucrozei 0,32 M duce la formarea sferoplatilor, iar n celul se acumuleaz precursorii parietali. Sinteza proteinelor celulare nu este modificat. Adugarea D-Alaninei n mediul de cretere reverseaz efectele inhibitorii ale D-cicloserinei. D-cicloserina are dou grupri ionizabile. Este un antibiotic cu spectru larg de activitate, dar este mai eficient fa de bacteriile Gram pozitive dect fa de cele Gram negative. Este foarte important c D-cicloserina inhib creterea M. tuberculosis. O-carbamil-D-serina izolat dintr-o tulpin de Streptomyces are acelai mecanism de aciune: activitatea antibacterian este reversat de D-Alanin. Antibiotice antiribosomale (inhibitoare ale sintezei proteinelor*

Sinteza proteinelor implic 3 procese de recunoatere macromolecular: selecia ARNt iniiator; selecia codonului iniiator pe ARNm; interacia ARNm i ARNt iniiator cu ribosomul neangajat n sinteza proteinelor.

Primul eveniment al iniierii este legarea subunitii 30S de codonul iniiator al ARNm i formarea complexului de iniiere. La procariote, iniierea sintzei proteinelor se face prin legarea N-formil-metionil-ARNt. Dup legarea n polipeptid, N-f-Met este clivat sub aciunea peptidazelor. f-Met-ARNt iniiator ocup situsul ribosomal peptidil (P). Al II-lea complex aa-ARNt, ca i toate cele care urmeaz, se leag la nivelul situsului acceptor (A), unde are loc interaciunea dintre codonul ce specific aminoacidul urmtor i anticodonul din secvena ARNt. Formarea legturii peptidice ntre gruparea COOH a f-Met-ARNt legat la situsul P i gruparea NH2 liber a aminoacidului din situsul A, este catalizat de enzima peptidil-transferaz, component a subunitii 50S. Se formeaz un dipeptid legat la situsul A, n timp ce ARNt din situsul P este descrcat de aminoacidul corespunztor (fig. 79). Creterea polipeptidului cu un aminoacid se face prin clivarea acestuia de la ARNt situat n situsul P i legarea la aminoacidul din situsul A. Reacia de clivare-reunire (adic de formare a legturii peptidice) consum energie eliberat prin hidroliza GTP. La sfaritul reaciei, situsul A poart ARNt al celui de al II-lea aminoacid, de care este legat un dipeptid (f-Met i al II-lea aminoacid legat - o molecul de peptidil-ARNt). Situsul P, foarte apropiat de situsul A, accept complexul ARNt-peptidil (ARNt legat cu lanul polipeptidic n curs de biosintez). Translocaia ARNt la situsul P este nsoit de deplasarea coordonat a ribosomului de-a lungul secvenei de ARNm, cu distana egal cu un codon. Astfel, un alt codon este plasat n situsul A, care leag un alt aminoacil-ARNt, pe baza relaiei specifice codon-anticodon.

Fig. 79. Situsurile de aciune a antibioticelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Quinolonele inhib replicarea ADN. Rifampicina inhib transcrierea. Tetraciclinele inhib traducerea prin blocarea formrii complexului de iniiere. Aminoglicozidele ocup situsul acceptor al ribosomului i induc erori de citire a ARNm. Cloramfenicolul interacioneaz cu ARNr 23S al subunitii ribosomale 50S i inhib formarea legturii peptidice. Eritromicina i clindamicina se leag la subunitatea 50S i interfer cu procesul de translocaie a peptidului nascent, de la situsul acceptor (A), la situsul peptidil (P).

Unele antibiotice acioneaz selectiv asupra ribosomilor celulei procariote. Altele (de exemplu, cicloheximida) sunt active fa de ribosomii celulelor eucariote, iar o alt categorie sunt active fa de ambele tipuri de ribosomi. Unele sunt active asupra ribosomilor polisomali (puromicina, cloramfenicolul), iar altele blocheaz numai ribosomii liberi, de iniiere a catenei polipeptidice, pentru c situsurile lor de legare sunt restrictive i nu se pot asocia cu ribosomii polisomali (de exemplu, eritromicina). Unele antibiotice se leag de subunitatea ribosomal mic, iar altele se asociaz cu subunitatea ribosomal mare. Antibioticele cu aciune asupra ribosomilor sunt molecule complexe, adeseori avnd cicluri i grupri cationice, care favorizeaz interaciunile ionice cu ARNr. Spre deosebire de antibioticele care blocheaz sinteza mureinei la nivelul suprafeei externe a membranei citoplasmatice, cele care acioneaz la nivelul ribosomilor trebuie s ptrund n citoplasm.

Din punct de vedere chimic, majoritatea sunt aminoglicozide policationice, cu molecule polare. Ele au o regiune hidrofob mare, care uureaz difuzia prin stratul lipidic al membranei. Aminoglicozidele (streptomicina i kanamicina) au activitate bactericid dependent de concentraie. Sunt foarte solubile n ap i insolubile n solvenii organici i de aceea au o capacitate limitat de a traversa membranele lipidice. Aminoglicozidele cationice interacioneaz chimic cu antibioticele -lactamice. Rezultatul este deschiderea inelului lactamic i acilarea grupului amino al aminoglicozidei, cu pierderea reciproc a activitii antibacteriene. Aminoglicozidele interacioneaz ionic cu suprafaa extern a celulei i sunt transportate n celul. Sursa energiei este gradientul electrochimic al protonilor generai n procesul respiraiei. Cele cationice se leag de resturile ncrcate negativ ale LPS i de proteinele anionice ale membranei externe i nlocuiesc competitiv Mg2+ i Ca2+ care consolideaz LPS adiacente. Ele modific conformaia subunitii 30S a ribosomului polisomal, astfel nct crete rata erorilor de mperechere a codonilor cu anticodonii. Mesajul este tradus greit i se sintetizeaz proteine nefuncionale. Aminoglicozidele sunt active i fa de ribosomii liberi: asocierea antibioticului cu ribosomul liber blocheaz interaciunea acestuia cu ARNm (se blocheaz astfel formarea complexului de iniiere). Sensibilitatea la Str este dependent de subunitatea 30 S, pentru c ribosomii hibrizi formai din subuniti 30 S de la o tulpin Str rezistent i subuniti 50 S de la o tulpin Str sensibil, sunt Str rezisteni. Sensibilitatea la streptomicin este determinat de proteina S12. Streptomicina face ca ribosomul s citeasc greit ARNm i s insere greit aminoacidul. Ribosomul normal ncorporeaz fenil-alanina, ca rspuns la mesajul sintetic poli-U, dar streptomicina stimuleaz intens ncorporarea izoleucinei, a serinei i leucinei ca rspuns la mesajul poli-U. Schimbarea mutaional a unui singur aminoacid ntr-o protein a subunitii ribosomale 30S determin rezistena celulei la streptomicin, dar nu i la antibioticele care conin deoxistreptamina ca grup lateral ataat heterociclului complex, deoarece ele se asociaz cu ambele subuniti ribosomale. Rezistena la aminoglicozide este rezultatul modificrii moleculelor sub aciunea enzimelor bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Enzimele sunt codificate de plasmide sau aparin unor transpozoni: - fosforilarea dependent de ATP, a unui grup OH, sub aciunea unei fosfotransferaze; - adenilarea dependent de ATP, sub aciunea unei nucleotidil-transferaze; - acetilarea dependent de CoA, a unui grup amino, sub aciunea unei acetil-transferaze. Aminoglicozidele modificate de enzime se leag cu afinitate sczut de ribosomi i apare rezistena chiar la concentraii mari de antibiotice. Macrolidele (eritromicina, lincomicina i clindamicina) penetreaz greu n celula Gram negativ. Se asociaz cu ribosomii liberi, dar nu cu ribosomii polisomali. Se leag cu subunitatea 50 S i interfer cu procesul de translocaie a polipeptidului nascent, producnd disocierea peptidil-ARNt de ribosom. Dei unele antibiotice care interacioneaz cu ribosomii liberi blocheaz complexul de iniiere, eritromicina stopeaz sinteza proteic numai dup ce s-a sintetizat un polipeptid scurt. Unele antibiotice policiclice mari se leag cu subunitatea mare a ribosomului i blocheaz legarea factorilor de elongaie EFTu (Elongation Factor Thermo unstable) i EFG (Elongation Factor G, implicat n translocaia peptidului nascent). Acidul fusidic este bacteriostatic, dar la concentraii mari poate fi bactericid. Are o structur molecular de tip steroidic. Spre deosebire de ali inhibitori ai sintezei proteice, nu se leag direct de ribosomi, ci formeaz un complex stabil cu guanozin-trifosfatul i cu factorul de elongaie G. Sinteza proteic bacterian depinde de translocaia peptidilARNt de la situsul acceptor ribosomal, la situsul peptidil. Translocaia necesit factorul G de alungire proteic i hidroliza GTP. Acidul fusidic are capacitatea de a stabiliza complexul ribosom-factorul G de alungire GTP fosfat anorganic, inhibnd hidroliza GTP i blocnd alungirea catenei polipeptidice nascente. Puromicina a fost izolat din filtratele de Streptomyces alboniger. Antibioticul este un aminoglicozid substituit, alctuit din 3 componente : - 6-dimetil-aminopurina - 3-deoxi-3-amino-D-riboza - p-metoxi-L-fenilalanina. Legtura glicozidic, n configuraie ca i n nucleozidele naturale, este clivat de acizi tari (HCl 1N, la 100o, timp de 10 min), condiii n care legtura amidic a aminoacizilor este stabil. Comparativ cu multe alte antibiotice, puromicina are un spectru deosebit de larg al activitii, ce const n inhibiia creterii. Puromicina este un inhibitor al sintezei proteinelor i inhib creterea tuturor organismelor : bacterii, plante, protozoare, animale. Principalul mecanism de aciune al puromicinei, ca agent inhibitor al sintezei proteinelor a fost definit ca rezultat al investigaiei mecanismului biosintezei proteinelor. Datorit analogiei structurale cu aminoacil-ARNt, un intermediar al sintezei proteinelor, puromicina produce terminarea prematur a creterii catenei polipeptidice. Puromicina elibereaz polipeptidul n cretere din complexul

ribosom-ARNm, producnd o rupere a legturii ester ntre gruparea COOH a polipeptidului i gruparea OH a adenozinei din ARNt. Clivarea se datoreaz faptului c peptidul este transferat de la ARNt la puromicin. Datorit stoprii sintezei proteinelor, efectul puromicinei const n oprirea creterii celulei. Efectul este predominant bacteriostatic. Sinteza ADN i ARN continu pentru un timp la o rat normal sau aproape normal, dar sinteza proteinelor este inhibat imediat. {n celulele mamaliene, inhibiia sintezei proteinelor este reversat rapid dup ndeprtarea puromicinei. Deoarece puromicina este un analog al adenozinei, este posibil ca regiunea aminonucleozidic a moleculei s interfere direct cu metabolismul nucleotidelor. Puromicina are toxicitate crescut asupra organismelor superioare: nefrotoxicitate, stare de ru general etc. Bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile dect cele Gram negative. Diferenele de sensibilitate se pot datora nglobrii reduse a puromicinei. Ionii de Mg2+ mresc sensibilitatea la puromicin. Nu se folosete n terapia antiinfecioas, dar este util n studiul experimental al mecanismului sintezei proteinelor. Ea interfer cu sinteza proteic, producnd eliberarea prematur a polipeptidului nascent din asociaia sa cu ribosomul.

Puromicina Cloramfenicolul se leag reversibil cu subunitatea ribosomal 50 S i blocheaz alungirea peptidului nascent pe ribosom. Ribosomii 80 S nu sunt afectai, dar probabil ribosomii 70 S mitocondriali sunt sensibili la cloramfenicol. Rezistena se datoreaz, n general, inactivrii antibioticului catalizat de cloramfenicol-acetil-transferaz (CAT), efluxului activ sau permeabilitii sczute. Antibiotice care modific permeabilitatea membranei plasmatice Interaciunea unor antibiotice (gramicidina, polimixina, nistatina, amfotericina B) cu membrana plasmatic a celulei bacteriene produce creterea permeabilitii i pierderea proprietilor de membran selectiv. Rezultatul este moartea celulei prin liz osmotic. Polimixina actioneaz asupra membranei citoplasmatice ca un detergent cationic, avnd afinitate pentru gruprile sale cationice. Este singurul antibiotic cu aciune bactericid asupra celulelor aflate n faza staionar, dup ce au depit faza de cretere. Acioneaz asupra membranei externe, pe care o fragmenteaz, ceea ce explic aciunea sa bactericid i selectivitatea fa de bacteriile Gram negative (tabel nr. 5). Sensibilitatea diferitelor specii variaz foarte mult, ceea ce denot specificitatea interaciunii dintre antibiotic i microorganism. Antibioticele polienice (nistatin, amfotericina B) formeaz complexe cu sterolii din structura membranei plasmatice. Nu sunt active fa de bacterii, deoarece membrana lor nu conine steroli, dar inhib creterea micoplasmelor, deoarece conin steroli. Rezultatul interaciunii cu membranele celulelor sensibile este pierderea permeabilitii selective, pierderea ionilor de K+ i Mg2+ i diminuarea ratei sintezei proteinelor i a ARN. Toate tipurile de celule sensibile la aciunea antibioticelor polienice conin steroli. Sterolii sunt componente comune multor grupe de organisme: alge, protozoare, levuri, viermi, mamifere etc. Datorit efectului lor asupra permeabilitii membranei, antibioticele polienice mresc eficiena altor antibiotice. Antibioticele polienice se utilizeaz n tratamentul micozelor. Infeciile produse de fungi sunt mai rare dect cele bacteriene, rareori pun n pericol viaa i adeseori sunt lipsite de importan clinic. Tratamentul micozelor cu ageni chimici este limitat, datorit absenei specificitii aciunii lor. Cei mai importani ageni antifungici sunt cei ce acioneaz asupra membranelor celulare, iar dintre acetia, nistatinul i amfotericina B.

Tabel nr. 5: Antibiotice active asupra membranei bacteriene (adaptare dupa Topley si Wilsons, 1998): Clasa de inta specific Structura chimic antibiotice Polipepdide ciclice LPS membranei (Polimixina B, externe Polimixina E) Fosfolipidele membranei externe/interne

Gramicidinele

Fosfolipide

Gramicidina Tirocidina Fosfolipid

Amfotericina B este produs de Streptomyces nodosus. Mecanismul aciunii sale const n legarea de ergosterolul din membrana plasmatic a celulei fungice, a unor alge i a unor protozoare, dar i de celulele umane. Efectul este creterea permeabilitii membranei, astfel nct glucoza, K+ i alte molecule eseniale ies din celul. Amfotericina B se absoarbe puin din tubul digestiv i de aceea se administreaz prin injectare intravenoas. Rezistena fungic la acest antibiotic nu este cunoscut, dar efectele secundare sunt foarte frecvente i uneori severe. Nistatinul (Micostatin) este produs de Streptomyces noursei. Mecanismul de aciune este acelai ca i al amfotericinei B. Se administreaz local pentru tratamentul infeciilor cu Candida. Nu se absoarbe din intestin i se administreaz oral, numai pentru tratamentul suprainfeciilor intestinale, care adeseori sunt consecutive tratamentului cu antibiotice. Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici
Tabel nr. 6: Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici (dupa Topley si Wilsons, 1998): Clasa de Etapa de inta Structura chimic antibiotice biosintez specific

Novobiocina

Replicare

ADN-giraza
CH3 OH3C CH3 OO

CH3 O O OH CH CH3 CH3

HN CO NH2COO OH OH

CH2

novobiocina

Rifampicinele

Transcriere

ARNpolimeraza dependent da ADN

HC

CH3

rifampicina

Aminoglicozid Streptomicina, Kanamicina, Tobramicina)

Traducere

Subunitatea 30S ribosomal (perturbarea citirii ARNm)

H2C HO HO

NH2 O OH O HO

NH2 NH2 O CH2OH OH HO NH2

kanamicina

HOH2C HO HO

H3CHN

O H

OH CH3 H CHO O H

HN HO H2N C NH HN HO

C NH

NH2 O OH

streptomicina

Cloramfenicol

Traducere

Tretracicline

Traducere

Factor de elongare EG-F Inhibiia fixrii aminoacilatARNt. Inhibiia peptidiltransferazei. Factor de elongare EG-F Inhibiia fixrii aminoacilatARNt Inhibiia peptidiltransferazei.

O C H O2N C NH C CH2OH CHCl2

OH H

cloramfenicol
H3C OH N(CH2) OH

OH

OH

OH

CONH2 O

tetraciclina

Acid fusidic

Traducere

Factor de elongare EG-F


HO

CH3 H CH2 C CH3 O H HO CH3 CH3 CO CH3 CH2 CH C CH3

acid fusidic
CH3 H C 3 N O HO H3C H3C O OH OH CH3 O OH CH3 CH3 O CH3 O CH3 O CH2CH3 OH OCH3

Macrolide

Traducere

Situsul aminoacil (A) de pe subunitatea ribosomal 50S (perturbarea translocaiei)

H3C H3C

eritromicina

Lincosamide

Traducere

Inhibiia fixrii aminoacilatARNt Inhibiia peptidiltransferazei

CH3 N CH3 HO C H H7C3 CO NH C H HO O OH S CH3 OH

lincomicina

Rifamicina B este sintetizat natural, iar rifampicina este derivatul semisintetic cu cea mai larg utilizare clinic. Rifampicina este alctuit dintr-o grupare cromofor aromatic, inclus ntr-o caten alifatic. Ea se asociaz cu subunitatea B a ARN-polimerazei dependent de ADN i probabil chiar cu ADN n complexul de iniiere, blocnd astfel iniierea transcrierii i sinteza ARN. Antibioticul se folosete n terapia combinat a tuberculozei. Mutantele rezistente, cu subunitatea B a ARN-polimerazei modificat se selecioneaz repede.

Rifamicina

Actinomicina D (Dactinomicina) este format dintr-o grupare cromofor aromatic i un ciclu peptidic. Ea interacioneaz cu ADN i inhib replicarea i transcrierea. Gruparea aromatic se intercaleaz n dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rmne la suprafa.

Actinomicina D Novobiocina interfer cu sinteza ARN, deoarece inhib ARN-polimeraza dependent de ADN, iar griseofulvina inhib replicarea ADN, consecutiv interferenei cu polimerizarea nucleotidelor purinice. Cercetri recente sugereaz c novobiocina acioneaz asupra subunitii B a ADN-girazei (topoizomeraza II) care produce i menine starea supraspiralizat a ADN. Griseofulvina sintetizat de Penicillium griseofulvum a fost izolat ca un factor care produce dezvoltarea anormal (rsucirea) a hifelor fungice. Se folosete pentru tratamentul infeciilor fungice superficiale. Inhib creterea fungilor micelieni, dar nu este activ fa de bacterii sau levuri. Nu influeneaz creterea fungilor cu perei celulozici, dar inhib creterea fungilor care conin chitin. Griseofulvina influeneaz celulele fungice prin contact direct: creterea hifelor aeriene nu este modificat. Concentraiile mici produc rsucirea hifelor, ramificarea extensiv, micorarea distanei dintre pereii transversali, creterea diametrului. La concentraii mari de antibiotic, modificrile de cretere se amplific i hifele se rup. Injectarea intravenoas a griseofulvinei la obolan determin oprirea mitozei n metafaz, produce mitoze multipolare i nuclei anormali. n miceliile tratate cu griseofulvin scade coninutul de proteine, de acizi nucleici. Antibioticul interfer cu creterea fungic, probabil mpiedicnd incomplet formarea aparatului mitotic de diviziune.

Griseofulvina
Antibioticele care interacioneaz cu ADN produc efecte nediscriminatorii asupra ADN bacterian, viral sau al celulei eucariote.

CAPITOLUL VI VIROLOGIE Virusurile* sunt ageni infecioi de natur nucleoproteic, care se disting net de sistemele biologice prin caracteristici unice att structurale, ct i biochimice i funcionale. Particularitatea structural const n organizarea de tip acelular, iar cea funcional const n aceea c virusurile se exprim ca entiti genetice numai n interrelaiile cu sistemele biologice. Caracterele structurale i funcionale unice ale virusurilor reies indirect i din faptul c aceste entiti nu sunt incluse n nici unul din sistemele de clasificare a lumii vii.
Etimologic, denumirea de virus vine de la cuvntul grecesc ios, al crui sens este otrav de natur biologic. Prin latinizarea acestui cuvnt a derivat noiunea de virus. tiina care se ocup de studiul virusurilor se numete Virologie. Primele cunotiine tiinifice referitoare la virusuri dateaz de mai bine de un secol, ns preocuprile de ordin practic pentru tratarea sau prevenirea unor maladii virale, datorit caracterului lor evident i uneori foarte grav sunt cunoscute din cele mai vechi timpuri. Inc din anii 2500 . C., n China existau descrieri ale variolei umane, care se refereau att la simptomatologia ct i la caracterul transmisibil al acestei maladii. Aristotel (484-322) afirma c rabia (turbarea) este transmis prin muctura de cine. Preocuprile cu caracter strict aplicativ au devansat cu mult timp descoperirea propriu-zis i definirea pe plan conceptual a noiunii de virus. Recunoscnd c supravieuitorii epidemiilor de de variol erau protejai de infeciile ulterioare, chinezii au recurs la un procedeu empiric de vaccinare, prin inhalarea crustelor uscate din leziunile de variol (variolizare).Variolizarea s-a practicat timp de secole, ca o metod riscant de prevenire a variolei. In l796, Edward Jenner, dup ce a suferit o infecie variolic grav la vrsta de 7 ani, a introdus vaccinarea variolic, sesiznd c mulgtorii de vaci, care se infecteaz cu virusul cowpox devin rezisteni la infecia cu virusul variolei (smallpox). L.Pasteur (l822-l895) a fundamentat tiinific practica producerii i utilizrii vaccinului rabic, fr s evidenieze agentul infecios. El presupunea ca maladia este rezultatul infeciei animalelor i omului santos, cu un agent infecios de dimensiuni foarte mici, cu particulariti distincte, invizibil cu mijloacele optice ale timpului su i care nu poate fi izolat prin metodele aplicabile altor ageni patogeni. In l892, D. I. Ivanovski a artat ca boala infecioas denumit mozaicul tutunului este datorat unui agent transmisibil, invizibil la microscop i care strbate filtrele ce rein celulele bacteriene. Leziunile caracteristice sunt transmise n serie de la o plant bolnav, la cele sntoase, prin filtratele de lichid acelular extras din frunzele infectate. In l897, Beijerinck a confirmat filtrabilitatea acestui agent patogen, intuind natura sa deosebit i l-a considerat ca fiind un agent contagium, vivum, fluidum(contagios, viu, fluid, adic trece prin filtrele care rein bacteriile). A. Lwoff (l957) l consider pe Beijerinck ca fiind adevratul ntemeietor al Virologiei ca tiin. R. Dulbecco (1952) a cuantificat virusurile infecioase pentru om i animale, prin testul plajelor de liz. Preparatul viral diluat se folosete pentru a infecta monostratul celular, acoperit ulterior cu agar moale pentru a limita difuzia liber a virionilor. Rezultatul este liza localizat a monostratului i apariia plajelor. Aceiai tehnic se folosete pentru izolarea virusurilor dintr-un amestec heterogen.
*

Capitolul de virologie general i propune prezentarea particularitilor moleculare ale structurii virionilor, diversitatea genetic i modalitile de expresie a genomului viral, precum i mecanismele moleculare ale interaciunii virus-celul gazd n diferitele sale variante: litic, persistent sau oncogen. Modelul general de structur a virionului Descrierile referitoare la anatomia virusurilor se refer totdeauna la virion unitatea integrat de structur i funcie a tuturor virusurilor dotat cu proprietatea de infeciozitate a celulelor sensibile.

Din punct de vedere morfologic se disting urmtoarele tipuri de virioni (fig. 80):
virioni de form sferic (izodiametric) sau sferoidal (de exemplu, virusurile gripale, adeno- i herpesvirusurile, picorna i reovirusurile etc.); - virioni de form cilindric alungit, adic de bastona rigid sau flexibil (de exemplu, virusul mozaicului tutunului, fagii filamentoi); - virioni de form paralelipipedic, caracteristic poxvirusurilor (de exemplu, virusul vaccinal, virusul variolei etc.); - virioni cu form de obuz sau de cartu, la rhabdovirusuri; - virioni n form de cirea cu coad (de exemplu, fagii cu coad). Dimensiuni. Virusurile au dimensiuni submicroscopice. Cele mai mari sunt orthopoxvirusurile, de 240 300 nm, adic apropiate de dimensiunile celor mai mici bacterii, la limita de rezoluie a microscopiei optice. Bacteriofagii cei mai mari ating 200 nm. Cele mai mici sunt enterovirusurile, sub 30 nm diametru, adic de dimensiunile ribosomilor. Tehnicile de centrifugare analitic au fcut posibil obinerea unor cantiti mari de virus purificat. Organizarea intern a virionului i relaiile spaiale ale diferitelor componente structurale s-au evideniat prin studii de difracie cu raze x a preparatelor virale n stare cristalin.
-

Virionii posed doi constituieni structurali eseniali i definitorii: genomul i capsida. Virionii alctuii numai din genom i capsid, crora le lipsete nveliul extern, sunt caracteristici virusurilor nude (Picorna-, Reo-, Adenovirus). La virusurile nvelite, celor dou componente obligatorii se adaug o structur de suprafa, denumit peplos sau nveli extern. Peplosul poart pe suprafaa sa, subuniti proeminente (peplomere), denumite spicule, care sunt structuri supramoleculare de glicoproteine virale.

Fig. 80. Tipuri morfologice de virioni.

Majoritatea virusurilor au o morfologie specific, conferit de modul de aezare a capsomerelor n capsid. Unele virusuri au o capsid helical, ce const dintr-o nlnuire a moleculelor proteice (capsomere), ntr-o caten ce formeaz o spiral n jurul acidului nucleic. Alte virusuri au o capsid poliedric. Cel mai comun poliedru este icozaedrul. Virusurile nvelite au un aspect sferic, dei capsida lor poate fi icozaedric. Capsida viral Capsida este o structur proteic ce acoper genomul viral (capsa, grec = cutie). Cea mai mic unitate structural a capsidei este capsomera. La rndul ei, capsomera este alctuit dintr-un lan polipeptidic (fiind i unitate biochimic) sau dintr-un agregat de catene polipeptidice identice sau diferite. Capsomerele sunt cele mai mici uniti structurale vizibile la microscopul electronic. In general, la virusurile cu simetrie helical, capsomerele sunt uniti morfologice ale capsidei i n acelai timp sunt uniti de structur biochimic, fiind formate dintr-un singur polipeptid.

Fig. 81. Reprezentarea schematic a structurii virionului. A. Virion nud cu capsid helical. B. Virion acoperit de nveliul viral, cu nucleocapsid tubular i simetrie helical. nveliul este format dintr-un dublu strat fosfolipidic, n care sunt inclavate proteine virale sub form de spicule (peplomere). nveliul este tapetat la interior de o preotein de membran codificat de virus. C. Virion icozaedric format dintr-o regiune centrala (core) n care se gasete genomul acoperit de capsida icozaedric. Cele dou componente formeaza nucleocapsida. nveliul viral, prevzut cu spicule, acoper nucleocapsida.

La virusurile cu simetrie icozaedric, capsomerele sunt numai uniti morfologice, dar din punct de vedere biochimic sunt oligomere. In alctuirea lor intr mai multe uniti biochimice: cele cu structur de penton conin 5 subuniti (pentamere), iar cele cu structur de hexon conin trei subunitai (trimere). Polipeptidele din structura oligomerului pot fi identice sau diferite. Inveliul extern Inveliul extern sau peplosul (peplos, grec = manta) este o structur accesorie care acoper capsida unor virusuri. Peplosul este dobndit n timpul maturrii virionilor prin procesul de nmugurire, care, n general are loc la suprafaa celulei (herpesvirusurile se nvelesc prin nmugurire la nivelul membranei nucleare). Peplosul viral ntrunete toate criteriile de structur trilaminar ale membranei celulei animale: stratul fosfolipidic dublu, n care sunt inclavate proteine derivate din celul, precum i proteine codificate de virus. Fosfolipidele i proteinele de origine celular sunt diferite n funcie de tipul de celul n care a avut loc multiplicarea viral. Cele mai multe glicoproteine ale peplosului sunt codificate de genomul viral. Glicoproteinele codificate de virusuri sunt constituienii universali ai peplosului, dar diversitatea lor biochimic este foarte limitat (unul sau cteva tipuri pentru un virus). Greutatea molecular a glicoproteinelor este cuprins ntre l0 i l00 kDa, iar coninutul glucidic, ntre 5 i 40%. Aceste molecule sunt formate dintr-un ax polipeptidic, iar componenta glucidic constituie catene laterale de N-acetilglucozamin, manoz, fucoz, acid neuraminic. Glicozilarea proteinelor virale este catalizat de transferazele celulare. Cele mai cunoscute glicoproteine virale sunt spiculele, inclavate n peplos. Spiculele sunt prelungiri proeminente la suprafaa peplosului. Cele mai studiate sunt spiculele din nveliul mixovirusurilor, cu funcie de hemaglutinine i de neuraminidaz. Originea lor este mixt: componenta proteic este codificat de virus, iar glicozilarea este catalizat de enzimele celulare, n timp ce proteina parcurge drumul de la locul sintezei, pn la nivelul membranei. Lipidele (sub forma glicolipidelor sau a fosfolipidelor) sunt ncorporate n nveliul viral n timpul nmuguririi din membranele celulare. Inveliul viral are un coninut semnificativ mai nalt de colesterol, comparativ cu membrana citoplasmatic. Pentru majoritatea virusurilor nvelite (Herpes-, Toga-, Rhabdo-, Myxo, Oncornavirus), componentele moleculare ale nveliului sunt ncorporate n membrane celulare preformate. La Pox- , Iridovirus i lipofagi, nveliul viral se asambleaz ntr-un mod mai puin cunoscut. Semnificaia biologic a capsidei i a nveliului extern. Capsida ndeplinete un rol protector esenial pentru genomul viral, acoperindu-l integral i particip la procesele de adsorbie i fixare a virionului pe suprafaa celulei sensibile.

Inveliul extern consolideaz funciile capsidei, protejeaz nucleocapsida i asigur o structur mai compact a virionului. Spiculele proeminente pe suprafaa peplosului favorizeaz fazele de adsorbie i fixare a virionului n procesul infecios. Genomul viral. Organizare fizic Genomul viral este alctuit dintr-o molecul de acid nucleic ADN sau ARN. Niciodat virionii nu conin ambele tipuri de acizi nucleici. Virusurile al cror genom este alctuit dintr-o molecul de ADN aparin grupului dezoxiribovirusuri, iar cele care au ca genom o molecul de ARN formeaz grupul larg al ribovirusurilor. Unele virusuri, n diferite stadii ale ciclului de multiplicare, au alternativ, genom ADN sau ARN (retra-, hepadna, caulimovirusuri). Genomul viral poate avea o structur unitar sau informaia genetic este distribuit n mai multe segmente genomice legate prin interaciuni specifice. Moleculele de acid nucleic viral pot fi monocatenare sau dublu catenare, lineare sau circulare. Faptul c genomul unor virusuri este format dintr-o singur caten de ADN s-a dedus din observaia c determinrile cantitative ale adeninei nu sunt echivalente cu ale timinei, iar cantitatea de guanin nu este egal cu cea de citozin. In funcie de structura molecular a materialului genetic, virusurile cu genom ADN se mpart n trei clase: - virusuri cu genom dublu catenar, linear (adeno, herpes etc.); - virusuri cu genom dublu catenar, circular (papova); - virusuri cu genom monocatenar, linear (parvovirusuri). Toate genomurile ADN lineare, mono- sau dublu catenare au secvene repetate invers, fie la extremiti (adeno-), fie att la extremiti, ct i n interior. Moleculele genomice monocatenare, lineare(parvovirusuri) sau circulare (fagul fi x 174), au o tendin foarte accentuat de a se plia, formnd bucle dublu catenare n ac de pr, ori de cte ori secvenele de baze permit formarea unui numr semnificativ de perechi, reunite prin intermediul punilor de H. Circa jumtate din bazele de ADN monocatenar sunt legate prin puni de H, astfel nct molecula este foarte compact. Odat cu formarea parial a unei catene duble, molecula se pliaz. Starea pliat este favorabil unei mpachetri optime, deoarece permite o stivuire mai eficient a suprafeelor hidrofobe ale bazelor. Genomul viral dublu catenar, din punct de vedere topologic (al configuraiei spaiale) poate fi linear cu extremiti libere (adeno, herpes) sau cu extremitile legate covalent prin puni fosfodiesterice (poxvirusuri), circular nchis (papovavirusuri), cu diferite grade de supraspiralizare i corespunztor, cu un grad mai mare sau mai mic de condensare. La fagul , genomul este dublu catenar linear, cu cozi monocatenare complementare adezive la cele dou capete 5(sticky ends). Genomul viral are sarcin net negativ (este policationic) i este asociat cu dou tipuri de molecule care favorizeaz plierea (condensarea) i mpachetarea: poliamine (oligocationice) i proteine(policationice). Dintre poliamine, spermina i spermidina s-au identificat n virionii mixo-, herpes-, adeno-, poxvirusurilor, iar la fagul T 4 - putrescina i spermidina. Efectul de mpachetare este favorizat de legturile ionice ntre gruprile cationice ale poliaminelor i proteinelor i de gruprile polianionice ale acizilor nucleici. Proteinele asociate genomului sunt bazice de tipul protaminelor i histonelor i sunt cunoscute sub denumirea generic de nucleoproteine. Unele proteine asociate genomului sunt ARN-polimeraze. La unele virusuri ADN, la captul 5 al fiecrei catene este asociat o protein, care-i confer stabilitate, dar are i rol n iniierea replicrii genomului. Genomul viral i proteinele asociate formeaz regiunea central, electrono-dens a virionului. In mediul celular, dup ce genomul viral este eliberat, poliaminele induc modificri conformaionale ale moleculei genomice: relaxeaz i extind catenele genomice, favoriznd procesele de replicare i transcriere n celula infectat.

Majoritatea virusurilor infecioase pentru om i animale au ca genom o molecul de ARN monocatenar. Numai membrii familiei Reoviridae au ca genom o molecul de ARN dublu catenar. Peste 90% dintre virusurile infecioase pentru plante, aparin ribovirusurilor, genomul lor fiind alctuit dintr-o molecul ARN mono- sau dublu catenar.
Dimensiunile genomului ribovirusurilor sunt relativ uniforme, variaiile fiind n limita a 30 de ori: genomul virusului hepatitei delta are gr. mol. de 500 kDa (l678 nucleotide). Este cel mai mic genom viral i n ciclul multiplicrii este dependent de virusul hepatitei B. Cel mai mare genom ARN este acela al reovirusurilor (l5000 kDa).

Genomul dezoxiribovirusurilor are o scar de variaie dimensional mai larg, de la 1 la l85. Cel mai mic genom este al virusului hepatitei B (l000 kDa* 3 200 nucleotide), iar cel mai mare este al unui avipoxvirus (l85 000 kDa). Uneori, virionii unui preparat prezint variaii ale cantitii de ARN genomic. De exemplu, la paramixovirusuri, un virion poate s conin mai multe copii ale genomului viral. Alteori, particulele virale pot fi goale(lipsite de genom), sau includ numai un fragment de genom. Din genom lipsesc diferite secvene genice, uneori chiar cele care condiioneaz multiplicarea viral. Acetia sunt virioni defectivi i n ciclul multiplicrii sunt dependeni de prezena n celul, a unor virusuri helper(ajuttoare), care suplinesc defectele genetice ale virionilor defectivi.
*

Un Dalton este egal cu masa atomului de hidrogen, adic 1,672649 x 10-24 g. 1 kDa =1 000 D.

Genomuri virale ARN segmentate (divizate, multipartite) Unele ribovirusuri, infecioase pentru organismul animal, precum i altele infecioase pentru plante au genomul alctuit din mai multe segmente. Ribovirusurile cu genom segmentat, infecioase pentru om i animale (virusurile gripale, reo- i arenavirusurile) se caracterizeaz prin faptul ca toate segmentele genomului sunt ncorporate ntr-o capsid comun. Virusurile gripale au genomul alctuit din 8 i respectiv 7 segmente de ARN monocatenar. La Arenaviridae, genomul este format din dou segmente inegale (L = Large = 2 x l06 D i S = Small = l06 D). La reovirusuri, genomul are caracter de unicitate, fiind format din l0 segmente de ARN dublu catenare. La toate cele trei familii de virusuri, segmentele de ARN sunt distincte, adic se deosebesc prin secvena nucleotidelor i nu provin prin fragmentarea unei molecule mari. Dovada caracterului lor distinct este c moleculele nu hibrideaz unele cu altele, fiecare fiind transcris n ARNm specific i codific sinteza unei proteine. Ribovirusurile cu genom segmentat, infecioase pentru plante (Tobra-, Bromo-, Como-, Nepo-, Cucumovirus) au o particularitate distinct: segmentele genomului lor nu sunt ncorporate n aceiai capsid viral, ci sunt distribuite individual n capside separate. Pentru desfurarea ciclului de multiplicare viral este necesar infecia simultan cu toate particulele virale care constituie complementul genomic. Virusul mozaicului lucernei (alfalfavirus) are genomul alctuit din 5 segmente, repartizate n 4 tipuri de virioni: trei au form de bastona, fiecare avnd cte o molecul de ARN, iar al IV-lea, de form elipsoidal conine dou segmente de ARN. Genomul segmentat pare a fi avantajos, deoarece mesajele genetice mai mici sunt mai uor replicate i transmise n celula eucariot animal sau vegetal. Pentru virusurile cu genom segmentat repartizat n mai multe capside, faptul pare dezavantajos pentru iniierea replicrii, dependent de toate segmentele genomice ncapsidate separat, dar n realitate, n procesul infecios se elibereaz cantiti imense de particule virale, care asigur ansa transmiterii tuturor particulelor ce conin un complement genomic. Modaliti particulare de codificare a informaiei genetice la virusuri Virusurile prezint o diversitate proprie de sisteme genetice, nentlnit la sistemele celulare (bacterii, fungi plante i animale, luate la un loc). Diversitatea genetic a virusurilor este consecina succesului lor de a parazita toate grupele cunoscute de organisme. Raportul dintre gr. mol. a genomului i a produsului de sintez este de circa l0/l pentru genomul monocatenar i 20/l pentru cel dublu catenar. Valoarea foarte mic a acestui raport se datoreaz existenei unor mecanisme moleculare care permit utilizarea cu maxim eficien a informaiei genetice coninut n genom. Genomul de dimensiuni mici prezint avantajul de a fi transcris i tradus mai rapid i mai fidel. Datorit dimensiunilor mici ale genomului lor, virusurile fac economie de informaie genetic, utiliznd mai multe strategii de codificare. Noiunea de strategie semnific modalitile de organizare i funcionare a informaiei genetice care permit utilizarea informaiei genetice cu randament optim. l. Virusurile codific sinteza unei varieti foarte limitate de proteine. Capsida este format din molecule proteice de acelai tip, sau dintr-un numr mic de tipuri de proteine diferite, la care se adaug alte cteva tipuri de proteine asociate genomului. Asociate peplosului, se gsete un numr restrns de glicoproteine. 2. Pentru realizarea unor funcii proprii, unele virusuri utilizeaz molecule ce aparin total sau parial celulei gazd: de exemplu, enzima de replicare (ARN-polimeraza) a fagului Q-beta (un fag ARN) este alctuit din 4 subuniti polipeptidice, dintre care una este codificat de virus, iar celelalte trei aparin celulei. 3. Unele polipeptide virale ndeplinesc funcii multiple, avnd att rol structural (adic sunt proteine care intr n alctuirea virionului) ct i rol reglator. 4. In ciclul de multiplicare, unele virusuri utilizeaz informaia genetic a virusurilor helper. Virusurile helper suplinesc anumite deficiene funcional-replicative ale virusului defectiv. Virusurile defective nu se pot replica pn la stadiul de virus matur, deoarece le lipsesc genele codificatoare ale proteinelor structurale sau genele reglatoare ale

morfogenezei. De exemplu, adenovirusurile au funcia de helper pentru replicarea unor parvovirusuri (Adeno-AssociatedViruses AAV), iar virusul hepatitei B are rol helper pentru replicarea virusului delta. 5.Virusurile utilizeaz mai multe modaliti de transmitere a informaiei genetice de la genom la proteine, prin intermediul ARNm. Ele depesc condiiile restrictive ale cantitii limitate de informaie genetic, impus de dimensiunile reduse ale capsidei, prin existena genelor suprapuse. Suprapunerea genic semnific faptul c o secven de ADN poate s codifice mai mult dect o protein. Fenomenul suprapunerii se realizeaz pe dou ci: 1) ndirea acelorai secvene codificatoare ale moleculei de ARNm n succesiuni diferite. La virusurile infecioase pentru animale, informaia genetic are caracter discontinuu, aa cum este i a celulelor. Fenomenul de ndire (splicing) a secvenelor informaionale neadiacente de acid nucleic s-a identificat iniial la adenovirusuri* (Berget, 1977), dar acum este recunoscut ca fiind universal i are loc fie n timpul sintezei ARNm sau, n genomul eucariot, ca rezultat al rearanjrii genelor prin fenomene de transpoziie n timpul diferenierii celulare.
n celulele infectate cu adenovirusuri, moleculele de ARN care hibrideaz cu ADN viral sunt heterogene ca dimensiuni : aceleai sonde de ADN hibrideaz cu molecule lungi i cu molecule scurte de ARN. S-a dedus astfel, c genomul viral este transcris n molecule lungi, clivate ulterior n fragmente mai mici i reunite n molecule de ARNm de lungimi diferite (clivare-jonciune = sudare). S-a precizat pentru prima dat c gena este discontinu: are fragmente necodificatoare care alterneaz cu cele codificatoare. Apoi s-a constatat c discontinuitatea este o caracteristic general a genelor celulei eucariote. Genele adenovirale introno-exonice sunt transcrise de ARN-pol II n precursori ARNm. Precursorii sunt supui proceselor de prelucrare i maturare, n care secvenele intronice sunt eliminate i degradate. Clivajul are loc totdeauna la aceleai secvene semnal, dar jonciunea reunete un numr variabil de secvene codificatoare i n succesiune alternativ, astfel nct o gen (E1A) codific cel puin 8 proteine diferite.
*

ARNm este rezultatul unui proces de prelucrare a copiei primare (ARN premesager), ce const n eliminarea intronilor* i ndirea exonilor. La virusuri, exonii sunt asamblai n succesiuni diferite n molecula de ARNm, ceea ce diversific gama proteinelor codificate de o secven de ADN. Secvenele intronilor nu se gsesc n ARNm matur.
* Sunt dou posibiliti de eliminare a intronilor: - intronii nu sunt transcrii, deoarece ARN-polimeraza sare de la un exon la altul i ignor intronii - intronii sunt transcrii i rezult o copie primar (ARN-premesager), care e clivat pentru eliminarea intronilor, iar exonii sunt ndii. Procesul secionrii intronilor i ndirea exonilor este rezultatul aciunii unui aparat enzimatic, denumit spliceosom, care recunoate secvena GU-intron-AG exon. Secvenele GU-AG care delimiteaz intronul marcheaz situsurile de clivare. Semnalul este ns mai complex, deoarece aceste secvene apar cu o frecven prea mare pentru a constitui singure semnalul clivrii. Unele molecule de ARN mesager se ndesc singure. Moleculele de ARN au activitate ribozimic i intronii se elimin fr intervenia aparatului enzimatic al spliceosomului. Reacia nu este pur enzimatic, deoarece ARN nsui se modific. Se consider c o enzim adevrat rmne nemodificat la sfritul reaciei.

Echipamentul enzimatic care catalizeaz prelucrarea ARNm prin clivare i ndire este localizat n nucleu i n consecin, mecanismul ndirii genice poate fi activ numai la virusurile care au o faz nuclear a ciclului de replicare (adeno, herpes, papova, influenza). 2) Iniierea traducerii mesajului la dou sau chiar trei situsuri diferite. Unele virusuri schimb cadrul de citire a informaiei n timpul traducerii (frame shifting), iniiind sinteza proteic la noi situsuri de traducere a ARNm (open reading frames ORF). Prin iniierea traducerii mesajului la dou sau chiar trei situsuri diferite, aceiai secven de nucleotide este tradus n dou sau trei proteine distincte. Ribosomii au capacitatea intrinsec de a schimba cadrul de citire n timpul traducerii mesajului, pe care unele virusuri o exploateaz pentru a diversifica setul de proteine pe care le sintetizeaz. S-a sugerat c subunitatea 40S a primului ribosom angajat n traducerea ARNm se fixeaz la primul codon de iniiere a traducerii (AUG). Restul ribosomilor alunec pe molecula de ARNm, pn la urmtoarea triplet de iniiere AUG, de unde rencepe traducerea mesajului. De exemplu, n timpul traducerii mesajului pentru proteina gag a virusului sarcomului Rous, 5% din ribosomi i schimb cadrul de citire pentru a sintetiza proteina gag-pol. Secvene specifice ale ARNm viral favorizeaz alunecarea ribosomilor, astfel nct se sintetizeaz i mici cantiti de revers-transcriptaz (RT). In ciuda diversitii strategiilor funcionale ale genomului viral, universalitatea codului genetic nu este nclcat, dei anumii codoni pot avea o frecven superioar. Gene neeseniale. Calificativul de gen neesenial a genomului viral este complicat de faptul c un produs genic poate fi esenial n anumite condiii de mediu celular i nesemnificativ n altele. De exemplu, gena Tk de HSV 1 nu este esenial pentru replicarea virusului n celule care cresc i se divid cu o rat crescut, dar este esenial pentru replicarea genomului n celulele care nu se divid (neuroni).

Gena Tk permite ca timidina exogen s fie ncorporat n ADN. Dependena virusului de produsul genei proprii depinde de nivelul activitii enzimei n celula gazd. Un alt exemplu al unei gene neeseniale este gena codificatoare a glicoproteinei E3 (de la adenovirusuri). Gena poate fi inactivat prin mutaie i ciclul de multiplicare viral nu este modificat. Virusul mutant, in vivo, este mai puin virulent dect virusul de tip slbatic, iar leziunile tisulare sunt diminuate. Glicoproteina E3 este activ la nivelul la nivelul reticulului endoplasmic i stopeaz maturarea moleculelor CMH I pe suprafaa celulei infectate, astfel nct celulele Tc nu rspund eficient fa de celulele infectate cu virusul de tip slbatic. Se formeaz mai mult virus progen, iar patologia tisular este mai ampl. Importana geneticii virale. Studiile de genetic viral au adus o contribuie de o valoare deosebit la definirea unor noiuni fundamentale. Analiza modului n care este codificat i transmis informaia genetic, la virusurile infecioase pentru celula animal a dat o definiie mai flexibil noiunii de gen, ca rezultat al descoperirii c aceiai secven de ADN sau ARN poate s specifice (s codifice) mai mult dect un produs genic. Conceptul vechi, o gen = o enzim a fost nlocuit cu definiia mai corect, o gen codific mai multe polipeptide. Datorit suprapunerii genice, fenomen descoperit la virusuri, genomul nu mai poate fi considerat ca o succesiune linear de uniti codificatoare independente. Descoperirea caracterului discontinuu al informaiei genetice este de asemenea, rezultatul studiului genetic al virusurilor infecioase pentru celula uman i animal. Una din marile contribuii ale virologiei animale la dezvoltarea stiinelor biologice n general i a biologiei moleculare n special, a fost descoperirea i caracterizarea enzimei revers-transcriptaz a retravirusurilor. Pentru prima dat a devenit evident ca transferul informaiei genetice n sistemele biologice nu se face exclusiv pe filiera ADN --ARN --- proteine, ci n anumite situaii, informaia genetic poate fi transmis n sensul ARN --- ADN --- ARN ---proteine. A fost astfel completat axioma central a biologiei moleculare, care susinea transmiterea unidirecional a informaiei genetice. Pe de alt parte, enzima revers-transcriptaz a devenit unul dintre instrumentele foarte importante ale biotehnologiilor bazate pe clonare i secveniere. S-a lrgit cadrul de aplicare a metodologiei ingineriei genice. A devenit posibil propagarea copiilor ADN ale genomului viral ARN, precum i a copiilor ADN obinute prin reverstranscrierea ARNm celular. Semnificaia biologic a genomului viral. Informaia genetic viral conine determinani genetici care asigur desfurarea ciclului de multiplicare, n celula gazd sensibil: replicarea genomului, informaia genetic necesar devierii metabolismului celulei gazd, n sensul sintezei componentelor virale, genele pentru sinteza proteinelor structurale i reglatoare, precum i genele care asigur asamblarea i eliberarea virionilor progeni din celula gazd. Genomul viral condiioneaz patogenitatea i virulena viral i asigur potenialul de variabilitate a virusurilor. Variabilitatea este o proprietate esenial pentru propagarea virusurilor n natur. Astfel, spiculele de hemaglutinin ale virusului gripal prezint o variaie biochimic de la un sezon la altul, iar spiculele virusului imunodeficienei umane (HIV), cu rolul de a fixa virionul pe receptorii membranari ai limfocitului TCD4 au tendina spre o variaie biochimic accentuat. Definirea conceptului modern de virus Noiunea de virus a fost definit n cadrul conceptual actual de ctre A. Lwoff, pe baza stabilirii unor deosebiri distincte ntre virus i nevirus. Ca o consecin a unui mare numr de caractere discriminatorii fa de sfera viului (care semnific existena unor deosebiri absolute) pe care le posed n comun, s-a conchis ca virusurile formeaz un grup particular de ageni infecioi, reunii ntr-o categorie unic, distinct de lumea vie, fa de care asemnrile i afinitile sunt minime, iar diferenele i deosebirile sunt fundamentale. In tabelul urmtor sunt redate caracterele discriminatorii dintre virusuri i bacterii.
Caractere Unitatea structural Strile posibile de existen Virusuri Virionul Virionul sau virusul infecios matur (particula viral infecioas). Virus vegetativ, adic genomul viral liber n celula infectat, care poate fi replicat. Provirus, sau genomul viral integrat n cromosomul celulei gazd. Genomul viral i capsida, structuri eseniale i obligatorii, formeaz mpreun nucleocapsida. Bacterii Celula bacterian Celula bacterian (forma vegetativ), capabil de diviziune. Sporul bacterian (forma facultativ de difereniere). Relativ complex (structuri eseniale i accesorii): perete celular, membrana

Structura intern

Simetria la nivel molecular Acizi nucleici Proteine

Inveliul extern (peplosul), cu spicule hemaglutinante este o structur caracteristic numai virusurilor nvelite. Constant, de tip helical, icozaedric sau binar (mixt). ADN sau ARN, niciodat ambii, cu localizare exclusiv n genomul viral Numr fix de molecule de acelai tip (identice) sau aparinnd unui numr mic de tipuri diferite. Proteinele virale au rol structural (intr n alctuirea capsidei) i uneori au rol enzimatic (sunt proteine de replicare a genomului). De regul sunt absente. Se gsesc n peplosul viral sub forma glicoproteinelor i sinteza lor este catalizat de glicozil-transferazele celulare. De regul sunt absente. Se gsesc n peplos i provin din membrana celular la nivelul creia are loc nvelirea virionului. Absent. Uneori virionul conine enzime cu rol de replicare sau enzime care favorizeaz ptrunderea virionului sau eliberarea sa din celul. Lipsesc enzimele de biosintez sau cele productoare de energie. Absent

plasmatic, citoplasm, nucleoid, ribosomi, vacuole, incluzii, spor, aparat fotosintetic, capsul, flageli, pili, fimbrii. Absent ADN, n cromosom i plasmide. ARN, ca ARNm, ARNt i ARNr, n citoplasm. Numr mare de molecule, ce aparin la 2-3 000 de tipuri diferite, cu rol structural i funcional. Prezente n mod constant Prezente constant

Glucide Lipide

Echipamentul enzimatic biosintez i catabolism

Prezent constant

de de

Capacitatea de sintez a moleculelor cu potenial energetic ridicat Capacitatea de sintez independent a constituienilor chimici Capacitatea de cretere Capacitatea de diviziune Dependena de substratul viu pentru multiplicare

Prezent constant

Absent

Prezent

Absent Absent Se multiplic exclusiv n substratul celular viu, pornind uneori numai de la genom, iar alteori de la genom i de la enzimele de replicare

Prezent constant Prezent constant Multiplicarea celor parazite este independent de substratul viu, cu excepia rickettsiilor i chlamidiilor i pornete totdeauna de la ansamblul integrat al constituienilor celulari, chiar pentru cele dependente de substratul viu. Bacteriile parazite niciodat

Utilizarea sistemelor structurale i biochimice ale gazdei n cursul parazitismului intracelular: -sistemul enzimatic Lipmann* -ARNt ribosomii Parazitism absolut

Totdeauna

Constant

Absent

Tipul de organizare
8

Acelular

Celular

Sistemul enzimatic Lipmann cuprinde enzimele care convertesc energia potenial a moleculelor, n energie util; enzimele care catalizeaz sinteza proteic (cu participarea ribosomilor i a ARNt); componentele catenei de respiraie celular.

Caracterele enumerate n tabel relev cteva particulariti structurale i funcionale cu totul speciale, proprii exclusiv virusurilor. Conceptul de virus, definit pe baza nsumrii unui numr mare de criterii discriminatorii fa de celula bacterian, reflect o total lips de concordan i absena oricrei afiniti structurale i funcionale ntre virusuri i sistemul biologic n forma sa cea mai simpl celula bacterian. Natura virusurilor Virusurile sunt entiti infecioase complexe i organizate, deoarece conin dou componente eseniale: una genetic (acidul nucleic) i una proteic. Uneori, proteinele nu sunt eseniale pentru exprimarea proprietilor sistemului, pentru c acidul nucleic n stare pur este infecios. Caracterul nalt organizat al virionului rezult din faptul c relaiile spaiale dintre genom i capsid sunt definite i constante i deriv din simetria la nivel molecular. Virionii nu au echipament enzimatic propriu, productor de energie. Uneori, virionul conine enzime de replicare a genomului. Consecina este c virionul nu are metabolism, nu crete i nu se divide. Virusurile realizeaz complexe biologice numai n contextul procesului infecios n celula sensibil. In afara relaiilor cu celula gazd, virionul matur este o entitate inert. Deoarece nu au metabolism propriu, virusurile nu se multiplic, ci sunt multiplicate de celul, pornind numai de la genomul viral i nu de la ansamblul constituienilor structurali. Infecia viral este rezultatul ptrunderii n celul, a virionului sau numai a acidului nucleic viral. Pentru sinteza componentelor virale este utilizat aparatul structural i enzimatic al celulei infectate (ribosomii i enzimele catalizatoare). Instruciunile programului genetic viral sunt executate numai n celula vie. Starea de dependen total a replicrii virale de substratul celular viu, corespunde relaiei de parazitism absolut, fundamental distinct de cea a parazitismului obligat, caracteristic unor microorganisme patogene (Treponema, Rickettsia, Chlamydia etc.). Aceste bacterii preiau substanele nutritive din celula gazd, au propriul aparat de sintez a macromoleculelor componente, i pstreaz totdeauna integritatea structural. Diviziunea lor are loc pornind de la ansamblul integrat al structurilor celulare. In contrast, multiplicarea viral necesit, n esen, numai genomul viral, toate celelalte componente necesare multiplicrii fiind de origine celular. In acord cu concepia veche, virusurile sunt organisme primitive - contagium, vivum, fluidum aa cum le-a definit Beijerinck n l897). Concepia a dinuit datorit prezenei n structura virusurilor, a dou componente definitorii pentru lumea vie acizii nucleici i proteinele. Dar proprietile particulare ale sistemelor biologice nu sunt date de moleculele componente, ci de nivelurile superioare de integrare funcional a componentelor structurale. Dificultatea major a ncadrrii virusurilor n categoria sistemelor vii sau nevii, decurge din faptul c, n prezent nu exist o definiie unanim acceptat a vieii. Definiiile se reduc la o enumerare a proprietilor observabile ale unui organism, dar multe din aceste proprieti se ntlnesc i la formele de organizare ale materiei neanimate. Szent-Gyorgyi consider c viaa este o calitate a unor sisteme fizice, o expresie a interaciunilor dintre structurile care alctuiesc sistemul, dar este greu de definit. In sprijinul concepiei apartenenei virusurilor la lumea vie, a fost invocat procesul multiplicrii lor, considerat ca fiind analog multiplicrii celulelor bacteriene. Studiile ulterioare de biologie molecular, au evideniat diferenierea net, de fond, ntre multiplicarea viral i multiplicarea bacterian: virusurile se multiplic ntr-un substrat celular viu, pornind exclusiv de la genomul viral, dup modelul furnizat de informaia genetic nscris n genom. Dintre marii virologi, foarte puini susin ca virusurile sunt vii. Luria (l973) le consider vii, pornind de la un punct de vedere foarte original de a defini sistemele biologice: el consider c un sistem biologic (care are calitatea de viu) este o entitate care, dup ce a fost izolat i pstreaz o configuraie specific i prin aceasta, posibilitatea de a fi reintegrat n circuitul materiei vii. Din acest punct de vedere, virusul este un organism ntr-o msur mai mare chiar dect o celul din organismul unui metazoar. Viaa reprezint capacitatea de a reproduce un anumit tip de organizare specific i independent: dup Luria, o molecul de ADN, in vitro, este vie, pentru c i pstreaz configuraia, are o structur i o organizare proprie, un anumit grad de autonomie. Cei mai muli autori consider c ncadrarea virusurilor n lumea vie este imposibil, artificial sau forat. In evoluie, viul ncepe numai dup constituirea unui program genetic, dar proprietatea fundamental a viului este capacitatea de autoreproducere. Virusurile posed anumite proprieti ale sistemelor vii: au un program genetic, se disemineaz, sunt sensibile la aciunea factorilor de mediu, dar sunt lipsite de autonomie, adic de capacitatea de a se manifesta ca sisteme biologice

de sine stttoare. Lipsa de autonomie le plaseaz n afara sferei viului. Virusurile nu se reproduc ca sisteme autonome, ci sunt multiplicate numai de sistemele celulare. Rich A. (l980) caracterizeaz sistemele vii, n funcie de fluxul diferitelor elemente i procese pe care le desfoar. Sistemele biologice realizeaz un flux triplu: de energie, de materie i de informaie, care coordoneaz multitudinea reaciilor chimice. Virusurile sunt sisteme informaionale. Prin programul genetic, virusurile interacioneaz cu sistemele vii, fac schimb de informaie genetic, dar virionul matur n afara celulei este inert. Dup F. Jacob (l970), distincia dintre viu i neviu, o constituie raportul celor dou categorii de sisteme cu timpul. Organismele sunt indisolubil legate de timpul istoric, n sensul c sunt rezultatul unui proces istoric evolutiv. Nici una dintre structurile lor nu poate fi detaat de contextul istoric. Virusurile au un timp istoric al evoluiei proprii, legat intrinsec de gazdele celulare, conserv experiena trecutului i o transmit, ntocmai ca i fiinele vii. Probabil c la origini au ntrunit mai multe caracteristici ale viului, pe care le-au pierdut de-a lungul evoluiei. Corpurile nevii nu depind de timpul istoric. Dup Crick (l966), un sistem biologic trebuie s ndeplineasc trei condiii minimale: l)s aib capacitatea de cretere; 2)s aib metabolism (s fac sinteze moleculare i s produc energie); 3)s se autoreproduc. El consider c ncadrarea virusurilor n sistemele vii, nseamn a extinde proprietile lor dincolo de anumite limite. Virusul n afara relaiei sale cu substratul celular nu este viu, dar sistemul virus-celul are toate proprietile sistemului biologic. Monod (l97l) consider c sistemele biologice sunt singurele din univers, dotate cu urmtoarele patru proprieti definitorii eseniale: l)morfogeneza autonom (proprietatea de a se construi ele nile); 2)emergena (proprietatea de reproducere); 3)reproducerea la nivel molecular, cu caracter predominant nevarietar; 4)teleonomia (proprietatea de a avea o structur i o organizare adaptate supravieuirii individului i speciei). Virusurile nu ndeplinesc aceste criterii. Pentru A. Lwoff (l98l), organismul viu este un sistem ordonat i integrat, de structuri i funcii interdependente, capabil de metabolism, cretere i reproducere. Ceea ce determin complexitatea unui organism superior organizat, n raport cu un virus nu este complexitatea superioar a moleculelor sale, ci gradul mai nalt de organizare i integrare a acestor molecule. Insumnd aceste criterii, uneori complementare, prin care sunt definite sistemele biologice, concluzia este c unitatea fundamental (ce rspunde acestor criterii), care st la baza organizrii tuturor sistemelor biologice este celula. Dintre toate celulele cunoscute, bacteria reprezint cea mai simpl unitate de integrare i reproducere, care reunete calitile de organizare, autonomie i invarian, prin care se caracterizeaz sistemele vii. Celula bacterian constituie un minim vital, situat la frontiera lumii vii. Nivelul inferior celulei bacteriene se definete n termeni de chimie i de fizic, iar sistemele superioare, n termeni de organizare (F. Jacob, l970).
Pentru c virusurile nu sunt nici organisme, nici celule, ele nu sunt fiine vii. Virusurile sunt virusuri pentru ca virusurile sunt virusuri (A. Lwoff. 1962, l98l).

Simetria virusurilor Simetria este definit de aranjarea ordonat i repetat ntr-un ansamblu, a subunitilor sale identice ca form i mrime, dispuse n jurul unui plan sau al unui ax. Mult timp dup descoperirea virusurilor i dup acceptarea naturii lor nucleoproteice s-a considerat ca genomul este acoperit de o molecul proteic uria. Intr-o capsid de dimensiuni medii, intr circa 330 000 de aminoacizi. Dac fiecare aminoacid este codificat de trei baze, pentru edificarea structurii capsidei ar fi necesar un genom care s cuprind circa un milion de nucleotide. Dar nici cele mai mari virusuri nu au un genom de asemenea dimensiuni. In cursul sintezei unei molecule proteice att de mari, ar crete mult ansa ncorporrii greite a aminoacizilor, astfel nct moleculele proteice ar fi inutilizabile pentru morfogeneza viral. Ineficiena asamblrii ar fi un dezavantaj incompatibil cu cu perpetuarea virusurilor n natur. Watson i Crick (l956) au adus dovada c genomul viral, datorit dimensiunilor sale reduse nu poate codifica sinteza unei molecule mari* i nici sinteza unui numr mare de proteine diferite. Ei au presupus c n alctuirea capsidei intr un numr mare de molecule identice, dispuse dup o arhitectur riguros simetric. Ipoteza a fost verificat prin metode biochimice, de analiz a gr. mol. a proteinelor capsidale i a compoziiei lor n aminoacizi.
*

Avantajele folosirii subunitilor mici pentru a construi structuri complexe sunt multiple: reduce cantitatea de informaie genetic necesar; asamblarea i dezasamblarea pot fi uor controlate, deoarece subunitile se asociaz prin legturi multiple cu nivel energetic sczut; erorile n sinteza structurii sunt mai uor evitate, deoarece mecanismele de corecie pot opera n cursul asamblrii pentru a exclude subunitile malformate.

In natur exist exemple de structuri cu simetrie molecular: toate cristalele au moleculele componente aezate simetric. Ele au inspirat pe autorii modelului aezrii simetrice a moleculelor capsidei virale. In structura molecular a capsidei intr un numr fix de molecule proteice de acelai tip, sau un numr limitat de tipuri diferite, dispuse obligatoriu ntr-o aranjare simetric. Ca i n structura cristalelor, ele au o aranjare perfect ordonat. Watson i Crick au dedus c dintre toate tipurile de simetrie cunoscute, numai simetria helical i cea cubic, permit mpachetarea ordonat a subunitilor componente, realiznd simultan i condiia obligatorie a identitii ambianei lor chimice. La baza simetriei moleculare a cristalografiei geometrice st principiul echivalenei. Conform acestui principiu, oricare din componentele unei structuri cu organizare simetric, trebuie s se afle n ambiana unor componente echivalente. Deoarece elementele de construcie ale capsidei virale (capsomerele), uneori nu sunt perfect identice (unele sunt trimere, altele sunt pentamere), iar pe alt parte, moleculele mari sunt uor deformabile, principiul echivalenei este nclcat i se aplic principiul cvasiechivalenei. S-au descris trei tipuri de simetrie viral: - simetria helical (la virusul mozaicului tutunului, la mixovirusuri, paramixo-, rhabdovirusuri etc.); - simetria icozaedric (la polio-, adeno-, herpesvirusuri); - simetria mixt, la fagii din seria T par (capul are simetrie icozaedric, iar coada are simetrie helical). Simetria helical Simetria helical este definit de aezarea unitilor componente n jurul unui ax, care este supus, concomitent, unei micri de rotaie i unei micri de translaie, paralel cu acelai ax (micarea este similar unui urub). Capsomerele sunt aezate n mod repetat, avnd poziii rezultate din cele dou tipuri de micare simultan n jurul axului i paralel cu acesta, astfel nct definesc o suprafa cilindric, cu o structur helical (fig. 82). Unele virusuri au nucleocapside helicale flexibile, ceea ce le permite s dobndeasc o form sferic (izodiametric, dup ce sunt nvelite de peplos, sau o form linear flexuoas, dac sunt nude (de exemplu, unii bacteriofagi). Cele cu nucleocapsid rigid au form cilindric. Dintre virusurile cu simetrie helical, cu nucleocapsid rigid, cel mai cunoscut este VMT. Diametrul extern al cilindrului este de l8 nm, iar cel intern, de 4 nm. Lungimea cilindrului este de 300 nm. Capsida este alctuit din 2130 capsomere identice, formate la rndul lor dintr-o singur unitate proteic (sunt capsomere monomere), cu gr. mol. de l7,5 kDa, fiecare protein avnd l58 aminoacizi, a cror secven este cunoscut. Genomul su este o molecul de ARN monocatenar, linear, cu gr. mol. de 2 x l06 D, aezat n zona central a virionului, inclavat ntre capsomere. Configuraia spaial a genomului este o spiral cu diametrul de 8 nm (mai mare dect diametrul intern al cilindrului). Din aceast cauz, spirele de ARN genomic se inclaveaz i se inser printre moleculele proteice capsidale, deoarece acestea sunt deformabile, nefiind corpuri geometrice perfecte. Fiecare capsomer are raporturi spaiale cu trei nucleotide. Fiecare tur de helice a ARN conine 49 de nucleotide, care se gsesc n raporturi spaiale cu l6,3 molecule proteice, aezate helical. Unele virusuri nude, cu simetrie helical au aspectul unor filamente flexibile i o structur tubular mai lax (fagii filamentoi). O serie de virusuri infecioase pentru om i animale prezint o nucleocapsid cu un grad foarte accentuat de flexibilitate, astfel nct virionul ia forma sferic. Faptul se explic prin flexibilitatea individual a fiecrei capsomere, evideniat la paramixovirusuri. Cele mai reprezentative virusuri cu capsid helical flexibil aparin familiilor Orthomyxo, Paramyxo- i Rhabdoviridae.

Fig. 82. Reprezentarea schematic a unei poriuni din virionul de VMT.

Simetria icozaedric Virusurile cu simetrie icozaedric au fost considerate ca avnd o form sferic (izodiametric), deoarece pe imaginile electrono-optice, la o mrime moderat, aspectul lor este sferic. In realitate, aceste virusuri au un contur hexagonal, datorit capsidei lor poliedrice, cu un nalt grad de organizare, constituit din capsomere aezate dup o simetrie riguroas. Virionii cu simetrie icozaedric, n aparen de form sferic, sunt constituii din capsomere asimetrice (neidentice), aezate n jurul axelor de simetrie. Spre deosebire de VMT, la care unitatea proteic este n acelai timp i unitate de structur, la virusurile cu simetrie icozaedric, unitile morfologice vizibile la microscopul electronic (capsomerele) sunt alctuite din cteva (3-5) subuniti proteice. Ca urmare, ambiana fiecrei subuniti i legturile cu vecinele sale nu sunt perfect identice, ci aproximativ echivalente sau cvasiechivalente (Caspar i Klug, l962). Conturul hexagonal foarte regulat al virusurilor sferice, aa cum apare la microscopul electronic la mriri nalte sugereaz ideia c forma lor ar fi apropiat de aceea a unui corp solid cu toate feele identice, cu toate laturile i unghiurile egale. Din cele 5 corpuri solide euclidiene care rspund acestor condiii i anume, tetraedrul, cubul, octaedrul, dodecaedrul i icozaedrul, ultimul d un profil hexagonal al umbrei sale, n cele mai multe orientri ale fasciculului de lumin. Simetria icozaedric a virusurilor sferice a fost clarificat dup mai multe experiene i demonstraii intuitive. In microscopia electronic s-a utilizat pe scar larg, tehnica de umbrire a preparatului viral, adic acoperirea sa cu un strat monoatomic de metal (aur) pulverizat. Astfel, dimensiunile particulelor virale se mresc artificial. Metalizarea mrete densitatea virionilor la fluxul de electroni i evidenierea lor este mai uoar. Williams i Smith (l958) au demonstrat c umbrele proiectate de un icozaedru pe o suprafa plan pe care este aezat i iluminat din diferite unghiuri corespund exact imaginii electrono-optice a virusului Tipula iridescent (patogen pentru larvele de insecte) umbrit prin metalizare. Expuse la fluxul de electroni, particulele virale icozaedrice, umbrite, nu dau o umbr sferic, ci o umbr care sugereaz organizarea lor poligonal. Forma umbrei este diferit n funcie de incidena fasciculului de electroni, dar totdeauna sugereaz a fi dat de un poligon cu toate feele identice, cu toate laturile i unghiurile egale. Dintre cele 5 solide analizate, iluminate n aceleai condiii sub diferite unghiuri de inciden, umbra dat de virionii umbrii prin metalizare se aseamn cel mai mult cu umbra rezultat dup iluminarea lateral a icozaedrului. Icozaedrul este un poliedru regulat cu 20 de fee, toate triunghiuri echilaterale (eicosi, grec = 20), 30 de muchii (creste) i l2 vrfuri (vertexuri). El are cel mai nalt tip de simetrie, caracterizat ca fiind de tip 5: 3 :2, deoarece are 6 axe de simetrie rotaional de ordinul 2, 10 axe de simetrie de ordinul 3 i 15 axe de simetrie de ordinul 2.

Virusurile sferice prezint i ele o simetrie de ordinul 5: 3: 2, deoarece capsomerele lor stau pe /sau n jurul axelor de simetrie de tip 5: 3: 2 ale unui icozaedru. In natur exist exemple similare. De exemplu, simetria de ordinul 5 este cea mai frecvent la flori. Trepiedul unui aparat fotografic are un ax de simetrie de tip 3. O scar n form de spiral prezint o simetrie rotaional de tip 2 n jurul axului sau central. Construcia virionilor icozaedrici Descoperirea simetriei icozaedrice a virionilor sferici ridic o serie de probleme privind modul n care poate fi construit o astfel de structur. In acest sens s-au elaborat o serie de ipoteze, fr s se fi ajuns la o concepie unitar. Microscopia electronic a demonstrat n cazul virusurilor din aceast categorie, existena a dou tipuri de capsomere, avnd 5 i respectiv 6 laturi (pentoni i hexoni), rezultnd la rndul lor, din aranjarea smetric a unor uniti de construcie mai mici. Problema construciei particulei virale const deci, n a identifica modul n care capsomerele de form penta- i hexagonal se pot aranja simetric pentru a acoperi o suprafa nchis, alctuind un fel de cutie icozaedric (fig. 83). Incercnd sa explice aceast construcie, Caspar i Klug (l962) au recurs la unul din principiile de geometrie aplicat de arhitectul B. Fuller n construcia domului geodezic. In proiectul de plan (realizat n construcie), pentru cupola domului, Fuller a divizat suprafaa unei sfere n faete triunghiulare echilaterale, n raporturi cvasiechivalente, aranjate dup o simetrie icozaedric. Procedeul triangulrii sferei ofer soluia optim pentru asamblarea unei cutii nchise, construit din uniti identice de structur. Un grad comparabil de cvasiechivalene nu poate fi realizat prin nici un alt model de subdivizare a suprafeei unei sfere, deoarece creeaz tensiuni net superioare (fig. 88).

Fig. 83. a. Reeaua plan de triunghiuri echilaterale (izometrice). B. Prin plierea a douzeci de triunghiuri echilaterale, rezult icozaedrul . c. Sgeile simple indic direcia n care se face apropierea vertexurilor. d. Reprezentarea schematic a domului geodezic al lui Fuller. Suprafaa sa este alctuit din faete triunghiulare cvasiechivalente, grupate n hexamere sau pentamere, n jurul unor suprafee circulare mici.

Unitile moleculare identice ale capsidei, n acord cu ipoteza lui Caspar i Klug (l962) se leag specific i formeaz o structur stabil i simetric, deoarece exist un numr limitat de ci n care o anumit unitate poate fi legat de vecinele sale pentru a forma un numr maxim de legturi stabile. Cea mai simpl situaie este aceea ntlnit la cristale, care apar ca o reea periodic tridimensional, n care, fiecare unitate este n raporturi echivalente cu vecinele sale. In cazul particulelor virale, moleculele capsidale, dei identice, nu sunt n raporturi exact echivalente, ci numai cvasiechivalente.

Aezarea subunitilor de construcie n raporturi cvasiechivalente face posibil asamblarea unui numr redus de subuniti mai mari ntr-o capsid puin mai deformat, dar pstrnd simetria icozaedric. Pentru a nchide icozaedrul, sunt necesare dou tipuri de uniti de construcie: pentagonale i hexagonale. Cele hexagonale sunt aezate pe feele i pe muchiile icozaedrului, iar cele pentagonale, la vrfurile icozaedrului. Radiolarul Aulonia hexagona (descris de Haeckel) are scheletul calcaros, alctuit din uniti de form hexa- i pentagonal i probabil a inspirat pe autorii acestui model de simetrie (fig. 84). Relaiile dintre genom i capsid, la virusurile icozaedrice sunt greu de explicat. In unele cazuri, genomul viral n asociaie cu una sau cu mai multe proteine bazice, formeaz regiunea central (core) a nucleocapsidei cvasisferice. Alteori (la herpesvirusuri), genomul ADN este rsucit pe o structur format din proteine fibrilare, rezultnd o structur toroidal. La adenovirusuri, genomul are interaciuni ferme cu proteinele capsidale, cea ce confer stabilitate maxim structurii nucleocapsidice.

Fig. 84. Scheletul de siliciu al radiolarului Aulonia hexagona, avnd aspectul unui model hexagonal mbrcat pe o sfer. Printre ochiurile hexagonale ale reelei sunt intercalate pentagoane. n lipsa pentagoanelor, o reea hexagonal nu poate acoperi o sfer.

Cele mai importante familii de virusuri cu simetrie icozaedric, din punct de vedere practic (clinic) i teoretic sunt picorna-, adeno- i herpesvirusurile. Caracteristicile lor structurale i funcionale sunt prezentate sumar n acest capitol. Simetria icozaedric prezint avantaje funcionale importante, evideniate prin eficiena replicrii virale. Virusurile icozaedrice pot fi asamblate cu o mai mare economie de proteine, deoarece ofer posibilitatea mpachetrii i condensrii genomului ntr-un spaiu mai restrns, comparativ cu cele helicale. De exemplu, genomul ARN al virusului mozaicului galben al napului este acoperit de l80 de molecule proteice, dispuse dup o simetrie icozaedric, n timp ce genomul VMT, de dimensiuni echivalente este acoperit de o capsid alctuit din 2130 capsomere. Alte avantaje sunt legate de uurina asamblrii particulei virale i mai ales de stabilitatea structurii care rezult. Simetria binar Simetria complex sau binar este prezent n modul cel mai evident la bacteriofagii cu coad contractil (de exemplu, fagii din seria T-par, care infecteaz E. coli), a caror structur formeaz un adevrat dispozitiv pentru injectarea ADN n celula bacterian: capul are o simetrie icozaedric, n timp ce capsomerele cozii sunt ordonate dup o simetrie helical. Amnuntele referitoare la arhitectura molecular a fagilor vor fi prezentate ulterior n acest capitol. Multiplicarea virusurilor Multiplicarea este procesul complex n cursul cruia are loc transcrierea i traducerea informaiei genetice n proteine, replicarea genomului i asamblarea virionilor progeni. Procesul multiplicrii virale prezint particulariti care decurg din parazitismul absolut, de nivel genetic, al acestor entiti. Replicarea are loc exclusiv n celulele vii, care furnizeaz nu numai precursorii monomerici ai macromoleculelor, ci i ntregul dispozitiv celular efector (ribosomi, enzime activatoare ale aminoacizilor, ARNt, diferii factori solubili, sistemele generatoare de energie etc.). Celula infectat cu un virus constituie un complex viu complexul virus-celul n care se desfoar dou categorii de procese: - sintezele moleculare specific virale - diataxia viral. Termenul de diataxie(Lwoff, l98l) semnific punerea n ordine sau asamblarea moleculelor specific virale, n structuri virale. Multiplicarea viral este, n esen, rezultatul exprimrii programului genetic viral, datorit cruia, ordinea celular normal este nlocuit de ordinea viral. Informaia genetic viral deviaz metabolismul celulei. Dei celula poate asigura majoritatea funciilor replicrii virale, adeseori este necesar aciunea unor enzime virale existente n virion sau codificate timpuriu de genomul viral. Numrul genelor virale difer considerabil. Ele codific sinteza urmtoarelor categorii de proteine: - enzime pentru replicarea genomului viral (replicaze). Ele pot fi componente ale virionului matur (infecios) sau se sintetizeaz n celul, dup infecie; - proteine structurale, componente ale capsidei i peplosului; - proteine reglatoare, de dou categorii: a) cele care modific specificitatea aparatului de biosintez al celulei n sensul specificitii virale; b) proteine reglatoare ale morfogenezei virale. Multiplicarea viral (producerea particulelor virale progene) este condiionat de infecia fiecrei celule, in vivo sau in vitro, cu cel puin o particul viral. Practic ns, pentru a asigura infecia fiecrei celule a unei culturi i un grad foarte nalt de sincronizare a etapelor replicrii sunt necesare l0-l00 particule virale pentru fiecare celul. Calitatea unei celule sau a unui organism de a fi gazd pentru multiplicarea unui virus poart denumirea de sensibilitate. Pentru ca o celul s fie sensibil la infecie sunt necesare dou condiii: - virionul s se fixeze stabil de componente moleculare ale suprafeei celulei;

celula s permit desfurarea ciclului de replicare (s fie permisiv). Particularitile funcionale ale celulelor care condiioneaz desfurarea ciclului de multiplicare viral, au fost echivalate, prin analogie, cu factorii de cretere ai celulei bacteriene. Tipurile de celule i speciile de organisme pe care le poate infecta i n care se poate multiplica un virus, definesc spectrul su de gazd. Unele virusuri au spectrul de gazd foarte larg i se pot multiplica n celulele unor specii foarte diverse. De exemplu, arbovirusurile se multiplic n esuturile insectelor hematofage i sunt transmise vertebratelor, la care produc infecii. Unele rhabdovirusuri infecioase pentru vertebrate se multiplic n esuturile insectelor, dar i ale unor plante. Alte virusuri sunt foarte specializate i infecteaz cteva tipuri de celule ale unei specii. Multiplicarea viral se desfoar ntr-o serie de etape succesive, mai mult sau mai puin secveniale, dei o anumit faz se continu n faza urmtoare, astfel nct dup cteva ore de la infecie, ntr-o singur celul se pot ntlni majoritatea fazelor replicrii unui virus cu genom ADN. Multiplicarea viral propriu-zis este precedat de interaciunea virionilor cu substratul celular. Iniierea procesului infecios Evenimentul preliminar al multiplicrii este adsorbia particulei virale, ca o consecin a ciocnirilor ntmpltoare a virionilor aflai n suspensie, cu suprafaa celulei. Procesul adsorbiei este ineficient, uneori fiind necesare milioane de ciocniri favorizate de micrile browniene ale moleculelor din suspensie. Forele electrostatice au rol important n realizarea adsorbiei. Densitatea virionilor i a celulelor influeneaz decisiv eficiena acestui proces, care este reversibil. Fixarea ireversibil(ataarea) a virusului pe suprafaa celulei, presupune aciunea unui mecanism care stabilizeaz interaciunea, pn n momentul nglobrii virionului. Una din particularitile virusurilor i anume specificitatea lor pentru o anumit categorie de celule este n primul rnd o specificitate de fixare, condiionat de interaciunea unei proteine virale(ligand* sau antireceptor), cu un constituient normal al suprafeei celulare, care are rolul de receptor de virus.
Ligandul este orice molecul sau structur care mediaz interaciunea specific sau nespecific dintre un virus i celul sau dintre dou celule.
*

Rolul interaciunii specifice este demonstrat de faptul c acidul nucleic viral purificat este infecios pentru un spectru mai larg de celule. Gradul de specificitate al interaciunii virus-celul este diferit. Suprafaa celulelor vegetale este acoperit cu cear, pectin, dar mai ales cu un perete gros celulozic i nu are receptori de virus. Nu se cunoate nici un virus care s utilizeze receptori celulari specifici. Infecia celulei vegetale este condiionat de lezarea peretelui celulozic: virusurile sunt inoculate de vectori (artropode, nematode)care transmit virusul sau prin leziunea mecanic a celulei. Infecia viral n-are consecine patologice dac virusul nu se disemineaz de la celula infectat iniial (adeseori n frunze), la celulele nvecinate. Trecerea virusului de la o celul la alta este mpiedicat de pereii celulari. Dar celulele conin canale n peretele despritor (plasmodesmata), ceea ce produce un continuum intercelular. Diseminarea virusurilor la distan n esuturile plantei se face prin celulele perforate ale floemului. Interaciunea fag-bacterie este caracterizat printr-un grad nalt de specificitate (utilizat n scop practic pentru tipizarea fagic a tulpinilor bacteriene), iar aceea dintre virus i celula animal are un nivel intermediar. Uneori, ataarea virusului de celula animal este mediat de receptori foarte specifici, de aici decurgnd citotropismul, cu consecine majore asupra patogenitii virale. De exemplu, poliovirusul (un enterovirus) are specificitate de legare pentru celulele mucoasei intestinale i pentru motoneuronii din coloanele anterioare ale mduvei spinrii. In mod obinuit, ciclul se desfoar n celulele mucoasei intestinale, fr manifestri clinice, dar dup infecia motoneuronilor survine paralizia muscular. Se cunosc mai bine liganzii virali, dect receptorii celulari. Virionii nvelii se leag de receptorii celulari prin glicoproteinele peplosului, care adesea proemin sub forma spiculelor. Structurile de legare a virusurilor nude cu simetrie icozaedric sunt situate la vrfurile icozaedrului. Ele sunt polipeptide ale capsidei sau sunt proteine fibrilare proeminente la vrfuri (de exemplu, fibra pentonic a adenovirusurilor).

Definirea receptorului celular de virus este dificil, deoarece particula viral este un ligand de dimensiuni mari, ce interacioneaz cu o suprafa mare a celulei, la nivelul creia se gsesc molecule de legare specific i nespecific. Pentru ca o molecul membranar s aib rolul de receptor pentru virus, n primul rnd, trebuie s aib o densitate suficient de mare pentru a asigura interaciuni multiple cu ligandul viral. Pe de alt parte, virusul se poate lega de receptori diferii pe diferite tipuri de celule. Totui, s-au identificat receptorii celulari pentru cteva virusuri. Din punct de vedere biochimic, receptorii celulari pentru virusuri sunt glicoproteine, glicolipide sau glucide. Specificitatea de legare este conferit de o parte a unei macromolecule sau de catenele glucidice ale conjugatelor glicoproteice. Astfel, ligandul virusului influenza hemaglutinina (o glicoprotein a peplosului) se leag specific de resturile de acid sialic ale glicoproteinelor membranei citoplasmatice. Receptorul pentru acetilcolin, de la nivelul sinapselor neuroefectoare poate avea rol de receptor i pentru virusul rabic. nveliul HSV1 conine cel puin 9 glicoproteine. Cteva (B, C, D, H, L) mediaz legarea virionului de heparan-sulfat*, cu rol de receptor celular. Glicoproteinele B i D mediaz tropismul HSV1 pentru neuronii SNC.
Heparan-sulfatul este un proteoglican, o macromolecul alctuit dintr-o regiune central proteic, pe care se leag covalent catene laterale de glicozaminoglicani, formnd un monomer proteoglicanic. Mai muli monomeri se leag prin intermediul componentei proteice, de o molecul lung de acid hialuronic. Glicozaminoglicanii (MPZ acide) sunt polizaharide ce conin uniti dizaharidice nalt repetitive.
*

EBV produce mononucleoza infecioas, o maladie limfoproliferativ benign. Este singurul virus al familiei pentru care s-a identificat un receptor de mare afinitate: este glicoproteina membranar CD21 (sau CR2, adic receptorul pentru complement de tip 2, ce leag C3d). Receptorul CD21 are rol n activarea normal a limfocitelor B. n timpul activrii cascadei C, C3 este clivat n C3b, care se leag de complexele Ag-Ac. C3b este prelucrat proteolitic i rezult C3d. C3d ataat de complexul Ag-Ac, se fixeaz la limfocitul B, pe calea CR2. C3d este ligandul natural pentru CR2. Receptorul pentru HCMV pare a fi molecula CMH I. Receptorii celulari pentru virusurile nude cu simetrie icozaedric sunt mai puin cunoscui. Adenovirusurile se fixeaz prin intermediul fibrei pentonice, la o varietate de receptori celulari, inclusiv moleculele CMH I. Receptorii pentru Rhinovirusuri sunt moleculele intercelulare de aderen (ICAM-1). ICAM-1 se gsete pe celulele epiteliului cavitii nazale i pe multe alte tipuri de celule din organism. Are 5 domenii extracelulare omologe domeniilor Ig (D1-D5), un domeniu transmembranar i un domeniu citosolic i face parte din suprafamilia Ig. Cele 5 domenii sunt aezate linear. Funcia normal este de a lega integrina LFA-1 de pe suprafaa limfocitelor. Interaciunea LFA-1-ICAM-1 mediaz aderena dintre celulele epiteliale i limfocitele T care lizeaz celulele epiteliale infectate cu virus. Expresia ICAM-1 pe celulele epiteliale ale cavitii nazale este restrictiv n condiii normale, dar este indus de mediatorii inflamaiei (IL-1, IFN , TNF) eliberai dup infecia cu rinovirus, ceea ce uureaz diseminarea infeciei. Pe de alt parte, inducia expresiei ICAM-1 este important pentru localizarea limfocitelor la situsul inflamaiei. Receptori pentru HIV1. Molecula CD4 are rol de coreceptor pentru recunoaterea Ag, n asociaie cu moleculele CMH II, dar transmite i semnalul activator al celulei T. Celulele CD4 secret limfochine activatoare pentru limfocitele B i macrofage. CD4 se gsete i pe membrana celulelor liniei monocitmacrofag. Proteina CD4 este un polipeptid de 55 kDa al membranei. Regiunea extracelular conine 372 aminoacizi, ce formeaz 4 domenii, omologe cu ale moleculei de Ig. HIV infecteaz i celule CD4- : neuroni, astrocite. Utilizarea AMC specifici fa de diferite componente membranare a dus la identificarea sfingolipidului* galactozil ceramid (Gal C), ca un posibil receptor pentru HIV pe membrana neuronal.
Sfingolipidele sunt formate dintr-un aminoalcool cu 18 atomi de C(sfingozina). La gruparea NH2 a sfingozinei este legat un acid gras, majoritatea cu 24 atomi de C). Cele care conin o grupare glucidic se numesc sfingoglicolipide.
*

Sfingozina Celulele organismelor uman i animal au receptori pentru un numr mare de ageni infecioi. Teleonomic ns, moleculele cu rol de receptori nu sunt destinate legrii virionilor, ci ndeplinesc diferite funcii normale: de exemplu, unele au rol de receptori de hormoni. Moleculele care au rol de receptori de virus sunt polifuncionale. Virusurile mprumut diferite molecule ale suprafeei celulare, prin intermediul crora dobndesc accesul n celul. Numrul receptorilor de virus, pe suprafaa unei celule este cuprins ntre l0 000 i l00 000. Tropismul unor virusuri pentru anumite celule sau esuturi este determinat de specificitatea interaciunii cu receptorul: de exemplu, tropismul HIV-1 pentru limfocitele T i pentru macrofagele care prezint receptorul CD4 ; tropismul EBV pentru limfocitele B care conin receptorul CD21. Dar specificitatea i distribuia tisular a receptorilor nu poate explica tropismul celor mai multe ribovirusuri, deoarece adeseori infecia este abortiv: virionul este internalizat i genomul este dezvelit, dar multiplicarea este stopat ntr-o etap ulterioar, ceea ce sugereaz existena unor factori celulari, care condiioneaz sinteza macromoleculelor eseniale ale ciclului de multiplicare viral (ARN, proteine). De exemplu, virusul influenza se fixeaz de resturile de acid sialic ale glicoproteinelor i glicolipidelor, care au o distribuie ubicvitar n cele mai multe esuturi. Totui, infecia cu virusul influenza este limitat exclusiv la celulele epiteliale ale tractului respirator al omului i la modelele animale ale infeciei. Pentru aceste virusuri, tropismul viral este condiionat de existena receptorilor celulari i de starea de permisivitate a celulei. Virusurile se multiplic n celulele care nu pot s declaneze un rspuns antiviral mediat de IFN /. Ataarea de receptorii celulari este un proces reversibil. Dac nu se produce internalizarea, virusul poate s se detaeze (fenomen denumit eluie), de pe suprafaa celulei. Unele virusuri au mecanisme speciale de eluie. Detaarea virionilor ortho- i paramyxo- este mediat de neuraminidaz (NA), o esteraz care cliveaz resturile de acid sialic din catenele glucidice ale glicoproteinelor. Resturile de acid sialic rmn legate de HA i previn legarea de alt receptor. De aceea, se admite c rolul NA este de a desializa glicoproteinele pe msur ce ele sunt inserate n nveliul viral nascent. De cele mai multe ori, ataarea virusului determin modificri ireversibile n structura receptorului i n mod obligatoriu urmeaz internalizarea (nglobarea virusului n celul). Uneori ns, dup fixare, virionul se poate detaa i se reabsoarbe pe alt celul. Dup legarea virusului, receptorii celulari se modific. Astfel, glicoproteina CD4, dup interaciunea cu HIV se fosforileaz, o modificare esenial pentru nglobarea virionului. Inhibiia fosforilrii cu inhibitori ai protein-kinazei blocheaz nglobarea i virionii rmn la suprafaa celulei. Fosforilarea declaneaz semnalul reorganizrii citoscheletului. Chiar dac virusul nu ptrunde n celul, legarea sa de membrana citoplasmatic influeneaz activitatea celulei. De exemplu, legarea VEB de suprafaa limfocitului B poate iniia activarea acestuia. Ptrunderea virusului n celul(infecia propriu-zis) Faza de ptrundere sau de nglobare a virusurilor n celulele sensibile se desfoar dup mecanisme diferite, derivate din complexitatea structurilor de suprafa ale celulei i ale virionului (fig. 85). Peretele mureinic al bacteriilor Gram pozitive, complexitatea structural a peretelui bacteriilor Gram negative, precum i natura celulozic a peretelui vegetal constituie bariere foarte eficiente fa de infecia viral. Celulele vegetale sunt infectate numai dup leziunea mecanic a peretelui celulozic, iar fagii din seria T-par au un aparat complex, foarte specializat, prin intermediul cruia genomul viral este injectat n celula bacterian. Virusurile infecioase pentru celulele animale sunt nglobate n ntregime n celula sensibil, consecina direct a absenei peretelui celular. Ptrunderea virusurilor n celula animal, dup fixarea ireversibil se poate produce prin dou mecanisme fundamentale: endocitoza i fuziunea.

Mecanismul predominant prin care virusurile ptrund n celula animal este endocitoza (denumit i viropexie), un proces analog celui de pinocitoz, caracteristic virusurilor nude (adeno-, reovirusuri), dar i unor virusuri nvelite (influenza, rhabdo-, poxvirusuri). Interaciunea iniial a virionului cu receptorii din membrana celular nu este suficient pentru a declana endocitoza particulei legate, ci reprezint semnalul* pentru iniierea agregrii proteinelor contractile ale celulei i pentru formarea unor pseudopode.
Celulele (cu excepia fagocitelor profesioniste) au capaciti endocitare foarte limitate. Dup fixarea virionului de receptor este indus endocitoza, ce const n reorganizarea unor componente ale citoscheletului.
*

Formarea pseudopodelor uureaz interaciunile multiple ale suprafeei virionului cu receptorii celulei. Proteinele contractile ale citoplasmei se activeaz i realizeaz nchiderea particulei virale, ntr-o vacuol de endocitoz, denumit microvezicul sau pinosom tapetat cu clatrin*, printr-un mecanism similar nchiderii unui fermoar.
* Clatrina este o protein mare, oligomeric, ce formeaz o reea pe suprafaa intern a membranei plasmatice, favoriznd intruzia membranei i formarea unei vezicule tapetat cu reeaua molecular, care ulterior poate fuziona cu alte organite celulare.

Marginile libere ale membranei celulare intruzate, fuzioneaz i restabilesc integritatea suprafeei celulare, astfel nct virusul rmne inclus ntr-o vezicul de endocitoz. Vezicula pierde nveliul de clatrin i fuzioneaz repede cu mici cisterne de reticul endoplasmic neted i cu lizosomi. Se formeaz un endosom al crui pH se acidific sub aciunea unei pompe protonice din membran. Pe msur ce pH scade, proteinele capsidei sufer modificri de conformaie i expun un domeniu hidrofob ce determin fuziunea cu membrana endosomului. Acesta este mecanismul de ptrundere a virionilor nuzi, prin liza endosomului. Virusul eliberat din endosom este fie sub forma nucleocapsidei (adeno, herpes), fie sub forma nucleoproteinelor (enterovirusuri). Pentru virusurile nvelite, la pH acid al endosomului, nveliul viral fuzioneaz cu membrana endosomului, ceea ce favorizeaz eliberarea nucleocapsidei n citoplasm.

Fig. 85. nglobarea unei particule virale nude prin mecanismul endocitozei mediat de receptori.

Al II-lea mecanism de ptrundere, pentru unele virusuri nvelite, const ntr-un proces de fuziune a nveliului viral cu membrana citoplasmatic. Peplosul, la contactul cu membrana celular, se dizolv i rmne ncorporat n membran. La locul coalescenei celor dou structuri, se formeaz un canal, care permite trecerea virionului n citoplasm.

Fuziunea nveliului viral, cu membrana plasmatic necesit interaciunea proteinelor virale de fuziune ale peplosului, cu constituienii specifici ai membranei celulare. Fuziunea este modalitatea de ptrundere n celul, caracteristic virusurilor nvelite. Astfel ptrund n celul unele paramixo- i poxvirusuri. Paramixovirusurile conin, inclavat n peplos, o protein de fuziune (F), care mediaz fuziunea nveliului viral cu membrana celulei sensibile. Proteina F mediaz fuziunea celor dou structuri, numai dac este inclavat n nveliul fosfolipidic viral i dac este inut n contact strns cu membrana celular, prin intermediul hemaglutininelor.

Fig. 86. Unele virusuri animale nvelite intr n celul, fiind endocitate n vezicule tapetate cu clatrin. Vezicula de fagocitoz i pierde nveliul de clatrin i fuzioneaz cu lizosomii. Scderea pH-ului n vezicul determin un proces de fuziune a nveliului viral cu embrana veziculei endosomale i eliberarea nucleocapsidei n citoplasm.

Cele dou mecanisme de nglobare (endocitoza i fuziunea) nu se exclud reciproc. Acelai virus nvelit poate fi nglobat pe o cale sau alta, n funcie de substratul celular. Mai mult, cele dou mecanisme pot coexista frecvent pentru un virus dat, n raporturile sale cu o linie celular. Rareori, virionul ptrunde n celul, prin modaliti particulare, ce constau n liza local a membranei plasmatice, la contactul cu virionul. Se produce liza peplosului viral i a membranei celulare sau virionul trece intact prin brea membranar ; Decapsidarea este procesul de conversie treptat a virusului, din starea de virion complet, la starea de virus vegetativ (genomul liber n celula infectat), prin pierderea capsidei i, cnd este cazul, a nveliului viral. Dezagregarea capsidei este un proces puin cunoscut, datorit dificultilor de modelare experimental i se produce n trepte. La reovirusuri, decapsidarea se iniiaz nainte de contactul cu celula gazd, sub aciunea proteazelor intestinale i este incomplet, pentru c replicarea genomului este catalizat de o enzim asociat virionului. La picornavirusuri, capsida se dezagreg parial la suprafaa celulei, dup legarea de receptorul celular. Cel mai adesea, decapsidarea are loc n vezicula endosomal, sub aciunea proteazelor lizosomale i a pH acid. Capsida virusurilor herpetice i adeno se dezagreg la contactul cu porul nuclear. Dezvelirea virusurilor din grupul pox se face n dou etape: nveliul extern este degradat sub aciunea enzimelor citoplasmatice, iar dezagregarea nveliului intern i eliberarea ADN este catalizat de produsele de sintez a unor gene virale timpurii. In vitro, dezvelirea virusurilor cu peplos este modelat sub aciunea detergenilor neionici (polieteri i esteri poliglicerici, de exemplu, Tween 80). Acetia interacioneaz cu componentele hidrofobe ale membranei i astfel peplosul este rupt i solubilizat.

Deplasarea intracelular pn la locul replicrii este necesar numai pentru virusurile care au sedii caracteristice ale replicrii. Cele care se multiplic n citoplasm ajung uor la sediul desfurrii procesului, imediat dup ce au strbtut membrana citoplasmatic. Virusurile care se multiplic n nucleu, necesit transferul de la locul ptrunderii n celul, pn n nucleu. Deplasarea lor pare a fi orientat de un tropism molecular ale crui mecanisme nu se cunosc. Reorganizarea unor componente ale citoscheletului* are un rol important n mecanismul transportului citoplasmatic. Nu se cunoate nici un acid nucleic viral transportat n nucleu ca molecul liber.
Citoscheletul este format din 3 elemente structurale: microfilamente, microtubuli i filamente intermediare. Microfilamentele sunt alctuite din subuniti de actin, iar microtubulii sunt formai din tubulin. Aceste elemente sunt comune marii majoriti a tipurilor celulare. Ele au rol structural, de transport i de mobilizare a organitelor. Filamentele intermediare sunt formate din subuniti de citocheratin i sunt specifice pentru starea de difereniere celular.
*

Adeno- i herpesvirusurile sunt transportate prin citoplasm sub forma nucleocapsidelor, n vacuola membranar de endocitoz, pn la contactul cu un por nuclear, prin care acidul nucleic este transferat n nucleu, iar capsida rmne la nivelul membranei nucleare. Proteinele virale asociate cu acidul nucleic au rol esenial n procesul de transport i ndeplinesc dou funcii: - furnizeaz semnale specifice i orienteaz transportul complexului spre nucleul celulei; - confer complexului o configuraie stabil, compatibil cu transferul prin porii membranei nucleare. Acizii nucleici monocatenari sunt transportai cu o eficien mai mare deoarece moleculele monocatenare sunt polare, mai flexibile i sunt tapetate cu proteina SSB (single strand binding). De exemplu, ARN de influenza este transportat n nucleu sub forma ribonucleoproteinei. Proteinele complexului mediaz transferul nuclear. Dezoxiribovirusurile i retravirusurile intr n nucleul celulei, fie ca particule ntregi (nucleocapside) fie sub forma complexelor nucleoproteice(ADN i proteinele asociate). Nu se cunoate mecanismul prin care nucleocapsida interacioneaz cu membranele nucleare. Transferul complexului nucleoproteic n nucleu se realizeaz probabil prin fuziunea nucleocapsidei cu membrana nuclear. Virusurile nude din grupul Papova ptrund n nucleu ca virioni ntregi, prin fuziunea nespecific a veziculei de endocitoz, cu membrana nuclear extern, dup care, virionul sau numai complexul nucleoproteic trece n nucleoplasm, prin fuziunea vacuolei cu membrana intern. Tranzitul acestor virusuri n nucleu este rapid (virionii de SV 40 se gsesc n nucleu la l5 min. dup infecie) i se explic prin tropismul nuclear al proteinelor. Sinteza ARNm viral Existena mesagerilor specific virali este o condiie esenial i o restricie major pentru iniierea procesului de multiplicare. Virusul ofer aparatului de sintez al celulei, un ARNm pe care celula trebuie s-l recunoasc i s-l traduc n proteine. Generarea mesagerilor virali semnific nceputul subordonrii aparatului de sintez proteic i trecerea de la sinteza proteinelor celulare, la sinteza celor specific virale. Transcrierea este prima treapt a expresiei genelor virale i urmeaz ptrunderii nucleocapsidei n celul. Unele virusuri au enzime de transcriere asociate genomului i activitatea lor ncepe foarte curnd dup dezagregarea parial a capsidei. Alteori, chiar molecula genomic de ARN funcioneaz ca ARNm. In citoplasm nu s-a detectat activitate ARN-polimerazic, astfel nct genomul virusurilor care nu au transcriptaze proprii, nu poate fi transcris. Datorit acestui fapt, genomul ADN (adeno, herpes, papova) poate fi transcris n ARNm numai dup ce ajunge n nucleu. Poxvirusurile sunt o excepie. Ele au propria enzim de transcriere (ARN-polimeraza) pentru sinteza ARNm i se multiplic n citoplasm. Ribovirusurile se multiplic n citoplasm. Genomul viral ARN este transcris n ARNm de o enzim proprie de transcriere, ori ARN genomic funcioneaz i ca ARNm. Sinteza ARNm viral este catalizat de dou categorii de polimeraze: - ARN-polimeraza II celular, pentru virusurile a cror informaie genetic este transcris n nucleu (dezoxiribovirusuri); - ARN-polimeraza viral, pentru cele care se multiplic n citoplasm (poxvirusuri i ribovirusri). Cele dou tipuri de polimeraze au omologii extinse ale secvenei de aminoacizi, inclusiv ale secvenei Gly-

Asp-Asp. Acest tripeptid se gsete chiar i n ARN-polimeraza fagic i n reverstranscriptaz. De aceea se consider c are rol n recunoaterea matriei de acid nucleic. Cele mai multe molecule de ARNm viral sunt monocistronice, adic sunt traduse ntr-o singur molecul proteic. Sinteza ARNm la dezoxiribovirusuri Toate genomurile ADN lineare, mono- sau dublu catenare au secvene repetate invers, fie la extremiti (adeno-), fie att la extremiti, ct i n interior. Genomul viral ADN se disociaz de proteinele specifice de mpachetare, acestea fiind nlocuite de histonele celulei. Astfel, ADN dobndete o structur nucleosomal, asemntoare cu a ADN celular, favorabil proceselor de replicare i transcriere. Sinteza ARNm este rezultatul transcrierii unicei catene, la cele cu genom monocatenar, sau a uneia dintre catene, la cele cu genom dublu catenar. La majoritatea virusurilor cu genom ADN, se disting dou faze ale transcrierii: timpurie i tardiv. O mic parte a genomului, este transcris n ARNm timpuriu, necesar sintezei proteinelor precoce. Cea mai mare parte a genomului este transcris ulterior, n ARNm tardiv. Cele dou etape ale transcrierii sunt separate n timp, de momentul replicrii genomului viral. ARNm timpuriu i ARNm tardiv sunt transcrise de pe catenele genomice opuse. Reglarea cantitativ a sintezei proteinelor timpurii i tardive se face posttranscriere, prin intermediul ARN antisens. In faza timpurie a infeciei productive se acumuleaz preponderent copiile catenei timpurii, care sunt traduse n proteine timpurii. In faza tardiv a ciclului de multiplicare, ARN polimeraza II transcrie copii multiple ntregi ale catenei opuse, din care, prin clivare rezult ARNm tardiv i moleculele de ARN antisens. Prin asocierea moleculelor de ARNm cu ARN antisens se formeaz ARN dc i astfel ARNm timpuriu este inactivat. ARN dc s-a identificat cu anticorpii specifici marcai cu fluorocromi, n celulele infectate cu virusuri ADN (adeno, HSV, polioma, SV40, vaccinal) Dezoxiribovirusurile infecioase pentru celulele eucariote, au informaie genetic discontinu, deoarece, pentru a face economie de informaie genetic, secvenele codificatoare ale unei proteine (exoni)se ndesc ntr-o succesiune alternativ. O secven necodificatoare pentru sinteza unei proteine, va avea rol de exon pentru ARNm al altei proteine. Consecina direct este c transcrierea genelor se face, iniial, ntr-o molecul de ARN premesager, ce va fi prelucrat ulterior de aparatul enzimatic al celulei. Copiile de ARNm sunt rezultatul unui proces de prelucrare prin clivare i ndire alternativ (splicing). Ulterior sunt supuse altor modificri: adugarea secvenei de poli-A (l00-200 de resturi) la captul 3 i metilarea captului 5(bonetare). Bonetarea este esenial pentru stabilirea interaciunii ARNm viral cu subunitatea ribosomal 40 S. Prelucrarea ARNm al dezoxiribovirusurilor este catalizat de enzimele celulare. Att transcrierea ct i prelucrarea ARNm au loc n nucleu. La poxvirusuri, transcrierea ARNm este catalizat de o ARN-polimeraz proprie virionului i procesul are loc n citoplasm. Moleculele de ARNm sunt monocistronice (conin informaia genetic pentru sinteza unei singure proteine). La dezoxiribovirusuri, transcrierea i traducerea informaiei genetice sunt evenimente separate spaial i temporal: transcrierea are loc n nucleu, iar sediul traducerii este citoplasma. Fac excepie poxvirusurile, la care transcrierea ARNm i traducerea au loc n citoplasm. Originea ARNm la ribovirusuri La ribovirusuri, ARNm are origini diferite n funcie de tipul de virus, de natura genomului su (ARN mono- sau dublu catenar), dar n special n funcie de polaritatea materialului genetic. Polaritatea acizilor nucleici este stabilit convenional, n raport cu posibilitatea traducerii lor directe sau indirecte, n proteine. ARN genomic, tradus direct n proteine, fr s necesite o etap prealabil de transcriere este considerat a avea polaritate (complementaritate) pozitiv. ARN genomic, care este mai nti transcris ntr-o molecul de ARNm complementar are polaritate negativ (fig. 87).

Fig. 87. Transcrierea i traducerea informaiei genetice la virusuri: (a) cu genom de polaritate pozitiv ; (b) cu genom de polaritate negativ

In ciclul de multiplicare a ribovirusurilor nu se face distincia funcional ntre ARNm timpuriu i tardiv, deoarece genomul viral funcioneaz alternativ ca matri pentru sinteza ARNm i a ARN genomic. Dup natura ARN genomic i dup raportul su cu ARNm, ribovirusurile infecioase pentru celulele animale, pot fi mprite n 6 clase: - clasa I cuprinde familiile Picornaviridae i Togaviridae, la care ARN genomic are rol de ARNm i codific sinteza proteinelor virale structurale i funcionale. Genomul acestor virusuri este infecios, pentru c funcioneaz direct ca ARNm pentru sinteza ntregului set de proteine virale, inclusiv a ARNpolimerazei, care catalizeaz replicarea genomului viral. Coronavirusurile au particularitatea c genomul lor, cu polaritate pozitiv, este transcris iniial de ARNpolimeraza viral, ntr-o copie de sens negativ, de aceiai lungime. Catena negativ, la rndul ei, este transcris n ARNm monocistronic, de diferite lungimi; - virusurile clasei a II-a (Paramyxo-, Rhabdo-, Filoviridae, virusuri viscerotrope Marburg, Ebola) au genom cu polaritate negativ. Genomul lor antimesager nu funcioneaz ca ARNm i nu este transcris de celul. Virionul conine o transcriptaz proprie, ARN-polimeraza dependent de ARN, care transcrie genomul de sens negativ, n ARNm monocistronic. Transcrierea este iniiat la un singur promotor*, dar ARN-polimeraza recunoate secvenele semnal i la sfritul fiecrei gene, este eliberat copia de ARNm monocistronic.

Promotorii sunt secvene de ADN care regleaz expresia regiunilor codificatoare adiacente.

virusurile clasei a III-a (Myxoviridae) au genom segmentat, monocatenar, cu polaritate negativ. Fiecare segment genomic este transcris n propriul su mesager. Fiind de polaritate negativ, transcrierea catenei genomice n ARNm este catalizat de o ARN-polimeraz dependent de ARN, existent n virion, analog funcional cu enzima de transcriere a altor ribovirusuri cu catena genomic ARN de polaritate negativ. ARN-polimeraza virusului influenza este defectiv din punct de vedere funcional: nu iniiaz sinteza ARNm i nici nu-l modific prin bonetare sau metilare intern. Aceste funcii sunt suplinite de ARN-polimeraza II a celulei, cea care catalizeaz iniierea sintezei i metilarea ARNm celular; - clasa a IV-a (Arenaviridae), au genom ARN monocatenar, format din dou segmente. Particularitatea sa funcional const n aceea c jumtatea 3 a fiecrui segment genomic are o polaritate negativ i este transcris n ARNm complementar, de o transcriptaz virionic, iar jumtatea 5 a fiecrui segment are polaritate pozitiv. Pentru jumtatea 5, ARNm rezult dup o transcriere dubl: mai nti se sintetizeaz o copie a genomului i ulterior, aceasta este transcris n ARNm. Deoarece informaia este nscris n direcii opuse n cele dou jumti ale fiecrui fragment, strategia de codificare a genomului este ambisens. La Bunyaviridae, genomul este de asemenea ambisens, deoarece att ARN genomic (de sens negativ), ct i catena complementar transcris ulterior (de sens pozitiv), funcioneaz ca ARNm; - clasa a V-a (Reoviridae), au genomul ARN dublu catenar, segmentat. Fiecare din cele l0 segmente genomice este transcris separat la ARNm, de o transcriptaz a virionului. Transcrierea este conservativ, deoarece catenele genomice parentale nu se separ i numai catena de complementaritate negativ funcioneaz ca matri. ARNm este monocistronic. ARN genomic rmne n regiunea central a virionului, iar copiile complementare sunt eliminate prin capsida parial dezintegrat. - clasa VI-a (Retraviridae), prezint particularitatea c genomul lor se replic printr-o copie intermediar de ADN. ARN genomic are complementaritate pozitiv, dar nu funcioneaz ca ARNm. ARN pur nu este infecios pentru c replicarea sa este dependent de revers-transcriptaza asociat virionului, care transcrie ARN genomic ntr-o molecul de ADN. ARNm este transcris din molecula de ADN, de ARNpolimeraza II celular. Biosinteza proteinelor timpurii Sinteza proteinelor cu specificitate viral este evenimentul esenial al ciclului de multiplicare viral i necesit existena unui mesaj viral generat n etapa transcrierii. Sinteza proteinelor virale semnific traducerea unui mesaj strin celulei i este supus unor restricii. O restricie major a sintezei proteinelor virale deriv din faptul c n celula infectat, exprimarea genelor virale este n competiie cu activitatea numeroaselor gene celulare funcionale. O singur copie a genomului viral, iniiaz programul de dominan asupra programului celular, de 104 106 ori mai mare, care este deja exprimat. Mesagerii virali sunt n competiie, pentru traducere, cu mesagerii celulari. Proteinele virale sunt sintetizate de aparatul celular de sintez proteic (aminoacizi, ARNt, ribosomi, enzimele catalizatoare). Aparatul de sintez proteic al celulei traduce numai mesaje unitare, i nu recunoate situsurile multiple de iniere a traducerii unui ARNm viral policistronic. La unele virusuri, ARNm este policistronic, copie a ctorva gene i este tradus ntr-o poliprotein gigant, clivat ulterior n proteine individuale de mrime adecvat. Poliproteina nu se evideniaz la electroforez n gel de poliacril-amid, deoarece este clivat chiar n timp ce se sintetizeaz. Inhibiia clivajului, prin ncorporarea analogilor aminoacizilor, sau prin creterea temperaturii face posibil detectarea ei la electroforez. Proteinele virale se sintetizeaz pe polisomii citoplasmatici. Pentru virusurile care se multiplic n nucleu, proteinele sintetizate n citoplasm trebuie s fie transportate n nucleu, pentru a-i ndeplini funcia specific: enzime de replicare a genomului sau proteine virale structurale. Proteinele virale precoce aparin urmtoarelor categorii: l) Proteine de reglare au rol de instituire i meninere a ordinii virale. Ele inhib sinteza macromoleculelor specifice celulei, prin modificarea specificitii sistemelor enzimatice de replicare, transcriere i traducere,

astfel nct sintezele macromoleculare ale celulei sunt stopate i metabolismul este orientat n sensul sintezei constituienilor virali. Proteinele virale cu rol n controlul expresiei genelor sunt multifuncionale ; 2) Proteine matriceale au rolul de a delimita viitoarea fabric de virus, adic teritoriul celular n care virusul se multiplic; 3) Proteine-enzime de tipul polimerazelor: ADN- i ARN-polimeraza, nucleaze (enzime de clivare), ligaze, proteaze. Virusurile codific serin-proteaze, cistein-proteaze i aspartic-proteaze, dar nu codific metaloproteaze. Serin-proteazele, la situsul activ conin o Ser reactiv, care mpreun cu Asp i His formeaz triada catalitic, ce cliveaz legturile peptidice. Cistein-proteazele au o diad catalitic format din resturi de Cys i His. Ambele categorii formeaz intermediari enzim-substrat. Aspartic-proteazele virale sunt asemntoare cu omologele lor celulare(pepsina, gastrina, catepsina D, renina), n general sunt active la pH acid i nu par s formeze intermediari enzim-substrat. Cele mai multe virusuri, n faza timpurie exprim o cantitate foarte limitat de informaie genetic. Numai poxvirusurile exprim 30-50 de funcii n faza precoce. Replicarea genomului viral In etapa timpurie se sintetizeaz proteine virale cu rol enzimatic, care condiioneaz procesul replicrii virale i implicit, evoluia complexului virus-celul gazd. Pentru replicarea ADN viral sunt utilizai precursorii din mediul de cretere a celulelor, deoarece ADN celular nu este degradat. Celula sintetizeaz nucleotide, din care se sintetizeaz acizii nucleici virali. Procesul replicrii genomului viral a fost studiat prin tehnica autoradiografiei, ce const n adugarea n mediul nutritiv, a precursorilor nucleotidelor, marcai radioactiv i detectarea lor ulterioar n ADN viral. Replicarea genomului viral ADN este dependent de aciunea catalitic a unei ADN-polimeraze. Virusurile mici utilizeaz ADN-polimeraza celular, iar cele complexe (adeno, herpes), codific sinteza ADN-polimerazelor proprii. Virusurile herpetice codific 7 proteine-enzime, cu rol n replicarea genomului. Replicarea ADN viral se face dup modelul semiconservativ. Mecanismul replicrii s-a studiat la toate familiile de dezoxiribovirusuri. Replicarea ADN la adenovirusuri La adenovirusuri, genomul este o molecul dublu catenar, linear, de 2000-2500 kDa (circa 36 kbp), cu secvene repetate invers, lungi de l00-l40 nucleotide, la ambele extremiti ale celor dou catene(secvena de baze la un capt al unei catene (de exemplu 5) este repetat n ordine invers pe catena opus, n acelai sens (5-3). Ele permit circularizarea moleculelor monocatenare care apar n timpul replicrii. La cele dou capete 5, catenele genomice sunt asociate covalent cu o protein de 55 kDa. Replicarea ADN, catalizat de ADN-polimeraza proprie este semiconservativ i asimetric. Asimetria const n faptul c numai una dintre catene este copiat ntr-o caten complementar. Replicarea se iniiaz la captul 3 al uneia dintre cele dou catene ale moleculei genomice parentale, la care se ataeaz o protein de 80 kDa, cu o secven asemntoare de aminoacizi cu a proteinei de 55 kDa de la captul 5. Proteina de 80 kDa de la captul 3 are rol de amors a replicrii. Sinteza ADN ncepe cu adugarea dCMP (deoxicitidin-monofosfat), la proteina amors, formnd o legtur esteric. Apoi ADNpolimeraza* alungete catena ADN n sensul 5 3, prin polimerizare succesiv la captul 3.
ADN-polimeraza nu iniiaz sinteza de novo a unei catene de ADN, avnd nevoie totdeauna de un primer, ci alungete o caten preexistent. De obicei, primerul este un fragment de ARN complementar fa de una dintre catene. Ulterior, secvena de ARN este nlocuit cu una de ADN.
*

La adenovirusuri, rolul de primer revine proteinei de 80 kDa, legat covalent la captul 5. Catena se alungete n direcia 5 - 3 pe catena matri i nu necesit fragmente Okazaki. Catena nascent deplaseaz catena preexistent de aceiai polaritate i mpreun cu catena matri de polaritate opus, formeaz o molecul dublu catenar. Catena deplasat are rol de matri pentru sinteza unei catene complementare. Dup acelai mecanism, se formeaz o molecul dublu-catenar, linear.

Virusurile din grupul Papova au genomul format dintr-o molecul de ADN dublu catenar, circular. Replicarea moleculei circulare se realizeaz dup modelul semiconservativ, bidirecional i este simetric. Dup acelai mecanism se replic ADN bacterian, precum i ADN din organite (mitocondrii, cloroplaste). Replicarea este precedat de despiralizarea celor dou catene, ca rezultat al inciziei succesive. Inciziile sunt reparate rapid dup ce s-a produs despiralizarea. Enzimele care incizeaz i repar rapid breele moleculei de ADN se numesc topoizomeraze. Rolul lor este acela de a relaxa ADN supraspiralizat n sens pozitiv sau negativ. Ele produc modificri ale configuraiei spaiale (topologice) a moleculei de ADN, prin modificarea gradului de spiralizare. Virusurile Papova nu au topoizomeraze proprii, ci utilizeaz enzimele celulare. Replicarea moleculei circulare ncepe la un punct fix, denumit originea replicrii, iar punctul n care catenele moleculei parentale se separ i sunt sintetizate catenele noi se numete bifurcaie de replicare. De la origine, bifurcaia de replicare se deplaseaz cu foarte puine excepii, n ambele direcii ale moleculei circulare. Din aceast cauz, o molecul de form circular, n cursul procesului de replicare are aspectul literei greceti theta (), iar mecanismul de replicare se numete theta. Rezultatul replicrii este o pereche de molecule circulare, denumite catenani. Catenarea este procesul de legare a dou molecule circulare de ADN ntr-o structur supramolecular, iar decatenarea este procesul invers, de separare a celor dou molecule. La herpesvirusuri, genomul este o molecul de ADN dublu catenar, linear, de l50 kbp. Molecula este alctuit din dou domenii cu secven unic: unul mai mare, notat cu L (Large), i altul mai scurt, S (Short). La Herpes simplex virus (HSV), fiecare secven este flancat la extremiti, de cte o secven de nucleotide repetate n ordine inversat (SRI), de cte 300-400 de baze. O particularitate a genomului HSV este orientarea ntmpltoare a celor dou secvene unice, astfel nct ntr-o populaie de virioni se gsesc simultan cele 4 variante de genom linear: P (Prototip), IL (Inverted L), IS (Inverted S) i ISL (Inverted S i L ). Ele apar ca o consecin a asocierii aleatorii n oricare dintre cele dou orientri a celor dou domenii genomice. Replicarea genomului se face prin intermediul moleculelor circulare. Dup ce ADN viral ajunge n nucleul celulei, secvenele terminale repetate n ordine invers (SRI) sunt supuse aciunii limitate a unei exonucleaze, la nivelul uneia dintre catene. Secvenele rmase se mperecheaz, formnd o molecul circular, dublu catenar, covalent nchis. Intr-o prim etap, replicarea moleculei circulare se face ciclic, dup modelul semiconservativ al cercului simplu. Ulterior, moleculele circulare generate n prima etap a transcrierii se replic dup modelul cercului rotativ. Un rol esenial n procesul de replicare l au helicazele*.
*

Helicazele sunt enzime care catalizeaz despiralizarea catenei duble a acizilor nucleici, prin disocierea legturilor de H i utilizeaz E eliberat prin hidroliza unui nucleotid 5-trifosfat (NTP), de obicei ATP. Energia eliberat n timpul hidrolizei NTP este utilizat pentru derularea AN, dei nu se cunoate modalitatea n care se cupleaz cele 2 reacii. Helicazele ADN s-au descris cu peste 20 de ani n urm, dar helicazele ARN s-au evideniat recent la virusuri, la bacterii, la levuri, pn la om. La virusuri, helicazele au rspndire larg, cu excepia retravirusurilor i a celor cu genom de polaritate negativ. Modularea structurii ARN este o etap esenial n numeroase procese fundamentale: sinteza ARN, transcrierea, replicarea i traducerea. La virusuri, helicazele au rol esenial n ciclul de replicare. Ele deruleaz ARN i ADN dc, dar i heteroduplexul ARN-ADN n timpul replicrii, transcrierii i traducerii genomului viral. Helicaza ar fi necesar oricrui virus, indiferent de natura genomului su, datorit existenei nucleotidelor complementare. La virusurile cu genom d c, ARN sau ADN, helicaza este necesar disocierii catenelor n timpul replicrii i transcrierii. La ribovirurile monocatenare, genomul se gsete tranzitoriu sub form dc: n timpul replicrii ARN de polaritate pozitiv, cnd aparatul de replicare trebuie s funcioneze, iar matria liber trebuie s fie permanent disponibil pentru un nou ciclu de replicare. Rolul helicazei ar fi acela de a disocia perechile intramoleculare de baze i de a preveni formarea perechilor extinse ntre matrice i catena complementar nascent. Virusurile cu genom mai mic de 5,8 kb nu codific helicaza.

Una dintre catenele moleculei circulare (catena leading*) este incizat la un situs specific, sub aciunea unei endonucleaze virale i rezult dou capete libere: 3OH i 5P. Cealalt caten rmne circular, nchis covalent. La captul 3 al catenei incizate (catena leading) este iniiat sinteza replicativ. Captul 3OH are rol de primer i crete prin polimerizarea nucleotidelor, catalizat de ADN-polimeraza. Catena circular funcioneaz ca matri rotativ.

Polimerizarea are loc totdeauna, prin alungirea unei catene primer n direcia 5- 3, ncepnd de la captul 3OH al catenei incizate. Cnd bifurcaia de replicare a parcurs cel puin odat catena circular cu rol de matri i catena incizat (leading*) este de dou ori mai lung n raport cu momentul iniial, ea poate fi copiat n sens invers, pe calea replicrii discontinue a fragmentelor Okazaki, de un alt complex enzimatic de replicare. Astfel, molecula nou sintetizat devine dublu catenar.
* Catena leading(to lead, englez = a conduce) este cea care expune captul 3OH liber i este transcris ntr-o caten complementar continu n direcia 5 -- 3.

Catena leading continu s se roteasc pe matria circular, fiind copiat succesiv. Se formeaz astfel mai multe molecule concatemere, n tandem, n conexiune cap-coad. Rezultatul intermediar al replicrii este un cerc cu o ramificaie lateral, care se aseamn cu litera greceasc sigma () i de aceea, replicarea dup modelul cercului rotativ se numete replicare sigma. Concatemerul poate fi separat de molecula circular prin clivare, sub aciunea unor endonucleaze. La rndul lor, capetele catenei incizate ale moleculei circulare sunt reunite sub aciunea unei ligaze i se reface continuitatea covalent nchis a structurii circulare dublu catenare. In procesul morfogenezei virale, concatemerii lineari sunt clivai n molecule dublu catenare lineare, de lungimea genomului. Replicarea dup modelul cercului rotativ are urmtoarele caracteristici: a)catena leading este legat covalent de catena parental; b)replicarea repetat pe matria circular genereaz o ramificaie lateral concatemer, legat covalent. Parvovirusurile au ca genom o molecul de ADN monocatenar, linear. Capetele moleculei au secvene palindromice*, repetate n ordine invers, care formeaz bucle n ac de pr. Regiunile palindromice terminale reprezint 5% din genom i sunt eseniale pentru replicarea acestuia, deoarece constituie secvenele primer pentru aciunea catalitic a ADN-polimerazei. Replicarea este catalizat de aparatul enzimatic al celulei. Intr-o prim etap, genomul monocatenar este convertit la forma dublu catenar, prin mperecherea bazelor complementare, denumit intermediar de replicare. Intermediarul dublu catenar este incizat ntr-o poziie opus situsului de iniiere pentru sinteza catenei complementare i genereaz un capt 3OH, de la care secvena repetitiv este alungit pe catena complementar cu rol de matri. Se sintetizeaz astfel, catene multiple cu polaritate genomic (pozitiv). Catenele nou sintetizate, cu polaritate genomic, rmn n configuraie linear i constituie genomul virionilor progeni sau se replic dup acelai mecanism, amplificnd rata sintezei catenelor genomice.
*Palindromul este o succesiune de baze, simetric fa de un punct central, astfel nct secvena bazelor este aceiai att n sensul 3 --- 5, ct i n sensul 5 --- 3.

Fig. 88. Reprezentarea schematic a replicrii genomului ADN viral.

Replicarea i transcrierea genomului viral ARN In citoplasma celulelor animale i umane, activitatea ARN-polimerazei nu este detectabil. Toate ARN-polimerazele dependente de ARN din celulele animale sunt codificate de ribovirusuri. De cele mai multe ori, la ribovirusuri, procesele de replicare i transcriere nu sunt separate n timp i spaiu, ci interfer, datorit faptului ca ARN genomic funcioneaz alternativ ca matri pentru copierea replicativ a ARN genomic sau pentru transcrierea ARN mesager. Replicarea genomului ARN monocatenar se face totdeauna dup urmtorul model: catena genomic este convertit la forma dublu catenar, sub aciunea catalitic a unei enzime de replicare (o ARN-polimeraz dependent de ARN), de origine viral, prin sinteza unei catene complementare de aceiai lungime. ARNpolimeraza se deplaseaz totdeauna n direcia 3 5 a matriei i sintetizeaz ARN n direcia de elongaie 5 3. Se formeaz o structur dc, denumit form de replicare. Forma dc de ARN este suportul sintezei replicative a ARN genomic i transcrierii ARNm. ARN-polimeraza nu necesit existena unui primer pentru a iniia sinteza catenei noi. Sinteza noilor catene are loc dup mecanismul semiconservativ asimetric. Din forma de replicare dublu catenar, catena genomic este deplasat progresiv de catena nou, n curs de sintez. Catenele nou sintetizate au aceiai secven de baze i aceiai polaritate ca i catena genomic. Sinteza catenelor noi este succesiv i complet, adic sinteza catenei urmtoare nu ncepe pn ce precedenta nu s-a eliberat. Forma de replicare dublu catenar, mpreun cu o caten nascent formeaz un intermediar de replicare. Catenele nou sintetizate, cu polaritate genomic devin suportul sintezei replicative sau se asociaz cu proteinele capsidale.

La virusurile care au ca genom o caten de ARN cu polaritate pozitiv (Picorna, Togavirus), catena de sens pozitiv a formei dc este dislocat de catena nascent a intermediarului de replicare, iar catena de sens negativ are rol de matri pentru sinteza copiilor de polaritate pozitiv, care ndeplinesc dou roluri: a) unele, dup prelucrarea prin bonetare*(metilare la captul 5), metilare intern i adenilare la captul 3, au rolul de ARNm;
* Bonetarea sau capping (cap, englez = bonet) semnific o etap a prelucrrii post-transcriere a moleculei de ARNm, ce const n adugarea la captul 5 a metil-G. Bonetarea este esenial pentru interaciunea moleculei de ARNm cu ribosomii n procesul traducerii informaiei genetice.

b) altele funcioneaz ca matrie pentru sinteza unor catene noi, de polaritate negativ, amplificnd rata sintezei ARN cu specificitate viral. La virusurile cu genom ARN de polaritate pozitiv, deoarece ARN genomic funcioneaz ca ARNm, ARN-polimeraza se sintetizeaz n celul, dup infecie, i nu este component a virionului. Din aceast cauz, ARN genomic este infecios (fig. 89).

Fig. 89. Modelul replicrii genomului viral ARN cu polaritate pozitiv.

La virusurile cu genom ARN de polaritate negativ (grupul Mononegavirales- paramixo-, rhabdo-, filovirusuri), mesagerii i catenele genomice sunt transcrise de pe matrie diferite: catena de polaritate negativ a formei dublu catenare funcioneaz ca matri pentru transcrierea ARNm monocistronici, iar cea de polaritate pozitiv este transcris n copii de lungimea genomului (fig. 90), de polaritate negativ, cu rol de ARN genomic. Replicarea se deosebete de transcriere prin modul n care progreseaz ARN-pol: continuu sau secvenial. Virionul conine o transcriptaz proprie o ARN-polimeraz dependent de ARN, care catalizeaz sinteza catenei de ARN complementar i a ARNm. De aceea, ARN purificat al acestor virusuri nu este infecios. Virusurile cu genom ARN se multiplic n citoplasm, cu excepia virusurilor gripale, la care, replicarea i transcrierea genomului au loc n nucleu. La mixovirusuri, transcrierea moleculelor cu rol de ARNm, ca i a celor genomice, este catalizat de aceiai ARN-polimeraz viral, dar enzima este defectiv funcional, deoarece alungete o caten preexistent, dar nu iniiaz sinteza de novo*.

* Polimeraza PB2 i proteina NS1 cliveaz capetele 5 bonetate ale mesagerilor celulari, pe care polimeraza PB1 le folosete ca primeri pentru sinteza replicativ i pentru transcrierea genomului viral. Alt explicaie a dependenei de nucleu rezid n aceea c mesagerii pentru sinteza proteinelor M1 i M2, respectiv NS1 i NS2 sunt prelucrai prin clivare i ndire.

Unele copii de polaritate pozitiv, cu rol de ARNm sunt bonetate (capping), metilate i poliadenilate de enzime celulare nucleare i sunt transferate n citoplasm, iar altele rmn n nucleu, cu rol de matri pentru sinteza ARN genomic (de polaritate negativ), pe toat durata procesului infecios.

Fig. 90. Modelul replicrii genomului viral ARN cu polaritate negativ.

Replicarea genomului ARN dublu catenar multipartit al reovirusurilor* (l0 segmente) este simultan cu transcrierea (fig. 91).
Reovirusurile se transmit pe cale oral i sunt prelucrate de proteazele digestive n lumenul intestinal. Dezvelirea implic parial, digestia proteolitic a capsidei externe. Proteoliza nu inactiveaz virusul, ci remodeleaz capsida extern. Virusul este activat, dup eliberarea proteinei majore 3, clivajul proteinei 1c i a HA 1. Virusul prelucrat proteolitic ader de celulele M i de enterocite. Rezult particule subvirale, identice cu cele obinute in vitro sub aciunea chimotripsinei.
*

Catena de polaritate negativ a fiecrui segment genomic este transcris de o ARN-polimeraz viral, n capsida parial deschis. Se sintetizeaz l0 tipuri de ARN cu polaritate pozitiv, care prsesc capsida prin dizlocarea capsomerelor de la vrfurile icozaedrului. Transcrierea este conservativ, deoarece ambele catene ale ARN genomic rmn n regiunea central, nedezvelit a virionului. Moleculele de ARN au dou funcii: a) sunt traduse n mesaje monocistronice i astfel se sintetizeaz proteine virale; b) se asambleaz cu o precapsid i au rolul de matrie pentru sinteza catenelor complementare, de polaritate negativ. Catenele perechi constituie genomul viral.

Fig. 91. Modelul replicrii genomului ARN dublu catenar al reovirusurilor.

Replicarea ARN genomic printr-un intermediar ADN este caracteristic retravirusurilor. Genomul lor este reprezentat de o caten de ARN, care, n fiecare virion se gsete n dublu exemplar, ceea ce confer caracterul diploid al genomului acestor virusuri. Nu se cunoate modul de asociere fizic a celor dou molecule de ARN. Genomul ARN al retravirusurilor este replicat printr-un flux de informaie genetic ce trece prin ADN, proces denumit transcriere invers* (fig. 92).
Fenomenul a fost descoperit de H. Temin i D. Baltimore (1970). Ei au tratat celulele infectate cu VSR, cu actinomicina D, un antibiotic care se inser ntre bazele nucleotidice i inhib transcrierea. S-a remarcat astfel c actinomicina D, inhib ciclul de multiplicare al retravirusurilor, dar nu inhib multiplicarea ribovirusurilor obinuite. Concluzia a fost c n ciclul lor de multiplicare exist o faz sensibil la actinomicina D, reprezentat de un intermediar ADN.
*

Singura funcie a ARN genomic este de a ndeplini rolul de matri pentru sinteza intermediarului de ADN n celula infectat. Celula nu posed o enzim care s ndeplineasc aceast funcie. Virionul conine o ADN-polimeraz dependent de ARN, denumit revers-transcriptaz (RT), precum i molecule de ARNt ncorporate din celul n procesul asamblrii, care ndeplinesc rolul de primer al transcrierii inverse, deoarece ADN-polimeraza nu iniiaz sinteza unei catene noi, ci doar alungete una preexistent.

Fig. 92. Succesiunea etapelor transcrierii i traducerii informaiei genetice la retravirusuri.

Procesul transcrierii ncepe timpuriu, deoarece RT se activeaz imediat ce virusul a ajuns n celula sensibil. Etapele replicrii ARN viral sunt urmtoarele: a) Legarea complexului molecular al RT, de ARN genomic viral; b) Sinteza unei copii de ADN complementar, catalizat de RT, care rmne legat prin puni de H, de ARN genomic. Rezult un hibrid molecular ARN-ADN; c) Digestia selectiv a ARN genomic, din hibrizii moleculari ARN-ADN, sub aciunea RN-azei H, sau chiar sub aciunea RT; d) Sinteza unei catene complementare de ADN viral. Astfel se formeaz o molecul dublu catenar de ADN viral, care este translocat n nucleul celulei infectate i se integreaz covalent n structura unui cromosom al celulei. ADN viral este integrat stabil i din punct de vedere structural nu se distinge de secvenele de ADN cromosomal. ADN integrat este transcris n dou tipuri de molecule de ARN: unele scurte (subgenomice), cu rol de ARNm i altele lungi, cu funcie genomic. La retravirusurile transductoare, copiile lungi de ARN ncorporeaz secvene oncogene (protooncogene), derivate din celula gazd. Activitatea ADN-polimerazic a RT necesit o matri de ARN sau ADN i, ca toate ADNpolimerazele cunoscute, nu iniiaz sinteza ADN de novo, ci necesit o molecul preexistent (primer). In vitro, primerul poate fi ARN sau ADN, dar n vivo, totdeauna este ARN. Pentru sinteza catenei ADN de polaritate negativ, rolul de primer l are molecula de ARNt, originar n celul. Pentru sinteza celei de a II-a catene de ADN, molecula de ARN genomic este incizat la nivelul secvenei polipurinice (PP) i funcioneaz ca primer. Toate revers-transcriptazele, pentru activitatea in vitro au nevoie absolut de cationi bivaleni: Mg2+ (l0 mM). Activitatea RN-azei H este inerent n toate preparatele de revers-transcriptaza. Ea hidrolizeaz ARNgenomic din hibridul ARN-ADN, pe msur progresiei celei de a II-a catene de ADN. Biosinteza proteinelor tardive

Categoria proteinelor tardive cuprinde pe acelea care se sintetizeaz dup replicarea genomului viral. Ele sunt n primul rnd, proteine structurale, necesare asamblrii virionilor progeni i se sintetizeaz cu o rat nalt, prin transcrierea i traducerea copiilor genomice multiple, rezultate prin replicare. De aceea, proteinele tardive se sintetizeaz n cantiti mari, uor detectabile pe imaginile electrono-optice sau la analiza electroforetic. De exemplu, n celulele infectate cu adenovirusuri, proteinele tardive se sintetizeaz n mare exces i formeaz incluziuni mari, n care agregatele moleculare au o distribuie ordonat, paracristalin. Alte proteine tardive au rol funcional: - proteinele reglatoare, al cror rol s-a demonstrat mai nti pentru bacteriofagi, iar ulterior, pentru adenoi herpesvirusuri. Cantitile de proteine necesare asamblrii diferitelor structuri virale sunt foarte diferite i proporiile sintezei trebuie corelate direct cu necesarul; - proteine de morfogenez, necesare asamblrii virusurilor cu structur complex; - proteine care uureaz eliberarea virionilor din celul. Pentru sinteza proteinelor tardive, virusurile folosesc aparatul celular de sintez i exploateaz mecanismele celulare pentru transportul i modificarea proteinelor traduse. Ca i proteinele celulare, cele virale se sintetizeaz pe ribosomii legai de membrane sau pe ribosomii liberi n citoplasm, n funcie de destinaie. In celula normal, ribosomii asociai membranelor, sintetizeaz proteine i glicoproteine de membran, iar ribosomii liberi sintetizeaz enzime i alte proteine citoplasmatice. Transportul i prelucrarea proteinelor Pentru localizarea diferit a proteinelor este determinant secvena de aminoacizi de la captul Nterminal al polipeptidului, denumit secvena semnal, dar i alte secvene ale polipeptidului, ca i modificrile ce survin dup sintez. Toate orienteaz proteina spre diferite localizri: intrarea n nucleu, inseria n membran etc. Determinanii care orienteaz destinaia proteinei se numesc semnale de triere. Semnalele au caracter de specificitate i constau din scurte secvene de aminoacizi care se adaug polipeptidului n cisternele aparatului Golgi. In funcie de destinaie, proteinele vor fi segregate i mpachetate n vezicule separate. Adeseori, proteinele virale se sintetizeaz sub forma unor precursori de dimensiuni mai mari, care sunt supui clivajului proteolitic, fie n timpul sintezei, fie ulterior. Clivrile sunt catalizate de proteaze celulare i mecanismul lor este similar cu acela al clivrii proteinelor celulare. Astfel, proteinele virale cu destinaie membranar pierd secvena N-terminal, nainte de terminarea sintezei. Proteinele structurale sunt, adeseori, clivate n timpul asamblrii virionilor. Glicozilarea proteinelor virale, consecutiv traducerii informaiei genetice urmeaz acelai mecanism ca i glicozilarea proteinelor celulare. Toate proteinele expuse pe suprafaa nveliului sunt glicozilate, iar cele din structura nucleocapsidei nu sunt niciodat glicozilate. Catenele glucidice ale glicoproteinelor virale i celulare, formate din l-3 resturi, sunt N-lincate de asparagin i conin secvena Man-GlcNac-GlcNac. Glicozilarea ncepe n timpul sintezei polipeptidului n reticulul endoplasmic. Catenele glucidice O-lincate sunt legate de treonin i serin i sunt adugate totdeauna n cisternele Golgi. Diferitele zaharuri ale catenei oligozaharidice sunt adugate secvenial, fiecare reacie fiind catalizat de o glicozil-transferaz specific de origine celular. Unele proteine virale sunt fosforilate. Ele interacioneaz cu ADN i au rol n replicarea ADN sau n transcriere. Altele sunt acilate, prin legarea covalent a acizilor grai. Proteinele virale tardive sunt transportate la situsuri diferite n funcie de sediul morfogenezei virionilor: o parte rmne n celul, iar o alt parte este transportat la nivelul membranei, avnd rol n procesul nmuguririi virale. Transportul glicoproteinelor de nveli este cunoscut la mixo- i paramixovirusuri. Ele se sintetizeaz pe poliribosomii ataai cisternelor de reticul endoplasmic. De aici migreaz n cisternele golgiene i se glicozileaz sau sufer alte modificri (acilare cu acid palmitic sau miristic). Prin vezicule de transport, glicoproteinele sunt transportate la nivelul membranei i se inser pe faa extern a acesteia. Proteina matriceal (M), neglicozilat, se agreg prin interaciuni necovalente, pe faa intern a membranei citoplasmatice, n zone distincte (petice). Asamblarea (morfogeneza) viral

Studiul dinamicii asamblrii virusurilor infecioase pentru celula animal este ngreunat, pe de o parte, de complexitatea structural a capsidei, iar pe de alt, de abundena componentelor moleculare ale mediului celular n care are loc asamblarea. Cunotiinele referitoare la mecanismele dominante ale asamblrii virale sunt rezultatul studiilor morfogenezei fagilor i a virusurilor infecioase pentru plante. Morfogeneza viral se supune principiului fundamental al autoasamblrii*, ca rezultat al faptului c fiind determinante de form, capsomerele se pot asocia ntr-o modalitate unic.
Autoasamblarea semnific faptul c toat energia i informaia pentru asamblare sunt coninute n monomerii individuali. Monomerii se asociaz unul cu altul, ntr-o ordine determinat, ntr-o combinaie de legturi ionice, legturi de H i interaciuni hidrofobe.
*

La virusurile cu simetrie helical (de exemplu, virusul mozaicului tutunului VMT), capsida se asambleaz pe msur ce capsomerele interacioneaz cu ARN genomic (fig. 93). La acest virus s-a demonstrat pentru prima dat, existena unei relaii fixe ntre genom i capsomere, precum i mecanismul autoasamblrii. Genomul VMT este alctuit din 6390 de nucleotide. Dac fiecare capsomer, n procesul morfogenezei capsidei se asociaz cu trei nucleotide, rezult c lungimea genomului viral, determin n mod obligatoriu, lungimea virionului. Altfel spus, n timpul asamblrii virionului, capsomerele se aeaz n jurul moleculei de ARN genomic. In absena genomului, capsomerele se asambleaz n numr foarte mare, formnd o capsid imens, dar goal. La VMT, molecula proteic este n acelai timp, unitate chimic i unitate structural a capsidei (capsomera). In anumite condiii de mediu (creterea valorii pH), capsida se dezorganizeaz n capsomerele componente. Restabilirea condiiilor de mediu, induce autoasamblarea capsidei cilindrice, deoarece capsomerele sunt determinante de form, adic se pot asambla ntr-un singur mod, dup principiul de construcie a simetriei helicale.

Fig. 93. Procesul autoasamblrii semnific interaciunea genomului cu capsida. a. La VMT, structura n ac de pr a genomului cu regiunea de iniiere, se leag de primul disc dublu format din capsomere pentru a iniia asamblarea virionului. b, c. Inseria ARN viral n scobitura central a discului dublu format din capsomere. d, e. Alungirea virusului se realizeaz prin adugarea succesiv a discurilor duble de capsomere.

Mecanismul autoasamblrii capsidei VMT este urmtorul: iniial se formeaz un complex stabil, de l7 uniti proteice (capsomere), n form de disc, aezate ntr-un strat unic. Ele se agreg spontan pentru a forma un disc alctuit din dou straturi ce conin 34 capsomere. Fiecare strat al discului conine l7 capsomere, aproape acelai cu numrul de capsomere (l6,3), ntr-un tur al helixului VMT. Discul alctuit din dou straturi de capsomere este intermediarul cheie al asamblrii VMT. O proprietate important a discului este c subunitile pot s alunece una fa de alt, pentru a forma un helix cu dou tururi. Discul, alctuit din dou tururi de capsomere interacioneaz cu ARN genomic. Asamblarea ncepe prin inseria buclei de iniiere a genomului (secvena de mpachetare), n spaiul liber din centrul discului proteic. Discul proteic recunoate specific secvena de mpachetare a genomului. Cu excepia secvenei de mpachetare, care iniiaz procesul asamblrii, proteinele capsidei i ARN genomic interacioneaz nespecific. Prin interaciunea lor nu se formeaz legturi covalente noi, ci numai legturi secundare slabe. Ca dovad a interaciunii laxe, att ntre capsomere, ct i ntre capsomere i ARN, capsida se disociaz prin creterea valorii pH.

Virionul este complet asamblat dup ce este acoperit captul 5 al genomului. In general, virionii cu structur complex se asambleaz gradat din ansambluri distincte, construite din subuniti proteice, ce se formeaz spontan prin autoasamblarea moleculelor proteice individuale. In esen, asamblarea virionilor cu simetrie icozaedric, este rezultatul a dou procese ce se desfoar succesiv sau aproape simultan: - asamblarea proteinelor structurale n capsomere i a acestora n structura capsidei. La virusurile complexe, capsomera ca unitate de construcie este alctuit din cteva molecule proteice; - asocierea capsidei cu acidul nucleic genomic. La ribovirusurile nude, cu simetrie icozaedric, asamblarea capsidei i asocierea ei cu ARN sunt procese aproape concomitente, datorit instabilitii ARN viral n celul. La virusurile ADN cu simetrie icozaedric (adeno-, herpetice), ansamblurile proteice pot forma o structur goal, matur, denumit precapsid, nainte de a se asocia cu genomul. Interaciunea genomului viral (ADN sau ARN), cu proteinele capsidale i rolul acestor interaciuni n mpachetarea genomului rmn necunoscute. n capsid este mpachetat, de regul, numai ARN genomic, ca dovad a existenei unei secvene de mpachetare (identificat la ARN Sindbis un alfavirus). In procesul asamblrii capsidelor cu simetrie icozaedric, particip proteinele de cofraj. Ele au probabil, nu numai un rol mecanic, ci i catalitic n realizarea unor interaciuni stabile ale moleculelor componente. Dup asamblarea capsidei i consolidarea interaciunilor ntre capsomere, proteinele de cofraj sunt eliminate din structura virionului. La reovirusuri, segmentele genomice de ARN dublu catenar se asambleaz cu o protein de morfogenez i formeaz regiunea central a virionului, pe suprafaa creia se asambleaz capsida. Studiul ultrastructural al replicrii virusului vaccinal a relevat procesul stadial complex al morfogenezei, cu participarea cisternelor aparatului Golgi, care formeaz nveliul extern al virionilor. n citoplasma celulelor infectate apar zone difuze sau bine delimitate alctuite din material fin-granular, denumite viroplasm, n interiorul crora se asambleaz virionii progeni. Procesul asamblrii, complex i incomplet elucidat, comport edificarea de novo a unor structuri membranare destinate s nglobeze o parte din materialele viroplasmei. Creterea, turnover-ul i repararea membranelor se face prin intercalarea componentelor structurale (proteine, lipide) n structurile preexistente. Biogeneza de novo a membranelor rmne una dintre marile probleme ale biologiei. Pentru virusurile pox, exist dovada structural c unele componente ale nveliului, sintetizate sub control viral, ncep s se condenseze n membrane. Membranele sunt asamblate n focare viroplasmice discrete i rmn separate de membranele celulare. Membranele virale sintetizate de novo sunt detectabile n matricea viroplasmei i au structur trilaminar, fiind tapetate la exterior de un strat dens de spiculi. Pe msur ce membranele cresc, ele nconjur ADN nascent i proteinele acumulate n viroplasm. Eliberarea virionilor Eliberarea virusurilor din celul se face prin mai multe mecanisme, dependente n primul rnd, de natura virusului. Virusurile nude se elibereaz rapid dup moartea i liza celulei. Intr-o mic msur, virusurile nude (cu genom ARN sau ADN) se elibereaz prin modificarea permeabilitii membranei citoplasmatice. Ribovirusurile nvelite (mixo-, paramixo, toga-, retravirusuri) se elibereaz prin nmugurire din membrana citoplasmatic sau n cisternele reticulului endoplasmic granular (flavivirusuri). Ultimele etape ale asamblrii nucleocapsidei sunt asociate cu primele stadii ale nmuguririi, sau asamblarea capsidei precede nmugurirea (de exemplu, particulele de tip B i D ale retravirusurilor). Inmugurirea are loc la nivelul unor situsuri specifice ale membranei celulare, acolo unde proteinele virale s-au inserat, att pe faa intern ct i pe cea extern a membranei plasmatice sau a membranelor reticulului endoplasmic. Asamblarea prin nmugurire necesit co-localizarea componentelor structurale (fig. 94). Proteinele care proemin pe suprafaa extern a membranei sau n cisternele reticulului endoplasmic, sunt glicozilate, iar cele care tapeteaz faa intern a membranei citoplasmatice sunt neglicozilate. Glicoproteinele virale se inser n zone distincte ale membranei, din care proteinele celulare sunt deplasate sau chiar nlocuite. Nucleocapsidele se asociaz specific cu proteinele virale care tapeteaz faa citoplasmatic a membranei (proteina M), sau cu domeniile citoplasmatice ale glicoproteinelor virale inserate n membran (la togavirusuri).

La ortho- i paramixovirusuri, nucleocapsidele recunosc specific i se ataeaz de proteina matriceal. Ulterior ncepe nmugurirea i treptat, virionul se elibereaz, nvelit fiind de membrana citoplasmatic, n care se gsesc inclavate glicoproteinele virale. Proteina matriceal are rolul unei puni de legtur ntre nucleocapsida viral i glicoproteinele inserate n membran.

Fig. 94. Formarea nveliului viral prin nmugurire. Eliberarea particulelor virale progene.

Lipidele i glucidele din alctuirea nveliului viral sunt proprii celulei. Din aceast cauz, compoziia lor n structura unui virus difer n raport cu substratul celular n care se multiplic. Datorit acestui fapt, preparatele unui virus, obinute pe linii celulare diferite se deosebesc prin proprietile fizice, biologice i antigenice. Unele virusuri care nmuguresc, nu sunt foarte eficiente n procesul eliminrii proteinelor membranare, iar fenomenul ncorporrii proteinelor strine este real. De aceea, nveliul viral conine i glicoproteine de origine celular i chiar ale unui alt virus, care infecteaz concomitent aceiai celul. Faptul este ilustrat de neutralizarea retravirusurilor, att in vivo ct i in vitro, de anticorpii specifici fa de proteinele membranare. Proteinele membranare par a fi ncorporate pasiv n nveli, dac nu mpiedic steric formarea acestuia. Eliberarea virionilor prin nmugurire este mai eficient pentru randamentul infeciei (producerea virusului progen), deoarece nu depinde de dezintegrarea imediat a celulei. Celula rmne viabil o perioad mai lung de timp sau dup transformarea malign este chiar nemuritoare i elibereaz virus. Efectele virusurilor care nmuguresc, asupra celulei gazd sunt foarte diverse: de la citoliz (toga-, paramixo, rhabdovirusuri), pn la supravieuirea nelimitat a acesteia, dup transformarea cu retravirusuri. La herpesvirusuri, virionii se nvelesc la contactul cu lamela intern a membranei nucleare, traverseaz spaiul dintre cele dou lamele i la nivelul porilor nucleari trec n cisternele reticulului endoplasmic i n vezicule. Sistemele membranare nchise protejeaz virionii de contactul cu citoplasma i mediaz transportul la suprafaa celulei. Membrana veziculei de transport, fuzioneaz cu membrana citoplasmatic i virionii sunt eliberai n spaiul extracelular. Herpesvirusurile sunt totdeauna citolitice. Celulele infectate cu virusuri care nmuguresc la nivelul membranei citoplasmatice sau la nivelul altor membrane celulare, devin inta antigenic pentru efectorii sistemului imunitar, care recunosc glicoproteinele codificate de virus. Cele infectate cu virusuri nude sunt recunoscute de efectorii sistemului imunitar, deoarece expun antigene virale asociate cu molecule membranare. Infeciozitatea acizilor nucleici virali Desfurarea ciclului de replicare viral nu este condiionat de ansamblul integrat al componentelor structurale ale virionului, ci n esen, numai de genomul viral i uneori, de proteinele de replicare asociate acestuia. Infeciozitatea acizilor nucleici virali s-a demonstrat iniial pentru ADN fagic i ulterior pentru ARN al VMT. Dac acidul nucleic genomic funcioneaz ca ARNm, infeciozitatea sa este o proprietate fr

excepie. ARN genomic cu polaritate negativ, n stare pur, nu este infecios, deoarece este necesar transcrierea sa ntr-o copie de ARN complementar, cu rol de ARNm. Infeciozitatea acizilor nucleici virali nu mai este condiionat de interaciunea cu receptorii suprafeei celulare. De aceea, spectrul celulelor infectate prin intermediul acizilor nucleici purificai crete foarte mult, dar eficiena procesului infecios (numrul de molecule genomice infecioase/celul i respectiv cantitatea de virus progen) diminu semnificativ. Tipuri de relaii virus-celul Utilizarea culturilor de celule a permis definirea mai multor tipuri de interaciuni ale virusurilor cu celulele pe care le infecteaz, dominate de particularitatea unic a acestor entiti infecioase parazitismul absolut. Interaciunea virus-celul este modulat de particularitile funcionale att ale virusului ct i ale celulei. Dup ce un virus infecteaz celula sensibil, ansamblul rezultat constituie o unitate funcional cu trsturi noi, distincte, care nu este suma aritmetic a celor dou uniti (celul i virus), ci un complex viu, a crui funcionalitate deriv din interaciunea celor dou genomuri. Uneori, genomul viral domin funcionalitatea complexului, iar alteori informaia genetic viral este dominat de programul genetic al celulei. Modalitile de evoluie a complexului virus-celul sunt urmtoarele: - evoluia (starea) independent; - evoluia (starea) dependent (sau interaciunea de tip integrativ). Starea independent a celor dou uniti care interacioneaz corespunde situaiei n care genomul viral nu se supune mecanismelor reglatoare ale celulei. Multiplicarea virusului se realizeaz ntr-un ritm propriu, coordonat de genomul viral. Rezultatul interaciunii este infecia viral productiv. Infecia productiv definete interaciunea n cursul creia virusul infectant preia controlul proceselor de biosintez celular i le deviaz de la sinteza constituienilor proprii, n sensul biosintezei mai mult sau mai puin exclusiv, de constituieni virali. Informaia genetic viral este exprimat integral, asigurnd desfurarea ntregului ciclu de multiplicare, asamblarea virionilor i, n multe cazuri, moartea i liza celulei cu eliberarea virusului progen (efect citocid). Celulele care permit exprimarea integral a mesajului genetic, multiplicarea i eliberarea virusului sunt permisive. Permisivitatea este o proprietate datorat structurii lor genetice. Celulele permisive provin, de regul, de la speciile pe care virusul le infecteaz n mod natural, dei exist numeroase excepii (de exemplu, ortho- i paramixovirusurile se multiplic n oul embrionat de gin). Caracterul permisiv i respectiv nepermisiv este, cel puin uneori, controlat genetic i este influenat de gradul de difereniere celular. Celulele embrionare sunt mai permisive. Celulele semipermisive permit multiplicarea viral, dar cu o rat mai mic. Degenerarea celulei i liza, dac se produc, apar ntr-un interval mai ndelungat dect al celulei permisive. Starea independent a genomului viral fa de celul se poate manifesta sub dou forme: a) a sistemului independent citocid b) a sistemului independent echilibrat, care corespunde unei evoluii moderate a interaciunii. Sistemul independent citocid corespunde relaiei n care genomul viral se replic foarte activ. Celula este copleit de rata nalt a biosintezei componentelor virale i de asamblarea virionilor progeni. Rezultatul este dezintegrarea celulei i eliberarea virionilor progeni. Aceast interaciune corespunde infeciei litice productive. Sistemul independent echilibrat caracterizeaz complexele furnizate de unele virusuri moderate, care persist n celul, dar nu inhib biosintezele celulare. Genomul viral se replic autonom, dar cu o rat sczut, care asigur persistena lui n celul i transmiterea de la o generaie celular la alt. Se sintetizeaz macromolecule virale i se asambleaz virioni progeni. Caracteristic este faptul c genomul viral se pstreaz n celul, n stare fizic independent, ca ADN episomal. Virusul determin o infecie de lung durat (infecie persistent). Infeciile persistente sunt produse de virusuri care se multiplic fr s produc modificri profunde ale metabolismului celular. Iniial, infeciile persistente au fost recunoscute numai in vivo, dar persistena viral se produce i in vitro. In culturile celulare se recunosc dou tipuri de infecii persistente: l) Infeciile echilibrate cronice (steady state infections, steady, engl. = stabil) corespund situaiei n care, toate sau aproape toate celulele dintr-o cultur sunt infectate cu un virus necitocid, care este produs

continuu, uneori foarte intens. Celulele rmn viabile, metabolic active i continu s se divid, iar virusul este transmis celulelor fiice. Disfunciile celulei, dei iniial sunt minore pot duce n timp, la tulburri severe. Acest tip de infecie a fost evideniat n celulele renale de maimu, aparent normale, contaminate cu SV4o sau cu SV5 (un paramixovirus). In culturile de celule renale, SV4o se multiplic, dar celulele rmn viabile, elibernd cantiti mari de virus n mediul extracelular. Infecia echilibrat, in vitro nu poate fi eliminat prin adugarea anticorpilor neutralizani, deoarece nu exist o faz de infecie exogen. 2) Starea de purttor (carrier state) se datoreaz infeciei produse de un virus citocid, a crui multiplicare este limitat la un numr restrns de celule permisive, dar majoritatea celulelor substratului sunt nepermisive. Persistena infeciei este asigurat de transmiterea virusului progen la un numr mic de celule permisive ale culturii. Majoritatea celulelor culturii sunt nepermisive, datorit unor fenomene de rezisten intrinsec sau datorit unor factori inhibitori (anticorpi, interferon) prezeni n mediu. Spre deosebire de infecia cronic echilibrat, starea de purttor de virus a unei culturi celulare poate fi vindecat (deoarece infecia este exogen), prin adugarea anticorpilor antivirali neutralizani sau prin clonarea suspensiei celulare, la o densitate suficient de mic, pentru a permite izolarea celulelor individuale indemne. Evoluia dependent sau interaciunea de tip integrativ a fost recunoscut iniial, pentru interaciunea fagului cu celulele de Escherichia coli K12. Genomul viral se integreaz n cromosomul bacterian, ca profag (provirus) i persist nu numai n celula infectat, ci se transmite descendenilor ei. Interaciunea de tip integrativ caracterizeaz raportul dintre genomul virusurilor oncogene i celulele animale. Uneori, rezultatul interaciunii de tip integrativ este transformarea malign (efect citochinetic) a celulei, consecin direct a modificrilor profunde a funciilor celulare. Celulele transformate malign pot s produc virus progen (transformare productiv), dar n alte cazuri, producerea virusului progen nu este detectabil. Alteori, interaciunea de tip integrativ nu are ca efect transformarea malign, ci constituie mecanismul molecular obligatoriu al multiplicrii virale (de exemplu, pentru retravirusurile neoncogene). In concluzie, tipurile de interaciuni dintre un virus i un substrat celular sunt dependente att de originea substratului celular, de stadiul fiziologic al celulelor, dar i de virusul infectant. Patologia celulelor infectate cu virusuri De cele mai multe ori, ntr-un substrat celular permisiv, multiplicarea virusurilor interfer cu funciile normale ale celulei gazd i produce modificri cu att mai ample, cu ct gradul de sensibilitate a celulei este mai mare, mergnd pn la degenerare i moarte. n celulele infectate cu virusuri, se acumuleaz componente virale care determin apariia modificrilor structurale, biochimice i funcionale, consecina fiind liza celulei. Virusurile care formeaz complexe echilibrate, se multiplic cu o rat sczut. Celulele rmn viabile, cu modificri structurale sau funcionale minime. Orice tip de modificare celular indus de virus, fie c are o expresie morfologic, fie numai una biochimic poart denumirea de efect citopatogen sau citopatic (ECP). Noiunea include att efectul litic, ct i toate celelalte modificri compatibile cu supravieuirea. Modificrile morfologice constau n schimbri ale aspectului celular: a)constricia- celulele devin mai mici, se rotunjesc, iar citoplasma are aspect granular; b)creterea volumului celular, creterea refringenei i apariia tendinei de agregare); c)vacuolizarea citoplasmei (indus de virusurile vacuolante tip SV4o), precum i alterri nucleare sau citoplasmatice, cu diferite grade de intensitate; d)fuziunea i formarea sinciiilor sunt modificri frecvente induse n special de virusurile nvelite; e) efectul citochinetic este produs de virusurile oncogene i const n stimularea ratei de diviziune, de cele mai multe ori ca rezultat al transformrii maligne, produs de retravirusurile oncogene i dezoxiribovirusuri, numai n substratul celular nepermisiv, cu o frecven redus. Frecvent, termenul de efect citopatogen este folosit n sens strict pentru a descrie exclusiv leziunile morfologice, deoarece sunt mai uor de evideniat. Modificrile morfologice sunt expresia celor metabolice, dei intensitatea lor nu este totdeauna corelat direct. Efectele citopatogene au, adeseori, un caracter specific i se nsoesc de apariia unor modificri caracteristice i pot fi utilizate pentru a preciza natura virusului infectant. Din punct de vedere funcional, cele mai evidente ECP sunt de tip citotoxic, citocid sau citochinetic. Efectul citotoxic hiperacut este cauza morii celulare, nainte de multiplicarea viral, fr producerea virusului progen. Moartea celular este rezultatul unui efect toxic al proteinelor virale, consecutiv infeciei

experimentale a culturilor celulare cu un inocul masiv. Efectul toxic este produs de proteina pentonic a adenovirusurilor. Efectul citocid este rezultatul infeciei celulelor sensibile cu virusuri citolitice i se datoreaz leziunilor progresive, care duc la alterarea profund a activitilor metabolice i a unor structuri celulare determinnd, n fazele tardive ale ciclului infecios, moartea celulei i eliberarea virionilor. Celulele cultivate n monostrat se desprind de suport i manifest alterri majore: rotunjire, vacuolizare, ratatinare (constricie celular), pierderea afinitii pentru coloranii vitali (albastru tripan, rou neutru), ceea ce permite identificarea i diferenierea lor de celulele vii. Efectul citocid i de distrugere litic a celulelor infectate cu virus se exteriorizeaz macroscopic, n culturi celulare n monostrat, prin apariia discontinuitilor pnzei celulare, denumite plaje de liz. Ele apar ca nite zone clare n mijlocul unui strat confluent de celule nvecinate, de obicei ca rezultat al multiplicrii n cicluri succesive, a unei singure particule virale din inoculul iniial. Plaja de liz este rezultatul lizei celulelor infectate n cicluri succesive de multiplicare. Forma i mrimea plajelor pot furniza date utile pentru identificarea virusului. Virusurile care nu lizeaz celula gazd, nu produc plaje de liz. Mecanismele moleculare ale efectului citopatic ECP este consecina parazitismului absolut al virusurilor, a eficienei lor de a subordona activitatea metabolic a celulei i de a o orienta n sensul sintezei macromoleculelor cu specificitate viral. Bazele moleculare ale ECP sunt puin cunoscute. Virusurile inhib mai multe procese celulare pentru c un singur mecanism de aciune nu are eficien complet. Mecanismele ECP sunt specifice virusului infectant. Intr-un complex virus-celul, predomin unul dintre mecanismele prezentate mai jos. 1. Modificri metabolice Interaciunea citolitic produce inhibiia sintezei macromoleculelor specifice celulei, denumit i efect de ntrerupere. In absena sintezelor specifice, care s nlocuiasc moleculele uzate, apar modificri funcionale i structurale incompatibile cu viaa. Virusurile controleaz metabolismul celular prin mai multe mecanisme, care constau n: - schimbri n metabolismul intermediar, n special al dezoxiribonucleotidelor ; - modificri ale sintezei, prelucrrii, transportului i turnover-ului macromoleculelor celulare ; - intensificarea exprimrii genelor virale i interferena cu programul celular. De regul, virusul nu omoar celula nainte de desfurarea ciclului de replicare. Modificri ale metabolismului ADN celular. Replicarea ADN celular are loc n faza S a ciclului i necesit dezoxiribonucleotide, enzime de replicare i sintez proteic. Pentru replicarea ARN al ribovirusurilor este folosit rezerva de ribonucleotide a celulei i metabolismul ADN celular nu se modific semnificativ. Retravirusurile se integreaz n cromosomii celulei i stimuleaz rata diviziunii celulare, dar nu interfer cu replicarea ADN celular. Replicarea ADN viral este, de cele mai multe ori, dependent de disponibilitatea dezoxiribonucleotidelor celulare. Dezoxiribovirusurile se multiplic n diferite tipuri de celule, chiar n cele difereniate terminal (de exemplu, neuroni), n care sinteza ADN i diviziunea nceteaz. Ele posed mecanisme prin care depesc condiiile restrictive ale cantitii limitate de dezoxiribonucleotid-trifosfai (dNTP). Uneori, chiar celulele care se divid nu pot oferi cantitile de dNTP impuse de sinteza ADN viral, ceea ce necesit un aport suplimentar. Disponibilitatea limitat a dNTP este depit prin dou mecanisme : - virusurile cu genom mic (papova) induc intrarea celulei n faza S. Se exprim genele celulare pentru sinteza enzimelor ce catalizeaz sinteza dNTP i replicarea ADN. Antigenul T de 94 kDa, codificat de SV4o se leag de o protein supresoare a diviziunii celulare i a replicrii ADN proteina p53 - i astfel se anuleaz efectul su inhibitor. Exprimarea unei singure gene virale pregtete celula pentru replicarea ADN. Activarea genelor reglatoare ale diviziunii, st la baza potenialului oncogen al acestor virusuri;

virusurile cu genom mare (adeno, herpes, pox), suplimenteaz cantitatea de dNTP deoarece codific propriile enzime ale metabolismului nucleotidelor i ale replicrii ADN. Genele virale pentru aceste enzime au fost probabil dobndite din celul. Ele nu funcioneaz, dac virusul infecteaz celule metabolic active, dar confer independena replicrii virale de faza S a ciclului celular. Enzimele virale catalizeaz aceleai reacii ca i omologele lor celulare, dar specificitatea de substrat i mecanismele de reglare sunt diferite, ceea ce le face inte pentru agenii antivirali. De exemplu, acyclovir i gancyclovir, analogi ai guanozinei pot fi fosforilate de Tk a herpesvirusului, dar nu de Tk a celulei. adenovirusurile codific trei proteine pentru replicarea ADN: o ADN-polimeraz, o protein legat terminal de genom cu rol de primer al sintezei ADN viral i o protein care se asociaz cu ADN monocatenar. Herpesvirusurile codific 7 proteine cu rol n replicarea ADN, ceea ce le confer independena de ciclul celular i le permite s se multiplice dup inhibiia sintezei ADN i chiar n celule care nu se divid (neuroni), unde produc infecii persistente latente .

Modificarea strii fizice a ADN. Virusurile complexe(adeno, herpes)modific starea fizic a ADN celular, fcnd-o incompatibil cu replicarea i cu funcia de transcriere, ceea ce determin inhibiia sintezei macromoleculelor specifice celulei. Matricea nuclear este substratul fizic pentru cromatin, dar i pentru procesele de transcriere i replicare a ADN. Unele molecule virale se asociaz cu matricea nuclear i modific distribuia ADN n nucleu. De exemplu, n celulele infectate cu virusuri herpetice, ADN se desprinde din punctele de inserie pe matricea nuclear, iar dup infecia cu adenovirusuri, efectul este invers, de marginaie a cromatinei (deplasarea i aglomerarea ei spre periferia nucleului, n blocuri heterocromatice). Virusurile pox codific o DN-az, ce ptrunde n nucleul celulei i depolimerizeaz ADN monocatenar, despiralizat pentru replicare sau pentru transcriere. Ca rspuns la infecia cu unele virusuri, celulele sufer fenomenul de apoptoz, n cursul creia se produce clivajul internucleosomal al cromatinei. In general, virusurile inhib programul apoptotic, celula rmnnd viabil ca substrat al multiplicrii virale, iar altele (influenza, Sindbis) par a fi adaptate s se multiplice n celulele apoptotice. Modificri ale metabolismului ARN. Pentru sinteza proteinelor virale, este totdeauna necesar sinteza ARNm cu specificitate viral. Perturbarea metabolismului celular se produce la toate treptele: transcriere, prelucrare, transportul nucleo-citoplasmatic, traducere, sau modificarea ratei degradrii. Toate confer ARN viral un avantaj competitiv prin urmtoarele mecanisme: - toate ribovirusurile i poxvirusurile codific sinteza unei ARN-polimeraze cu aciune specific fa de genomul viral; - dezoxiribovirusurile codific n faza timpurie, sinteza cel puin a unui factor viral care schimb specificitatea ARN-pol II celulare i o orienteaz spre ADN viral, trecnd-o sub controlul unui promotor viral foarte activ. - majoritatea ribovirusurilor inhib activitatea aparatului de transcriere al celulei, deoarece se multiplic n citoplasm i nu necesit activitatea de transcriere a celulei. Unele proteine virale cu rol important n ciclul de multiplicare (de exemplu proteaza 3C a poliovirusului i proteina M a VSV), inhib transcrierea genelor gazdei (Lyles, 2000, mmbr, 64, 4) catalizat de toate cele 3 ARN-polimeraze celulare. Proteinele ribovirusurilor sunt localizate, n cea mai mare parte n citoplasm, dar proteaza 3C i proteina M se gsesc i n nucleul celulei infectate. In cele 2 sedii proteina M ndeplinete funcii distincte: n ciclul replicrii virale(are rol n asamblarea virionilor i inducerea procesului de nmugurire), iar n nucleu inhib transcrierea genelor celulare. Proteaza 3C a FMDV cliveaz histona H3 i inhib transcrierea prin alterarea matriei cromatiniene. Excepia o constituie virusurile influenza care avnd o faz nuclear a ciclului, necesit activitatea de transcriere a celulei pentru producerea oligonucleotidelor bonetate pe care le folosesc ca primeri pentru sinteza ARNm viral. ; - cele mai multe virusuri neoncogene inhib maturarea ARNm celular prin mecanisme complexe. De exemplu, proteina NS1 a virusului gripal inhib maturarea ARNm celular, n 2 trepte: interfer cu treapta de clivare a ARN premesager i inhib treapta adenilrii captului 3. Tot ea cliveaz un fragment de l0-l3 nucleotide de la captul 5 al ARNm celular. Fragmentele au rol de primeri pentru iniierea sintezei ARNm viral n nucleul celulei infectate, dat fiind incapacitatea ARN-polimerazei virale de a iniia

sinteza moleculelor de ARN. Efectul este transferul secvenei de bonetare de la ARNm celular la mesagerii virali, fcndu-i nefuncionali pe primii i asigurnd traducerea celor virali; la adenovirusuri, dou proteine timpurii inhib transferul nucleo-citoplasmatic al ARNm celular din nucleu i favorizeaz transferul ARNm viral tardiv; virusurile herpetice i virusul vaccinal mresc rata degradrii ARNm i inhib sinteza proteinelor celulare. Creterea ratei degradrii nu este specific ARNm celular, deoarece ARNm virali sunt supui aceluiai proces, dar abundena ARNm virali datorat ratei superioare a transcrierii compenseaz pierderea prin degradare. In celulele infectate cu VSV, ARNm virali, n mare exces cantitativ, sunt asociai cu proteina N (nucleoproteina) n complexe RNPm i formeaz o rezerv mare de ARNm care intr n competiie eficient cu ARNm al gazdei. Dar ARNm viral este tradus preferenial chiar cnd abundena sa este diminuat de 10 ori sau mai mult: se crede c ARNm viral conine secvene ce favorizeaz traducerea (situsuri interne care favorizeaz legarea ribosomilor); - n celulele infectate cu virusul influenza este inactivat un factor celular(eIF4E) care se leag de secvena de bonetare a ARNm. Pentru a se lega de captul bonetat, eIF4E trebuie fosforilat de o kinaz celular. In celulele infectate cu virusul influenza, eIF4E este parial inactivat prin nivelul redus al fosforilrii. ARNm virali au acelai cap bonetat i o secven de 10-13 nucleotide, ca i mesagerii celulari i teoretic, ar trebui s fie la fel de sensibili la inactivarea eIF4E. ARNm al virusului influenza conine o secven la captul 5 care favorizeaz legarea ribosomilor i ridic nivelul traducerii.

Modificri ale metabolismului proteinelor. Sinteza, prelucrarea i transportul proteinelor virale constituie domeniul de intersecie a funciilor celulare i virale, deoarece virusurile intr n competiie cu mecanismele sintezei proteinelor celulare. ARNm virali i celulari intr n competiie direct pentru traducere. Att celula ct i virusul sunt dependente de aparatul celular de sintez i transport proteic. Inhibiia sintezei proteinelor celulare este una dintre consecinele cele mai evidente ale infeciei cu virusuri citocide, iar retravirusurile produc perturbri minime. Intre cele dou extreme se situeaz raporturile celorlalte virusuri cu substratul n care se multiplic. Mecanismele moleculare ale ntreruperii sintezei proteinelor celulare i ale schimbrii specificitii aparatului de sintez celular sunt multiple. Virusurile citocide (polio, herpes, adeno, vaccinal) ntrerup selectiv sinteza proteinelor celulare prin mai multe mecanisme: - inhib traducerea mesagerilor celulari - inactiveaz factorii specifici ai sintezelor celulare; - prin transcrierea i traducerea preferenial a mesagerilor virali. Mecanismul traducerii discriminatorii ntre ARNm celular i ARNm viral a fost dedus din faptul c inhibiia sintezei proteinelor celulare este prea rapid pentru a fi atribuit numai scderii cantitative a ARNm sau inhibiiei sintezei sale (herpes, vaccinal, rinovirus) : - ARNm al adenovirusurilor este asemntor cu ARNm celular i este foarte eficient n competiia traducerii cu mesagerii celulari; - n celulele infectate cu virusul polio sau cu virusuri herpetice se produce dezagregarea selectiv a polisomilor celulari. Ribosomii rmn funcionali i disponibili pentru sinteza proteinelor virale. Pe msur ce sinteza proteinelor virale devine detectabil, apare o nou clas de polisomi, mai mari, corespunztoare ARNm viral, care este mai mare dect dimensiunea medie a ARNm celular ; - traducerea ARNm al picornavirusurilor este independent de secvena de bonetare 5. ARNm are o secven lung 5 necodificatoare ce conine un situs intern de intrare a ribosomilor. Aproape totdeauna, n celula infectat se sintetizeaz o cantitate total de proteine, mai mic dect n celula normal, deoarece, n general, infecia diminu capacitatea de sintez proteic. In multe cazuri, inhibiia sintezei proteinelor are rolul de a inhiba rspunsul antiviral al celulei, iar traducerea preferenial a ARNm viral este consecina adaptrii virusurilor la replicarea n prezena aciunii unor astfel de mecanisme inhibitorii. Aproape toate ribovirusurile, n ciclul replicrii, produc molecule de ARN dublu catenar. Rspunsul celulei gazd la ARN dc este inhibiia sintezei proteice, mediat de o fosfo-chinaz dependent de ARN (PKR). PKR este, n esen, o chinaz indus de IFN, dar cele mai multe celule exprim constitutiv nivele semnificative ale acestei proteine. Rolul ei este de a activa rspunsul celulei la ARN dc, chiar n absena IFN. In prezena ARN dc, PKR fosforileaz subunitatea a eIF2 i iniierea traducerii este astfel blocat.

2. Pierderea funciilor normale ale membranelor celulare Virusurile altereaz membrana celulei gazd, pe dou ci: - modific permeabilitatea membranei citoplasmatice; - induc fuziunea membranei cu celulele nvecinate. Ambele procese sunt rezultatul diminurii sau stoprii biosintezelor proprii celulei, precum i al nlocuirii proteinelor celulare membranare, cu glicoproteine ale peplosului viral. Astfel se perturb echilibrul mediului ionic intracelular, diminu