Aislamiento, cuantificacin e identificacin de probioticos a partir de un producto comercial.

Universidad de Caldas Ing. De alimentos Microbiologa de alimentos. Manizales. Colombia.

RESUMEN Los alimentos probiticos son aquellos a los cuales se les han adicionado microorganismos que benefician la salud del hospedero, manteniendo un equilibrio en la flora intestinal. En el mercado se pueden encontrar variedad de productos probiticos en diferentes presentaciones; como para este caso en el que se analizo en laboratorio un yogurt ACTIVIA de alpina el cual contiene una serie de cultivos lcticos. El propsito de la prctica fue comprobar, si realmente haba un crecimiento de bacterias llamadas probiticos. Para ello se realizaron diluciones de la solucin madre hasta en cajas de petri se adiciono 1 ml de la disolucin y por duplicado cada una, despus se adiciono agar MRS; y por ltimo se dejaron en incubacin hasta observar que existiera crecimiento de colonias tpicas. Al terminar la incubacin se realizo la identificacin de lactobacilos con las diferentes pruebas bioqumicas, obteniendo resultados positivos.

Palabras claves: probioticos, lacto bacilos, flora intestinal

ABSTRACT Probiotic foods are those to which they have added microorganisms that benefit the host's health, maintaining a balance in the intestinal flora. In the market you can find variety of probiotic products in different forms, as for this case that was analyzed in the laboratory an alpine Activia yogurt which contains a number of lactic cultures. The purpose of the practice was to check if there really was a

growth of bacteria called probiotics. For this dilutions of the stock solution to 10

^ (-8) in petri dishes was added 1 ml of solution 10 ^ (-7) and 10 ^ (-8) in

duplicate each after MRS agar was added, and finally is allowed to incubate until existed observe typical colony growth. After the incubation was carried lactobacillus identification with different biochemical tests with positive results. Keywords: probiotics, lactobacillus, intestinal flora

INDRODUCCION

En los ltimos aos el auge de consumo, de alimentos con contenidos benficos para la salud ha marcado la tendencia, entre ellos los probiticos que ayudan sobre todo en el mejoramiento de las enfermedades relacionadas con el aparato gastrointestinal. Los probiticos son alimentos con microorganismos vivos adicionados que permanecen activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiolgicos. Ingeridos en cantidades suficientes, tienen efectos muy beneficiosos, como contribuir al equilibrio de la flora bacteriana intestinal del husped y potenciar el sistema inmunitario. Pueden atravesar el tubo digestivo y recuperarse vivos en las heces, pero tambin se adhieren a la mucosa intestinal. No son patgenos, excepto en casos en que se suministran a individuos inmunodeficientes. Los probiticos son considerados alimentos funcionales ya que estos cumplen la funcin de prevenir enfermedades. Las bacterias adicionadas a los productos como las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium que

son las ms comunes, son sensibles a algunos factores fsicos como las temperaturas altas, por esta razn la mayora de productos que encontramos en el mercado son lcteos ya que estos se mantienen a temperatura de refrigeracin, y tambin existen alimentos probiticos como salas y aderezos porque mantienen una temperatura ambiente. Esto es porque la que la viabilidad de los probiticos es de suma importancia, debido a que sus efectos benficos sobre la salud del husped dependen de que permanezcan vivos hasta llegar a su sito de accin. En cuanto a la industria de alimentos cuando se quiere adicionar una bacteria, para obtener un producto probiticos se deben seguir algunos pasos establecidos por la FAO que son: identificacin del genero, la especie, y la cepa prebitica; realizar estudios in vitro para la seleccin de probiticos de uso en humanos; evaluar la seguridad de los probiticos; estudios in vivo utilizando animales y humanos; etiquetado; viabilidad e identificacin de la cepa declaradas en productos probiticos comerciales.

De acuerdo a lo dicho anteriormente podemos seleccionar una cepa de bacterias probioticas y si cumplen con estos requisitos posteriormente podemos estar seguros de adicionarla al alimento. El objetivo de la prctica es conocer la tcnica que permita identificar y determinar los microorganismos probioticos presentes en el alimento que ser objeto de estudio. MATERIALES Y METODOS La prctica se llevo a cabo en un entorno asptico y limpio, para evitar contaminacin, con instrumentos estriles.

A continuacin se realizaron las diluciones 1/10 hasta la dilucin 10^-8

Figura 3: Obtencin de las diluciones, hasta 10^ -8

Posteriormente se inoculo 1 mL de las diluciones (10^-7 y 10^- 8) por duplicado en cajas de Petri estriles.

Figura 4: adicin de 1ml de las diluciones en cajas de Petri Figura 1.materiales para la determinacin de cultivos lcticos

El alimento analizado fue yogurt ACTIVIA del cual se tomaron 10g.

En seguida se agregaron 15 mL de agar MRS fundido en cada caja y se homogenizaron suavemente

Figura 2: Pesaje de 10 g de yogurt

Figura 5: Adicin del agar fundido en cada caja

Pasado el tiempo de incubacin se contaron las colonias y se realiz el clculo de las UFC/ml. (este se encuentra al final del informe).

Figura 6: Homogenizacin.

Despus de que se homogeniz y cuando el agar estaba completamente firme y seco se incub a 37C durante 48h, en condiciones de anaerobiosis.

Figura 9: Recuento de las colonias

Para la identificacin de lactobacilos, se seleccionaron las colonias y se realizaron las siguientes pruebas:

Figura 7: Ambiente de anaerobiosis para favorecer el crecimiento

Figura 10: Seleccin de las colonias tpicas para las pruebas

Catalasa

Figura 8: Incubacin de las muestras Figura 11: Prueba de la catalasa

A las pruebas de indol, motilidad, rojo de metilo y Voges-Proskauer (MR/VP), se les inoculo la colonia y se encubaron por 24h a 35C

Prueba Voges-Proskauer: se le adicion 5 gotas de alfa naftol y 2 gotas de KOH

Figura 14: Tubo VP Figura 12: inoculacin de la colonia

Prueba rojo metilo:

Figura 13: Incubacin a 35 C por 24h

Figura 15: Tubo MR

Transcurrido el tiempo de incubacin se procedi a realizar las pruebas de confirmacin. Motilidad

Prueba Indol: adicionaron 2 reactivo Kvacs

se gotas

le del

Figura 16: Tubo CT

Figura 14: Tubo SIM

RESULTADOS

Tincin de gran +, indol negativo, catalasa negativa (para lactobacillus) UFC /ml N Al comparar con los resultados obtenidos (para el anlisis de ACTIVIA de DANONE de la empresa Alpina con fecha de vencimiento del 15 de diciembre del cual la cepa Probitica Lactobacillus Acidophylus) se hallo que la prueba de catalasa dio positiva, por ende podemos decir que lo ms probable es que las colonias aisladas (1.35*10-4UFC/ml ) eran probiticos.

N Colonias Caja 1 Caja 2 DS 10 4 8 5 10-7 10-8

Vol. S 1 ml 1 ml

N=

) (

) (

N=1.35*10-4UFC/ml

PRUEBA Catalasa Tincin de Gram Motilidad VogesProskauer Rojo metilo Indol

RESULTADO Positivo Gram + Positivo Negativo Positivo Negativo

ANALISIS DE RESULTADOS Al hacer el recuento en placa de la cantidad de UFC/ml se hallo que en las placas no se obtuvieron colonias caractersticas de los probiticos, pero aun as por recomendacin de persona encargada en el laboratorio se realizaron las pruebas bioqumicas.

A pesar de que las colonias que crecieron en las cajas de petri no dieron la coloracin de las colonias caractersticas de los probiticos al desarrollar las pruebas bioqumicas se hallaron similitudes en cuanto a lo que nos dieron dichas pruebas con las colonias aisladas, y los resultados de las pruebas bioqumicas que deben dar en presencia de probiticos

La razn de que no se dio la coloracin de las colonias de los probiticos podra ser debido a las condiciones del medio de incubacin, o que al medio no se le haba adicionado el azul de metilo que toman los probiticos y causan la coloracin.

Al analizar las pruebas bioqumicas para los probiticos, algunas de estas debieran ser:

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

De acuerdo a los resultados obtenidos en la prctica de laboratorio se pudo determinar que en el alimento analizado (yogurt Activia) existe la presencia del lactobacilos. Se logro el objetivo de conocer la tcnica que permitiera identificar y determinar los microorganismos probiticos, y la importancia que tienen estos para la salud de los consumidores. Al tener un conocimiento previo de las pruebas bioqumicas que deban dar positivas se logro determinar la presencia de probiticos en el yogurt.

MARTNEZ MIRANDA, M, 2011. Guas de laboratorio microbiologa de alimentos. Programa de ingeniera de alimentos, departamento de ingeniera, Universidad de Caldas. SANZ Y, COLLADO MC, AND DALMAU J, Probiticos: criterios de calidad y orientaciones para el consumo. Acta Pedriatr Esp, 2003. 61(9): p. 476-482.

No podemos reiterar la presencia de los probiticos solo con conocer los resultados de las pruebas bioqumicas, puesto a que no se presentaron las colonias caractersticas de estos, queda la duda de su total identificacin.

Para estudios prximos podran tomarse productos de los cuales se conozca con certeza la presencia de probiticos, para evitar posibles confuciones.