Universidad Autnoma de Ciudad Jurez Instituto de Ciencias Biomdicas Biologa molecular Rafael Guzmn Delgado Practica #6 Electroforesis de cidos

nucleicos en gel de agarosa

La electroforesis es un mtodo donde las molculas son separadas segn el tamao y su carga. En cidos nucleicos, que poseen carga negativa, se trasladan hacia el nodo (+). Esto ocurre en una cmara de electroforesis donde se coloca el gel, hecho de agarosa que funciona como un filtro, buffer TAE, que es un amortiguador de pH. Al final se obtendr un gel, que en luz UV se observa un patrn de bandas, las cuales, dependiendo del orden podremos determinar si es DNA cromosmico, plasmdico, superenrollado, RNA, etc. Palabras clave: Electroforesis, agarosa, ADN, ARN

Introduccin La electroforesis es un mtodo que lleva a cabo la separacin de molculas de acuerdo al tamao y a la carga elctrica. El trmino hace referencia al traslado de las partculas bajo un campo elctrico y a travs de un gel. La fuerza motriz de este mtodo es la tensin elctrica que se aplica a los electrodos en los extremos del gel. (Somma & Querci, 2007). Gran cantidad de molculas biolgicas contienen grupos ionizables y en solucin las encontramos cargadas (cationes o aniones), las cuales, al encontrarse en un campo elctrico sern separadas segn su carga. Esta tcnica nos ayuda a analizar ADN, fragmentos de ADN, ARN, protenas y otras. En los cidos nucleicos, el grupo fosfato provee carga negativa a estas molculas en pH neutro, por lo tanto los fragmentos migraran del nodo (+) al

ctodo (-) (Padilla, Diez, Martnez, Brcena, & Garca, 2008). La velocidad y resolucin de la separacin de fragmentos est regulada por la concentracin de agarosa, funciona como filtro, y el voltaje aplicado. Al aumentar la concentracin de agarosa los cidos nucleicos se mueven ms lentamente y se obtendr una mayor resolucin de fragmentos de menor longitud. A mayor voltaje la velocidad a la que son separados los fragmentos de ADN incrementa. Los cidos nucleicos separados las muestras son mezcladas con colorantes, de esta manera se puede visualizar directamente, en el gel, la muestra. Para un anlisis ms detallado es necesaria la utilizacin de una cmara de UV, la cual pondr en evidencia los cidos nucleicos (Duque, 2009).

Objetivos Realizar el protocolo de electroforesis de las muestras obtenidas anteriormente. Analizar el patrn de bandas final.

ARN Para colocar las muestras de ARN, se agreg al ARN 30L H2O DEPC. De cada solucin resultante se tomaron 20L y se mezcl con 20L de buffer de carga. Se cargaron los 40L en los pozos del gel de agarosa. La fuente de energa fue establecida a 70V y se dej as hasta ver que las muestras llegaran al tope con los siguientes pozos y no se salieran del gel. Finalmente, los geles fueron observados en una cmara de UV. Se analizaron los resultados.

Materiales Cmara de electroforesis Peines Pipetas de 20L y 200L Agarosa al 2% TAE buffer (Tris-acetato) Bromuro de etidio Buffer de carga Muestra de ADN y ARN H2O DEPC (Dietil pirocarbonato) H2O desionizada

Resultados Mtodo La agarosa contenida en un molde fue colocada al interior de la cmara de electroforesis, despus se le agrego el TAE y finalmente el bromuro de etidio. ADN Para colocar las muestras de ADN, se agreg al ADN plasmdico, obtenido por lisis alcalina, 50L de H2O desionizada, el ADN plasmdico obtenido por columna y el ADN cromosomal se tomaron directamente. Despus se mezcl 10L de muestra con 10L de buffer de carga. Se cargaron los 20L en los pozos del gel de agarosa.

En el gel de extraccin de DNA podemos observar que en los carriles 13 y 5-8 se observaron casi los mismos patrones, donde el DNA ubicado en el pozo es DNA cromosomal, la banda siguiente es del DNA plasmdico superenrollado y la siguiente banda es el plsmido. La intensidad depende en gran parte por la cantidad de DNA de la muestra. En el pozo 7 podemos observar barrido podemos decir que es debido a que la muestra contena alcohol (Fig. 1). Por parte de la extraccin del DNA cromosomal se observ en los pozos 11-13 y 15 (Fig. 1).

Sobre la extraccin del RNA podemos ver que en el pozo 4 vemos el RNA mensajero, mientras que en los pozos 2, 4, 5 y 6 observamos manchones que es RNA degradado (Fig. 2).

adems es esencial para realizar otras tcnicas.

Bibliografa
Duque, D. P. (2009). ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA. Protocolos de laboratorio UEG2009. Padilla, C. A., Diez, J., Martnez, E., Brcena, J. A., & Garca, C. (2008). Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. In D. d. B. y. B. Molecular (Ed.). Somma, M., & Querci, M. (2007). ANLISIS DE LA PRESENCIA DE ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS: Comunidades Europeas.

Conclusin Es importante conocer cmo se lleva a cabo la electroforesis y cmo interpretar y analizar los resultados. Muchos de stos pueden ser falsos debido a una mala metodologa. Sobre los cidos nucleicos debemos tener en cuenta que poseen carga negativa y que en una electroforesis migrarn hacia el nodo (+). Segn el patrn de bandas podemos deducir que tipo de ADN y ARN contiene la muestra. Esta tcnica,

Figura 1. DNA cromosomal y plasmdico.

Figura 2. RNA de diferentes organismos.