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EXTRAO, PURIFICAO E AVALIAO DA ATIVIDADE DA TORRES, M. C. L. et al. GLUTATIONA S-TRANSFERASE DE FGADO BOVINO 1
Extraction of glutathione s-transferase from bovine liver
Maria Clia Lopes Torres2, Nilda de Ftima Ferreira Soares3, Jos Antnio Marques Pereira3

RESUMO Considerando a ao detoxificante da enzima Glutationa S-Transferase (GST), importante contra o estresse oxidativo, cncer e outras doenas degenerativas, com este estudo, objetivou-se avaliar a atividade dessa enzima extrada de fgado bovino e avaliar a estabilidade em condies de refrigerao (5 0C). O fgado bovino foi selecionado por ser matria prima disponvel comercialmente e de baixo custo. A extrao foi realizada em quatro etapas (homogeneizao/centrifugao, passagem em coluna contendo dietilaminoetilcelulose (DEAE-celulose), precipitao com sulfato de amnia e passagem em coluna contendo Carboximetilcelulose (CMC). O extrato obtido apresentou atividade com o 1 cloro 2, 4 dinitrobenzeno, na presena de glutationa reduzida. O extrato final apresentou atividade especfica 5 vezes maior que o extrato bruto centrifugado e estabilidade da atividade enzimtica foi mantida nas condies de 50C, durante 70 dias. Termos para indexao: Glutationa S-Transferase, extrao, fgado bovino, atividade enzimtica. ABSTRACT Considering the detoxication functions of Glutathione S-transferase (GST) enzyme, that is important against oxidative stress, cancer and others degenerative diseases, this study aimed to evaluate the stability and activity of Glutathione S-transferase extracted from bovine liver, which is commercially available at low cost. The extraction was done in four steps (homogenization/centrifugation, passage through column containing diethylaminoethyl-cellulose (DEAE), precipitation with ammonium sulfate and passing through column of carboxy-methyl-cellulose (CMC). The extract thus obtained showed activity with 1 chloro 2, 4 dinitrobenzene, in the presence of reduced glutation. The specific activity of the final extract was 5 times greater than the crude centrifuged extract, and was stable for 70 days when stored at 5 oC. Index terms: Glutathione S-transferase, extraction, bovine liver, enzyme activity. (Recebido para publicao em 14 de janeiro de 2004 e aprovado em 22 de maro de 2005)

INTRODUO A Glutationa S-Transferase (GST) o principal grupo de protenas solveis do fgado, envolvidas na detoxificao celular de compostos eletroflicos, geradas intracelularmente ou encontradas na forma de xenobiticos. Essas protenas so encontradas em diferentes formas, chamadas de isoenzimas (HAYES & PULFORD, 1995; WINDERSTEN & MANNERVIK, 1995). Sua ao detoxificante importante na proteo contra estresse oxidativo, cncer e outras doenas degenerativas, incluindo aquelas associadas com o envelhecimento (BABBITT, 2000). Os xenobiticos, semelhana do que acontece com as substncias endgenas, so conjugados com diversas substncias. Entre as reaes importantes, temse a sulfatao, a acetilao, a metilao, alm de conjugaes com a glutationa (GSH) e com aminocidos.

A conjugao de agentes txicos com o tripeptdeo GSH catalisada, na sua fase inicial, pela GST que atua na fase II da biotransformao, prevenindo danos membrana celular e outras macromolculas (DYBING et al., 2002; MALMEZAT et al., 2000). Hayes et al. (2005) mencionam que as GSTs do citoplasma dos mamferos so todas dimricas com subunidades de 199-244 aminocidos. Baseado na semelhana da cadeia de aminocidos, sete classes de GST citoslicas so reconhecidas e denominadas Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega e Zeta. Habig & Jakoby (1981) purificaram GST de fgado de rato usando coluna carboximetil celulose (CMC) e embora, as quatro enzimas purificadas apresentassem reatividade com os substratos especficos, todas formas ativas, em diferente graus, na conjugao da glutationa com o composto 1 cloro 2,4 dinitrobenzeno (CDNB). Chico & Listowsky (2005) citam o fgado de rato como o rgo que encerra maior a

Parte da dissertao de doutorado do primeiro autor, apresentada Universidade Federal de Viosa/UFV Campus Universitrio 36.570-000 Viosa, MG. Professora da Universidade Federal de Gois/UFG Escola de Agronmia e Engenharia de Alimentos Cx. P.131 74.001-970 Goinia, Gois celialopes@agro.ufg.br 3 Professores da Universidade 30, n. 2, Viosa/UFV Departamento de Cinc. agrotec., Lavras, v.Federal de p. 302-307, mar./abr., 2006 Tecnologia de Alimentos 36.570-000 Viosa, MG.
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Extrao, purificao e avaliao da atividade ... concentrao desse tipo de enzimas, por ser o local onde grande nmero de substncias metabolizado. Outros rgos, como intestino, rins, bexiga, crebro, tm tambm participao significativa. Diversas fraes das clulas hepticas so obtidas quando o fgado removido e submetido homogeneizao, seguida de centrifugaes sucessivas a velocidades crescentes. Trs grandes famlias de protena que so amplamente distribudas na natureza exibem atividade glutationa transferase. Duas delas, a mitocondrial e as citoslicas, so compostas por enzimas solveis que apresentam similaridade na estrutura tridimensional. A terceira famlia denominada GST microssomal composta por protenas associadas a membranas e participam do metabolismo dos eicosanoides e da glutationa e no apresenta similaridade estrutural com as duas outras famlias citadas. No entanto, todas as trs famlias apresentam ao catalisadora na conjugao do 1-cloro 2,4dinitrobenzeno (CDNB) (HAYES et al., 2005). As atividades citoslicas so 5 a 40 vezes maiores do que as mitocrocondriais (OGA, 1996; PETERS & ROELOFS, 1997). As GSTs citoslicas representam a maior famlia das transferases e tm atividades que so nicas nesse grupo de enzimas. Elas catalisam lise do grupo thiol do 4-acetato nitrofenol; apresentam atividade de thiol transferase; promovem reduo do trinitroglicerina, do cido dehidroascrbico e do cido monometilarsonico; e catalisam a isomerizao do maleilacetoacetato e e 53-cetoesteride (HAYES et al., 2005). Para avaliar a atividade da GST em diferentes tecidos, o 1 cloro 2-4 dinitrobenzeno (CDNB) tem sido considerado como o substrato para todas as suas isoenzimas, embora diferenas significativas nas atividades especficas tenham sido mostradas (WARHOLM et al., 1986). Considerando a ao detoxificante da enzima Glutationa S-Transferase (GST), importante contra o estresse oxidativo, cncer e outras doenas degenerativas, este estudo teve como objetivos avaliar a atividade dessa enzima extrada de fgado bovino e avaliar a estabilidade em condies de refrigerao (5 0C). O fgado bovino foi selecionado por ser matria prima disponvel comercialmente e de baixo custo. MATERIAL E MTODOS As peas de fgado bovino resfriado, at comporem o peso de aproximadamente 3 kg, foram obtidas no comrcio varejista da cidade de Viosa, em diferentes locais de venda e levadas ao laboratrio de

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Bioengenharia do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFV. As peas divididas em trs lotes de 1 kg e embaladas em sacos de polietileno foram congeladas temperatura de -18oC, por 24 horas, antes do processo de extrao. As peas, oriundas de estabelecimentos inspecionados, encontravam-se no prazo de garantia de qualidade. De cada lote foram retiradas 100 g de fgado, previamente triturado, para realizao das anlises. Os lotes foram considerados como repetio e as anlises foram conduzidas em triplicatas. Extrao A extrao da protena GST foi realizada segundo metodologia descrita por Habig & Jakoby (1981), adaptada para as condies de realizao, com as seguintes modificaes: a) A quantidade de fgado usado (100 g) foi inferior (500 g); b) a gua resfriada para triturao da amostra foi substituda pela soluo de tampo fosfato de potssio, pH 6,7, previamente resfriado a 40C; c) as colunas de DEAE-celulose e CMC de 15x 22 cm e de 5x 40 cm foram substitudas por 5 x 7 cm e 2,5 x 13 cm, respectivamente. Em cada etapa, o volume do extrato foi medido e foram realizadas as determinaes de protenas e da atividade da GST. A protena foi determinada pelo mtodo Bradford (1976), usando a albumina de soro bovino como padro, e a medida da atividade da GST, conforme metodologia descrita por Habig et al. (1974). Para a obteno do extrato bruto foram pesados 100 g de fgado de cada lote, parcialmente triturados e homogeneizados, em liqidificador convencional, por um minuto, com trs volumes (p/v) de tampo fosfato de potssio, pH 6,7, previamente resfriado a 40C. O homogeneizado foi centrifugado, por 90 minutos, a 10.000 x G, temperatura de 40C, e o sobrenadante foi filtrado em funil de vidro com algodo, para remover partculas flutuantes. Aps, o sobrenadante foi passado em uma coluna (5 x 7 cm) de dietilaminoetil- celulose (DEAE-celulose)(MERCK), equilibrada com tampo Tris-HCl 30 mM e pH 8,0, e o eluente coletado de 10 em 10 mL em tubos de ensaio. A coluna foi lavada com o tampo Tris-HCl com 1 M de NaCl, at que nenhuma atividade enzimtica no eluente fosse detectada. Em cada tubo, foi determinado o teor de protenas e a atividade da GST. Dos tubos com presena de protenas e que apresentaram atividade da GST foi feito um pool dos extratos, onde foi adicionado 66 g de sulfato de amnia, para cada 100 mL do pool (para precipitao Cinc. agrotec., Lavras, v. 30, n. 2, p. 302-307, mar./abr., 2006

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TORRES, M. C. L. et al. linear. Os valores de abs foram previamente subtrados dos valores para a reao espontnea (sem adio do extrato de fgado). A unidade da atividade da enzima foi definida como a relao da taxa inicial da reao, com o valor do coeficiente de extino molar para o CDNB, nas condies do experimento (De =9,6 mM-1. cm-1), conforme Habig et al. (1974). A atividade especfica foi definida como a unidade da atividade da enzima, por mg de protena. Efeito do pH na atividade da enzima O efeito do pH da soluo-tampo usado na CMC, para reteno da enzima, foi testado, colocando-se 2 g de resina e 10 mL de tampo fosfato de potssio com pH variando de 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; e 7,5. Aps 24 horas de contato, o sobrenadante foi retirado e a resina testada em presena de 2 mL de extrato, contendo a enzima. Aps agitao por 15 minutos e repouso por uma hora na refrigerao, os tubos foram centrifugados a 8.000 x G, por 15 minutos. O sobrenadante foi coletado e teve sua atividade enzimtica determinada, conforme descrito anteriormente. Estabilidade da GST O pool , obtido do processo de extrao da coluna CMC, foi acondicionado em frasco mbar e estocado temperatura de 5 0C. A cada 10 dias foi determinada a atividade (conforme descrito anteriormente) para verificar a estabilidade na estocagem. RESULTADOS E DISCUSSO Os ensaios para a atividade da enzima foram realizados em pH e concentraes de substratos e GSH, conforme as recomendaes descritas na literatura para extrao e purificao da GST de fgado de ratos. Isso permitiu a comparao dos resultados com os valores encontrados em estudos similares. Os resultados obtidos no procedimento de extrao esto na Tabela 1. No extrato bruto, obtido do processo de homogeneizao e centrifugao, o fgado apresentou elevado contedo em protenas em relao s etapas seguintes, com decrscimo, na concentrao de protenas solveis, de 2450 para 106 mg, na ltima etapa de extrao, alcanando rendimento de 4,33%. Este percentual de rendimento foi inferior ao valor descrito por Habig & Jakoby (1981), para fgado de ratos, considerado a fonte mais fcil para purificao, devido s altas concentraes, em que as transferases representam aproximadamente 10% das protenas solveis.

da GST) e submetido centrifugao a 10.000 x G, por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado, de cada 100 mL, foi dissolvido em 30 mL de fosfato de potssio 30 mM em pH 6,7. A soluo obtida foi dialisada, em sacos de dilise, com porosidade para protenas at 12 KDa, com duas trocas de 2 litros desse tampo a cada 12 horas. A soluo dialisada foi aplicada numa coluna (2,5x 13 cm), previamente preparada com Carboximetilcelulose (CMC) (SIGMA), equilibrada com a mesma soluo-tampo, descrita anteriormente. A coluna foi lavada com dois volumes do tampo e, ento, foi eluda com volumes iguais ao volume da coluna, por um gradiente linear de 0 a 200 mM de KCl (0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 e 200) em tampo fosfato de potssio 30 mM e pH 6,7. Os eluentes desta coluna foram coletados em volumes de 5 mL, em tubos de ensaio, e foram determinados o teor de protenas e a atividade da enzima em cada tubo, obtendo-se um pool dos extratos daqueles tubos que apresentaram presena de protenas e atividade da GST. Atividade da GST A atividade da enzima GST citoslica foi determinada, de acordo com Habig et al. (1974), usando como substrato 1 cloro 2,4 dinitrobenzeno (CDNB) (SIGMA), preparado em 80% de etanol. O ensaio foi conduzido em triplicata a 250C, com tampo fosfato de potssio 0,1 M e pH 6,5, na presena de 1 mM de glutationa reduzida, 1 mM de CDNB e 100 L do extrato de fgado. Ensaio da mistura, sem adio da frao citoslica, foi usado como controle para verificar a taxa de reaes no-enzimticas. A correo nas medidas de absorbncia da reao com o extrato foi realizada pela subtrao da absorbncia na ausncia da enzima (controle). A variao da absorbncia, quando o substrato est conjugado com a glutationa, foi monitorada a 340 nm, usando um espectrofotmetro modelo GBC-UV 918. Em uma cubeta de 3 mL foi adicionada a mistura da reao, composta de 2.600 L de tampo fosfato potssio 0,1 M, pH 6,5 (quantidade suficiente para completar o volume de 3 mL), 150 mL de GSH (20 mM em gua deionizada), 150 mL de CDNB (20 mM em gua deionizada) e, por ltimo, 100 L do extrato de fgado. A taxa da reao foi iniciada pela adio do extrato e monitorada, a intervalos de 10 segundos, por um perodo de trs minutos. Os dados foram representados em grfico de abs (nm) versus tempo (segundos), e a taxa inicial foi determinada por regresso Cinc. agrotec., Lavras, v. 30, n. 2, p. 302-307, mar./abr., 2006

Extrao, purificao e avaliao da atividade ... TABELA 1 Purificao da Glutationa S-Transferase de fgado bovino.
Protena (mg) 2450+60,8 271+9,03 156+6,67 106+4,01 Ativ. Total (M .min -1 ) 26,04+0,76 6,25+0,36 3,23+0,17 5,73+0,22 Ativ. Especfica (M .min -1 .mg -1 de protena) 0,011+0,002 0,023+0,002 0,021+0,002 0,054+0,005

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Etapas da purificao Extrato bruto centrifugado Extrato da DEAE-celulose Extrato aps dilise Extrato da CM- celulose

Os dados so as mdias de trs repeties + erro padro.

A atividade total diminuiu medida que o processo de purificao foi ocorrendo, enquanto a atividade especfica foi elevada em cinco vezes. Esses dados de atividade total e da atividade especfica mostram comportamento semelhante aos resultados da literatura. Habig & Jakoby (1981) purificaram a GST de fgado de ratos e encontraram aumento na atividade especfica de, aproximadamente, 10, 42, 33 e 22 vezes maior para as principais transferases - AA, A, B e C, respectivamente - aps etapas de purificao com a CMC. No extrato bruto de crebro de bovino, Young & Briedis (1989) encontraram uma atividade especfica de 0,06 M.min -1. mg -1, aproximadamente s e i s v e z e s ma io r d o q u e a e n c o n tr a d a n e s te experimento com o extrato bruto de fgado bovino. Chico & Listowsky (2005) em extrao de GST de rato observaram que a distribuio da glutationa stransferase varia muito entre os rgos, sendo o fgado o que apresentou maior atividade. No extrato proveniente da coluna de DEAE-celulose possvel observar (Figura 1) que a concentrao de protena foi crescente a partir do tubo 22, alcanou o mximo de concentrao no tubo 39 e ocorreu declnio acentuado de 750 mg de protena para 150 mg no tubo 40. Em relao atividade especfica (Figura 1) a partir do tubo 20, a atividade foi aumentando gradativamente at o tubo 31 e alcanou o mximo de atividade entre os tubos 32 e 41. Um pool dos extratos dos tubos 22 a 42 foi formado e foram determinadas a concentrao de protena e a atividade especfica da GST, na presena do substrato CDNB. Na Figura 2 est representado o perfil da concentrao de protena eluda da coluna da CMC. Habig & Jakoby (1981) relataram que na coluna de CMC possvel separar a maioria das transferases e que, inicialmente, as transferases ficam retidas na coluna e

as outras protenas so eludas. Com a passagem do gradiente linear de KCl na coluna, as transferases so ento eludas. No entanto, observa-se na Figura 2 concentrao muito alta de protenas sendo eluda da coluna no incio do processo, antes de iniciar a passagem do gradiente de KCl. Acompanhando tambm o mesmo comportamento, essas protenas apresentaram atividade especfica elevada, em relao ao substrato CDNB, entre os tubos 8 e 16. Dois picos menores de atividade enzimtica podem ser observados prximos aos tubos 5 e 18. O efeito do pH da resina, na reteno da atividade enzimtica, no foi observado nos diferentes pHs a que se submeteu o extrato da GST, conforme observado na Figura 3. Em estudos realizados com fgado de ratos, Habig et al. (1974) identificaram quatro diferentes picos de sada de protenas, de acordo com a especificidade pelo substrato, e as GSTs foram chamadas de A, B, C, D e E, na ordem inversa de sua eluio, ou seja, a espcie eluda de mais alta troca inica, correspondendo ao ltimo pico de sada, foi nomeada de GST-A. A presena de ons na soluo da enzima, proporciou maior efeito tamponante e estabilidade, provavelmente, pode ter sido a condio que interferiu na adsoro da enzima, na coluna de CMC. Apesar das protenas no terem ficado retidas na coluna de CMC, elas apresentaram atividade com o CDNB, nas condies estabelecidas para as transferases extradas de fgado de ratos. Foi possvel obter um pool dos extratos, referentes aos tubos de nmero 5 ao 17, com atividade especfica cinco vezes maior do que a atividade no extrato bruto de fgado. Na avaliao da estabilidade da atividade da enzima no pool obtido da CMC nas condies de refrigerao (50C), observa-se na Figura 4 que a enzima manteve a atividade especfica estvel durante 70 dias. Cinc. agrotec., Lavras, v. 30, n. 2, p. 302-307, mar./abr., 2006

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TORRES, M. C. L. et al.

M/min.mg de protena

180

0 ,0 7 0 0 0 ,0 6 0 0 0 ,0 5 0 0 0 ,0 4 0 0

Protena (mg)

Protenan(mg) ) P r o te a ( m g

150 120 90 60 30 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61

0 ,0 3 0 0 0 ,0 2 0 0 0 ,0 1 0 0 0 ,0 0 0 0

Nmero de tubos Nmero de tubos

N me r o d e tu b o s

FIGURA 1 Perfil da concentrao de protena ( )e atividade especfica ( ) do extrato de fgado bovino eludo da coluna de DEAE-celulose.

FIGURA 2 Perfil da concentrao de protenas ( )e atividade especfica ( ) do extrato de fgado bovino eludo da coluna de Carboximetilcelulose (CMC)

M / m in M/min.mg . m g

0 ,0 5 5 0 ,0 5 0 ,0 4 5 0 ,0 4 4 4 ,5 5 5 ,5 6 6 ,5 7 7 ,5 8

pH pH

FIGURA 3 Atividade especfica do extrato na resina CMC com diferentes pHs.

( M / m de protena ( M/min.mgin . m g d e p r o t e n a )

Ativ. iEspecfica c f i c a A t v. E sp e

0 ,0 6

0 ,0 5

0 ,0 4 0 10 20 30 D ia s Dias 40 50 60 70

FIGURA 4 Estabilidade do pool do extrato obtido da coluna de CMC, temperatura de 50C.

Peters & Roelofs (1997) estudaram a estabilidade da GST de fgado de humanos em trs temperaturas de estocagem, durante 24 meses nas temperaturas de -20, 80 e -1960C no encontraram diferena significativa em relao sua atividade.

CONCLUSO A enzima Glutationa S- Transferase (GST), presente no extrato de fgado de bovino, apresentou atividade com o 1 cloro 2, 4 dinitrobenzeno (CDNB) em presena de glutationa (GSH). Aps a extrao e

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M /m in de d e p r o te n M/min.mg.m g protena a

Extrao, purificao e avaliao da atividade ... purificao em coluna de dietilaminoetil-celulose (DEAEcelulose) e Carboximetilcelulose (CMC) a atividade especfica da enzima aumentou cinco vezes. A atividade enzimtica no extrato obtido manteve-se estvel por 70 dias estocado temperatura de 50C. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BABBITT, P. C. Reengineering the glutathione Stransferase scaffold: a rational design strategy pays off. Proceeding National Academy Sciences, Washington, v. 97, n. 19, p. 10293-10300, 2000. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, New York, v. 72, p. 248-254, 1976. CHICO, D. E.; LISTOWSKY, I. Diverse expression profiles of glutathione S-transferase subunits in mammalian urinary bladders. Archives of Biochemistry and Biophysics, [S.l.], v. 45, n. 1, p. 56-64, 2005. DYBING, E.; DOE, J.; GROTEN, J.; KLEINER, J.; OBRIEN, J.; RENWICK, A. G.; SCHLATTER, J.; STEINBERG, P.; TRITSCHER, A.; WLAKER, R.; YOUNES, M. Hazard characterization of chemicals in food and diet. Food Chemical and Toxicology, London, v. 40, n. 1-2, p. 237-282, 2002. HABIG, W. H.; JAKOBY, W. B. Glutathione S-Transferase (rat and human). Methods in Enzymology, [S.l.], v. 77, n. 27, p. 218-239, 1981. HABIG, W. H.; PABST, M. J.; JAKOBY, W. B. Glutathione S-Transferases: the first enzymatic in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 249, n. 22, p. 7130-7139, 1974.

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