DHIONNE CORRIA GOMES

PRODUO DE ESCLEROTIORINA POR Penicillium sclerotiorum E OBTENO DE DERIVADOS COM APLICAO POTENCIAL EM ALIMENTOS

Faculdade de Farmcia da UFMG Belo Horizonte, MG 2011

DHIONNE CORRIA GOMES

PRODUO DE ESCLEROTIORINA POR Penicillium sclerotiorum E OBTENO DE DERIVADOS COM APLICAO POTENCIAL EM ALIMENTOS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincia de Alimentos Orientadora: Prof. Dr. Jacqueline A. Takahashi

Faculdade de Farmcia da UFMG Belo Horizonte, MG 2011 2

Dedico este trabalho minha famlia, que mesmo nos momentos mais difceis, deram sempre o impulso que eu precisava para pular em direo dos meus sonhos

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada possvel, e somente nEle se encontram as respostas. Professora Jacqueline, por ter acreditado e confiado em mim desde quando este projeto estava somente no papel. Por ser sempre exemplo de dedicao, de inteligncia, mas tambm de respeito, honestidade e f. minha me Helena, por ter me dado no somente o dom da vida, mas tambm por ter instigado em mim a curiosidade, e me transmitido a sabedoria e inteligncia. Aos meus irmos Diego e Diogo, meus melhores amigos, meus pilares, meu apoio. A meu pai. Aos colegas de laboratrio, em especial aos mais presentes: Fabiana, Karine, Ana Sarah, Adriana, Ana Paula, Willian, Bruna, Erick, Rafael, Camila, Paulo e Isabela pelo auxlio e por fazer com que o ambiente de trabalho, e consequentemente a realizao deste projeto, se tornasse mais agradvel. Aos meus amigos do CEFET e da graduao por estarem sempre presentes em minhas conquistas. Ao Philipe, pelo apoio, sensatez e compreenso nos momentos difceis. Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos, pela contribuio em minha formao cientfica, em especial professora Evelyn, presente em minha formao desde a poca da graduao. Aos amigos do laboratrio de Microbiologia Industrial, em especial Raquel e Ana Diolina, que foram parte fundamental na minha caminhada at aqui. Ivana e Vany, pelo auxlio na obteno e interpretao dos espectros de RMN e dos cromatogramas. Professora Cidinha, pelo auxlio com a identificao de fungos. Ao CNPQ e FAPEMIG, por terem fornecido os recursos necessrios para a realizao deste projeto. A todos os outros que, de uma maneira ou outra, com menor ou maior intensidade, ajudaram-me a construir este sonho.

S sabemos com exatido quando sabemos pouco. medida que vamos adquirindo conhecimento, instala-se a dvida Johann Wolfgang Von Goethe

SUMRIO
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... RESUMO ................................................................................................................... ABSTRACT ............................................................................................................... 1 INTRODUO ............................................................................................... 2 REVISO DA LITERATURA ......................................................................... 2.1 Biotecnologia ................................................................................................ 2.1.1 Biotecnologia da indstria de alimentos ......................................................... 2.2 Fungos ........................................................................................................... 2.2.1 Metablitos secundrios ................................................................................. 2.2.2 Azafilonas ....................................................................................................... 2.3 Penicillium sclerotiorum .............................................................................. 2.3.1 Esclerotiorina .................................................................................................. 2.4 Corantes naturais ......................................................................................... 2.4.1 Corantes naturais usados em alimentos ........................................................ 2.5 Biotransformaes ....................................................................................... 2.5.1 Beauveria bassiana ........................................................................................ 3 MATERIAL ..................................................................................................... 4 MTODOS ..................................................................................................... 4.1 Manuteno dos micro-organismos ........................................................... 4.2 Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum ........................................ 4.3 Purificao da esclerotiorina ...................................................................... 4.4 Biotransformao da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 4.4.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformao .................................................... 4.4.2 Anlise e purificao do biotransformado ...................................................... 4.5 Obteno de produtos de sntese com diazometano ............................... 4.5.1 Sntese ........................................................................................................... 4.5.2 Anlise e purificao ...................................................................................... 4.6 Biotransformao do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 4.6.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformao .................................................... 4.6.2 Anlise e purificao do produto biotransformado ......................................... 4.7 Obteno de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 4.7.1 Triagem de fungos .......................................................................................... 4.7.2 Anlise de CLAE ............................................................................................ 4.8 Identificao do Cladosporium sphaerospermum .................................... 5 RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................... 5.1 Produo e extrao da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum ...... 5.2 Purificao da esclerotiorina ...................................................................... 5.3 Biotransformao da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 5.3.1 Cultivo de Beauveria bassiana ....................................................................... 5.3.2 Obteno dos produtos biotransformados ..................................................... 5.3.3 Elucidao estrutural do Biotransformado 1 ................................................... 5.3.4 Elucidao estrutural dos outros biotransformados ....................................... 5.4 Sntese da 1-metil-esclerotiorina ................................................................ 5.4.1 Elucidao estrutural do Produto 1 ................................................................ 5.5 Biotransformao da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 5.6 Obteno de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 8 9 10 11 12 13 14 14 15 15 16 18 19 21 23 24 29 30 34 38 38 38 39 40 40 41 42 42 42 42 42 42 43 43 44 45 47 47 48 50 50 52 53 58 62 63 65 67 7

Identificao do Cladosporium sphaerospermum .......................................... Anlise por CLAE ........................................................................................... Interpretao dos resultados da triagem ........................................................ Interpretao dos resultados da biotransformao em uma etapa de B. bassiana ......................................................................................................... 5.6.5 Extrato de P. sclerotiorum .............................................................................. 5.7 Projeo para uso dos resultados em alimentos ...................................... 6 CONCLUSES .............................................................................................. 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. 8 APNDICES E ANEXOS ............................................................................... 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4

68 69 70 73 74 75 77 79 87

LISTA DE TABELAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Corantes naturais autorizados e suas principais fontes .................................... Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum ............... Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana ..................... Eluentes utilizados na coluna cromatogrfica de purificao da esclerotiorina . Gradientes de eluio utilizados na anlise do HPLC ....................................... Informaes obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, subespectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina ................... Massas das substncias isoladas da biotransformao da esclerotiorina por B. bassiana e respectivos rendimentos ............................................................. Deslocamentos qumicos dos tomos de carbono inseridos na molcula de esclerotiorina pela biotransformao ................................................................. Resultado da anlise elementar do biotransformado 1, e nmero de tomos correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de massas ESI-MS ................................................................................................. Propriedades fsico-qumicas do biotransformado 1 ......................................... Propriedades fsico-qumicas do biotransformado 4 ......................................... Propriedades fsico-qumicas do biotransformado 5 ......................................... Propriedades fsico-qumicas da 1-metil-esclerotiorina ..................................... Algumas referncias bibliogrficas sobre biotransformaes realizadas pelos fungos utilizados neste experimento ................................................................. Substncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformao de mais de um fungo ....................................................................................................... 25 36 36 39 44 51 53 54

10 11 12 13 14 15

55 60 61 61 66 67 73

LISTA DE FIGURAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Classes de metablitos secundrios fngicos ................................................... Fruto de Garcinia atroviridis ............................................................................... Metablitos secundrios isolados de P. sclerotiorum ........................................ Dimerizao do herbertenediol .......................................................................... Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ Corantes produzidos por fungos ........................................................................ Possveis mudanas estruturais das antocioanidinas em meio aquoso em funo do pH ..................................................................................................... Estrutura bsica do corante Arpink Red e estruturas das Monascusonas A e B ........................................................................................................................ Estruturas da Ankaflavina e Monascina ............................................................ Reduo assimtrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana .............................. Oxidao da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana ................................. Hidroxilao de um derivado do adamantano por B. bassiana ......................... 4-O-metil-glicosilao do composto CGP-62706 por B. bassiana ................... Hidrlise do composto CGP-291 por B. bassiana ............................................. Acetilao da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana ............................................. Produtos formados pela desmetilao do Diuron por B. bassiana .................... Montagem das vidrarias na preparao de diazometano .................................. Penicillium sclerotiorum em gar batata inclinado aps 3 dias. Frente (A) e verso (B) do tubo ............................................................................................... Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ Cromatografia em camada delgada comparativa do padro de esclerotiorina (A) e o extrato de Penicillium sclerotiorum (B) .................................................. Coluna cromatogrfica de purificao da esclerotiorina em trs etapas de eluio ............................................................................................................... Beauveria bassiana em gar batata inclinado aps 3 dias. Frente (A) e verso (B) do tubo ......................................................................................................... Comparao entre os deslocamentos qumicos de RMN de 13C da esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ...................... Comparao entre os deslocamentos qumicos de RMN de 13C da isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ............... Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando os diferentes cromforos ........................................................................................ Correlaes observadas no espectro bidimensional de HMBC para o biotransformado 1 .............................................................................................. Correlaes observadas no espectro bidimensional de HMBC para o biotransformado 1 .............................................................................................. Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1 ................................... Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5 ............................ Provvel estrutura do biotransformado 4 ........................................................... Provvel estrutura do biotransformado 5 ........................................................... Mecanismo proposto para a reao entre azafilonas e aminas primrias ........ Reao de formao do diazometano ............................................................... Comparao entre os deslocamentos qumicos da esclerotiorina (em preto) e do Produto 1 (em vermelho) .............................................................................. Correlaes observadas no mapa de contornos HMBC para o produto 1 ........ Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina) ................................. 17 20 20 21 21 24 27 28 28 30 31 31 32 32 32 33 37 47 48 49 49 52 54 55 56 57 57 57 58 59 59 62 62 64 64 65 9

37 38 39

40 41

Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum ............................................... Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente (A) e verso (B) ............................................................................................................ Caractersticas microscpicas do Cladosporium sphaerospermum. Conidiforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reproduo assexuada (d) ................................................................................. Cromatograma da biotransformao em duas etapas em contraste com o cromatograma dos biotransformados isolados .................................................. Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum ......................................

68 68

69 74 75

LISTA DE SIGLAS
CCD CEPT CLAE COSY DEPT ESI-MS FDA HDL HIV HMBC HPLC HSQC IV LDL NADPH NOESY RMN TOCSY UFMG USP UV Cromatografia em coluna delgada Protena de transferncia de colesterol esterificado Cromatografia lquida de alta eficincia Correlation spectroscopy Distortionless enhancement by polarization transfer Espectroscopia de massas por ionizao por eletrospray Food and Drug Administration Lipoprotena de alta densidade Vrus da imunodeficincia humana Heteronuclear multiple bond correlation Cromatografia lquida de alta eficincia Heteronuclear single quantum coherence Infravermelho Lipoprotena de baixa densidade Fosfato de dinucletido de nicotinamida e adenina Nuclear Overhauser effect spectroscopy Ressonncia magntica nuclear Total correlation spectroscopy Universidade Federal de Minas Gerais Universidade de So Paulo Ultravioleta

10

RESUMO
O fungo Penicillium sclerotiorum produz uma grande variedade de metablitos secundrios, entre eles, a esclerotiorina, que tem tido aplicaes nas indstrias alimentcia e farmacutica. Devido sua forte colorao alaranjada, sua capacidade antioxidante, potencial atividade biolgica de reduo do colesterol plasmtico e no tratamento da diabetes, esta substncia tem sido alvo de diversos estudos na rea de alimentos. Neste projeto, foram produzidas substncias atravs da biotransformao da esclerotiorina com o fungo Beauveria bassiana, obtendo-se cinco produtos de forte colorao avermelhada. A mudana na colorao da substncia aconteceu devido troca de um heterotomo de oxignio ligado ao carbono 1 da molcula de esclerotiorina por um tomo de nitrognio. O experimento de biotransformao foi repetido utilizando, como substrato, a 1-metil-esclerotiorina, uma substncia semi-sinttica, porm os mesmos resultados no foram obtidos. Aps a obteno destes resultados, foi feita uma triagem com 14 diferentes espcies de fungos, alm de Beauveria bassiana, para verificar a capacidade destes fungos em biotransformar a esclerotiorina. Os extratos foram analisados por CLAE e mostraram que, destes 14 fungos, nove foram capazes de biotransformar a molcula de esclerotiorina em uma ou mais substncias que apresentaram colorao avermelhada.

Palavras-chave: esclerotiorina, biotransformao, corantes, alimentos

11

ABSTRACT
The fungus Penicillium sclerotiorum produces a wide variety of secondary metabolites, among them the sclerotiorin, which has many uses in food and pharmaceutical industries. Due to its strong orange color, its antioxidant activity and other functions related to cholesterol reduction and treatment of diabetes, this substance has been subject of extensive studies in food science. In this project, substances were produced by esclerotiorin biotransformation with the fungus Beauveria bassiana. Five new products with strong red color were obtained. The change in coloration of the molecule was due to the exchange of the oxygen heteroatom attached to sclerotiorin carbon 1 by a nitrogen atom. The biotransformation experiment was repeated using, as substrate, 1-methyl-sclerotiorin, a semi-synthetic substance, but the same results were not obtained. After these results, it was performed a screening with 14 different fungi, besides Beauveria bassiana, to evaluate their capacity to biotransform sclerotiorin. The extracts were analyzed by HPLC and showed that, from these 14 fungi, nine were able to transform sclerotiorin molecule in one or more substance with red color.

Key words: sclerotiorin, biotransformation, colorants, food

12

INTRODUO
Os fungos podem ser utilizados na indstria de duas maneiras: como agentes produtores de alguma substncia de interesse ou como promotores de reaes para a produo de importantes substncias, sendo os dois processos conhecidos como, respectivamente, fermentao e biotransformao. Utilizando-se processos

fermentativos, podem-se obter substncias de atividades interessantes como antioxidantes, antimicrobianos ou corantes. Os corantes naturais, isolados de plantas ou micro-organismos, podem apresentar atividades importantes na indstria farmacutica e de alimentos. H necessidade constante de estudos nessa rea, pois grande parte desse potencial biotecnolgico no explorado. As biotransformaes, por serem regio e estereoespecficas, so pontos importantes na produo de variadas substncias. O uso de micro-organismos para a promoo de determinada reao causa reduo de tempo e custo, pois dispensa o uso de grandes quantidades de reagentes qumicos e controle das condies do meio reativo. Muitos produtos de biotransformao so utilizados na indstria farmacutica e de alimentos. O objetivo geral do trabalho foi produzir derivados do corante natural fngico esclerotiorina que possam posteriormente ser usados como corantes, anti-oxidantes ou conservantes alimentares. Os objetivos especficos foram: Produzir esclerotiorina a partir do cultivo do fungo Penicillium sclerotiorum por meio de fermentao em meio submerso; Extrair e purificar a esclerotiorina do meio de cultivo utilizando tcnicas cromatogrficas; Obter derivados da esclerotiorina em reaes de sntese com diazometano; Obter produtos biotransformados da esclerotiorina e de derivados com o emprego do fungo Beauveria bassiana, visando a produo de azafilonas inditas; Avaliar a possibilidade de produo de derivados inditos da esclerotiorina por outros fungos presentes na coleo de fungos do LaB.

13

REVISO DA LITERATURA
2.1 Biotecnologia
Biodiversidade ou diversidade biolgica refere-se variedade de vida na Terra, como o resultado de bilhes de anos de evoluo, compreendendo um nmero extraordinrio de plantas, animais e micro-organismos. Embora demasiadamente afetada pela interveno humana, a biodiversidade tem fornecido muitos microorganismos e molculas com importantes atividades metablicas, farmacolgicas e grande valor de mercado. Quando corretamente explorada por pases de rica biodiversidade (usualmente pases em desenvolvimento ou subdesenvolvidos), o uso dos recursos naturais de forma sustentvel torna-se ferramenta para a diminuio da pobreza, beneficiando tambm o planeta como um todo (Rouhi, 2003). Da extensa biodiversidade brasileira, somente uma pequena frao de espcies de plantas e micro-organismos j foi estudada quimicamente (Gottlieb, 1980; Hawksworth, 1991). Atualmente, a prospeco da biodiversidade tem sido ativamente direcionada ao desenvolvimento de novos frmacos, em processos dinmicos de monitoramento da atividade biolgica, bem como para a descoberta de novos micro-organismos para serem usados em processos industriais visando produo de alimentos ou aditivos alimentares (Araujo et al., 2006). A biotecnologia industrial atua no desenvolvimento de produtos e processos utilizando seres vivos, ou parte deles, sendo uma rea de grande importncia na indstria de alimentos e medicamentos, principalmente quando integrada prospeco da biodiversidade (Butler, 2004). Processos fermentativos so utilizados na indstria qumica para a produo de solventes, cidos orgnicos, principalmente os cidos ctrico, ltico, fumrico e giberlico. Metais diversos, como o cobre, zinco, prata, ouro ou urnio podem ser extrados com o emprego de micro-organismos, a partir de minrios de baixo teor (Borzani et al., 2008). Os processos biotecnolgicos na indstria farmacutica englobam a produo de antibiticos, esterides, vitaminas, aminocidos, polissacardeos e vrias protenas. Modificaes na estruturas de esterides e antibiticos so obtidas com o uso de micro-organismos que podem proporcionar reaes de hidroxilao, hidrogenao, desidrogenao, hidrlise, esterificao, isomerizao, aminao ou ruptura de cadeias (Borzani et al., 2008). 14

Processos de tratamento biolgico dos resduos (guas residuais, lixo) tambm so processos fermentativos. H, ainda, os processos que tem por objetivo a produo industrial de micro-organismos que podem ser utilizados como fixadores de nitrognio do ar na agricultura (bactrias do gnero Rhizobium), no controle biolgico de pragas (bactrias do gnero Bacillus), na produo de vacinas (Borzani et al., 2008), ou ainda para produo de massa celular como para produo de fermento biolgico (levedura prensada) ou de levedura forrageira (single cell protein). 2.1.1 Biotecnologia na indstria de alimentos A produo de alimentos fermentados, principalmente bebidas, representa o maior uso dos micro-organismos na indstria alimentcia. H pesquisas consolidadas onde os melhores parmetros para este tipo de fermentao so descritos, bem como tem sido descrita a utilizao de resduos da indstria de alimentos para a produo destas bebidas (Alvarenga, 2006 e Alvarenga et al., 2008). Os leites fermentados tem sido alvo de grande nmero de estudos, devido aos benefcios comprovados destes alimentos (Gonzles-Snchez et al., 2010). Alm disso, destaca-se a produo de vinagres, manteigas, queijos, picles, chucrute, azeitonas, po e cacau. Concentrados protico-vitamnicos so produzidos atravs de algas e leveduras do gnero Candida. O enriquecimento protico de farinhas e farelos pode ser feito pela ao de bolores (Aquarone et. al., 2008). Fungos tambm podem ser utilizados em processos de biorremediao para uso de gua proveniente de indstria de alimentos (Azab, 2000).

2.2 Fungos
Os fungos so organismos eucariotas, podendo ser unicelulares, como as leveduras, ou pluricelulares, como os cogumelos, sendo diferenciados dos outros reinos por possurem parede celular contendo quitina, e ausncia de clorofila (Tortora et al., 2002). Os fungos filamentosos e leveduras apresentam a vantagem de crescimento relativamente fcil em processos fermentativos, sendo bem adaptveis produo industrial (Smedsgaard e Nielsen, 2004). O grande avano, intrnseco ao uso de fungos e seus metablitos secundrios, advm de mltiplos fatores, como a relativa facilidade de produo do metablito ativo por fermentao; a concomitante pronta possibilidade de um scale up do processo 15

fermentativo; o fato de que mesmo espcies comuns de fungos, como aquelas dos gneros Penicillium e Aspergillus, conhecidos por sua ubiqidade, produzem metablitos bioativos (Takahashi e Lucas, 2008). A produo de antibiticos por fungos tem algumas caractersticas, comuns produo de outros metablitos secundrios: a produo do metablito especfica da linhagem; h uma instabilidade no processo biossinttico, com tendncia a uma diminuio com repiques sucessivos usados para a manuteno das linhagens; a produo de antibiticos segue uma cintica de crescimento fngico associado a um meio de cultura especfico (Wijeratne et al., 2004); o aumento da produtividade freqentemente ocorre na etapa de esporulao do microorganismo; e a variedade estrutural dos metablitos biossintetizados pode ser aumentada com pequenas variaes das condies de cultivo (Takahashi e Lucas, 2008). Fungos do filo Basidiomycota e Ascomycota sempre foram utilizados na alimentao humana, principalmente nos pases orientais. Estudos sobre o perfil nutricional de fungos filamentosos mostram que a biomassa de alguns fungos inferiores apresenta alto teor de protenas, com destaque para Penicillium sclerotiorum, Penicillium janthinellum, Syncephalastrum racemosum e Rhizopus stolonifer. Fungos da espcie Penicillium sclerotiorum, P. citrinum e P. pinophillum apresentam boa relao entre cidos graxos poliinsaturados e saturados, podendo ser considerados alimentos saudveis (Carvalho, 2009). 2.2.1 Metablitos secundrios Metablitos secundrios so diferenciados dos primrios por no participarem das reaes bsicas fundamentais sobrevivncia dos micro-organismos. So geralmente bioativos, de baixa massa molecular e so produzidos como famlias de compostos em partes restritas do ciclo de vida, geralmente na fase exponencial do crescimento fngico, com a produo geralmente correlacionada a um estado especfico de diferenciao morfolgica (Keller et al., 2005). Alm das plantas, apresentam metabolismo secundrio alguns micro-organismos como as bactrias filamentosas, as bactrias formadoras de esporos e os fungos filamentosos. Peptdeos, alcalides, terpenos e policetdeos so grupos representativos de metablitos secundrios (Figura 1).

16

Figura 1 Classes de metablitos secundrios fngicos (adaptado de Keller et al. 2005) 17

Considerando os vinte medicamentos mais prescritos atualmente, seis so substncias provenientes do metabolismo secundrio de fungos. Levando-se em conta que apenas 5% dos fungos esto descritos, h um potencial muito grande a ser explorado. A busca de metablitos secundrios deve ser feita levando em conta que sua sntese pode corresponder ao nicho ecolgico do fungo e que a interao entre metablitos pode induzir um aumento de sua produo (Schulz et al. 2002). O primeiro produto cristalino considerado um metablito bioativo foi o cido micofenlico, isolado de Penicillium glaucoma, em 1896, por Gosio. Alguns produtos do metabolismo de fungos tem sido usados na prtica de diferentes maneiras como, pela aplicao direta do produto na medicina, agricultura ou indiretamente, usando-se o produto original como material de partida para subseqente modificao qumica ou microbiolgica (biotransformaes), ou utilizando-o como composto principal para snteses qumicas de novos anlogos (Brdy, 2005). A grande maioria dos metablitos bioativos produzidos por fungos vem de espcies da classe dos ascomicetos e outros fungos filamentosos, alm de espcies endofticas (fungos que vivem associados a plantas). Algumas espcies de basidiomicetos vem sendo estudadas, como o caso do Mycena leaiana, um fungo superior de colorao laranja, cuja substncia responsvel pela cor apresenta atividade antibitica. O nmero total de substncias bioativas conhecidas produzidas por fungos de aproximadamente 8600, representando 38% de todos os produtos microbianos (Brizuela et al. 1998; Brdy, 2005). Alguns fungos so capazes de produzir metablitos secundrios, muitos dos quais so txicos e mesmo cancergenos tanto para o homem, como para os animais. Fungos que crescem nos alimentos, produtores de metablitos txicos, so chamados toxignicos e os metablitos so denominados micotoxinas (Sabino et al., 1982). Entre as micotoxinas de grande interesse para a Sade Pblica e de importncia agroeconmica esto as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona,

fumonisinas e os alcalides do ergot. Uma nica espcie de fungo capaz de produzir uma ou vrias micotoxinas, e uma mesma micotoxina pode ser produzida por diferentes espcies de fungos (Hussein e Brasel, 2001). 2.2.2 Azafilonas Os policetdeos fngicos podem variar de tetracetdeos a octacetdeos, tendo entre 4 ou 8 unidades C2 que contribuem para a cadeia policetdica. Alguns so produzidos por biosntese mista, podendo envolver a rota da sntese dos aminocidos 18

ou

terpenides.

Esta

classe

inclui

as

antraquinonas,

hidroxiantraquinonas,

naftoquinonas e azafilonas, cada uma contendo grande variedade de cores (Mapari et al. 2010). As azafilonas so um grupo de substncias que geralmente apresentam colorao forte. Pertencem a uma classe de metablitos secundrios estruturalmente diversa, com uma estrutura pirona-quinona, contendo um anel bicclico altamente oxigenado e um centro quaternrio quiral (Osmanova et. al., 2010). Azafilonas exibem uma ampla gama de interessantes atividades biolgicas, como atividade antibacteriana, antiviral, antifngica, antioxidante, citotxica, nematicida e antiinflamatria. A potente atividade no seletiva das azafilonas pode estar relacionada formao de -piridonas (Osmanova et. al., 2010). A maioria das espcies produtoras de azafilonas so pertencentes aos gneros Penicillium, Monascus, Chaetomium e Talaromyces (Osmanova et. al., 2010). Musso e colaboradores investigaram a capacidade de inibio da protena molecular Hsp90 por azafilonas sintetizadas por Bulgaria inquinans, Monascus purpureus e Arpergillus deflectus, assim como seus derivados semi-sintticos. A protena Hsp90 atua na proliferao celular e sua inibio pode ser benfica no tratamento do cncer (Musso et al. 2010).

2.3 Penicillium sclerotiorum

Muitas espcies do gnero Penicillium possuem a capacidade de produzir substncias bioativas, como a xestodecalactona, que possui propriedades antifngicas (Edrada et al., 2002) e a metil-acetal-atrovenetinona, substncia com atividade anti-HIV (Shiomi et al., 2005). Penicillium sclerotiorum um micro-organismo mesfilo, de colorao

esverdeada, com aspecto cotonoso. Est presente em solos, porm, j foi isolado do interior da planta Garnicia atroviridis (Figura 2), podendo, portanto, ser tambm classificado como fungo endoftico. Os extratos isolados com hexano e acetato de etila de P. sclerotiorum apresentam atividade antimicrobiana e anti-HIV. A investigao qumica dos extratos de P. esclerotiorum levou identificao das seguintes azafilonas: penicilazafilona A (13) e B (14) e decloroisocromofilona III (15), alm de outras substncias: penicilisorina (16), 2,4-di-hidroxi-6-(5,7S-dimetil-2oxo-trans-3-trans-5-nonadienil)-3-metilbenzaldedo (17), cido (2E,4E,6S)-4,6-di19

metilocta-2,4-dienico

(18)

(5S,6R)-5,6-di-hidro-3,5,6-trimetilpiran-2-ona

(19)

(Arunpanichlert et al., 2010). Porm, o constituinte em maior concentrao nos extratos de P. sclerotiorum a azafilona esclerotiorina (20) (Arunpanichlert et al., 2010). Lucas e colaboradores descreveram estudos sobre a atividade antimicrobiana de trs substncias isoladas dos extratos de P.sclerotiorum, pencoldeo (21), isocromofilona VI (22), alm da esclerotiorina (20). As estruturas moleculares se encontram representadas na Figura 3 (Lucas et. al., 2007; Arunpanichlert et. al., 2010).

Fonte: The Plant Observatory, 2010 Figura 2 Fruto de Garcinia atroviridis

Figura 3 Metablitos secundrios isolados de P. sclerotiorum 20

Espcies do gnero Penicillium, alm da produo de metablitos, possuem um longo histrico de uso biotecnolgico na produo de enzimas. Knob e Carmona descreveram uma -xilosidase com grande atividade extrada de P. sclerotiorum. Esta enzima degrada a xilana, a mais abundante fonte de carbono no-celulsica presente em madeira e resduos agroindustriais. A adio desta enzima a raes animais pode aumentar seu valor nutritivo. Outro uso seria na clarificao e macerao de sucos e vinho (Knob e Carmona, 2009). Penicillium sclerotiorum tambm relatado na literatura como til em alguns experimentos de biotransformao, como a dimerizao do herbertenediol (23), para formar mastigoforenos A (24) e B (25), como mostrado na Figura 4 (Harinantenaina et. al., 2005).

Figura 4 Dimerizao do herbertenediol 2.3.1 Esclerotiorina O constituinte qumico predominante em P. sclerotiorum a esclerotiorina (20), pigmento contendo um tomo de cloro. A esclerotiorina (20) foi primeiramente isolada em 1940 por MacCurtin (MacCurtin e Reilly, 1940). Estudos vm mostrando que este pigmento possui algumas atividades biolgicas interessantes, como a induo de formao de clamidosporo, clula hifal que se comporta como esporo no fungo, de maior resistncia trmica (Weng et al., 2004).
O O O O O

20
Cl

Figura 5 Estrutura molecular da esclerotiorina

21

A esclerotiorina (20) tem tido aplicaes importantes na indstria de alimentos, como, por exemplo, a inibio da lipoxigenase. Esta enzima catalisa a oxidao regio e estereoespecfica de cidos graxos contendo um sistema cis,cis-1,4-pentadieno, formando hidroperxidos. A peroxidao de cidos graxos provoca a rancificao de alimentos oleoginosos e gorduras de origem vegetal e animal, alterando o sabor, odor, colorao e reduzindo seu valor nutritivo. Em mamferos, os produtos das reaes catalisadas pela lipoxigenase so responsveis por uma grande variedade de desordens, como aterosclerose, alergias, inflamao, asma e hipersensibilidade. Por esse motivo, inibidores da lipoxigenase podem ser usados tanto em indstria de alimentos, como antioxidantes; ou em setores de sade, graas a seus benefcios farmacolgicos (Chidananda e Sattur, 2007). Sabe-se tambm que a esclerotiorina (20) capaz de inibir a protena de transferncia de colesterol esterificado (CETP). A CETP conhecida por transferir colesterol esterificado entre as lipoprotenas do plasma. Vrios fatores indicam a importncia desta protena no desenvolvimento da aterosclerose, pois ela diminui a concentrao do colesterol nas lipoprotenas de alta densidade (HDL). Pessoas com deficincia gentica de CETP possuem alto HDL, baixos nveis de lipoprotena de baixa densidade (LDL) e apresentam baixa incidncia de aterosclerose (Tomoda et al., 1999). Outra atividade importante da esclerotiorina (20) a inibio da enzima aldose redutase, uma oxiredutase dependente de NADPH que catalisa a converso de glicose em lcool, e promove acmulo de sorbitol em vrios tecidos, quando em condies de hiperglicemia, como o caso da diabetes mellitus. Este nvel elevado de sorbitol pode levar a vrias complicaes como retinopatia, catarata, neuropatia e nefropatia. Os inibidores da aldose redutase podem reverter essa mudana bioqumica ou at prevenir estas complicaes (Chidananda et al., 2006). Alm dos possveis usos na rea de alimentos, estudos mostram vrias outras atividades farmacolgicas interessantes da esclerotiorina (20), como a inibio da monoamina oxidase, alvo da ao de antidepressivos; inibio do receptor de endotelinas, responsvel pela vasoconstrio e fibrose de vasos sanguneos; ou at mesmo sua atividade antibacteriana (Pairet et al., 1995; Weng et al., 2004). Estudos mais recentes mostram uma atividade inibidora da protease e invertase do HIV (Arunpanichlert et al., 2010).

22

2.4 Corantes naturais

Um corante natural definido como um pigmento que sintetizado e acumulado ou excretado a partir de clulas vivas. Certos pigmentos, assim como fenis oxidados e outros derivados mais simples de fenis podem ser formados at mesmo por clulas em processo de morte (Hendry, 1996). A presena ou ausncia de colorao de uma molcula biolgica determinada por sua estrutura, principalmente a estrutura eletrnica, o tamanho da molcula, solubilidade e a composio elementar. Algumas alteraes na estrutura de molcula incolores podem fazer com que ela absorva energia em comprimentos de onda menos energticos, e consequentemente, do cor substncia. Esta alterao chamada de mudana batocrmica e pode ser causada por seis modificaes estruturais: aumento do tamanho da cadeia, ramificao da cadeia carbnica, rearranjo em um simples anel, adio de nitrognio ou oxignio, ligao de dois ou mais anis e adio de certos metais de transio. Molculas que j possuem colorao, ao sofrerem uma mudana batocrmica, podem ter sua colorao alterada (Hendry, 1996). Fungos filamentosos, particularmente ascomicetos e basidiomicetos, e liquens so conhecidos por sintetizarem e secretarem diversas classes de pigmentos, como metablitos secundrios, que possuem uma extraordinria gama de cores. Cogumelos e liquens so difceis de cultivar em laboratrio, e, consequentemente, difceis de extrapolar a produo de seus metablitos para escala industrial. Muitos ascomicetos, ao contrrio, so adequados produo industrial pela facilidade de crescimento em laboratrio. O controle das condies de cultivo em biorreatores minimiza as variaes entre lotes (Mapari et al. 2010). Diferentemente das plantas, fungos no produzem clorofilas e poucas espcies so produtoras de carotenos. Algumas espcies fngicas acumulam substncias pigmentadas que, em geral, esto ausentes ou presentes somente em baixas concentraes em espcies de outros reinos, como o caso da riboflavina (vitamina B2), que proporciona a colorao amarela a fungos dos gneros Russula e Lyophyllum. Os nicos pigmentos comuns entre fungos e plantas ou animais so as betalanas, melaninas, um pequeno nmero de carotenides e algumas antraquinonas (Hendry, 1996). Os pigmentos policetdeos so encontrados predominantemente nos

ascomicetos, e em alguns basidiomicetos. Alm desses, as terfenilquinonas e outros 23

derivados fenlicos, como os derivados dos cidos fenilpropanico e cinmicos tambm so responsveis pela colorao de alguns fungos (Hendry, 1996). Os corantes sintetizados por fungos apresentam diversas funes, variando de proteo contra foto-oxidantes letais, como os carotenides, proteo contra o estresse ambiental, como as melaninas, ou at agindo como cofatores em catlises enzimticas, como o caso das flavinas (Mapari et al. 2005). A Figura 6 apresenta a estrutura de algumas classes de corantes produzidos por fungos, o -caroteno (26), um carotenide, a monascina (27), um policetdeo e o cido leprarnico (28), uma terfenilquinona.

Figura 6 Corantes produzidos por fungos (adaptado de Hendry, 1996) 2.4.1 Corantes naturais usados em alimentos Corantes utilizados em alimentos so chamados aditivos de cor. Segundo o FDA, aditivo de cor qualquer corante, pigmento ou substncia que, quando adicionado ou aplicado a um alimento, droga ou cosmtico, ou at ao corpo humano, capaz de, sozinho, ou atravs de reaes com outras substncias, transmitir cor (FDA, 2010). Aditivos de cor so utilizados em alimentos por muitas razes: para encobrir a perda de cor devido exposio luz, ar, temperaturas extremas, umidade e condies de estocagem; para corrigir variaes naturais na cor; para melhorar cores que existem naturalmente e para prover cor a alimentos sem cor. Refrigerantes de cola, margarina e balas de menta so exemplos de alimentos que possuem a colorao devido ao uso de aditivos (FDA, 2010).

24

A preferncia dos consumidores por corantes extrados de fontes naturais est associada imagem de serem produtos saudveis e de boa qualidade. Corantes sintticos tendem a ser julgados como indesejveis e prejudiciais. Alguns so considerados responsveis por reaes alrgicas e intolerncias (Blenford, 1995). Os corantes naturais mais utilizados esto listados na Tabela 1: Tabela 1 Corantes naturais autorizados e suas principais fontes (adaptado de Mapari et. al., 2005) Pigmento cido carmnico e carmina Antocianinas Fonte Cochonilha fmea inseto do Peru e Equador Sabugueiro, uva, cenoura roxa, repolho Betanina Caramelo Carbo medicinalis Carotenides -caroteno Bixina ou norbixina Capsantina e capsorubina Licopeno Lutena Cantaxantina Clorofila Clorofilina (complexo cprico da clorofila) Curcumina Riboflavina Rizoma de planta (Curcuma longa) da ndia Semi-sinttica, usando ribose produzida por fermentao bacteriana Amarelo Laranja-amarelo Tomate (Lycopersicum esculentum) Malmequer (Tagestas erecta) Salmo, camaro e flamingos Grama, luzerna e urtiga Grama, luzerna e urtiga Amarelo dourado Rosa alaranjado Verde a oliva Verde azulado Vermelho alaranjado leo de palma Sementes de urucum (Bixa orellana) da Amrica do Sul Pprica (Capsicum annum L.) Laranja avermelhado Amarelo a laranja Laranja Beterraba Carboidratos comestveis Planta Gama de cor Laranja a vermelho Rosa a vermelho Rosa/vermelho a azul/malva dependente do pH Rosa a vermelho Marrom Preto

25

Os corantes naturais que so atualmente autorizados para uso na Unio Europia so derivados de variadas fontes, de plantas a insetos, como o caso do cido carmnico, derivado da cochonilha, um inseto da famlia Dactylopiidae. A atual produo de corantes naturais depende do suprimento externo e sazonal de diversos materiais, resultando em variaes no perfil do pigmento extrado. Como os corantes so extrados de fontes naturais, eles so, na maioria dos casos, misturas de composio variada que dependem do cultivar e das condies climticas, e so difceis de serem caracterizados no que diz respeito pureza e presena de contaminantes (Mapari et al. 2010). H uma grande variao na estabilidade e funcionalidade de diferentes classes de corantes naturais existentes. Problemas de estabilidade perante aquecimento, luz e pH limitam a aplicao de certos corantes a certos tipos de produtos. Antocianinas so flavonides e so caracterizadas por uma estrutura catinica bsica. A cor violeta bsica de antocioaninas sensvel oxidao, branqueando com dixido de enxofre, e variando com o pH, o que limita a sua aplicao a alimentos cidos e bebidas. A Figura 7 representa as mudanas na estrutura de antocionanidinas que resultam na mudana da colorao. Betaninas, carotenides e pigmentos de clorofila so facilmente descoloridos por oxidao, sendo sensveis luz, ao aquecimento e ao oxignio. O corante curcumina apresenta um problema diferente, pois este pigmento carrega um sabor picante, o que limita o seu uso como corante (Mapari et. al., 2005).

26

R OH

R OH

HO

O R'

OHH
+

O R'

29
OAcar OH

30
OAcar OH

pH 1-2 ction flavlico, vermelho H+ -H2O OH+H2O

R

-H 2

O O +H 2

pH 6,5-8 anidrobase, violeta H+ OH-

R O-

OH OH HO O R' OAcar OH OH O O R'

32
pH 9-12 anidrobases, azul

OAcar

31
H+
O-

pH<6 carbinol, incolor

R

OH-

R O-

O-O

O R'

O
+

O R'

H
OAcar O-

OH-

OAcar

pH 13-14 pseudobase chalcona, amarelo

33

34
O-

Figura 7 Possveis mudanas estruturais das antocioanidinas em meio aquoso em funo do pH (Terci e Rossi, 2002)

Estudos sobre corantes produzidos por fungos visam a sua utilizao em alimentos. Na Repblica Checa, um novo corante de alimentos chamado Arpink Red TM (35), uma antraquinona produzida por Penicillium oxalicum, foi liberado para comercializao entre 2004 e 2006. Fungos do gnero Monascus so utilizados no sul da China, Japo e sudeste da sia para produzir vinho vermelho de arroz, queijo de soja vermelho e Anka (arroz vermelho). Estes fungos so conhecidos por produzirem pigmentos que variam do laranja ao violeta, alm das monascusonas A (36) e B (37), pigmentos amarelos descobertos recentemente. Estes pigmentos, alm do corante de alimentos Arpink RedTM (35) esto representados na Figura 8. Entretanto, algumas cepas de Monascus tambm produzem citrinina, uma micotoxina, o que limita o seu 27

uso na rea de alimentos. No Japo, apenas a espcie Monascus purpureus autorizada para uso em alimentos (Mapari et. al., 2005 e Mapari et. al., 2010).

Figura 8 Estrutura bsica do corante Arpink Red e estruturas das Monascusonas A e B

A toxicidade de outros policetdeos produzidos por fungos, principalmente do gnero Monascus, tm sido pesquisada. O pigmento amarelo ankaflavina (38) e seu anlogo estrutural, monascina (39) (representados na Figura 9), apresentam baixa ou nenhuma citotoxidade para clulas, o que indica que so substncias seguras, se consumidas em doses apropriadas (Mapari et. al., 2010).

Figura 9 Estruturas da Ankaflavina e Monascina

Corantes vermelhos e amarelos tem sido amplamente usados em alimentos, porm ainda h uma demanda de corantes azuis. Os ascomicetos so capazes de produzir policetdeos que variam do vermelho ao amarelo, e at mesmo verde e azul. 28

Muitos destes corantes apresentam atividade anti-oxidante e anti-aterognica, e alguns j possuem estudos sobre sua toxicidade. Alm de alguns policetdeos produzidos por Monascus, corantes laranjas extrados de P. aculeatum e corantes amarelos extrados de E. nigrum so potencialmente seguros. Porm, grande parte dos corantes estudados so instveis luz, o que pode degradar a colorao apresentada (Mapari et. al., 2010).

2.5 Biotransformaes
Transformaes microbianas ou biotransformaes representam uma srie de reaes biolgicas, geralmente de xenobiticos, substncias estranhas para o organismo, catalisadas por clulas ntegras ou enzimas isoladas. Devido sua alta regio e estereosseletividade, transformaes microbianas complementam snteses orgnicas e tem sido muito aplicadas na indstria farmacutica e de alimentos. As reaes de biotransformao, especialmente aquelas que utilizam fungos, tambm tem sido usadas como modelos in vitro do metabolismo mamfero de uma variedade de compostos bioativos e drogas (Rai, 2009). As biotransformaes podem ser realizadas por bactrias, fungos, leveduras e plantas, e podem envolver diferentes enzimas, como oxigenases, redutases e hidratases (Duetz et al., 2003; Palmqvist et al., 2006). Biotransformaes tem sido usadas na indstria de alimentos para diversos fins. Por exemplo, as catequinas do ch so naturalmente convertidas em teaflavinas durante o seu processamento, atravs da enzima polifenol oxidase. As teaflavinas so substncias bioativas, com alta atividade antioxidante, alm de propriedades antimutagnicas e antiinflamatrias, e aumentam a qualidade da bebida. Esta converso acontece naturalmente, porm, pode ser feita com maiores rendimentos utilizando extratos de planta contendo a enzima ou at mesmo utilizando a enzima purificada (Sharma et al., 2009). Outro exemplo a obteno de compostos de aroma a partir de carotenides. A clivagem da molcula de carotenides obtida atravs de degradao trmica, fotoxigenao ou autoxidao, o que gera a formao de compostos de aroma. Esta clivagem tambm pode ser obtida atravs do sistema enzimtico de dioxigenases de micro-organismos ou plantas (Uenojo et al., 2007).

29

2.5.1 Beauveria bassiana Beauveria bassiana um fungo filamentoso de ocorrncia global em solos. Como um agressivo fungo entomopatognio e parasita, ele causador da doena muscardina em insetos. O fungo prolifera no corpo do inseto, produzindo toxinas, como a beauvericina, que enfraquece o sistema imune do hospedeiro, eventualmente matando-o (Rai, 2009). Beauveria bassiana tem sido frequentemente empregado em estudos de biotransformao devido a seu eficiente sistema enzimtico, ampla aceitabilidade de substratos e sua capacidade de realizar diferentes tipos de reao. Tem sido relatado que este fungo capaz de biotransformar mais de 300 tipos diferentes de substratos (Rai, 2009). Beauveria bassiana um importante catalisador microbiano, o segundo microorganismo mais frequentemente usado como biocatalisador, atrs somente do Aspergillus niger, e suas aplicaes so superadas somente por A. niger, Pseudomonas putida e Saccharomyces cerevisiae (Rai, 2009). As principais reaes catalisadas por Beauveria bassiana so descritas a seguir. Os exemplos tambm representam as principais reaes de biotransformao realizadas por fungos (Rai, 2009).

Reduo Uma variedade de redues catalisadas por fungos conhecida, sendo que a mais comum a reduo do grupo carbonila. A Figura 10 representa a reduo assimtrica do naftalenan-6-ona (40) por B. bassiana (Rai, 2009).
O OH

OH

40
O

41

42

Figura 10 Reduo assimtrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana

Oxidao Alguns estudos sobre oxidao biocataltica tem sido focados em reaes de sulfoxidao. A Figura 11 representa a oxidao da benzidrilsulfanil acetamida (43) levando ao ismero R do modafinil (44), catalisada por Beauveria bassiana. Modafinil 30

um frmaco neurotrpico autorizado para uso nos Estados Unidos para o tratamento da narcolepsia e apnia do sono (Rai, 2009).

O S NH2

O S

NH2

43

44

Figura 11 Oxidao da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana

Hidroxilao Hidroxilao microbiana uma das reaes de biotransformao mais comuns e importantes. Baseia-se na introduo regio e estereosseletiva de um grupo hidroxila em um carbono no ativado, o que difcil de se obter pelos mtodos qumicos tradicionais. A Figura 12 representa a hidroxilao de um derivado ster do adamantano (45) por Beauveria bassiana (Rai, 2009).

O OH O

45

46

Figura 12 - Hidroxilao de um derivado do adamantano por B. bassiana

Glicosilao A insero de uma molcula de glicose e, principalmente, a insero de um grupo 4-O-metil-glicose uma tpica reao catalizada por B. bassiana. A Figura 13 mostra a glicosilao do composto CGP-62706 (47) por este fungo. Este composto um potente inibidor da tirosina quinase, enzima que transfere um grupo fosfato a um resduo de tirosina de uma protena, e deste modo, regulando importantes funes no corpo, como a abertura de canais inicos e a expresso gnica (Rai, 2009).

31

HN

H N

Cl

HN

H N

Cl

48
4'-O-Metil-glicose

47

N O

Figura 13 4-O-metil-glicosilao do composto CGP-62706 por B. bassiana

Hidrlise Hidrlise de steres e epxidos so relatadas para Beauveria bassiana. A Figura 14 representa a desacetilao do composto CGP-291 (49), um agente antiprotozorio (Rai, 2009).

N N O2N N N O2N O O

N N N NH

49

50
O

Figura 14 Hidrlise do composto CGP-291 por B. bassiana

Acetilao A Figura 15 representa a biotransformao da 3,4-dicloroanilina (51) pelo B. bassiana (Rai, 2009).

Cl

NH2

Cl

H N

Cl

51

52
Cl O

Figura 15 - Acetilao da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana

32

Desmetilao A Figura 16 representa a degradao do herbicida Diuron (53), atravs de desmetilaes. Os produtos formados so menos txicos do que o herbicida e, por esta razo, o B. bassiana pode ser utilizado para recuperao de solos contendo este produto txico (Rai, 2009).

Cl

H N

Cl

H N

H N

Cl

H N

NH2

Cl

53

54
Cl

55
O Cl O

Figura 16 Produtos formados pela desmetilao do Diuron por B. bassiana

33

MATERIAL
A maior parte dos materiais utilizados no desenvolvimento do projeto se encontra no LaB, Laboratrio de Biotecnologia e Bioensaios, do Departamento de Qumica da UFMG. As anlises de RMN, CLAE e as anlises elementares foram feitas no Departamento de Qumica da UFMG. A identificao do fungo foi feita no Laboratrio de Micologia, do Instituto de Cincias Biolgicas. As anlises por espectrometria de massas foram feitas na Central Analtica, USP. Os fungos utilizados fazem parte da coleo de fungos do LaB.

Equipamentos: Espectrmetro Bruker Avance DRX400 e DPX200 foram utilizados para registrar espectros de RMN PE 2400 CHN Elemental Analyzer foi utilizado para anlise elementar HPLC Shimadzu prominence LC-20AT Espectometro de massas Burker Daltonics modelo MicroTOF lc Espectmetro de massas MicroMass Waters Q-TOF-Micro Infravermelho Perkin Elmer Spectrum BX Ultravioleta B-380 Micronal Ponto de fuso Gehaka modelo PF 1000, srie 0530/06001020 Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, srie J03610 Balana analtica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/ 0,1mg Balana eletrnica Digimed KN1000C, classe de exatido II, srie 04G6 Bomba de vcuo e presso Tecnal TE-0581 Estufa de secagem Fanen Ltda Modelo 002 CB Estufa para placa cromatogrfica Quimis G-317 8122 Evaporador rotativo Fisatom Modelo 803 Capela VECO, modelo JLF 912, srie FL 5799 Refrigerador Nuaire -86C Ultralow Freezer Cmera fotogrfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels Microondas Master Cooking CCE M-500 Mili-Q Plus Milipore Qpak 1 CPMQ004R1 34

Micropipeta automtica Digipet 1-5 mL Micropipeta automtica Digipet 20-200 L Incubadora de bancada Cientec CT-712 Microscpio eletrnico Olympus CX 40 Coluna cromatogrfica de vidro de 5cm de dimetro e 100cm de altura Coluna cromatogrfica de vidro de 1,5cm de dimetro e 100cm de altura

Reagentes e meios de cultura: D-glicose Peptona bacteriolgica Fosfato de potssio dibsico Cloreto de sdio gar batata dextrosado Extrato de levedura Sulfato de magnsio hepta-hidratado Hidrxido de sdio N-methyl-N-nitroso-p-toluenosulfonamida Diazald Acetato de etila Diclorometano Hexano lcool metlico d-clorofrmio Metanol grau HPLC Acetonitrila grau HPLC Termmetro Incoterm, srie 313675 Slica gel 60G (Vetec) para cromatografia em camada delgada Slica gel (Vetec 70-230 mesh) pra cromatografia em coluna Slica gel (Sigma 230-400 mesh) para cromatografia em coluna flash

Preparo de meios de cultura: Meio base 1 (Lucas et al., 2007) Os ingredientes listados na Tabela 2 foram dissolvidos em quantidade suficiente de gua para alcanar a concentrao desejada. A soluo obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 C por 15 min. 35

Tabela 2 Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum Ingrediente Glicose Peptona de carne bacteriolgica Fosfato de potssio monobsico Cloreto de sdio Sulfato de magnsio hepta-hidratado Concentrao (g.L-1) 20 5 1 5 0,5

Meio base 2 O meio base 2 foi preparado conforme descrito para o meio base 1, porm, utilizando 50% da concentrao dos ingredientes. A soluo obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 C por 15 min.

Meio base 3 (Martins, 2009) Os ingredientes listados na Tabela 3 foram dissolvidos em quantidade suficiente de gua para alcanar a concentrao desejada. A soluo obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 C por 15 min. Tabela 3 Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana Ingrediente Glicose Peptona de carne bacteriolgica Extrato de levedura Concentrao (g.L-1) 20 10 0,5

gar batata dextrosado Foi preparado segundo instrues do fabricante. Em um bquer foram adicionadas quantidades de gar batata dextrosado e gua suficientes para alcanar a concentrao de 39 g.L-1. Este bquer foi aquecido em forno de microondas at fuso do gar. A preparao obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em autoclave vertical a 121 C por 15 min.

gar Sabouraud Foi preparado segundo instrues do fabricante. Em um bquer foram adicionados gar sabouraud e gua para alcanar a concentrao de 65 g.L-1. Este bquer foi aquecido em microondas at garantir total fuso do gar. A preparao 36

obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em autoclave vertical a 121 C por 15 min.

Preparo de diazometano (Hudlicky, 1980) Em um balo de fundo redondo, foram adicionados 200 mL de etanol P.A. e 100 mL de hidrxido de sdio a 10%. Em um funil de separao foram adicionados 10,4 g de Diazald diludos em 80 mL de ter etlico P.A.. Conforme a montagem (Figura 17), a soluo etrea foi gotejada no balo lentamente, devido ao risco de exploso, em temperatura controlada de 60 C. O diazometano, diludo em ter etlico, foi recolhido em um erlenmeyer.

Figura 17 Montagem das vidrarias na preparao de diazometano Preparo de soluo de esclerotiorina 20 mg.mL-1: Em uma proveta de 10 mL, foram dissolvidos 200 mg de esclerotiorina em 10 mL de acetato de etila.

37

MTODOS
4.1 Manuteno dos micro-organismos
Os fungos da coleo do LaB so armazenados como uma suspenso de esporos em glicerol 12% a -86 C. Os fungos a serem utilizados foram retirados do armazenamento, transferidos para geladeira (a 8 C) onde permaneceram por dois dias. Em seguida, retirou-se uma alquota desta suspenso e inoculou-se em uma placa de Petri contendo gar batata dextrosado (Takahashi et al., 2008).

4.2 Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum

Um pedao do cultivo do Penicillium sclerotiorum no gar em placa de petri foi recortado e transferido para um tubo contendo gar batata dextrosado inclinado. Aps trs dias, a biomassa do fungo foi retirada do meio inclinado por meio de raspagem com ala de platina, utilizando gua esterilizada e inoculado em erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio base 1. Este erlenmeyer foi mantido sob agitao em agitador rotatrio a 100rpm, a temperatura ambiente durante 3 dias, e aps crescimento, o contedo foi transferido para erlenmeyers de maior capacidade, totalizando 7 litros de meio base 2. O crescimento ocorreu durante 21 dias, temperatura ambiente, sem agitao. Aps o crescimento e consequente produo de esclerotiorina, o miclio foi separado do meio de cultura atravs de filtrao a vcuo em funil de Buchner, utilizando filtros com poros de 14 m. Foi adicionado acetato de etila nas duas partes: no miclio, quantidade suficiente para cobrir o fungo e emergi-lo em todo o solvente e, na parte lquida, quantidade relativa a 30% do volume de meio de cultura. O miclio foi deixado em contato com o acetato de etila por 15 min, para extrair a esclerotiorina que tambm estava presente nesta parte. A parte lquida foi transferida para um funil de decantao, sendo separada a fase aquosa da fase orgnica, esta ltima contendo os metablitos secundrios desejados. A fase orgnica foi reservada e procedeu-se a extrao da fase aquosa com acetato de etila por mais duas vezes.

38

Todas as fraes orgnicas obtidas, juntamente com o solvente que havia sido deixado em contato com o miclio, foram reunidas e concentradas em evaporador rotativo, a 65 C, utilizando vcuo.

4.3 Purificao da esclerotiorina

A presena de esclerotiorina (20) no extrato foi comprovada por cromatografia em camada delgada (CCD), sendo purificada por cromatografia em coluna de slica. O extrato foi solubilizado em diclorometano, e a esta soluo foi incorporada uma quantidade de slica que ocupasse aproximadamente o mesmo volume de extrato utilizado. Aps a evaporao do solvente, feita em evaporador rotativo a 50 C, a slica contendo o extrato e foi adicionada lentamente ao topo da coluna. A partir da, foi dado incio ao processo de eluio, retirando-se fraes de 250 mL. A ordem dos eluentes utilizados encontra-se listada na Tabela 4. Cada frao retirada da coluna foi evaporada em evaporador rotativo a 65 C, utilizando vcuo. Tabela 4 Eluentes utilizados na coluna cromatogrfica de purificao da esclerotiorina Frao 1 2a3 4a5 6a7 8 a 14 15 a 16 17 a 20 21 a 22 Eluente Hexano Hexano + Diclorometano 85:15 Hexano + Diclorometano 50:50 Hexano + Diclorometano 25:75 Diclorometano Diclorometano + Acetato de etila 97:3 Diclorometano + Acetato de etila 95:5 Metanol

Procedeu-se anlise de cada frao por cromatografia em camada delgada comparativa, constatando-se que as fraes 11 a 16 continham esclerotiorina (20) em boa quantidade, porm a amostra resultante da combinao destas fraes ainda no estava pura. Deste modo, procedeu-se a uma cromatografia em coluna flash. Esta tcnica feita utilizando presso na coluna e a eluio isocrtica (Still et al., 1978). O eluente escolhido foi diclorometano/acetato de etila 99:1, sendo retiradas 19 fraes de 39

50 mL. Cada frao foi analisada por CCD, constatando-se que as fraes 4 a 15 estavam aparentemente puras. Desta forma, elas foram combinadas, analisadas por CCD e uma pequena parte desta amostra foi submetida anlise de ponto de fuso. Parte desta amostra (20mg) foi enviada para anlise por RMN. Como solvente foi utilizado clorofrmio deuterado (CDCl3).

4.4 Biotransformao da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

4.4.1 Cultivo de B. bassiana e biotransformao Um frasco de armazenamento contendo o fungo Beauveria bassiana foi retirado do ultra-freezer, transferido para um tubo de ensaio contendo meio gar batata inclinado, onde ficou por quatro dias, temperatura ambiente. Aps crescimento, a biomassa foi transferida, por meio de raspagem com ala de platina, para erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL de meio base 1. Foi feita uma biotransformao em duas etapas, procedimento que consiste em se cultivar o fungo em meio de cultura apropriado e, posteriormente, transferir sua biomassa para um recipiente contendo somente gua destilada adicionada do composto a ser biotransformado. Isso permite que as duas etapas sejam otimizadas separadamente. Em ensaios de biotransformao em duas etapas, na etapa de obteno de massa celular (fase de cultivo) o meio de cultura pode ser enriquecido de nutrientes, o que permite o desenvolvimento mais rpido do micro-organismo. O meio usado na biotransformao propriamente dita, ao contrrio, deve ser bem simples, contendo basicamente um tampo, soluo fisiolgica, ou apenas gua destilada, como foi utilizado no experimento realizado. Nessas condies, no so disponibilizados nutrientes para o micro-organismo, impedindo sua multiplicao (crescimento), mas sua massa celular continua vivel por um perodo, biotransformando compostos que sejam adicionados ao cultivo. Algumas vantagens deste processo em relao ao processo de uma nica etapa so: menor tempo de transformao, maior concentrao de substrato, controle mais fcil de reaes e facilidade na extrao e purificao do produto (Medeiros, 2002). Foram utilizados onze erlenmeyers de 500 mL contendo, cada um deles, 200 mL de meio base 3. O inoculo do fungo B.bassiana, previamente preparado, foi transferido para os onze erlenmeyers contendo o meio de cultura 3. Aps dez dias de cultivo sem 40

agitao, temperatura ambiente, o contedo de cada erlenmeyer foi filtrado a vcuo, em funil de Buchner, e o miclio foi transferido para um outro erlenmeyer de 500 mL contendo apenas 200 mL de gua destilada esterilizada. Dos onze erlenmeyers contendo o miclio do fungo imerso em gua destilada, um foi utilizado como controle do fungo e dez foram utilizados para a realizao da biotransformao, sendo que nesses, foi adicionado 1 mL de soluo de esclerotiorina (20) em acetato de etila na concentrao de 20 mg.mL-1. Tambm foi adicionado 1 mL desta soluo em outro erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL gua destilada estril, de modo a servir como controle do substrato. Todos os erlenmeyers utilizados, os dez do experimento da biotransformao e os dois controles foram incubados sob agitao a 100 rpm durante 14 dias, temperatura ambiente. Aps este perodo, em cada erlenmeyer o miclio foi separado por filtrao a vcuo em funil de Buchner. O filtrado foi transferido para um funil de separao e extrado 3 vezes utilizando 60 mL de acetato de etila. O solvente foi removido em evaporador rotativo a 65 C a vcuo 4.4.2 Anlise e purificao de biotransformado O extrato foi analisado por CCD, primeiramente utilizando como solvente diclorometano e, depois, diclorometano/acetato de etila 98:2. Nenhum produto com Rf prximo ao da esclerotiorina (20) foi observado, porm, observou-se uma mancha vermelha mais polar, perto do ponto de aplicao da amostra. Desta forma, foi feita outra CCD, utilizando como solvente acetato de etila e como eluente

diclorometano/acetato de etila 75:25, sendo observadas cinco manchas vermelhas. Estas manchas no foram encontradas no perfil cromatogrfico dos dois controles, e foram classificadas como produtos novos, provavelmente, produtos de

biotransformao. Os produtos biotransformados foram submetidos a cromatografia em coluna e cromatografia em placa preparativa. Os produtos 1, 4 e 5 estavam presentes em maior quantidade e foram enviados para anlise por RMN. Como solvente foi utilizado o clorofrmio deuterado (CDCl3).

41

4.5 Obteno de produtos de sntese com diazometano

4.5.1 Sntese Foram adicionados 900 mg de esclerotiorina (20) em um balo de fundo redondo, e 100 mL de ter etlico. Aps a dissoluo total da amostra, o diazometano previamente preparado foi adicionado lentamente at se verificar o desaparecimento total das bolhas. A amostra foi deixada em repouso por 10 min e, em seguida, levada ao evaporador rotativo para evaporao do solvente e, consequentemente, o trmino da reao (Hudlicky, 1980). 4.5.2 Anlise e purificao O produto da reao foi analisado por CCD, utilizando diclorometano como solvente e diclorometano/acetato de etila 98:2 como eluente, em comparao com um padro de esclerotiorina (20). Estas condies evidenciaram a formao de dois novos compostos com o RF prximo ao da esclerotiorina (20), um mais polar e outro menos polar, sendo que este ltimo estava em maior quantidade. O derivado sinttico mais polar que a esclerotiorina (20) foi separado atravs de cromatografia em coluna. Foram retiradas 18 fraes, sendo que o derivado foi eludo com diclorometano. Anlises de CCD mostraram que o derivado estava puro. Desta forma, uma parte foi separada para anlise do ponto de fuso. O material foi enviado para anlise por RMN, utilizando clorofrmio deuterado (CDCl3) como solvente. O produto teve sua estrutura determinada como sendo o 1-metil-esclerotiorina (64).

4.6 Biotransformao do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

4.6.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformao O procedimento utilizado para a biotransformao do 1-metil-esclerotiorina (64) foi o mesmo utilizado no item 4.4.1. 4.6.2 Anlise e purificao do produto biotransformado Anlises por CCD, utilizando acetato de etila como solvente e

diclorometano/acetato de etila (75:25) como eluente evidenciaram a presena de um nico ponto vermelho, ausente no perfil cromatogrfico dos controles.

42

Atravs de cromatografia em coluna de slica flash (230-400 mesh), foi possvel isolar o produto vizualizado por CCD nas fraes coletadas com diclorometano/acetato de etila 80:20.

4.7 Obteno de outros derivados da esclerotiorina

4.7.1 Triagem de fungos Para verificar outras possibilidades de produo de novos biotransformados, foram selecionadas 14 espcies de fungos da coleo do LaB, e, juntamente com o Beauveria bassiana, foi feita uma triagem. Os fungos utilizados foram: Absidia cylindrospora Aspergillus parasiticus Beauveria bassiana Cladosporium sphaerospermum Clonostachys rosea f catenulata Microsporum gypseum Mucor plumbeus Paecilomyces lilacinus Paecilomyces varioti Penicillium janthinellum Pestalotiopsis palustris Rhizopus oryzae Rhizopus stolonifer Syncephalastrum racemosum Thamnostylum sp. As biotransformaes foram feitas em uma nica etapa. Neste processo no h a separao do meio de cultivo, e a substncia de interesse adicionada diretamente ao fungo, aps o crescimento deste (Sato, 2001). Os fungos, aps serem retirados do armazenamento, foram repicados para tubos de ensaio contendo gar batata dextrosado inclinado e incubados por trs dias a temperatura ambiente. Aps este perodo, cada fungo foi transferido atravs de raspagem com ala de platina e gua esterilizada para dois erlenmeyers de 250 mL, contendo cada um 100 mL de meio base 2 e deixados a temperatura ambiente, sob agitao a 100 rpm. Aps trs dias, os fungos apresentaram bom crescimento, e a esclerotiorina (20) foi adicionada em um 43

dos erlenmeyers contendo cada fungo. O segundo erlenmeyer no recebeu a substncia e foi utilizado como controle. Foi adicionado 0,5 mL de soluo de esclerotiorina (20) em acetato de etila (20 mg.mL-1). Os erlenmeyes foram deixados sob as mesmas condies de agitao e temperatura durante 14 dias. Aps este perodo, o contedo de cada frasco foi filtrado a vcuo com funil de Buchner, o miclio foi separado, e o meio foi transferido para um funil de separao. Procedeu-se uma extrao com trs volumes de 30 mL de acetato de etila, que foi posteriormente evaporado, dando origem aos extratos. O extrato de cada fungo, assim como seus respectivos controles, foram analisados por CLAE. O extrato da biotransformao da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana em duas etapas obtido no item 4.4.1 tambm foi analisado por CLAE. Este resultado foi comparado com o resultado do ensaio do B. bassiana descrito neste tpico para estimar qual dos experimentos (o primeiro, em duas etapas, ou o segundo, em uma etapa) alcanou maior rendimento. Um extrato do Penicillium sclerotiorum (item 4.2) tambm foi analisado por CLAE para obter o tempo de reteno dos metablitos deste fungo, inclusive o tempo de reteno da esclerotiorina (20). 4.7.2 Anlise por CLAE Cada extrato em metanol (1 mg.mL-1) foi filtrado com uma membrana com poros de 0,45 m de tamanho e transferido para frasco devidamente identificado. Foram injetados 20 L de cada amostra no cromatgrafo. Como fase estacionria foi utilizada uma coluna de polaridade inversa (C18). Como fase mvel, foi utilizado um gradiente de misturas de acetonitrila e gua deionizada, contendo 0,05% de cido frmico (conforme Tabela 5), com um fluxo constante de 1 mL/min. Foram utilizados solventes de grau HPLC para a eluio e preparo das amostras. Os solventes, assim como a gua, passaram por processo de desgaseificao anterior ao seu uso. Tabela 5 Gradientes de eluio utilizados na anlise do HPLC Tempo de anlise (min) 0 30 40 Acetonitrila (%) 50 100 100 gua (%) 50 0 0

44

O detector foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm. Entre uma anlise e outra, a coluna foi lavada por 15 min com acetonitrila/gua (1:1) (Castro, 2008). Para comparao dos tempos de reteno entre diferentes amostras, foi calculado o intervalo de confiana da mdia dos tempos de reteno da esclerotiorina (20) nas diferentes amostras, e este foi extrapolado como o intervalo de confiana do mtodo. O intervalo de confiana calculado pela frmula:

Equao 1 Intervalo de confiana

onde

a mdia dos tempos de reteno da esclerotiorina (20), t o coeficiente de t

student e EPM o erro padro da mdia. O erro padro da mdia pode ser calculado pela frmula a seguir, onde amostras. o desvio padro populacional e n o nmero de

Equao 2 Erro padro da mdia

O coeficiente t obtido da tabela de distribuio de t student (Anexo 1), levando-se em conta a confiabilidade (Pimentel-Gomes, 2000) e o nmero de graus de liberdade, obtido por GL = n-1.

4.8 Identificao do Cladosporium sphaerospermum

No incio deste trabalho, o fungo C. sphaerospermum era o nico que ainda no tinha tido sua taxonomia determinada. Sua identificao foi realizada no Instituto de Cincias Biolgicas da UFMG, sob a superviso da Prof Dr Maria Aparecida de Resende, como descrito a seguir, a partir de seu microcultivo em gar sabouraud. O micro-organismo foi inoculado em uma lmina de microcultivo para que pudesse ser feita a sua identificao. Um pequeno bloco de gar sabouraud foi cortado e colocado na superfcie de uma lmina microscpica estril. O fungo foi inoculado neste bloco de gar e uma lamnula estril foi colocada em cima do gar. O sistema foi 45

armazenado a 37 C em uma placa de Petri estril com um pedao de algodo embebido em gua glicerinada (Funder, 1968). Aps 10 dias de crescimento, a lamnula e o gar foram retirados, o fungo foi corado com lactofenol e outra lamnula foi posta em cima da lmina. A lmina foi analisada em microscpio tico. As hifas e estruturas de reproduo, assim como as caractersticas macroscpicas foram utilizadas para determinar o gnero e espcie do fungo filamentoso.

46

RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Produo e extrao da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum
Penicillium sclerotiorum um fungo filamentoso que apresenta colorao esverdeada. Geralmente, o meio utilizado para seu cultivo fica alaranjado aps alguns dias, devido produo de metablitos secundrios. Aps trs dias de cultivo em tubo com gar batata inclinado, o fungo apresentou bom crescimento e esporulao (Figura 18).

Figura 18 Penicillium sclerotiorum em gar batata inclinado aps 3 dias. Frente (A) e verso (B) do tubo.

O meio base 1 foi escolhido por ter apresentado resultados satisfatrios em outros trabalhos desenvolvidos no laboratrio relacionados a crescimento de fungos filamentosos (Bracarense, 2008; Carvalho, 2009). Este meio possui quantidades suficientes de fontes de carbono, nitrognio, alm de minerais necessrios para o crescimento deste fungo. Aps trs dias neste meio, o fungo apresentava quantidade satisfatria de biomassa, sem indcios aparentes de contaminao. Os miclios estavam homogneos, e o meio apresentava colorao alaranjada, sem turvao, o que, caso acontecesse, poderia ser um indcio de contaminao por leveduras e/ou bactrias. O prximo passo foi o cultivo deste fungo em uma escala maior, que foi obtido por cultivo em meio de cultura lquido em frascos erlenmeyer contendo um total de sete litros de meio de cultura. O meio foi dividido em vrios recipientes com o objetivo de se 47

ter uma superfcie de contato do meio de cultura com o ar maior, uma vez que o P. sclerotiorum um micro-organismo aerbio. O meio foi preparado com metade da concentrao dos constituintes, com o objetivo de que os nutrientes se esgotassem mais rapidamente e os micro-organismos alcanassem mais rapidamente a fase estacionria, onde acontece a produo de metablitos secundrios. O crescimento foi realizado at o 21 dia, quando o meio de cultura apresentou uma forte colorao alaranjada. Aps a extrao do contedo total de meio de cultura, foram obtidos 3,07 g de extrato.

5.2 Purificao da esclerotiorina

A estrutura da esclerotiorina (20), assim como a numerao dos tomos de carbono, encontra-se na Figura 19.

Figura 19 Estrutura molecular da esclerotiorina

A presena de esclerotiorina (20) no extrato foi averiguada por cromatografia em camada delgada utilizando diclorometano como solvente e diclorometano/acetato de etila (98:2) como eluente. Um padro de esclerotiorina (20) pura tambm foi aplicado na placa. Como o composto pesquisado possui uma forte colorao alaranjada, neste caso no foi necessria a utilizao de agentes reveladores (Figura 20). Nestas condies, a esclerotiorina (20) apresentou um fator de reteno Rf = 0,37. Como mtodo de purificao da esclerotiorina (20) a partir do extrato bruto de P. sclerotiorum, foi escolhida a cromatografia em coluna (Figura 21), pelo fato de este metablito possuir uma forte colorao alaranjada, o que facilita o uso desta tcnica de purificao. 48

Figura

20

Cromatografia

em

camada

delgada

comparativa do padro de esclerotiorina (A) e o extrato de Penicillium sclerotiorum (B)

Figura 21 Coluna cromatogrfica de purificao da esclerotiorina em trs etapas de eluio

49

O primeiro fracionamento do extrato gerou 22 fraes, sendo que a combinao das fraes 11 a 16 gerou uma amostra com boa quantidade de esclerotiorina (20), porm impura, que foi novamente submetida a cromatografia em coluna de slica. Com este segundo fracionamento, as fraes 4 a 15 resultaram em esclerotiorina (20) aparentemente pura. Para comprovar a pureza desta substncia, foi feita uma CCD, que apresentou somente uma mancha, com o mesmo Rf que o padro de esclerotiorina (20), tambm aplicado na placa. A anlise de ponto de fuso mostrou que a amostra fundiu entre 199 e 202 C, o que comprovou a pureza da amostra. Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20) por este procedimento, relativos a aproximadamente 30% de rendimento em relao massa total do extrato. A anlise por RMN comprovou que a substncia isolada foi a esclerotiorina (20). Os dados encontram-se na Tabela 6, pgina 51. Os espectros de RMN encontram-se nos Apndices 1 a 6. A numerao utilizada foi descrita na Figura 19, pgina 48.

5.3 Biotransformao da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

5.3.1 Cultivo do Beauveria bassiana O fungo Beauveria bassiana foi escolhido, pois na literatura so relatados diversos experimentos em que este fungo foi usado na biotrasnformao de vrias substncias (Buchanan et al., 2001; Zhan et al., 2006; Osorio-Lozada et al., 2008). Alm do que, este micro-organismo produz baixas quantidades de metablitos secundrios, e nenhum possui uma colorao forte, o que poderia dificultar o emprego das tcnicas cromatogrficas utilizadas. Para o cultivo do Beauveria bassiana, foi escolhido o meio base 3. relatado na literatura que o B. bassiana apresenta crescimento adequado neste meio de cultura (Martins, 2009). Foi feito um estudo comparativo em laboratrio, o que comprovou este dado. Aps trs dias de cultivo em gar batata inclinado (Figura 22), o B. bassiana foi transferido para erlenmeyer contendo o meio base 3, onde foi incubado por 10 dias, sem agitao, a temperatura ambiente, apresentando bom crescimento por toda a superfcie do meio de cultura.

50

Tabela 6 Informaes obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de sub-espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina

13

C,

Numerao 1 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Multiplicidade CH C CH C C C C C C CH CH C CH CH CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 C CH3

C (ppm)
152,63 158,11 106,38 138,67 110,81 185,97 84,58 191,78 114,57 115,68 142,86 131,97 148,84 35,13 30,06 11,94 20,18 12,35 22,53 170,10 20,06

H (ppm)
7,93 6,65 6,08 7,06 5,70 2,49 1,37 0,87 1,01 1,85 1,57 2,17

JH (Hz) d, 15,8 d, 15,8 d, 10,0 m m t, 7,2; 7,2 d, 6,8 -

51

Figura 22 Beauveria bassiana em gar batata inclinado aps 3 dias. Frente (A) e verso (B) do tubo. 5.3.2 Obteno dos produtos biotransformados O miclio de B. bassiana foi colocado em recipiente contendo gua destilada estril, e a esclerotiorina (20) foi adicionada como soluo concentrada em acetato de etila, de modo que fosse usado um volume pequeno do solvente, portanto, em condies de baixa toxicidade para o fungo. O miclio do fungo e a esclerotiorina (20) foram deixados em contato por 14 dias. Muitos trabalhos relatam que este tempo suficiente para reaes de biotransformao (Sakamaki et al., 2001, Miyazawa et al., 1995, Liu et al., 1984). Aps este perodo, procedeu-se a extrao, sendo obtidos 360,8 g de extrato. A purificao das substncias se iniciou com uma cromatografia em coluna. Foram retiradas 22 fraes de 200mL, sendo utilizados como eluentes, nesta ordem, hexano, misturas de hexano/diclorometano, diclorometano e misturas de

diclorometano/acetato de etila at a concentrao de 1:1. Com este procedimento, foram isoladas 4 fraes, utilizando como eluentes, misturas de diclorometano/acetato de etila nas concentraes de 85:15, 80:20, 60:40 e 50:50, nesta ordem. A ordem de eluio encontra-se na Tabela 7. Anlises por CCD mostraram que o material obtido nas polaridades diclorometano/acetato de etila 85:15, 60:40 e 50:50 estavam puros. A amostra isolada com a polaridade diclorometano/acetato de etila 80:20 possua duas substncias distintas, que posteriormente foram isoladas utilizando placa preparativa de slica gel. Este procedimento consistiu em preparar placas

cromatogrficas de 10 x 10 cm, com espessura de 1 mm de slica gel. A amostra foi aplicada inteiramente na placa e, aps a eluio e conseqente separao dos constituintes, as duas substncias foram separadas pela raspagem seletiva de cada banda visualizada na placa, diludas com metanol e filtradas em filtro quantitativo com poros de 14 m. Neste procedimento, utilizando acetato de etila como solvente e 52

hexano/acetato de etila (8:2) como eluente, foi possvel separar os biotransformados 2 e 3. A massa obtida de cada substncia encontra-se na Tabela 7 Tabela 7 Massas das substncias isoladas da biotransformao da esclerotiorina por B. bassiana e respectivos rendimentos Polaridade Substncia Massa (mg) Diclorometano/acetato de etila 85:15 Diclorometano/acetato de etila 80:20 Diclorometano/acetato de etila 80:20 Diclorometano/acetato de etila 60:40 Diclorometano/acetato de etila 50:50 Biotransformado 1 Biotransformado 2 Biotransformado 3 Biotransformado 4 Biotransformado 5 27,5 8,3 1,9 12,8 13,7 Rendimento (%) 13,8 4,2 1 6,4 6,8

Os cinco produtos de biotransformao isolados do extrato de B. bassiana possuem aparentemente as mesmas caractersticas fsicas. So slidos temperatura ambiente, com colorao vermelho forte, muito solveis em diclorometano, acetato de etila ou metanol. 5.3.3 Elucidao estrutural do Biotransformado 1 O processo de elucidao estrutural de substncias geralmente inicia-se com a anlise do espectro no infravermelho, cujas bandas indicam os grupos funcionais presentes na estrutura. O prximo passo a anlise dos espectros de RMN de 1H e de
13

C e do sub-espectro DEPT, que mostram a quantidade de tomos de carbono e

hidrognio presentes, dando uma boa noo de sua vizinhana. Os espectros de RMN bidimensionais mostram as correlaes entre tomos de carbono e hidrognio, o que, na maioria das vezes, j permite montar a estrutura da molcula. Muitas vezes, algumas anlises suplementares como a anlise elementar, espectometria de massas ou ultravioleta podem ser necessrias para confirmar a presena de algum fragmento estrutural ou confirmar a molcula proposta (Silverstein et al., 2005). Em casos de reao ou biotransformao, a elucidao estrutural do produto pode ser iniciada pela comparao de seu espectro de RMN com o espectro do material de partida. Os deslocamentos qumicos de RMN de
13

C do biotransformado 1

foram comparados com os deslocamentos da esclerotiorina (20), apresentando semelhana por toda a molcula, com exceo dos tomos de carbono prximos ao 53

oxignio participante do heterociclo (Figura 23), podendo-se concluir que a molcula do biotransformado 1 possui um esqueleto parecido com o da esclerotiorina (20), com alguma alterao neste ponto da molcula.

Figura 23 Comparao entre os deslocamentos qumicos de RMN de esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)
13

13

C da

A anlise do espectro de RMN de

C do biotransformado evidenciou, ainda, a

presena de oito novos tomos de carbono, no presentes na molcula original da esclerotiorina (20). A comparao entre os dados obtidos dos espectros de RMN de
13

C (Figura 23) indica que a insero destes tomos foi perto dos anis da molcula. A anlise do espectro de RMN de 1H, do sub-espectro DEPT, do mapa de

contornos HSQC, assim como os valores dos deslocamentos qumicos no espectro de RMN de
13

C (Tabela 8) permitiram concluir que os sinais correspondiam a: 2 carbonos

secundrios, 5 carbonos tercirios e 1 carbono quaternrio. Tabela 8 Deslocamentos qumicos dos tomos de carbono inseridos na molcula de esclerotiorina pela biotransformao Deslocamento qumico C 36,6 55,4 127,7 128,7 128,7 129,2 129,2 135,8 Multiplicidade (DEPT) CH2 CH2 CH CH CH CH CH C 54

A anlise elementar (Tabela 9) indicou a presena de um tomo de nitrognio na molcula. O clculo do nmero de tomos foi feito usando-se massa molecular 493,2060, obtida a partir do espectro de massas ESI-MS (Apndice 14). O pico de massas 516,1876 referente ao on M+Na, inerente ao mtodo. O pico de massas 437,1927 referente a fragmento da molcula. Apesar da tcnica de ESI-MS no ser uma tcnica destrutiva, alguns poucos fragmentos podem aparecer nos espectros produzidos. Tabela 9 Resultado da anlise elementar do biotransformado 1, e nmero de tomos correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de massas ESI-MS tomo Carbono Hidrognio Nitrognio % de massa 68,95 6,23 2,80 Nmero de tomos 29 32 1

A literatura relata a produo da isocromofilona VI (22), um composto que possui o mesmo esqueleto bsico da esclerotiorina (20), porm, o heterotomo ligado ao anel um nitrognio. Os valores dos deslocamentos qumicos da isocromofilona VI (22) (Anexo 2), em comparao com os deslocamentos do biotransformado so bem semelhantes (Figura 24), um outro indcio da presena do tomo de nitrognio na nova molcula.

Figura 24 Comparao entre os deslocamentos qumicos de RMN de isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)

13

C da

55

Finalmente, a confirmao de que a biotransformao da esclerotiorina (20) tambm alterou o cromforo da molcula foi vizualizada pela colorao do biotransformado 1, que bem similar colorao da isocromofilona VI (22), que possui o tomo de nitrognio em seu cromforo, o que est de acordo com o cromforo do biotransformado possuir um tomo de nitrognio (Figura 25).

Figura 25 Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando os diferentes cromforos

Deste modo, foi possvel considerar que os oito novos tomos de carbonos estavam ligados a um tomo de nitrognio, o qual faria parte do esqueleto da molcula do biotransformado. Atrves do espectro bidimensional de RMN HSQC-TOCSY, foi possvel mostrar que os dois carbonos secundrios fazem parte do mesmo sistema de spins, estando separados dos 5 carbonos tercirios, os quais tambm fazem parte de um segundo sistema de spins. Com esta informao, e utilizando os acoplamentos indicados no espectro de HMBC, foi possvel propor o seguinte fragmento (Figura 26).

56

Figura 26 Correlaes observadas no espectro bidimensional de HMBC para o biotransformado 1

Como o sistema de spins dos carbonos tercirios diferente dos carbonos secundrios, foi proposto que o prximo constituinte desta cadeia seria o nico carbono quaternrio (Figura 27).

Figura 27 Correlaes demonstradas no espectro bidimensional de HMBC para o biotransformado 1

Os deslocamentos qumicos dos cinco carbonos tercirios restantes so bem prximos, e caractersticos de carbonos aromticos. Desta forma, chegou-se seguinte estrutura (Figura 28):

Figura 28 Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1

57

Na estrutura proposta, o anel aromtico possui dois pares de carbonos que possuem a mesma vizinhana. O espectro de RMN de
13

C (Apndice 8, pgina 90)

mostra que estes dois pares de sinais possuem o mesmo deslocamento qumico, e pode-se supor que possuam a mesma vizinhana. Os tomos de carbono so conectados entre si e com os outros carbonos prximos da estrutura. A estrutura proposta possui a frmula estrutural de C29H32O4NCl. Calculando a massa molecular terica a partir das massas atmicas exatas (Silverstein, 2005), se encontra um valor de 492,0214. A massa molecular obtida com o espectro de massas (Apndice 14) foi de 493,2060, o que est de acordo com a estrutura proposta. Os dados da nova substncia encontram-se na Tabela 10, pgina 60. Os espectros encontram-se nos Apndices 7 a 16. 5.3.4 Elucidao estrutural dos outros biotransformados Devido pouca quantidade de massa obtida, no foi possvel realizar anlises com os biotransformados 2 e 3. Os biotransformados 4 e 5 foram enviados para anlise por RMN, porm, os espectros obtidos no tinham resoluo suficiente para dar prosseguimento elucidao estrutural. Com os dados obtidos, sups-se que, nas duas molculas, assim como na molcula do biotransformado 1 (56), houve a troca do tomo de oxignio prximo ao carbono 1 por um tomo de nitrognio, com a insero de dois carbonos secundrios, que do continuidade molcula (Figura 29).

Figura 29 Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5

O espectro de massas do biotransformado 4 mostra que este composto difere do biotransformado 1 apenas por um grupo hidroxila. A provvel estrutura molecular para esta substncia seria aquela proposta na Figura 30.

58

O OH N O O O

57
Cl

Figura 30 Provvel estrutura do biotransformado 4

O biotransformado 5 possui a mesma massa que a isocromofilona VI (22), metablito do Penicillium sclerotiorum, e os sinais referentes cadeia lateral da isocromofilona VI (22) esto presentes no espectro de RMN do biotransformado. Deste modo, a provvel estrutura molecular para esta substncia seria a proposta na Figura 31.
O O HO N O O Cl

58

Figura 31 Provvel estrutura do biotransformado 5

importante ressaltar que nenhuma dessas estruturas pode ser confirmada sem a obteno de espectros de RMN com maior quantidade de amostra, ou maior pureza desta. Seguem abaixo os dados fsico-qumicos dos biotransformados 4 (57) e 5 (58). Os espectros encontram-se nos Apndices 17 a 22.

59

Tabela 10 Propriedades fsico-qumicas do biotransformado 1 Propriedade Estrutura molecular Biotransformado 1 (56)

Aspecto Frmula molecular Temperatura de fuso Massas (ESI-MS) m/z UV (, nm) IV (KBr) (, cm-1) RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 ()

Slido vermelho, cristalino C29H32O4NCl 110-112C 493,2060 375 nm 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220, 1140 0,89 (3H, t, H-15, J=7,2; 7,2 Hz); 1,03 (3H, d, H16, J=6,4 Hz); 1,40 (2H, m, H-14); 1,52 (3H, s, H18); 1,81 (3H, s, H-17); 2,16 (3H, s, H-20); 2,48 (1H, m, H-13); 3,03 (2H, m, H-21); 4,05 (2H, m, H-22); 5,68 (1H, d, H-12, J=10 Hz); 5,98 (1H, d, H-9, J=15,6 Hz); 6,90 (1H, d, H-10, J=15,6 Hz); 6,97 (1H, s, H-4); 7,10 (1H, m, H-25); 7,10 (1H, m, H-27); 7,26 (1H, s, H-26); 7,31 (1H, m, H-24); 7,31 (1H, m, H-28); 7,54 (1H, s, H-1)

RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 ()

11,99 (C-15); 12,62 (C-17); 20,23 (C-16); 20,30 (C-20); 23,23 (C-18); 30,04 (C-14); 35,05 (C-13); 36,63 (C-21); 55,44 (C-22); 84,82 (C-7); 102,44 (C-4a); 111,58 (C-4); 114,59 (C-8a); 114,64 (C-9); 127,71 (C-26); 128,73 (C-25); 128,73 (C-27); 129,25 (C-24), 129,25 (C-28); 131,54 (C-11); 135,79 (C-23), 140,86 (C-1); 144,30 (C-5); 144,95 (C-10); 147,80 (C-12); 148,04 (C-3); 170,04 (C19); 184,37 (C-6); 193,77 (C-8)

Solubilidade Rf, diclorometano/acetato de etila (8:2)

Solvel em diclorometano, acetato de etila e metanol, insolvel em gua 0,42

60

Tabela 11 Propriedades fsico-qumicas do Biotransformado 4 Propriedade Aspecto Temperatura de fuso Massas (ESI-MS) m/z UV (, nm) IV (KBr) (, cm ) Solubilidade
-1

Biotransformado 4 (57) Slido vermelho, cristalino 87-90 C 509,3581 375 nm 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220 Solvel em diclorometano, acetato de etila e metanol, insolvel em gua

Rf, diclorometano/acetato de etila 0,41 (1:1)

Tabela 12 Propriedades fsico-qumicas do Biotransformado 5 Propriedade Aspecto Massas (ESI-MS) m/z UV (, nm) IV (KBr) (, cm-1) Solubilidade Biotransformado 5 (58) Slido vermelho, oleoso 433,3309 375 nm 3320, 2920, 1640, 1460, 1360,1240, 740 Solvel em diclorometano, acetato de etila e metanol, insolvel em gua Rf, diclorometano/acetato de etila 0,20 (1:1)

Supe-se que os cinco biotransformados de colorao vermelha produzidos pelo Beauveria bassiana apresentaram como ponto comum a troca do tomo de oxignio por um tomo de nitrognio, ligado a uma cadeia lateral, que difere em cada biotransformado. Wei e Yao descrevem a reatividade de azafilonas perante aminas primrias, o que resulta na troca do heterotomo presente no anel bicclico. O mecanismo proposto para esta reao encontra-se representado na Figura 32 (Wei e Yao, 2005).

61

R H O R NH2 O O2R R O R X O O2R O R O N H O H

R H N O H

R H N O

O O2R O X R X O2R O

59

R O R N O2R R O R OH X X R O H N O

R H N O

- H2 O

N O2R O R

O O2R O X R

OH O2R O X

60

Figura 32 Mecanismo proposto para a reao entre azafilonas e aminas primrias

Desta forma, sugere-se que aminas primrias produzidas pelo Beauveria bassiana reagiram com a esclerotiorina (20), dando origem aos produtos de biotransformao 1-5.

5.4 Sntese da 1-metil-esclerotiorina

Na tentativa de se obter um derivado semi-sinttico da esclerotiorina (20) para posterior biotransformao, foi feito uma reao com o diazometano. Este composto altamente reativo e instvel, e por isso foi preparado anteriormente ao uso. Em razo de suas caractersticas txicas (principalmente a teratogenicidade), o seu preparo foi feito levando em conta todas as medidas de segurana necessrias (Figura 17, pgina 37). Seu preparo a partir do Diazald segue a equao abaixo (Figura 33) (Struempel et al., 2008).

Figura 33 Reao de formao do diazometano

62

As reaes com diazometano geralmente resultam em produtos metilados, e esta metilao acontece por uma substituio de um hidrognio na molcula do reagente, geralmente o hidrognio mais cido (Solomons, 2002). O hidrognio 1 da molcula da esclerotiorina (20) possui maior acidez do que os outros hidrognios da molcula. Sua retirada estabilizada por ressonncia nos dois anis da molcula. A metilao na posio 1 da molcula da esclerotiorina (20) o evento com maior probabilidade de ocorrer a partir da reao desta molcula com o diazometano. A esclerotiorina (20), figura 19, pgina 48, foi deixada em contato com o diazometano por 10 minutos, uma vez que este muito reativo, e um maior tempo de contato poderia levar formao de produtos de degradao, diminuindo o rendimento da reao principal. Os reagentes encontram-se dissolvidos em ter, e a evaporao deste leva ao trmino da reao. A reao com diazometano tambm leva formao de nitrognio gasoso, e o desprendimento deste pode evidenciar que a reao est em andamento. Anlises por CCD evidenciaram a formao de dois produtos principais, um mais polar e outro menos polar do que o material de partida, alm de produtos em menor quantidade. O produto menos polar mostrou-se altamente instvel, e foi degradado pela slica usada na CCD e na coluna cromatogrfica em menos de 30 minutos, tornando invivel seu isolamento para posteriores estudos e anlises. O produto mais polar foi separado por meio de cromatografia em coluna. A anlise do ponto de fuso mostrou que esta substncia fundiu entre 177 e 179 C, o que comprovou o alto grau de pureza da amostra. A reao foi feita com 900 mg de esclerotiorina (20) e foram obtidos 276,9 mg de produto, o que representa um rendimento de reao de 31%. 5.4.1 Elucidao estrutural do Produto 1 Foram obtidos espectros de RMN de 1H e de
13

C, sub-espectros DEPT, alm de

espectros bidimensionais do novo produto, e os valores dos deslocamentos qumicos foram comparados com os deslocamentos qumicos do material de partida, a esclerotiorina (20). Os valores encontrados foram bem prximos aos da esclerotiorina (20), com exceo da regio prxima ao carbono 1, onde os valores sofreram alguma alterao. Isto mostra que o produto da reao manteve a estrutura parecida com a estrutura do material de partida, porm, com alguma alterao nesta rea da molcula (Figura 34). 63

Figura 34 Comparao entre os deslocamentos qumicos da esclerotiorina (em preto) e do Produto 1 (em vermelho). Anlises dos espectros de RMN de 1H e de
13

C mostraram que, alm da

estrutura bsica da esclerotiorina (20), o novo produto possua um tomo de carbono a mais e, segundo seu valor de deslocamento qumico e posicionamento no sub-espectro de DEPT, tratava-se de um carbono primrio. Os valores de deslocamento qumico no novo grupo so: C = 20,20, H = 2,65, simpleto. O mapa de contornos HMBC mostrou as correlaes existentes entre este carbono primrio e C1 e C8a (Figura 35), indicando que este estava ligado ao carbono 1 da molcula da esclerotiorina (20).

Figura 35 Correlaes observadas no mapa de contornos HMBC para o produto 1

O sinal de H1 na molcula da esclerotiorina (20) no foi observado nos espectros do produto 1, o que est de acordo com a proposta de sua substituio por um grupo CH3. Nenhuma outra alterao foi encontrada nos espectros de RMN desta molcula. A estrutura do produto 1, identificado como 1-metil-esclerotiorina (64), est representada na Figura 36. 64

Figura 36 Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina)

Os dados da nova substncia encontram-se na Tabela 13, pgina 66. Os espectros encontram-se nos Apndices 23 a 32.

5.5 Biotransformao da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

O mesmo procedimento utilizado para a biotransformao da esclerotiorina (20) foi utilizado agora com o seu produto metilado. O objetivo foi verificar se as mesmas alteraes causadas na molcula da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana tambm so causadas em uma molcula com estrutura semelhante. A biotransformao da esclerotiorina (20) resultou em muitos novos produtos, sendo que alguns deles foram produzidos com altos rendimentos (Tabela 7, pgina 53). Este resultado no foi observado quando o substrato oferecido para o fungo foi a 1metil-esclerotiorina (64). Alguns poucos produtos com a mesma colorao alaranjada foram produzidos e apenas um produto mais polar com colorao vermelha foi observado, mesmo assim, nenhum desses em quantidade o suficiente para ser isolado e enviado para anlise visando elucidao estrutural. Tendo em vista que um dos produtos de biotransformao da esclerotiorina (20) por B. bassiana foi formado pelo ataque dos eltrons livres das aminas produzidas por este fungo ao carbono 1, a metilao desta posio impediu este ataque nucleoflico, j que, na 1-metil-esclerotiorina (64), este carbono est ligado ao grupo metila. Deste modo, esta reao no foi possvel de ocorrer, ou ocorreu em baixssimos rendimentos.

65

Tabela 13 Propriedades fsico-qumicas da 1-metil-esclerotiorina Propriedade Estrutura molecular 1-metil-esclerotiorina (64)

Aspecto Frmula molecular Temperatura de fuso Massas (ESI-MS) m/z UV (, nm) IV (KBr) (, cm-1) RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 ()

Slido alaranjado, cristalino C22H25O5Cl 177-179 C 404,2026 355 nm 3420, 2960, 1720, 1620, 1520, 1400, 1220, 1140, 1100, 980 0,88 (3H, t, H-15, J=14,8; 14,8 Hz); 1,03 (3H, d, H-16, J=13,2 Hz); 1,36 (2H, m, H-14); 1,57 (3H, s, H-18); 1,86 (3H, s, H-17); 2,19 (3H, s, H-20); 2,50 (1H, m, H-13); 2,65 (3H, s, H-21); 5,72 (1H, d, H12, J=19,6 Hz); 6,07 (1H, d, H-9, J=31,4 Hz); 6,72 (1H, s, H-4); 7,06 (1H, d, H-10, J=31,4 Hz)

RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 ()

11,98 (C-15); 12,40 (C-17); 20,20 (C-20); 20,20 (C-21); 20,25 (C-16); 22,93 (C-18); 30,08 (C-14); 35,10 (C-13); 85,33 (C-7); 106,45 (C-4); 109,93 (C-5); 110,71 (C-8a); 115,74 (C-9); 131,98 (C-11); 140,47 (C-4a); 142,26 (C-10); 148,44 (C-12); 156,74 (C-3); 166,87 (C-1); 169,84 (C-19); 185,65 (C-6); 192,87 (C-8)

Solubilidade

Solvel em diclorometano, acetato de etila e metanol, insolvel em gua

Rf, diclorometano/acetato de etila (98:2)

0,28

66

5.6 Obteno de outros derivados da esclerotiorina

Para uma triagem, quinze fungos da coleo de fungos do LaB foram selecionados, levando-se em conta os seguintes critrios: alta taxa de multiplicao, fcil crescimento no meio base, baixa produo de metablitos secundrios e ausncia de metablitos com colorao forte. exceo de Pestalotiopsis palustris, os demais micro-organismos escolhidos j foram usados em experimentos de biotransformao, como indica a Tabela 14. Tabela 14 Algumas referncias bibliogrficas sobre biotransformaes realizadas pelos fungos utilizados neste experimento Micro-organismo Absidia cylindrospora Aspergillus parasiticus Beauveria bassiana Referncias Guiraud et al., 2008; Lacroix et al. 1999 Gengar et al. 1999 Osorio-Lozada et al., 2008; Zhan et al., 2006; Buchanan et al., 2001 Clonostachys rsea Microsporum gypseum Mucor plumbeus Kakeya et al., 2002 Siebers-Wolff et al., 1993; Olivo et al., 2005 Lacroix et al. 1999; Garca-Granados et al., 2007; Souza et al., 2009 Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium janthinellum Rhizopus oryzae Rhizopus stolonifer Syncephalastrum racemosum Thamnostylum sp. Rosche et al., 2001; Gesell et al., 2001 Sachan et al., 2006; Mukherjee et al., 2006 Zhang et al., 2005; Kiehlmann et al., 1996 Rosche et al., 2001; Shiva et al. 2007 Choudhary et al., 2009; Xiangjiu et al., 2010 Lacroix et al. 1999; Kiehlmann et al., 1996 Lacroix et al. 1999; Souza et al., 2009

67

5.6.1 Identificao do Cladosporium sphaerospermum A Figura 37 representa o microcultivo do fungo, trs dias aps a inoculao.

Figura 37 Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum

O fungo apresentou crescimento lento. Macroscopicamente, o fungo apresenta colorao escura, tendendo ao esverdeado at marrom, com textura aveludada (Figura 38). Microscopicamente, o fungo possui hifas septadas, conidiforos curtos e pouco pigmentados como estrutura de reproduo (Figura 39). Estas caractersticas permitiram classificar o fungo como pertencente espcie Cladosporium sphaerospermum. Outros trabalhos sobre identificao de fungos do gnero Cladosporium relatam as mesmas caractersticas (Pereira, 2005).

Figura 38 Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente (A) e verso (B)

68

Figura 39 Caractersticas microscpicas do Cladosporium sphaerospermum. Conidiforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reproduo assexuada (d) 5.6.2 Anlises por cromatografia lquida de alto desempenho (CLAE) Em uma separao cromatogrfica de alto desempenho, os compostos so retidos e particionados por um nico mecanismo de reteno. Em fases reversas, os solutos interagem hidrofobicamente com as caldeias alqulicas do empacotamento, porm, existe a possibilidade de interao de alguns compostos com os grupos silanol residual, que, s vezes, chegam a mais de 20% dos grupos hidroxila da matria prima. Estas interaes podem levar formao de caudas, devido interao mais forte entre o soluto e os grupos silanol. As caudas tambm podem ser formadas por diferenas do tempo de reteno entre duas formas da mesma substncia, seja por isomeria ou equilbrio cido base (Ciola, 2003). Para minimizar os efeitos do equilbrio cido base, foi adicionado 0,05% de cido frmico gua utilizada na eluio. A eluio por gradiente pode proporcionar melhor visualizao do perfil cromatogrfico dos extratos. O gradiente foi otimizado a partir de uma soluo de esclerotiorina (20) e do biotransformado 1 (56). Vrios sistemas de eluio foram

69

testados, sendo que o sistema apresentado na Tabela 5, pgina 44 foi o que apresentou melhor separao e visualizao dos picos das duas substncias. O detector utilizado foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm. As substncias com colorao avermelhada so detectadas nestes dois comprimentos de onda, sendo que as substncias com colorao alaranjada so detectadas apenas pelo comprimento de onda de 470 nm. Desta forma, a anlise de CLAE foi capaz de discriminar substncias alaranjadas e vermelhas, e detectar, entre os produtos novos, quais tiveram o seu cromforo alterado, como no caso da biotransformao da esclerotiorina (20) pelo B. bassiana. O cromatograma do controle tambm foi analisado para garantir que as substncias indicadas como produtos de biotransformao no eram metablitos produzidos pelos fungos. Os cromatogramas encontram-se nos Apndices 33 a 50. 5.6.3 Interpretao dos resultados da triagem As diferenas entre o tempo de reteno de uma mesma substncia em amostras diferentes podem ser causadas por vrios fatores, como as alteraes de presso da coluna, impurezas nos eluentes, e as diferenas das matrizes das amostras (Ciola, 2003). Todas as amostras, com exceo dos controles, possuam esclerotiorina (20) e as diferenas nos tempos de reteno desta substncia nos diferentes extratos representa a variabilidade inerente ao experimento. Os extratos de biotransformao dos fungos Mucor plumbeus, Pestalotiopsis palustris, Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer apresentaram em seus

cromatogramas nenhum pico ou picos muito pequenos indicando a presena de poucos novos biotransformados. O cromatograma do extrato do Thamnostylum sp. no apresentou preciso suficiente para ser analisado, mesmo aps repetio do experimento. Apesar de apresentar bons resultados na biotransformao em duas etapas, Beauveria bassiana no apresentou nenhum biotransformado em grande quantidade nesta triagem feita em uma etapa. O extrato da biotransformao com Absidia cylindrospora apresentou trs picos com tempos de reteno de 8,011, 8,219 e 8,742 min, sendo que os trs foram visualizados pelos dois comprimentos de onda. O extrato da biotransformao com Aspergillus parasiticus apresentou um pico intenso com tempo de reteno de 8,721 min, lido pelos dois comprimentos de onda. Foram observados trs picos com tempos de reteno de 18,119, 18,413 e 20,965 min, 70

lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm. Outros picos foram observados, porm referem-se a metablitos presentes no controle. O extrato da biotransformao com Cladosporium sphaerospermum apresentou trs picos com tempos de reteno de 3,368, 3,552 e 8,748 min, sendo que os trs foram lidos pelos dois comprimentos de onda. Foram observados dois picos intensos com tempos de reteno de 4,866 e 5,355 min, sendo que ambos foram lidos somente pelo comprimento de onda de 470 nm. Clonostachys rosea f catenulata apresentou um extrato com dois picos com tempos de reteno de 8,669 e 10,053 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois comprimentos de onda. Microsporum gypseum apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de reteno de 9,685 min, lido pelos dois comprimentos de onda. Foram observados cinco picos com tempos de reteno de 7,769, 8,417, 10,805, 11,192 e 11,845 min, lidos somente pelo comprimento de onda de 470 nm, sendo que o primeiro deles bem intenso. Paecilomyces lilacinus apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de reteno de 8,941 min, lido pelos dois comprimentos de ondas. O extrato obtido de Paecilomyces varioti apresentou dois picos intensos com tempo de reteno de 8,950 e 10,364 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois comprimentos de onda. Penicillium janthinellum apresentou, em seu extrato, quatro picos com tempos de reteno de 8,717, 9,070, 10,092 e 10,551 min, todos lidos pelos dois comprimentos de onda, sendo que os com tempos de reteno de 8,717 e 10,092 min so bem intensos. Foram observados dois picos com tempos de reteno de 18,934 e 21,029 min, sendo que os dois foram lidos somente pelo comprimento de onda de 470 nm. A biotransformao com Syncephalastrum racemosum apresentou um extrato com sete picos com tempos de reteno de 3,447, 3,823, 5,215, 7,996, 8,201, 8,717 e 9,063 min, todos foram lidos pelos dois comprimentos de onda, sendo que, o pico com o tempo de reteno de 8,717 min bem intenso. Dos 15 fungos selecionados, nove produziram alguma substncia nova em contato com a esclerotiorina (20), sendo que todos estes produziram substncias avermelhadas, supostamente, resultante da troca do heterotomo de oxignio vizinho ao carbono 1, por um tomo de nitrognio. Aspergillus parasiticus, Cladosporium sphaerospermum, Microsporum gypseu e Penicillium janthinellum tambm 71

apresentaram outros produtos de biotransformao onde no houve mudana do

cromforo e as substncias mantiveram a colorao alaranjada da esclerotiorina (20), o que indica que estes fungos so capazes de fazer outra alterao na molcula, alm da troca do heterotomo. Todos os produtos de biotransformao produzidos pelos fungos apresentam caractersticas mais polares do que a esclerotiorina (20), com exceo do composto com tempo de reteno de 20,997 min, menos polar, produzido por Aspergillus parasiticus e Penicillium janthinellum. Aspergillus parasiticus, Cladosporium sphaerospermum, Microsporum gypseum, Paecilomyces varioti, Penicillium janthinellum e Syncephalastrum racemosum

produziram um ou mais produtos com grandes rendimentos, evidenciado pela intensidade dos respectivos picos das substncias. A mdia do tempo de reteno da esclerotiorina (20) nas 14 amostras que resultaram em cromatogramas com boa resoluo foi de 19,5014 e o desvio padro foi de 0,2280. Para saber se os 14 valores seguem a distribuio normal, foi aplicado o teste de normalidade de Ryan-Joiner. O valor crtico para n=14, com =0,01, de 0,9402 e o valor obtido com o teste de normalidade foi de 0,9585, o que comprova, com 99% de confiabilidade, que os valores seguem a distribuio normal. O erro padro mdio foi de 0,0770, o que levou a um intervalo de confiana de 19,5014 0,1662, com 95% de confiabilidade, utilizando 13 graus de liberdade. Esse intervalo de confiana foi extrapolado para se comparar os tempos de reteno das outras substncias dos cromatogramas. Deste modo, foi possvel comparar os tempos de reteno de substncias produzidas por diferentes fungos e estimar se a mesma substncia produzida por fungos diferentes. Como critrio, tambm foi levado em conta o comprimento de onda que as substncias absorvem. Cladosporium sphaerospermum e Syncephalastrum racemosum produzem uma substncia com tempo de reteno 5,285 min, porm no se trata da mesma substncia, pois este pico, no primeiro fungo lido pelos dois comprimentos de onda e, no segundo, lido somente pelo comprimento 470nm. A Tabela 15 lista as substncias produzidas por mais de um fungo. O tratamento estatstico garante 95% de confiabilidade.

72

Tabela 15 Substncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformao de mais de um fungo Tempo de reteno mdio (min) 3,408 Fungos produtores Cladosporium sphaerospermum Syncephalastrum racemosum 8,004 Absidia cylindrospora Syncephalastrum racemosum 8,210 Absidia cylindrospora Syncephalastrum racemosum 8,722 Absidia cylindrospora Aspergillus parasiticus Cladosporium sphaerospermum Clonostachys rosea f catenulata Penicillium janthinellum Syncephalastrum racemosum 9,006 Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium janthinellum Syncephalastrum racemosum 10,089 Clonostachys rosea f catenulata Penicillium janthinellum 20,997 Aspergillus parasiticus Penicillium janthinellum

5.6.4 Interpretao dos resultados da biotransformao em uma etapa de B. bassiana O cromatograma do extrato obtido com a biotransformao em duas etapas do Beauveria bassiana (item 4.4.1) apresentou quatro dos cinco biotransformados evidenciados por CCD e isolados no item 5.3.2 deste trabalho. Os tempos de reteno foram 8,625, 12,22, 16,285 e 18,060 min, sendo que os quatro foram lidos pelos dois comprimentos de onda (Figura 40). O cromatograma do biotransformado 3 no apresentou boa resoluo mesmo aps repetio do experimento, mas, pela sua polaridade, estima-se que ele possua um tempo de reteno prximo ao do biotransformado 2 (16,285 min). O cromatograma tambm evidenciou uma outra substncia com tempo de reteno de 9,993 min, que no foi isolada do extrato bruto. 73

Figura 40 Cromatograma da biotransformao em duas etapas em contraste com o cromatograma dos biotransformados isolados

O cromatograma obtido com o extrato da biotransformao em uma etapa no apresentou nenhuma substncia em quantidade considervel. Como j citado na literatura (Medeiros, 2002), a biotransformao em duas etapas produz substratos em maior quantidade, o que foi demonstrado na biotransformao da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana. 5.6.5 Extrato de P. sclerotiorum O cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum, obtido no item 4.2, apresentou os trs metablitos secundrios produzidos por este fungo citados na 74

literatura (Castro, 2008): isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencoldeo (21), respectivamente com os tempos de reteno de 8,94, 19,78 e 22,10 min, sendo que os dois ltimos so lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm e a isocromofilona VI (22) lida pelos dois comprimentos de onda (Figura 41).

Figura 41 Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum

5.7 Projeo para uso dos resultados em alimentos

Com os experimentos elaborados, foi possvel obter vrias substncias novas a partir da biotransformao da esclerotiona, sendo que cinco delas foram isoladas e uma teve sua estrutura proposta. A esclerotiorina (20) um corante e antioxidante de atividade comprovada (Chidananda e Sattur, 2007), com baixa toxicidade e registros de uso em alimentos (Negishi et al., 2000). O estudo da obteno de derivados desta molcula pode resultar na descoberta de substncias com melhores caractersticas, como: alterao de cor, maior efeito antioxidante, menor toxicidade, ou melhor incorporao em alimentos. Devido baixa toxicidade da esclerotiorina (20), pode-se supor que alguns de seus produtos derivados possam ser aplicados na indstria de alimentos, porm, para isso sero necessrios mais testes, principalmente os de toxicidade. A biotecnologia tem grande importncia no estudo dos alimentos e biotransformaes podem ser usadas na busca de novas substncias para este segmento. Tendo em mente as limitaes do uso de corantes naturais, como a dependncia de materiais sazonais e a variao do perfil do pigmento e, notando o crescente mercado para corantes naturais, pode-se inferir que o futuro da produo industrial de corantes naturais se basear em trs reas: produo robusta com 75

qualidade uniforme, descoberta de fontes alternativas de novas ou conhecidas classes de pigmentos e cores, e melhoria da funcionalidade. A habilidade da classe dos policetdeos de servir como corantes de alimentos tem escapado da ateno de cientistas de alimentos, inclusive na indstria. A recente aprovao de carotenides derivados de fungos filamentosos para uso como corantes em alimentos destaca o potencial dos policetdeos, que tem sido pouco explorado, com exceo dos pigmentos produzidos por fungos do gnero Monascus (Mapari et al., 2010). Estudos recentes indicam como fungos filamentosos podem ser usados como fbricas celulares para produo de pigmentos e podem ser desenvolvidos para expandir a paleta de cores dos corantes naturais existentes. No entanto, preciso compreender melhor como, porque e sob quais circunstncias fungos filamentosos produzem pigmentos policetdeos. Assim como outros corantes, os policetdeos precisam passar por testes de toxicidade antes de serem aprovados. No que se diz respeito aceitao dos consumidores e das autoridades, os policetdeos devem ser tratados de maneira igual aos atuais corantes aprovados que vem de fontes exticas, como o cido carmnico, extrado do inseto cochonilha, e os carotenides de origens fngicas (Mapari et al., 2010).

76

CONCLUSES
O fungo Penicillium sclerotiorum produziu esclerotiorina (20) em meio de cultura lquido, em cultivo esttico. Aps 21 dias de cultivo, a extrao com acetato de etila gerou 3,07 g de extrato.

A esclerotiorina (20) presente no filtrado do cultivo do fungo foi isolada do extrato, com alto grau de pureza, por cromatografia em coluna, utilizando diclorometano como eluente. Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20), relativos a 30% da massa total do extrato.

A reao da esclerotiorina (20) com o diazometano resultou na metilao da posio 1 da molcula de esclerotiorina (20). A reao de formao do 1-metilesclerotiorina (64) teve rendimento de 31%.

A biotransformao da esclerotiorina (20) pelo fungo Beauveria bassiana foi pouco eficiente quando foi adicionada diretamente no cultivo do fungo

(biotransformao em uma etapa).

A biotransformao da esclerotiorina (20) pelo fungo B. bassiana foi eficiente quando o meio de reao continha apenas massa celular e o substrato em gua destilada (biotransformao em duas etapas).

Foram isolados cinco produtos da biotransformao da esclerotiorina (20) por B. bassiana em duas etapas. A quantidade obtida dos biotransformados 1 a 5 foram, respectivamente, 27,5 mg, 8,3 mg, 1,9 mg, 12,8 mg e 13,7 mg, o que representa rendimentos de 13,75%, 4,15%, 0,95%, 6,4% e 6,85%, respectivamente.

Todos os produtos biotransformados apresentaram um tomo de nitrognio em substituio ao tomo de oxignio ligado ao carbono 1 da molcula de esclerotiorina (20), ligado a uma cadeia lateral, diferente em cada um dos cinco produtos. O biotransformado 1 (56) foi isolado e sua estrutura molecular foi determinada por mtodos espectroscpicos.

77

A biotransformao em duas etapas da 1-metil-esclerotiorina (64) pelo Beauveria bassiana no apresentou os mesmos resultados apresentados quando se usou a esclerotiorina (20). O heterotomo ligado ao carbono 1 no foi substitudo, provavelmente pelo fato de este stio estar alterado, com um grupo metila ligado

Da triagem de 15 fungos selecionados, para verificar a capacidade de biotransformao da esclerotiorina (20) em uma etapa, nove produziram alguma substncia com colorao vermelha, e destes, quatro produziram tambm alguma outra substncia de colorao alaranjada.

Os

metablitos

secundrios

produzidos

pelo

Penicillium

sclerotiorum,

isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencoldeo (21), aps a injeo no HPLC, apresentaram respectivamente os tempos de reteno de 8,94, 19,78 e 22,10 min.

78

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Alvarenga, L.M. Efeito do tratamento enzimtico da polpa na produo de aguardente de manga (Mangifera indica L.). Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, 2006. (Dissertao: Mestrado em Cincias de Alimentos) Alvarenga, R.M., Gomes, D.C., Oliveira, E.S., Lara, S.R. Uso de diferentes linhagens de leveduras para fermentao de polpa de manga para produo de aguardente de manga. In: XXI Congresso Brasileiro de Cincia e Tecnologia de Alimentos. 2008 Aquarone, E., Borzani, W., Schmidell, W., Lima, U.A. Biotecnologia Industrial, Volume 4: Biotecnologia na produo de alimentos. Editora Edgard Blcher Ltda. 1 Ed. 2008. So Paulo, Brasil Araujo, K.G.L., Domingues, J.R., Srur, A.U.O.S.; da Silva, A.J.R. Production of antioxidants by Anabaena PCC 7119 and evaluation of their protecting activity

against oxidation of soybean oil. Food Biotechnology. Vol 20. No 1. 2006. 65-77p Arunpanichlert, J., Rukachaisirikul, V., Sukpondma, Y., Phongpaichit, S., Tewtrakul, S., Rungjindamai, N., Sakayaro, J. Azaphilone and Isocoumarin derivatives from the endophytic fungus Penicillium sclerotiorum PSU-A13. Chem Pharm Bull. Vol 58. 2010. 1033-1036p Azab, M.S. Re-use of wastewater of food industries for the production of fungal biomass and enzymes for the bio-treatment of wastewater. Egyptian Journal of Biotechnology. Vol 7. 2000. 163-179p Brdy, J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. Vol 58. No 1. 2005. 1-26p Blendford, D. Colouring consumers perceptions. Food Ingredients Anal. Vol 17. 1995. 10-15p Borzani, W., Schmidell, W., Lima, U.A., Aquarone, E. Biotecnologia Industrial, Volume I: Fundamentos. Editora Edgard Blcher Ltda. 1 Ed. 2008. So Paulo, Brasil Bracarense, A.A.P. Isolamento, preparo de derivados e bioprospeco da atividade biolgica de metablitos de fungos filamentosos. Belo Horizonte: Departamento de Qumica, Universidade Federal de Minas Gerais. 2008. 130p. (Dissertao: Mestrado em Qumica) Brizuela, M.A., Garca, L., Prez, L., Mansur, M. Basidiomicetos: nueva fuente de metabolitos secundrios. Rev Iberoam Micol. Vol 15. 1998. 69-74p Buchanan, G.O., Reese, P.B. Biotransformation of diterpenes and diterpene derivatives by Beauveria bassiana ATCC 7159. Phytochemistry. Vol 56. 2001. 141-151p 79

Butler, M.S., The role of natural product chemistry in drug Discovery. J Nat Prod. Vol 67. 2004. 2141-2153p Carvalho, S.A. Avaliao do potencial de fungos macro e microscpicos como fonte de cidos graxos e outros macro e micronutrientes de interesse para a indstria alimentcia. Belo Horizonte: Departamento de Qumica, Universidade Federal de Minas Gerais. 2009. 136p. (Tese: Doutorado em Qumica) Castro, M.C.M. CLAE e investigao da atividade biolgica de metablitos de Penicillium sclerotiorum. Belo Horizonte: Departamento de Qumica, Universidade Federal de Minas Gerais. 2008. 85p. (Dissertao, Mestrado em Qumica) Chidananda, C., Rao, L.J.M., Sattur, A.P. Sclerotiorin, from Penicillium frequentans, a potent inhibitor of aldose reductase. Biotechnol Lett. Vol 28. 2006. 1633-1636p Chidananda, C., Sattur, A.P. Sclerotiorin, a novel inhibitor of lipoxygenase from Penicillium frequentans. J Agric FoodChem. Vol 55. 2007. 2879-2883p Choudhary, M.I., Mohammad, M.Y., Musharraf, S. G., Parvez, M., Al-Aboudi, A., Attaur-Rahman. New oxandrolone derivatives by biotransformation using Rhizopus stolonifer. Steroids. Vol 74. 2009. 1040-1044p Ciola, R. Fundamentos da Cormatografia a Lquido de Alto Desempenho: HPLC. 1 ed. 2005. Editora Edgard Blcher LTDA. So Paulo, SP Duetz, W.A., Bouwmeester, H., Beilen, J.B.V., Witholt, B. Biotransformation of limonene by bacteria, fungi, yeasts and plants. Appl Microbiol Biotechnol. Vol 61. 2003. 269277p Edrada R.A., Heubes, M., Brauers, G., Wray, V., Berg, A., Grfe, U., Wohlfarth, M., Mhlbacher, J., Schaumann, K., Sudarsono, Bringmann, G., Proksch, P. Online analysis os Xestodecalactones A-C, novel bioactive metabolites from the fungus Penicillium cf. montanense and their subsequent isolation from the sponge Xestospongia exigua. J Nat Prod. Vol 65. 2002. 1598-1604p FDA U.S. Food and Drug Administration, IFIC International Food Information Council, Food Ingredients and Colors. Disponvel em:

<http://www.fda.gov/food/foodingredientspackaging/ucm094211.htm>. Acesso em: 11 nov. 2010

Abril 2010.

Funder, S. Practical mycology: manual for identification of fungi. 3 ed. 1968. Hafner Publishing Company. Noruega. Garca-Granados, A., Martnez, A., Parra, A., Rivas, F. Manoyl-oxide biotransformations with filamentous fungi. Current Organic Chemistry. Vol 11. 2007. 679-692p 80

Gengar, R.M., Chuturgoon, A.A., Mulholland, D.A., Dutton, M.F. Synthesis of sterigmatocystin derivatives and their biotransformation to aflatoxins by a blocked mutant of Aspergillus parasiticus. Mycopathologia. Vol 144. 1999. 115-122p Gesell, M., Hammer, E., Specht, M., Francke, W., Schauer, F. Biotransformation of Biphenyl by Paecilomyces lilacinus and Caracterization of Ring Cleavage Products. Applied and Environmental Microbiology. Vol 67. No 1. 2001. 1551-1557p Gonzlez-Snchez, F., Azaola, A., Gutirrez-Lpez, G.F, Hernndez-Snchez, H. Viability of microencapsulated Bifdobacterium animalis ssp. lactis BB12 in kefir during refrigerated storage. International Journal of Dairy Technology. Vol 63. No 3. 2010. 431-436p Gottlieb, O.R., Mors, N.B. Potencial utilization of brazilian wood extractives. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol 28. 1980, 196-215p Guiraud, P., Bonnet, J.L., Boumendjel, A., Kadri-Dakir, M., Dusser, M., Bohatier, J., Steiman, R. Involvement of Tetrahymena pyriformis and selected fungi in the elimination of anthracene, and toxicity assessment of the biotranformation products. Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol 69. 2008. 296-305p Harinantenaina, L., Noma, Y., Asawaka, Y. Penicillium sclerotiorum catalyses the conversion of herbertenediol into its dimmers: mastigophorenes A and B. Chem Pharm Bull. Vol 53. No 2. 2005. 256-257p Hawksworth, D.L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation. Mycological Research. Vol 95. 1991. 641-655p Hendry, G.A.F, Houghton, J.D. Natural Food Colorants. 2 ed. Chapman & Hall. 1996. Glasgow, Esccia Hudlicky, M. An improved apparatus for the laboratory preparation of diazomethane. The Journal of Organic Chemistry. Vol 45. 1980. 5377-5378p Hussein, H.S., Brasel, J.M. Review: toxicity, metabolism and impact os mycotoxiins on humans and animals. Toxicology. Vol 167. No 2. 2001. 101-134p Kakeya, H., Takahashi-Ando, N., Kimura, M., Onose, R., Yamaguchi, I., Osada, H. Biotransformation of the Mycotoxin, Zearalenone, to a Non-estrogenic Compound by a Fungal Strain of Clonostachys sp. Biosci Biotechnol Biochem. Vol 66. 2002. 27232726p Keller, N.P., Turner, G., Bennett, J.W. Fungal secondary metabolism, from biochemistry to genomics. Nature reviews, Microbiology. Vol 3. 2005. 937-947p

81

Kiehlmann, E., Pinto, L., Moore, M. The biotransformation of chrysene to trans-1,2dihydroxy-1,2-dihydrochrysene by filamentous fungi. Can J Microbiol. Vol 42. No 6. 1996. 604-608p Knob, A., Carmona, E.C. Cell-associated acid -xylosidade production by Penicillium sclerotiorum. New Biotechnology. Vol 26. No 1/2. 2009. 60-67p Lacroix, I., Biton, J., Azerad, R. Microbial Models of Drug Metabolism: Microbial Transformations of Trimegestone (RU27987) a 3-Keto-4,9(10)-19-norsteroid Drug. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Vol 7. 1999. 2329-2341p Liu, D., Thomson, K., Anderson, A.C. Identification of nitroso compounds from biotransformation of 2,4-dinitrotoluene. Applied an Environmental Microbiology. Vol 47. No 6. 1984. 1295-1298p Lucas, E.M.F., Castro, M.C.M., Takahashi, J.A. Antimicrobial properties of sclerotiorin, isochromophilone VI and pencolide, metabolites from a Brazilian Cerrado isolate of Penicillium sclerotiorum van Beyma. Brazilian Journal of Microbiology. Vol 38. 2007. 785-789p MacCurtin, T., Reilly, J. Sclerotiorine, a chlorinated metabolic product of Penicillium sclerotiorum, Van Beyma. Biochem J. Vol 34. 1940. 1419-1421p Mapari, S.A.S., Nielsen, K.F., Larsen, T.O., Frisvad, J.C., Meyer, A.S., Thrane, U. Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as potential natural food colorants. Current Opinion in Biotechnology. Vol 16. 2005. 231-238p Mapari, S.A.S., Meyer, A.S., Thrane, U., Frisvad, J.C. Identification of potentially safe promising fungal cell factories for the production of polyketide natural food

colorants using chemotaxonomic rationale. Microbial Cell Factories. Vol 8. No 24. 2009. 1-15p Mapari, S.A.S., Thrane, U., Meyer, A.S. Fungal polyketide azaphilone pigments as future natural food colorants? Trends in Biotechnology. Vol 28. 2010. 300-307p Martins, L.R. Avaliao do potencial biotecnolgico de fungos brasileiros em reaes de biotransformao e biorremediao. Belo Horizonte: Departamento de Qumica, Universidade Federal de Minas Gerais. 2009. 189 p. (Tese, Doutorado em Qumica) Medeiros, S.F. Biotransformao de derivados da artemisinina com ao antimalrica por Mucor ramannianus. Rio de Janeiro: Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2002. 138p. (tese, Doutorado em Tecnologia de processos qumicos e bioqumicos) 82

Miyazawa, M., Nankai, H., Kameoda, H. Biotransformation of (+)-cedrol by plant pathogenic fungus, Glomerella cingulata. Phytochemistry. Vol 40. No 1. 1995. 6972p Mukherjee, G., Sachan, A., Shashwati, G., Mitra, A. Conversion of sinapic acid to syringic acid by a filamentous fungus Paecilomyces variotii. J Gen Appl Microbiol. Vol 52. 2006. 131-135p Musso, L., Dallavalle, S., Merlini, L., Bava, A., Nasini, G., Penco, S., Giannini, G., Giomarelli, C., Cesare, A., Zuco, V., Vesci, L., Pisano, C., Piaz, F., Tommasi, N., Zunino, F. Natural and semisynthetic azaphilones as a new scaffold for Hsp90 inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Vol 18. 2010. 6031-6043p Negishi, Y., Matsuo, N., Miyadera, K., Tanishima, M. Lipase inhibitors containing sclerotiorin. Jpn Pat. 2000. 98-376263 19981224 Olivo, H.F, Ozorio-Lozada, A., Peeples, T.L. Microbial oxidation/amidation of benzhydrylsulfanyl acetic acid. Synthesis of (+)-modafinil. Tetrahedron: Asymmetry. Vol 16. 2005. 3507-3511p Osmanova, N., Schultze, W., Ayoub, N. Azaphilones: a class of fungal metabolites with diverse biological activities. Phytochem Rev. Vol 9. 2010. 315-342p Osorio-Lozada, A., Miranda, R.T., Olivo, H.F. Biotransformation of N-

piperidinylacetophenone with Beauveria bassiana ATCC-7159. Journal of molecular catalysis B: Enzymatic. Vol 55. 2008. 30-36p Pairet, L., Wrigley, S.K., Chetland, I., Reynolds, E.E., Hayes, M.A., Holloway, J., Ainsworth, A.M., Katzer, W., Cheng, X-M., Hupe, D.J., Charlton, P., Doherty, A.M. Azaphilones with endothelin receptor binding activity produced by Penicillium sclerotiorum: taxonomy, fermentation, isolation, structure elucidation and biological activity. The Journal of Antibiotics. Vol 48. No 9. 1995. 913-922p Palmqvist, A., Rasmussen, L.J., Forbes, V.E. Influence of biotransformation on trophic transfer of the PAH, fluoranthene. Aquatic Toxicology. Vol 80. 2006. 309-319p Pereira, R.T.G., Pfenning, L.H., Castro, H.A. Caracterizao e dinmica de colonizao de Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de vries em fruto do cafeeiro (Coffea arbica L.). Cinc agrotec Lavras. Vol 29. No 6. 2005. 1112-1116p Pimentel-Gomes, F. Curso de estatstica experimental. 14 ed. Editora Degaspari. 2000. Piracicaba. 477p Rai, M. Advances in Fungal Biotechnology. 1a ed. I.K. International Publishing House. 2009. New Delhi, India 83

Rosche, B., Sandford, V., Breuer, M., Hauer, B., Rogers, P. Biotransformation of benzaldehyde into (R)-phenylacetylcarbinol by filamentous fungi or their extracts. Appl Microbiol Biotechnol. Vol 57. 2001. 309-315p Rouhi, A.M. Rediscovering natural products. Chemical and Engineering News. Vol 81. 2003. 77-78p Sabino, M., Inomata, E.I., Lamarco, L.C.A. Variao dos nveis de aflatoxina B1 em pasta de amendoim e paoca consumidas no estado de So Paulo. Revista Instituto Adolfo Lutz. Vol 42. No 1/2. 1982. 39-44p Sachan, A., Ghosh, S., Mitra, A. Biotransformation of p-coumaric acid by Paecilomyces variotti. Letters in Applied Microbiology. Vol 46. No 1. 2006. 35-41p Sakamaki, H., Kitanaka, S., Chai, W., Hayashida, Y., Takagi, Y., Horiuchi, C.A. Biotransformation of Thujopsene by Caragana chamlagu. J Nat Prod. Vol 64. 2001. 630-631p Sato, S. Produo de esterides. In: Lima, U.A., Aquarone, E., Borzani, W., Schmidell, W. Biotenologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimticos. So Paulo, 4 ed. 2001. Cap 9. 179-197p Schulz, B., Boyle, C., Draeger, S., Rmmert, A.K., Krohn, K. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycol Res. Vol 106. 2002. 9961004p Sharma, K., Bari, S.S., Singh, H.P. Biotransformation of tea catechins into theaflavins with immobilized polyphenol oxidase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. Vol 56. No 4. 2009. 253-258p Shiomi, K., Matsui, R., Isozaki, M., Chiba, H., Sugai, T., Yamaguchi, Y., Masuma, R., Tomoda, H., Chiba, T., Yan, H., Kitamura, Y., Sugiura, W., Omura, S., Tanaka, H. Fungal phenalenones inhibit HIV-1 integrase. J Antibiot. Vol 58. 2005. 65-68p Shiva, S.K., Hara, K.K., Sanjit, K., Sunil, M., Narayana, M.U.S., Prasad, R.B.N. Biotransformation of ferulic acid to acetovanillone using Rhizopus oryzae. Biocatalysis & Biotransformation. Vol 25. No 1. 2007. 109-112p Siebers-Wolff, S., Arfmann, H.A., Abraham, W.R., Kieslich, K. Microbiological Hydroxylation and N-oxidation of Cinchona Alkaloids. Biocatalysis and

Biotransformation. Vol 8. No 1. 1993. 47-58p Silverstein, R.M., Webster, F.X., Kiemle, D.J. Spectrometric Identification of Organic Compounds. 7 ed. Wiley books. 2005. New York, EUA

84

Smedsgaard, J., Nielsen, J. Metabolite profiling of fungi and yeast: from phenotype to metabolome by MS and informatics. Journal of Experimental Botany. Vol 56. 2005. 273-286p Solomons, T.W.G. Qumica Orgnica. 7 Ed. Editora LTC. 2002. Rio de Janeiro, RJ Souza, G.G., Anconi, C.P.A., Cornelissen, S., Almeida, W.B., Santos, H.F., Fortes, I.C.P., Takahashi, J.A. Selective activity of Mucor plumbeus reductase towards (-)camphorquinone. J Ind Microbiol Biotechnol. Vol 36. 2009. 1023-1027p Still, W.C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J Org Chem. Vol 43. No 14. 1978. 29232925p Struempel, M., Ondruschka, B., Daute, R., Stark, A. Making diazomethane accessible for R&D and industry: generation and direct conversion in a continuous microreactor set-up. Green Chemistry. Vol 10. 2008. 41-43p Takahashi, J.A., Lucas, E.M.F. Ocorrncia e diversidade estrutural de metablitos fngicos com atividade antibitica. Qumica Nova. Vol 31. 2008. 1807-1813p Takahashi, J.A., Castro, M.C.M., Souza, G.G., Lucas, E.M.F., Bracarense, A.A.P., Abreu, L.M., Marriel, I.E., Oliveira, M.S., Floreano, M.B., Oliveira, T.S. Isolation and screening of fungal species isolated from Brazilian cerrado soil for antibacterial activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Streptococcus pyogenes and Listeria monocytogenes. J Mycologie Md. Vol 18. 2008. 198-204p Terci, D.B.L., Rossi, A.V. Indicadores naturais de pH: usar papel ou soluo? Qumica nova. Vol 25. No 4. 2002. 684-688p The Plant Observatory. Garcinia atroviridis (Asam Gelugur). Disponvel em: <http://www.natureloveyou.sg/Garcinia%20atroviridis/Main.html>. Acesso em: 16 nov. 2010 Tomoda, H., Matsushima, C., Tabata, N., Namatame, I., Tanaka, H., Bamberger, M.J., Arai, H., Fukazawa, M., Inoue, K., Omura, S. Structure-specific inhibition of cholesteryl ester transfer protein by azaphilones. The Journal of Antibiotics. Vol 52. No 2. 1999. 160-170p Tortora, G.J., Funke, B.R., Case, C.L. Microbiology: an introduction. 7 ed. Benjamin Cummings. 2002. Boston, USA Uenojo, M., Junior, M.R. W., Pastore, G.M. Carotenides: propriedades, aplicaes e biotransformao para formao de compostos de aroma. Qumica nova. Vol 30. No 3. 2007. 616-622p 85 Maro 2010.

Wei, W.G., Yao, Z.J. Synthesis studies toward chloroazaphilones and vinylogous pyridones: two common natural product core structures. J Org Chem. Vol 70. 2005. 4585-4590p Weng, S.H., Su, N.W., Choong, Y.M., Lee, M.H. HPLC/colorimetry combination method for quantitative analyses of sclerotiorin produced by Penicillium sclerotiorum. Journal of Food and Drug Analysis. Vol 12. No 3. 2004. 199-204p Wijeratne, E. K., Carbonezi, C. A., Takahashi, J. A., Seliga, C. J., Turbyville, T. J., Pierson, E. E., Pierson-Iii, L. S., Whitesell, L., Bolzani, V. S., Gunatilaka, A. A. L. Isolation, Optimisation Of Production and Structure-Activity Relationship Studies of Monocillin I, the Cytotoxic Constituent of Paraphaeosphaeria quadriseptata. The Journal of Antibiotics. Vol 57. No 8. 2004. 541-550p Xiahgjiu, H., Zeng, X., Hu, H., Wu, Y. Cytotoxic biotransformed products from andrographolide by Rhizopus stolonifer ATCC 12939. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. Vol 62. 2010. 242-247p Zhan, J, Gunatilaka, A.A.L. Biotransformation of Amino- and Hydroxyanthraquinones by Beauveria bassiana ATCC 7159. J Nat Prod. Vol 69. 2006. 1525-1527p Zhang, H., Qiu, F., Qu, G., Yao, X. The directional biotransformation of curcumol by Penicillium janthinellum. Chinese Journal of Medicinal Chemistry. Vol 15. No 5. 2005. 305-306p

86

APNDICES E ANEXOS
Apndice 1 Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apndice 2 Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

87

Apndice 3 Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apndice 4 Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

88

Apndice 5 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apndice 6 Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

89

Apndice 7 Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apndice 8 Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

90

Apndice 9 Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apndice 10 Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

91

Apndice 11 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apndice 12 Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

92

Apndice 13 Mapa de contornos HSQC-TOCSY (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apndice 14 Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 1

Intens. x10 5 2.0 494.2060

+MS, 0.1-0.6min #(6-34)

516.1876 1.5

1.0

0.5 437.1927 0.0 420 440 460 480 500 520 540 m/z

93

Apndice 15 Espectro no UV do biotransformado 1

Apndice 16 Espectro no IV (KBr) do biotransformado 1

94

Apndice 17 Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 4

2203
AMOSTRA_02_021110 11 (0.204) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:15) 100
510.3581

02-Dec-2010

09:49:56

TOF MS ES+ 1.53e4

512.3657

513.3709 480.3997 533.3936

0 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720

m/z

Apndice 18 Espectro no UV do biotransformado 4

95

Apndice 19 Espectro no IV (KBr) do biotransformado 4

Apndice 20 Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 5

2204
AMOSTRA_03_021110 12 (0.222) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:15) 100
434.3309

02-Dec-2010

09:58:07

TOF MS ES+ 7.71e3

436.3343

376.2983

378.3040 346.2778 405.3774

437.3427

542.5028 543.5035 576.4747

0 300

m/z 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

96

Apndice 21 Espectro no UV do biotransformado 5

Apndice 22 Espectro no IV (KBr) do biotransformado 5

97

Apndice 23 Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apndice 24 Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do produto 1

98

Apndice 25 Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do produto 1

Apndice 26 Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do produto 1

99

Apndice 27 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apndice 28 Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do produto 1

100

Apndice 29 Mapa de contornos NOESY (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apndice 30 Espectro de massas (ESI-MS) do produto 1

2101
AMOSTRA_01_021110 13 (0.241) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:14) 100
405.2026

02-Dec-2010

09:37:50

TOF MS ES+ 3.78e4

407.2253

317.1865

363.2074

319.1919 365.2056

408.2386

427.2208

0 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

m/z

101

Apndice 31 Espectro no UV do produto 1

Apndice 32 Espectro no IV (KBr) do produto 1

102

Apndice 33 Cromatograma do extrato de Absidia cylindrospora

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

103

Apndice 34 Cromatograma do extrato de Aspergillus parasiticus

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

104

Apndice 35 Cromatograma do extrato de Cladosporium sphaerospermum

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

105

Apndice 36 Cromatograma do extrato de Clonostachys rosea f catenulata

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

106

Apndice 37 Cromatograma do extrato de Microsporum gypseum

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

107

Apndice 38 Cromatograma do extrato de Mucor plumbeus

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

108

Apndice 39 Cromatograma do extrato de Paecilomyces lilacinus

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

109

Apndice 40 Cromatograma do extrato de Paecilomyces varioti

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

110

Apndice 41 Cromatograma do extrato de Penicillium janthinellum

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

111

Apndice 42 Cromatograma do extrato de Pestalotiopsis palustris

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

112

Apndice 43 Cromatograma do extrato de Rhizopus oryzae

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

113

Apndice 44 Cromatograma do extrato de Rhizopus stolonifer

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

114

Apndice 45 Cromatograma do extrato de Syncephalastrum racemosum

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

115

Apndice 46 Cromatograma do extrato de Thamnostylum sp.

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

116

Apndice 47 Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformao da esclerotiorina)

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

117

Apndice 48 Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformao da 1-metil-esclerotiorina)

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

118

Apndice 49 Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformao da esclerotiorina em duas etapas)

Controle 530nm

Controle 470nm

Amostra 530nm

Amostra 470nm

119

Apndice 50 Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum

530nm

470nm

120

Anexo 1 Tabela de distribuio de t student (na vertical, graus de liberdade, na horizontal, probabilidade do teste)

GL/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120

0,9

0,8

0,7 0,51

0,6 0,727

0,5 1

0,4

0,3

0,2

0,1 2,92

0,05

0,02

0,01 63,66 9,925 5,541 4,604 4,032 3,707 3,499 3,355 3,25 3,169 3,106 3,055 3,012 2,977 2,947 2,921 2,898 2,878 2,861 2,845 2,831 2,819 2,807 2,797 2,787 2,779 2,771 2,763 2,756 2,75 2,704 2,66 2,617 2,576

0,001 636,6 31,60 12,92 8,61 6,869 5,959 5,408 5,041 4,781 4,587 4,437 4,318 4,221 4,14 4,073 4,015 3,965 3,922 3,883 3,85 3,819 3,792 3,767 3,745 3,726 3,707 3,69 3,674 3,659 3,646 3,551 3,46 3,373 3,291

0,158 0,325

1,376 1,963 3,078 6,314 12,71 31,82 4,303 6,965 1,25 1,19 1,638 2,353 3,182 4,541 1,533 2,132 2,776 3,747 1,44 1,943 2,447 3,143 1,86 2,306 2,896

0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,13 0,13 0,129 0,129 0,92

1,156 1,476 2,015 2,571 3,365

0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134

0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,365 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,1 0,26 0,26 0,397 0,542 0,396 0,54 0,7 1,383 1,833 2,262 2,821

0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883

0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764

0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 0,87 1,079 1,35 1,771 2,16 2,65

0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 0,128 0,258 0,392 0,535 0,69 0,865 1,071 1,337 1,746 1,74 1,33 2,12 2,11 2,583 2,567 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,127 0,256 0,127 0,256 0,127 0,256 0,127 0,256 0,127 0,256 0,39 0,39 0,39 0,39 0,39 0,86

1,734 2,101 2,552

0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,08 2,518 2,5 2,485 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 0,532 0,685 0,858 1,06

0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 1,319 1,714 2,069 2,06 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 0,531 0,684 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 0,53 0,53 0,53 0,683 0,856 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 0,683 0,854 1,055 1,05 1,31 1,697 2,042 2,457 2 1,98 1,96 2,39 2,358 2,326 1,303 1,684 2,021 2,423

0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,856 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 0,127 0,256 0,389 0,127 0,256 0,389 0,127 0,256 0,389

0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851

0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645

121

Anexo 2 Informaes obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, subespectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a isocromofilona VI c (ppm) 152,63 158,11 106,38 138,67 110,81 185,97 84,58 191,78 114,57 115,68 142,86 131,97 148,84 35,13 30,06 11,94 20,18 12,35 22,53 170,10 20,06 55,5 60,8 H (ppm) 7,93 6,65 6,08 7,06 5,70 2,49 1,37 0,87 1,01 1,85 1,57 2,17 4,02 3,92

Numerao 1 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Grupo CH-O C-O CH C C-Cl C=O C-O C=O C CH CH C CH CH CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 C=O CH3 CH2 CH2

JH (Hz) d, 15,6 d, 16,0 d, 10,0 m m t, 5,2; 7,6 d, 6,8 t, 4,8; 4,7 t, 4,8; 4,8

122