Frentedel eluvente

Fig. 19: Esquemageneralde aplicaciÓn.

Vl,Vr...: Solucionespatrón,P,, Pr-.-: Solucio-
nesmuestra,x = Puntode partida,D: Recorrido
del frente del eluyente(aprox.10 a 15 cm en
CCF,aprox.S-7 cm en HPTLC),dr : distancia
entrelos puntosde aplicación, y entreellosy los
bordes laterale inferiorde la placa (aprox1 a 2
cm en CCE aprox.0.5 cm en HPTLC).

jeringa.Esto mismo sucede en la técnica de pulverizaciónmedianteel Linomat lV

(CAMAG).
se usana menudotubosde puntode fusióncon puntasestiradas
Paraanálisiscualitativos a
modode caoilares prácticase representa
La realización
de aplicación. a modo de ejemploen
la Fig.22.
Con estos capilaresno es posiblemedirexactamente el volumena aplicar.Paraanálisis
exactos,es preferibleutilizar microcapilaresde volumen definido.En CCF se usan
generalmente capilarescon volumenesentre0,5 y 5 ¡.rly en HPTLCentre0,1 y 0,5 ¡ll. En
general,se empleancapilaresen combinacion con aplicadores.En la Fig.23 se muestraun
aplicadorsencillo,que puedetambiénusarseparaaplicaren formade banda[35]'
medianteundescensode capilares
Enel CAMAGNanomat| (Fig.24)seconsiguelaaplicación
La
electrónicamente.
controlado presión
de éstossobrela capase controlaautomáticamen-
también
te.Conesteaparato se pueden muestras
aplicar para cromatografiacircular(verCap.
3.5).

(CAMAG).
de aplicación
Fig.20: Plantilla
Fig.21: Ejemplode esquema de aplicaciónen
CÓFcuantitativa(técnicadel data-pair)[33]'
Vr"Vs: Soluciones Patrón
Ut"'U. : Soluciones
a analizar

Método del data-Pair:

",,,1.....,,..",,q-¡:
.
Vl Ur v2 Uz V.r U1 v2 u2

_.xrt:,*:;:*,. ..--* aO.¿ aOi a

33
 +-

Fig.22: Aplicaciónmediantetubo de punto de fusión.A tubo de punto de fusión,B estiramiento

sobre llamadébil de un mecheroBunsen,C aspiraciónde la solucióna ensayar,D aplicación.

F
v

t-
ta
Fig.23: Aplicadorsencillo(Merck). f.
tL

34
 grr
gnEE|l,

Fig.24: CAMAGNanomatI con dosificacióncapilary posicionadorpara la cubetaen U.

El principiode funcionamiento del microaplicador CAMAGes una jeringamicrométrica. El

volumende dosificación puede fijarse de
arbitrariamente manera continuaentre 0.5 y 2.3 ¡tl
medianteuntornillomicrométrico. Conel nanoaplicador se puedenelegirvolumenes entre50
y 230 nl. La soluciónde la muestrase introduceen lajeringacon un movimiento de palancay
se depositasobrela capade maneraanálogabajandola palanca.Graciasal piede protección
del soporledel micro/nanoaplicador en la correspondiente placabase(p. ej. del Nanomat
l/llllll),la puntade la agujase ajustaautomaticamente en el momentode la aplicaciónde
formaquejustotoquelasuperficie de la placasindañarla. se retirael aplicador
A continuación
y, despuésde sucesivoslavadosde la agujade la jeringa,se usa nuevamente (Fig.25).
ElCAMAGLinomatlVesadecuadoparaaplicartantopuntualmente comoenformade banda.
Se puedenpulverizar entre1 y 99 pl
sobrela capa volúmenesde muestracomprendidos
(Fig.26).
utilizandouna presiónde nitrógenodeterminada
(Fig.
lll puedenaplicarsemuestrasautomáticamente
Con la CAMAGDC-Probenautomat
¿t t.

Paravolumenessuperioresa 100 ¡rl es apropiadoel métododel "Contact-spotting". Una

películade un polímero
fluorohidrocarbonado se amoldasobreloshuecosde unaplantillade
aplicaciónmedianteaspiraciónpor vacío.Las solucionesmuestrase pipeteansobre los
huecosy a continuación se evaporansuavemente hastacasi sequedad.Estassoluciones
concentradas se ponenen contactocon la capa.Al aplicarpresiónsobrela caraposteriorde
la pelÍculade polímeromedianteun gas se transfierecompletamente la muestra(Fig.28)
t361.
a6
 Fig. 25: CAMAGNanomatlll con jeringa.

-
Fig.26: Pulverizacióncon el CAMAGLinomat
lV: a) aparato,b) toberade pulverización
en
funcionamiento.

Indicacionesy sugerenc¡as:
- En análisiscuantitativosdeben utilizarse
en lo posibleequiposde aplicación auto-
matizados.
- Al usarcapilares
debeprestarse atencióna
que se lleneny vacíenen su totalidad.
- Precaución:las solucionesde densidad
elevadapuedengotear desde el capilar
antesde la aplicación.
En algunasocasio-
nes el llenadoo vaciadode los caoilares
consoluciones de viscosidadelevadaoue-
de ser un procesolentoo inclusoincom-
pleto.Los disolventesfácilmentevolátiles
se evaporanparcialmenteen el capilar
antes de la aplicación.En todos estos
casos se debe utilizaruna jeringapara
Fig.27: CAMAGDC-Probenautomat
lll aplicarla muestra[37].

36
 Pel ícul ade pol ímero

n
{ at
Equi pode
apl i caci on

Aspiración de la
películade polímero

Traspasode Ia
muestra

Evaporación(con-
centración)de la
lf mueslra

(d)

Pl acade C C F

ñ Transferenciade la
muestra a la capa
de C C F

de sustanciapor contact-spotting.
Fig.28: Transferencia

La concentracióndeberíaescogersede tal maneraque un único vac¡adodel capilar

sustanciaa la capa,ya que aplicarvariasvecessobreel mismopunto
aportasesuficiente
puedeprovocarla deformación de la manchaal cromatografiar.
si se llenany vacíansobreun papelde filtro
de un solousopuedenreutil¡zarse
Loscapilares
vanasveces.
antesdel desarrollo[38].
Las manchasde oartidadebensecarsecompletamente

3.5 Desarrollo
Encromatogratíadecapafinase entiendepordesarrollo queel eluyenteo mezclapenetreen
la capade CCF- en generaldebidoal podercapilar,ocasionalmentetambiénporaplicac¡Ón
de presión- y en su avancetransportelassustanciasaplicadasen la direccióndel flujo.A
causade las interacciones
entremuestra,fase móvily faseestacionaria, las sustanciasse
separanen sus componentesindividuales.
Enla prácticase utilizandistintosmétodosde desarrollo,
ouese describen a continuación.En
principioexistentres posibilidades de desarrolloen CCF: desarrollolineal(ascendente u
horizontal),
desarrollo circulardesdeel centrohaciael exteriorv desarrollocircularhaciael
centro(anticircular).

3.5.1 El eluyente.
Para estudioscualitativos,la purezade los disolventesutilizadoscomunmenteen los
laboratorios
químicoses suficiente.
Porel contrario,lasseparaciones
paraanálisiscuantita-
tivosdebenrealizarse
con disolventesespecialesparacromatografÍa,altamentepurificados.
Hayqueteneren cuentaque algunosdisolventes (p.ej. EtOHen CHCIr)
llevanestabilizantes
que puedenfavorecero perjudicarla separación.
Lamejormanerade expresar la composicióndeleluyente esen parlesvolumétricas(p.ej.20 -r
80, v/v). Los componentesdel eluyentedeben medirseuno por uno y sólo despuésser
mezclados paraevitarloserroresdebidosa contracción o dilatacióndel volumen.La mezcla
debeefectuarse en un recipienteapafteantesde llenarcon ellala cubetade cromatografía.
Las cubetascargadasde eluyenteno deben reutilizarse
demasiadasveces (de 2 a 5)
porque:
- cadavezque se abrela cubetalos disolventes
se evaporande maneradesigualsegúnsu
volatilidad.
- puedentenerlugarreacciones
químicasentrecomponentes
del eluyente.
- uno o variosde los componentes del eluyente- p. ej. los polaresen el casode la gel de
sílice - pueden ser adsorbidospreferentemente por la capa durante el desarrollo
(empobrecimiento de una o variasporcionesdel eluyente).
- el empobrecimiento
se hacesentirespecialmente al usarmezclasde dos componentes,
sobretodo cuandoun componente en pequeñaproporción.
se encuentra Enestoscasosel
eluyentedeberíausarsesólo una vez.

3.5.2 Métodos de desarrollo.

Creciente(lineal)
Es la técnicade eluciónmás utilizada.La placase introduceen un recipienteadecuadode
maneraque el disolventemojela capa por debajode la líneade partida.Ésteasciendepor
capilaridad hastala alturadeseada(aprox.10 - 15 cm en CCF,o bien3 - 7 cm en HPTLC)y
transpoftala mezclade sustanciasa separar.Las manchasse hacenmayorescuantomás
cercanas al frentedeldisolvente.Durantela eluciónpuedendeformarse adquiriendoformade
elipse,especialmente en las proximidades del frentedel disolvente.Cuandoel frenteder
efuyentealcanzala alturaprevistase retirala placade la cubeta,se marcaexactamentesu
posición(alápizo rascandocon una espátula)y se seca la placa.

(lineal)
Horizontal
La placase encuentra
en posiciónhorizontal
y se le aplicael eluyentede maneracontinuaa
travésde unamechao una hendidura capilar,con lo que se puedeeluirdesdeuno o ambos
lados[39].

38
Bidimensional (lineal)
Cuandose desarrolla bidimensionalmente lamezclaa separarse aplicasobreel puntode
se introducela placaen unacubeta
partidasituadoen unaesquinade la placa.A continuación
normaly se desarrollade forma lineal(verarriba).Una vez seca la placa se gira 90",se
introduceen una segundacubetacon otro eluyentey se eluyede nuevo.La trayectoria
cromatográficadel primerrecorridopasa a ser la líneade padidadel segundodesarrollo
t401.
La posibilidadde eluir simultáneamenteun patrón en cada recorrido se da también en la
elución bidimensional(Fig.29). Sin embargo,el patrón no puede eluirsebidimensionalmente
sobre el mismo cromatograma,ya que se mezclaríacon la muestra.

Fig.29: Eluciónbidimensional.
1...6: Sustanciasseparadasde la soluciónproblema(campocentral)y de la soluciónpatrón
bandas laterales).

0)
-0)
uJ

il- Eluyentell

39
Una característica
particularde la CCF bidimensional
es la posibilidadde emplearen el
segundorecorridoun principioo mecanismode separacióndistintoal del primerdesarrollo
t411.
Radial (circular de dentro a fuera)
La capase disponehorizontalmente. Las sustanciasse aplicanen formade circunferencla
alrededor de un puntocentraly se añadeel eluyentesobreel centrode estacircunferencia.
Los componentesavanzancon el eluyentehacia fuera formandosegmentoscirculares
concéntricos y separándose.Estatécnicaes especialmente útil,comparadocon la elución
lineal,parasepararsustanciasde Rfs pequeños(Fig.30) ta2l.

Anticircular(circularde fuera a dentro)

La fase móvil se añadeaquí a lo largo de una circunferencia
y avanzahacia adentro.Los
puntosde paftidase disponenexteriormente en formade anillo(Fig.30).En estecaso las
sustanciascon Rfselevadosse separanespecialmente bien,comparadocon la eluciónlineal
t431.
Desarrollode flujo (continuo,overrun,linealy circular)
Se utiliza,porejemplo,unacubetaconvencional con unaaberturaen la tapa.Eldisolvente
se
evaporacontinuamente de la cubeta. Una varianteevaporacontinuamente el eluvente
calentando.
Un desarrollo
continuoresuelve
siempremejorlassustancias que avanzanmás lentamente,
comparadocon un desarrollo
normal,ya quetienena su disposición
un recorridomayor.Hay
que tomarsecon calmalos largostiemposde análisis[39].

Eluciónmúltiple (multipledevelopment,linealy circular)

Poreste métodola placade CCF se desarrollavariasvecestras el correspondiente secado
intermedio.El frente del eluyenterecorreasí variasveces las zonas cromatografiadas.Se
produceuna reconcentración y es posibleque las manchasadquieran formade elipseo de
bandasestrechas. Estoproduceen generaluna mejorresolución de las sustancias
con Rfs
menoresque 0.5.Eldesarrollo múltiplepuederealizarsecon un mismoeluyenteo con varios
eluyentesde distinta polaridad.Los desarrollosindividualespuedentener lugar sobre
recorridosde diferentelongitud144,451.

AMD (AutomaticMultiple Development,lineal)

El AMD es una variantetotalmenteautomatizada del desarrollomúltiplecon eluyentesde
polaridaddecreciente(enel casodelgelde sílice).Cadadesarrollo sucesivotienelugarsobre
un recorridoalgomás largoque el anterior.Al empezarcon el eluyentemás polar,todaslas
sustanciasaplicadasavanzancon el frenteconcentrándose en bandasestrechas.A medida
que progresael gradientese vanquedandorezagadas primerolassustancias máspolaresy
luegolasapolares.Todas lasetapaspuedenprefijarse a voluntad.Despuésde cadarecorrido
se eliminael disolventemediantevacío.El procedimiento ofreceexcelentesresolucióny
Engeneralse utilizael "desarrollo
sensibilidad. porgradiente" [46].Laobtenciónde gradientes
auténticoscon polaridadvariadade maneracontinuasóloes posibleen cubetasespeciales
(p.ej.cubetasen U)en lasque la alimentación del eluyentese realizaa travésde unabomba.

40