Manual Toxi Ude A 2013

MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324
Practica # 1: BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO (BPL) Y BIOSEGURIDAD

Objeto
En este documento se registran una serie de directrices bsicas sobre seguridad y los posibles riesgos a los cuales se puede estar expuesto en el laboratorio de Bioqumica y Toxicologa. Con ello se pretende generar un ambiente propicio y seguro para todas las personas que se encuentran desarrollando alguna actividad en este espacio y disminuir el impacto directo sobre el entorno.
Objetivos especficos
Los objetivos especficos en materia de bioseguridad involucran una serie de operaciones que pretenden identificar y disminuir el riesgo que involucran las actividades a desarrollar, especficamente en este laboratorio. Sin desconocer que existen otras que no se incluirn en este caso. En estas actividades podemos incluir: Manipulacin de material con riesgo biolgico. Utilizacin de sustancias y elementos qumicos que pueden causar algn efecto nocivo en el ser humano. Medidas de proteccin.
Definiciones
Antimicrobiano: Agente que mata los microorganismos o suprime su crecimiento y proliferacin. Antisptico: Sustancia que inhibe el crecimiento y la proliferacin de microorganismos pero no necesariamente los mata.
Fecha Elab: 26/01/2012
Fecha Rev: 26/01/2013
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Buenas prcticas de laboratorio

Conjunto de lineamientos, procedimientos operativos y prcticas previamente establecidas que son de obligatorio cumplimiento para asegurar la integridad de los individuos, del medio ambiente y la calidad de los datos producidos en los diferentes procesos que se ejecutan en los laboratorios.
Bioseguridad: Conjunto de directrices que tienen como objetivo principal garantizar la biocontencin mediante la implementacin de tecnologas, practicas y protocolos, para prevenir la liberacin accidental y la exposicin no intencional a agentes biolgicos, contaminantes y toxinas. Sin desconocer que la proteccin no se encuentra delimitada solo a los elementos de origen biolgico sino tambin a los factores de riesgo de procedencia qumica y fsica. Descontaminacin: Cualquier proceso utilizado para la eliminacin o muerte de microorganismos. Sin embargo, desde el punto de vista qumico se utiliza para referirse a la eliminacin o neutralizacin de sustancias qumicas peligrosas y materiales radioactivos. Desechos no contaminados o no infecciosos: Aquellos que se pueden reutilizar, reciclar o eliminar como desecho comn. Estos deben ser dispuestos en la caneca de color verde si se van a desechar en la ruta de basuras generales, en la caneca gris si es reciclable o entregados al respectivo monitor si pueden ser reutilizados en otra prctica. Desinfeccin: Proceso que involucra el uso de un medio fsico o qumico para la reduccin en mayor o menor grado de microorganismos, pero no necesariamente incluye la destruccin de esporas. Desinfectante: Sustancia o mezcla de sustancias qumicas utilizada para matar microorganismos, pero no necesariamente esporas. Los desinfectantes suelen ser de aplicacin sobre superficies u objetos inanimados. Ensayo: Sinnimo de prueba o mtodo de prueba. Esterilizacin: Proceso que involucra la muerte o eliminacin de toda clase de microorganismos incluyendo esporas. Limpieza: Conjunto de operaciones empleadas para eliminar la suciedad adherida a una superficie. Material contaminado, anatomopatolgicos y biosanitarios: Todo lo correspondiente a rganos, tejidos o fluidos potencialmente contaminados de origen animal y humano son considerados desechos anatomopatolgicos. A su vez, los materiales que incluyen: toallas de papel, gasas, algodn etc., que
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entren en contacto con fluidos orgnicos como sangre, suero, plasma, orina, entre otros son clasificados como desechos biosanitarios. Material contaminado reutilizable: Es el material que previamente puede ser destinado a un proceso de desinfeccin o de esterilizacin, y luego ser sometido a una accin de lavado con el fin de ser reutilizado o reciclado. No se puede efectuar limpieza previa de ningn material contaminado (potencialmente infeccioso).
Alcance
Este documento debe ser de consulta, conocimiento y aplicacin de todo el personal que ingrese al laboratorio de toxicologa a desarrollar actividades de docencia e investigacin. Consideraciones generales Durante el trabajo en el laboratorio el estudiante deber acoger las siguientes directrices: Usar la bata de laboratorio solo dentro de las reas del laboratorio, es decir, sta se debe retirar para la circulacin por fuera del mismo. Lavar las manos antes y despus cada prctica utilizando el jabn y/o desinfectante respectivo. Usar guantes de ltex, nitrilo o guantes protectores apropiados para todos los procedimientos. Una vez utilizados, los guantes se retiran de forma asptica y se depositan en el contenedor respectivo a continuacin se realiza el respectivo lavado y desinfeccin. Evitar el contacto de los guantes en uso, con la piel de la cara o de los brazos, ni con las perillas de las puertas, el telfono, los libros u otras superficies que posteriormente puedan ser usadas sin guantes. Usar gafas de seguridad y tapabocas. No fumar, ni consumir alimentos, ni medicamentos en el interior del laboratorio. Realizar desplazamientos con orden y precaucin por el espacio del laboratorio. No conversar, ni realizar actividades diferentes a las prcticas propias del programa de Laboratorio. Nunca utilizar los rganos de los sentidos como el gusto para analizar ni probar ninguna muestra en un laboratorio de toxicologa.
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Utilizar siempre los pipeteadores para dispensar los reactivos y muestras lquidas. Rotular siempre todo reactivo, solucin o muestra que se prepare. Ubicar y organizar los materiales y equipos que utilice de tal forma que no representen peligro alguno para usted o para sus compaeros. Utilizar nicamente las cantidades necesarias de cada reactivo segn las indicaciones del instructivo de la prctica. Preservar las instalaciones, equipos y utensilios del laboratorio. Asegurar la eliminacin nicamente de material no contaminante por los pozuelos y bajo la autorizacin del docente, monitor o tecnlogo del laboratorio. Manipular y descartar las muestras biolgicas siguiendo las normas de bioseguridad de la Universidad. Al finalizar cada seccin se debe dejar completamente limpio, desinfectado y ordenado el material utilizado y el rea de trabajo. Comunicar de inmediato al profesor cualquier inconveniente o dificultad presentada durante la prctica.
Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de toxicologa. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. OMS. Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3 ed. [Internet]. Ginebra: OMS. 2005. [Citado 27 de Julio de 2011]. Disponible en: http://fcm.uncu.edu.ar/joomla/downloads/OMS.pdf Clavijo E, Sierra U, Villamil M. Manual de buenas prcticas de laboratorio para el registro ante el ICA. 2007: 28 p. Comisin de Bioseguridad, Universidad Nacional Autnoma de Mexico.Manual de Procedimientos de Bioseguridad. [Internet].Mxico D.F.: UNAM. [Citado 27 de Julio de 2011]. Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/ci/pdfs/bioseguridad.pdf Comisin Nacional de Investigacin Cientfica y Tecnolgica. Manual de Normas de Bioseguridad. 2. Ed. [Internet].Chile.: CONICYT. 2008 [Citado 27 de Julio de 2011]. Disponible en: http://www.scribd.com/doc/8980585/ManualBioseguridad-2008
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Practica # 2: ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LOS MTODOS ANALTICOS

Caractersticas de funcionamiento de los mtodos analticos
Comprenden todos los datos y resultados experimentales generados en el proceso de aplicacin de un protocolo de anlisis a una muestra determinada, los cuales demuestran a su vez, que la metodologa aplicada es apta para el uso al que fue direccionado. La seleccin de un mtodo analtico debe ser realizada de forma que abarque todas las necesidades del anlisis y que se ajuste a las condiciones y posibilidades tanto de infraestructura, como de equipos y de personal. Y debe ser realizada ya sea por la persona lder del proceso o en consenso con el grupo de trabajo. El mtodo de anlisis elegido debe reflejar de la forma ms precisa y exacta el valor real del parmetro a evaluar. Para la cual se debe conocer la naturaleza del analito de inters, y su comportamiento en la matriz a utilizar, adems de su comportamiento durante la preparacin de la muestra y posterior anlisis. Etapas de la Aplicacin de un mtodo analtico Etapa 1: Preparacin: Etapa en la cual se acondiciona la muestra par el anlisis. Muestreo, acondicionamiento, disolucin, separaciones, purificacin Etapa 2: Medicin: Interpretacin de la seal obtenida en el equipo o mediante la tcnica instrumental Etapa 3: Tabulacin: Toma y tratamiento de datos. Para la obtencin de datos confiables y para el xito de la aplicacin del mtodo analtico se deben aplicar cada una de estas etapas de la mejor forma, de manera que se garantice poca variabilidad y la poca incidencia de errores operacionales y del analista.
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Adems de todo lo expuesto anteriormente, para la eleccin de un mtodo analtico, para el trabajo en el laboratorio y el anlisis de muestras, se deben tener en consideracin una seria de factores, los cuales garantizaran o no, la obtencin de datos confiables y ajustados a la realidad de acuerdo a los parmetros establecidos para el anlisis y la condiciones del laboratorio. Dichos parmetros estn enmarcados en la capacidad del mtodo analtico para mantener los criterios durante el tiempo y el comportamiento del mismo frente a la presencia o no de analito (caracterstica) de inters.
Parmetros fundamentales del mtodo analtico Fiabilidad (confiabilidad): Capacidad de un mtodo analtico para mantener los criterios fundamentales de la validacin a lo largo del tiempo. Rango: Valores o respuesta del instrumento limites (Inferior y superior) dentro del cual se encuentra el valor deseado o esperado para el anlisis. Diferencia entre el valor mayor y menor permitido para la prueba. Reproducibilidad: Capacidad que posee una mtodo o prueba de laboratorio de ser reproducido o replicado, por cualquier analista y obtener los resultados de la misma calidad y confianza. Desde el punto de vista del instrumento con esta variable se evala su capacidad dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones a lo largo de periodos dilatados de tiempo Repetibilidad: Fidelidad de los valores experimentales de una misma magnitud fsica medidos bajo las mismas condiciones experimentales. Incluyendo el mismo analista, instrumento de medida, lugar y procedimiento as como la cercana en el tiempo. Robustez: Capacidad de un equipo de no ser afectado por pequeos pero deliberados cambios de las condiciones del anlisis, cuando se evala esta variable, se deben identificar cuales son los puntos crticos del mtodo, adems de observar como la variacin de estos afectan el la calidad y veracidad del resultado final. Idoneidad: Hace referencia al conjunto de parmetros relacionados con la verificacin del buen funcionamiento de los instrumentos analticos y mtodos analticos. Un sistema es idneo (adecuado) si su respuesta, en el momento de su utilizacin se ajusta a los requisitos fijados en la validacin del mtodo.
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Especificidad: Propiedad del mtodo de producir una respuesta debido a la sola presencia o de acuerdo al analito de inters, sin ser afectado o sujeto a interferencia de otros componentes. Sensibilidad: Grado de respuesta de un instrumento a un estimulo externo generado con el fin de relacionar la presencia o concentracin del analito con la misma. Obteniendo un relacin proporcional y lineal de respuesta del equipo con respecto al analito. Por tal siendo lineal y proporcional. A travs de la recta obtenida en la curva de calibracin, mediante la pendiente se evala el parmetro para cada equipo Linealidad: Proporcionalidad entre la concentracin del analito y su respuesta, en un rango determinado.
Para el anlisis de analitos y metabolitos en fluidos biolgicos, se deben considerar que los niveles deben abarcar todo el rango de concentraciones previstas, entre el 10 y el 200% de la concentracin promedio esperada para ese tipo de anlisis en esa muestra.
Para la valoracin de la linealidad de los datos obtenidos, se pueden utilizar diferentes herramientas (software) estadsticas y mediante el anlisis por regresin lineal, mediante el mtodo de mnimos cuadrados.
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Y= bx + a Y X b a
Ecuacin de la lnea recta Respuesta Equipo (variable dependiente) Concentracin (variable independiente) Pendiente Intercepto
Los parmetros estadsticos que nos permiten medir o verificar la linealidad de los datos son los siguientes: Coeficiente de correlacin: r Coeficiente de determinacin: R
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Coeficiente de regresin: S X Y Varianza del error experimental total Varianza de la pendiente: S

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Precisin: Se define como el grado de concordancia que existe entre los datos obtenidos bajo las mismas circunstancias y nos permite cuantificar el error aleatorio o indeterminado de un anlisis o metodologa. Se evala por medio de: Repetibilidad Reproducibilidad Desviacin estndar % Desviacin Estndar Relativa (DER) Desviacin Estndar de la serie de datos Media aritmtica de la serie de datos (s) x 100 (X) S X
Exactitud: Expresa cual es el grado de acercamiento entre el valor medido o calculado al aplicar un mtodo con respecto al valor aceptado como referencia. Indica la capacidad del mtodo analtico para dar resultados lo ms prximos posibles al valor verdadero. Se evala a travs del porcentaje de recuperacin, que expresa la cantidad de analito recuperado (detectado) cuando se analizan muestras con concentraciones conocidas.
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Una de las herramientas estadsticas que se aplica para establecer la precisin y la exactitud es el test de t de student Para comparar la media de una serie de resultados con respecto al valor verdadero se analiza una serie de 6-10 veces una muestra de concentracin conocida y se aplica:
x1: valor tomado como referencia ( verdadero ) x2: media de la serie de datos n: nmero de muestras analizadas s: desviacin estndar de la serie de resultados experimentales Luego se lee el valor t tabla de la distribucin t de student. Se comparan: ( t exp) y ( t tablas ) para el grado de confianza elegido.
Valores predictivos La sensibilidad y la especificidad de una prueba solamente indican la proporcin de las muestras que han sido correctamente clasificadas como positivas o negativas pero no predicen el nmero de muestras que sern clasificadas correctamente, cifra que depende de la frecuencia del evento en el grupo de muestras al que se aplica la prueba. Valor predictivo positivo: de una prueba es la probabilidad de que una persona (o muestra) presente el evento (o analito) en estudio cuando al aplicar la tcnica de anlisis da un resultado positivo. Valor predictivo negativo: de una prueba es la probabilidad de que una persona (o muestra) no presente el evento (o analito) en estudio cuando al aplicar la tcnica de anlisis da un resultado negativo. Se evala con un grupo de muestras que contengan el analito buscado (positivas) y sobre otro grupo de muestras que no lo contengan(negativas) Los resultados se tabulan en una tabla de 2 X 2 as:
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MUESTRAS RESULTADOS Positivas Negativas a b Positivos Verdaderos Falsos Positivos Positivos c d Negativos Falsos Verdaderos Negativos Negativos
Clculos Sensibilidad = a/(a+c) es decir, S= (VP) / (VP +FN) Valor Predictivo Positivo VPP = a/(a+b) es decir, VPP=(VP) / (VP+FP) Valor Predictivo Negativo VPN= d/(d+c) es decir, VPN=(VN) / (VN+FN) Limite de deteccin (ld): Es la mnima cantidad de analito o sustancia de inters que puedes ser detectada en una muestra con razonable confianza, pero no necesariamente cuantificada. Limite de cuantificacin (lc): Es la menor concentracin o cantidad de analito que puede ser determinada con aceptable precisin y exactitud bajo las condiciones experimentales establecidas. Evaluacin: o LD = 3 a _ b o LD = 3 S_ b
De la ecuacin:
Y= bX + a
o LC = 10 S_ b
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BIBLIOGRAFA Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de toxicologa. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Mehta AC. The validation criteria for anlytical methods used in pharmacy practice research. J Clin Pharm Ther. 1989 Dec;14(6):465-73. Miller JC, Miller JN. Estadstica y Quimiometria para Qumica Analtica. 4 ed. Espaa: Pearson Education; 2002. 278 p. Manrique H. Rubn Daro. Manual de Referencia para la Validacin de Tcnicas Analticas. Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses. Medelln, 1995. Moron, C. Zacarias, I. De Pablo, S. (1997). Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos.(Cap 13) Universidad de Chile. Martin, JM. (2007). Introduccin para estudiantes de la facultad de fsica. (Version 2). Sigillum Universitatis Litterariae Hispalensis
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Practica # 3: VALIDACIN DE MTODOS CUALITATIVOS

Objeto
Identificar las caractersticas y principios de los mtodos de anlisis cuya respuesta es la presencia o ausencia de la sustancia de inters. Evaluando su adecuabilidad en presencia o ausencia de otros analitos que pueden reaccionar y originar resultados falsos positivos o falsos negativos segn el caso.
Objetivos Especficos
Aplicar una estrategia metodolgica para validar un mtodo analtico no cuantitativo que puede ser utilizado en el anlisis de un tipo de sustancias especficas, en este caso fenotiazinas. Aplicar una metodologa de anlisis cualitativo para determinar la presencia y/o ausencia de Fenotiazinas. Determinar la sensibilidad, especificidad, confiabilidad diagnstica y lmite de deteccin del mtodo utilizado para identificar fenotiazinas en un rango determinado de concentraciones. Establecer si el mtodo tiene una buena adecuabilidad de acuerdo a los parmetros anteriormente calculados para cada uno de ellos.
Definiciones
Adecuabilidad: Proceso que consiste en corroborar que los componentes, reactivos o equipos incorporados en la generacin de datos, funcionen de forma apropiada. Confiabilidad Diagnstica: Probabilidad de que en una serie de muestras a doble ciego, se detecte correctamente el metabolito, reactivo o analito de
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inters, debido a que ocurri una adecuada reaccin o interaccin de los reactivos, generando una respuesta analtica positiva. Evidencia: Interpretacin visible e igual para todos. Especificidad: Es la probabilidad de que la respuesta analtica resulte negativa debido a que en la muestra estudiada no existe fsicamente el analito de inters diagnstico, o se encuentra por debajo del lmite de deteccin. Resultado Positivo: Respuesta analtica generada cuando la matriz de estudio contiene una cantidad mnima detectable del analito de inters. Resultado Negativo: Respuesta analtica no generada cuando se considera que no esta presente en la matriz de estudio el analito de inters o se encuentra en una cantidad inferior a la mnima detectable. Selectividad: Extensin en la que un mtodo puede utilizarse para determinar analitos particulares en muestras o matrices sin interferencias de otros componentes con un comportamiento similar. Sensibilidad: Es la probabilidad de que la respuesta analtica resulte positiva cuando en la muestra estudiada est realmente presente el analito de inters diagnstico, en los lmites de deteccin o por encima de ste. Validacin: Proceso mediante el cual a travs de evidencia documentada se demuestra la adecuabilidad de una metodologa analtica que puede ser Cualitativa o Cuantitativa. Validacin de Mtodo no Cuantitativo: Procedimiento que consiste en aplicar una prueba diagnstico en un mismo nmero de muestras o testigos verdaderos positivos, que presenten la caracterstica de referencia exacta a estudiar y en testigos verdaderos negativos ausentes de la caracterstica.
Generalidades
Obtencin de pruebas convenientemente documentadas Las pruebas convenientemente documentadas son evidencia de que un mtodo de fabricacin o anlisis es lo suficientemente fiable como para producir el resultado previsto. Para ello es muy importante seguir las etapas de un proceso de validacin y considerar los parmetros o atributos de calidad de acuerdo al mtodo de anlisis: cualitativo o cuantitativo a utilizar. Por tanto, a continuacin se describe un proceso general de validacin y los parmetros a evaluar en la metodologa analtica no cuantitativa que aplicaremos en esta prctica.
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*USP: Farmacopea de Estados Unidos *ICH: Conferencia internacional de armonizacin Parmetros de calidad para mtodos analticos cualitativos o o o o o o Adecuabilidad Selectividad Especificidad y sensibilidad Valores predictivos: positivos y negativos Confiabilidad Diagnstica Lmite de deteccin
Materiales
Placas de Vidrio 20 x 20 Set de muestras Contraste para placas
Reactivos
Soluciones de 2 muestras de fenotiazinas en diferentes rangos de concentracin de acuerdo a cada set de muestras. Reactivo FPN (Reactivo General para Fenotiazinas): o FeCl3 5 % (w/v) o HClO7 20% o HNO3 50%(v/v).
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o Se mezclan en una relacin de 1 : 9 : 10 Nota: Cada semestre se utilizarn 2 fenotiazinas diferentes, por tanto, el color considerado positivo para cada metodologa deber ser indicado al inicio de cada prctica.
Seccin Experimental
Para la realizacin de la prctica y validar el mtodo analtico para la determinacin de la fenotiazina indicada por el profesor, por medio de la reaccin con el reactivo FPN, proceder de la siguiente forma: Ubicar la placa de vidrio de 20 x 20 sobre el contraste. Tomar una gota de cada una de las muestras (viales) contenidos en el set. Cada vial contiene aproximadamente 1 ml de muestra desconocida por el analista. Adicionar una gota del reactivo FPN a la gota de muestra en la placa de vidrio. Este procedimiento se debe realizar muestra por muestra, no se deben dispensar todas las muestras simultneamente. Observar el comportamiento de la muestra al reaccionar con el reactivo. Registrar el resultado como positivo (+) o negativo (-), para la presencia de la fenotiazina de acuerdo a las indicaciones del profesor. Recomendaciones Tener presente que cada muestra posee su propia pipeta para su dispensacin, para no contaminar las mismas y alterar los resultados. Cada grupo de trabajo debe realizar como mnimo este procedimiento con 7 sets diferentes la metodologa. Cuando finalicen la totalidad de las pruebas, cada grupo de trabajo debe de entregar un pre-informe con los resultados para cada muestra. Al final se les informara las concentraciones de cada una de las muestras, con el fin de que los estudiantes realicen un comparativo con sus resultados y obtengan el nmero de resultados Verdaderos positivos, Falsos positivos, Verdaderos negativos y Falsos negativos, datos con los cuales elaboraran un cuadro 2 x 2 para el informe final.
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Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de toxicologa. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Trullols E, Ruisnchez I,Rius FX. Validation of qualitative analytical methods. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2004 Feb; 23(2): 137-145. Ellison SL,Fearn T. Characterising the performance of qualitative analytical methods: Statistics and terminology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2005 Jun; 24 (6): 468-476. Snchez JF, Tejada ME, Koch W, Mora JLA, Marroqun R, Hernndez V, et al. Validacin de mtodos analticos no cuantitativos. Revista Mxicana de Ciencias Farmacuticas. 2010 Abr-Jun; 41 (2): 15-24.
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Practica # 4: Determinacin de Monxido de Carbono y Cianuro

Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la deteccin y confirmacin de txicos voltiles de importancia en el mbito clnico-teraputico, patolgico, analtico, ambiental, laboral, bromatolgico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Monxido de Carbono en una muestra de sangre. Realizar pruebas de orientacin y confirmacin necesarias para establecer la presencia de cianuro en una muestra.
Generalidades
El estudio de los txicos en general puede enfocarse desde diferentes campos: clnico-teraputico, patolgico, analtico, ambiental, laboral, bromatolgico y forense. En el campo clnico-teraputico se estudiar la sintomatologa y los tratamientos; en el patolgico, los fenmenos que perturban o perturbaron la funcin y morfologa de uno o varios rganos; en el analtico, las diferentes opciones a implementar como metodologa de anlisis; en el ambiental, los riesgos ocasionados por contaminantes derivados de procesos industriales, tecnolgicos y/o domsticos; en el campo de la medicina laboral, las intoxicaciones profesionales y los riesgos inherentes a la manipulacin de ciertas sustancias; en el bromatolgico, los contaminantes presentes en alimentos y en el forense, el que ha de tener en cuenta todas las ramificaciones anteriores y explicar ante la justicia las lesiones personales que se causan por los venenos, o los homicidios resultantes de la exposicin o ingestin de sustancias venenosas.
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Recomendaciones
Las caractersticas qumicas de ambos compuestos hacen que sean txicos voltiles. Para su correcta manipulacin deben de ser almacenados en recipientes que permitan su manejo pero que eviten su perdida por volatilizacin. Poseen alta capacidad de causar lesiones ya que son fcilmente absorbibles por va respiratoria.
Monxido de Carbono (CO)

Resulta de la combustin incompleta de la materia orgnica, y por eso en muchos incendios es una de las causas de muerte, tambin en minas de socavn, o en recintos cerrados, como en garajes de automviles en los que por accidente se olvida el motor en marcha; fue utilizado en gas de alumbrado y a veces en calefaccin. Los decesos son por lo general suicidas y en ocasiones accidentales. En este mbito hay diversas profesiones y ocupaciones que se encuentran ms afectadas por los nocivos efectos de este producto qumico, uno de los ms representativos son los agentes de trnsito y las personas que tienen como sitio de trabajo las calles y las avenidas de la ciudad. Adems de estos existen actividades no centralizadas en la ciudad que tambin se convierten en escenarios de riesgo para las personas, los cuales serian actividades como la minera, en la cual la presencia de CO se puede determinar por medio de un canario, el cual es altamente sensible. Esta sustancia tiene una afinidad 200 veces superior por la hemoglobina en sangre, que el O2 y por eso forma carboxihemoglobina. El cual es el principal riesgo de muerte en los recintos cerrados.
Desde el proceso fisiolgico, el intercambio gaseoso es el siguiente : HB-Fe + O2 (hemoglobina + Oxgeno) HB-Fe-O + CO2 (oxihemoglobina + dixido de carbono)
En la intoxicacin por CO, el intercambio es: HB-Fe.O2 + CO HBFeCO + O2 (Hemoglobina + monxido de carbono) (Carboxihemoglobina)
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La sintomatologa depende de la concentracin de la carboxihemoglobina, y as se establecen estos grados, cuando la exposicin es mnimo de una hora:
GRADO
% CARBOXIHEMOGLOBINA
SINTOMATOLOGA
I II III IV V
10-20% 20-30% 30-40% 40-50% 50% ms
Cefalea ligera. Cefalea, mareo, embotamiento. Confusin, visin borrosa, cefalea intensa, taquicardia e hipotensin. Trastornos de la memoria, confusin mental severa, incoordinacin, disnea. Coma y muerte, si no es retirado rpidamente del ambiente txico.
En la prctica, se determina el % de Hb saturada con CO. La ventaja de la unin HbCO es fcilmente reversible por medio de un alto bombeo de O 2. Para la determinacin del CO solo se emplean muestras de sangre.
Cianuro (CN)
Algunos plaguicidas y aun el cianuro de potasio y de sodio, son usados por joyeros, en galvanoplastia, en laboratorios fotogrficos, en la industria qumica; se conoce tambin como azul de Prusia. Se absorbe rpidamente por cualquier va; los compuestos alcalinos de las sales de cianuro en el estmago, son desdoblados por el HCl gstrico en HCN, que es excesivamente txico, y al entrar a la circulacin ataca los citocromos oxidasas, produciendo la muerte por anoxia histotxica. La sintomatologa, en la intoxicacin aguda, es de algunos segundos a pocos minutos e inicialmente hay convulsiones, pero rpidamente sobrevienen la inconsciencia y la muerte. En la necropsia, la piel tiene livideces de un color rojo cereza, semejante al ocasionado por el CO, y puede haber cianosis; cuando es ingerido, la mucosa gstrica en fresco es rojo cereza, y al medir el pH del estomago, este reacciona al medio alcalino, lo que es una gran pista para el diagnstico; el estomado tiene tambin olor a almendras amargas. En personas que se lo inyectan con fines suicidas, las vsceras aparecen de color rojo cereza, por la cianohemoglobina b que se forma en la sangre, porque el in CN reacciona con el radical frrico de la hemoglobina; en la inhalacin, tal como sucede en
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la cmara de gases, el color de las vsceras es tambin rojo rosado. En el laboratorio, por su volatilidad, el anlisis debe de realizarse rpidamente. Adems, en vsceras en descomposicin hay produccin de cianuro. La identificacin directa del cido cianhdrico se realiza en los mismos recipientes que contienen las muestras, preferiblemente estmago y su contenido, porque el cido cianhdrico se libera fcilmente a la temperatura ambiente debido a su elevada presin de vapor. El fundamento de la liberacin del cido cianhdrico se explica por la siguiente reaccin: CN- + H2O HCN + OH-
Seccin experimental
Reacciones de orientacin: Son aquellas que permiten detectar la presencia de un analito en la muestra problema, sin generar un valor cuantitativo. Monxido de Carbono Mtodo de dilucin La sangre normal debe presentar un color rojo amarillento, mientras que la sangre que contiene CO presentar un color carminado, por el contenido de carboxihemoglobina. Tomar 1 ml de sangre de la muestra problema en un tubo de ensayo grande y adicionar 10 ml de H2O destilada o desionizada. Tomar 1 ml de sangre NO CONTAMINADA en un tubo de ensayo y adicionar 10 ml de H2O destilada o desionizada. Sangre normal Sangre con CO rojo amarillento rojo carmes (intenso)
Hematina Alcalina Mediante este mtodo se produce la formacin de la Hematina alcalina por la reaccin de la hemoglobina y el hidrxido de sodio. En presencia de la
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carboxihemoglobina sta reaccin ocurre ms lentamente por lo cual se puede observar la diferencia de color en un ensayo con sangre normal. o A los mismos tubos del ensayo anterior agregar 5 gotas de NaOH al 10 % Observar si la solucin problema mantiene su color carminado durante algn tiempo, si es asi, entonces la muestra contiene carboxihemoglobina (presencia de CO). La solucin de sangre normal cambiara rpidamente hasta adquirir un color castao (hematina alcalina). (+)_Si permanece el color rojo carmes por un tiempo (-)_Aparicin de un color castao (cambio inmediato)
Cianuro Shombein Se basa en el aumento del potencial de reduccin de las sales cpricas al pasar a sales cuprosas, las cuales son insolubles o poco disociadas. La transformacin del cobre (II) a cobre (I), se da a expensas del in cianuro. Todo compuesto que pueda transformar por reduccin el cobre (II) a cobre (I) y origine un compuesto coloreado, puede utilizarse para la prueba, en lugar de la resina de guayaco. 8 HCN + 8 Cu +2 + C22H26O6 + H2O cido alfa guayaconco 8 CuCN + C22H24O9 +16H+ Azul de guayaco
Compuestos alternos: BENCIDINA, FENOLFTALEINA, ORTOTOLIDINA. Tomar una tira reactiva impregnada de sulfato de cobre (II) (CuSO 4). Tomar la tira reactiva preparada en solucin de CuSO 4 e impregnarla con la solucin de Bencidina en metanol recin preparada. Colocar el papel reactivo dentro del frasco que contiene la muestra para anlisis. Sin que esta roce las paredes del recipiente o el material de anlisis. La aparicin de un color azul, indica que la prueba es positiva.
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Esta prueba es altamente sensible (0.25 g de cianuro), pero no es especfica. Un resultado positivo debe ser confirmado con una prueba de mayor especificidad. Guignard Formacin de isopurpurato de sodio a expensas del in cianuro sobre el picrato sdico. Tomar una tira reactiva impregnada de cido pcrico Tomar 2.0 ml de la muestra problema y acidificarla con 0.5 ml de H 2SO4 concentrado. Colocar el papel reactivo dentro del vial que contiene la muestra acidificada sin que esta roce las paredes del recipiente o el material de anlisis. En presencia del cido cianhdrico el papel se torna rojo despus de 15 minutos de exposicin. Si no aparece la coloracin esperar hasta 30 minutos o calentar a bao mara a 70 C, durante 15 minutos. Despus de este tiempo si no se produce el cambio de color la prueba se considera negativa. INTERFERENCIAS: aldehidos, cetonas, anhidrido sulfuroso, cido sulfrico.
Reaccin de confirmacin: Este tipo de pruebas permiten determinar la presencia de un analito y sus resultados pueden ser utilizados para la cuantificacin del analito.
Monxido de Carbono Tcnica de Feldstein y klendshoj El monxido de carbono liberado por accin del cido sulfrico al 10% en una celda de microdifusin, se capta sobre una solucin de Cloruro de Paladio, en la cual el Monxido de carbono reduce el in paladio (+2) a paladio (0) y esto es observado como una pelcula plateada. Pd 2 + + C O + H 2O C O2 + Pd 0 + 2 H +
En una celda de Microdifusion (Conway), colocar en el compartimiento interno 2 ml de la solucin de cloruro de paladio 0.005 N
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En el compartimiento externo 2.0 ml de sangre de la muestra problema y 1 ml de cido sulfrico al 10 %, en puntos opuestos del compartimiento. Tapar y sellar la celda hermticamente con agua. Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda. Esquema de la prueba de microdifucin con cloruro de paladio (PdCl 2)
Dejar difundir durante 30 minutos en la estufa de secado (bao mara), Si en la sangre hay monxido de carbono se observa en la superficie del compartimiento central una fina pelcula de plata.
(+) Formacin de pelcula de plata (-) No hay formacin de pelcula
Cianuro Indirecto: Formacin del azul de prusia El in cianuro reacciona con las sales de hierro para formar el Azul de Prusia caracterstico.
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Reacciones: Fe(OH)2 + 2 KCN Fe(CN)2 + 4 KCN 3 K4(Fe(CN)6) + 4 FeCl3 Fe4(Fe(CN)6)3 Fe(CN)2 + 2 KOH K4(Fe(CN)6) 12 KCl + Azul de Prusia En una celda de Microdifusin (Conway) colocar en el compartimiento interno 2 ml de Hidrxido de sodio al 10%. En el compartimieno externo depositar 2.0 ml de la muestra y 1 ml de cido sulfurico al 10%. En puntos opuestos del compartimiento. Tapar y suavente mezclar la muestra y el agente liberador.
Dejar difundir durante 30 minutos a temperatura de 70C en la estufa de sacado (bao maria). Una vez transcurrido el tiempo de microdifusin, tomar 2.00 ml del compartimiento interno y traspasarlo a un tubo de ensayo grande. Agregar dos (2) gotas de sulfato ferroso (FeSO 4) al 10% y dos (2) gotas de una solucin de cloruro frrico (FeCl 3) al 10%. Agitar y calentar suavemente hasta ebullicin en el bao maria. Enfriar con agua del grifo y luego adicionar cido clorhdrico concentrado con precaucin hasta pH cido 0.5 - 1 (medir con tirillas). La positividad de la reaccin estar dada por la aparicin de un precipitado verde-azul. Si existe poco cido prsico la solucin toma primero un color entre el verde y el azul, se necesitar un tiempo prolongado de reposo (hasta doce horas) para observar algunos copos azules los cuales pueden ser filtrados y conservarse como prueba de la presencia de cianuro.
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BIBLIOGRAFA Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de toxicologa. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Guatelli, Manuel. Intoxicacin Oxicarbonada. Estudio Bioqumico y Metodologa analtica. Manuales EUDEBA, Editorial Universitaria de Buenos Aires. 1971. Gisbert Calabuig Juan A. Medicina Legal y Toxicologa. Ed. 4ta. Salvat Editores, S.A. Barcelona. Pag 617. Giraldo C. Medicina Forense. XIII edicin. Medelln: Colombia, 2009. P. 422423.
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Practica # 5: Determinacin de Etanol

Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la deteccin, confirmacin y cuantificacin espectrofotomtrica de etanol, sustancia reductora de importancia en el mbito clnico-teraputico, patolgico, analtico, laboral, bromatolgico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Etanol en una muestra de sangre. Realizar una curva de calibracin para la cuantificacin de Etanol en una muestra problema.
Generalidades
El alcohol Etlico es un compuesto orgnico, fcilmente oxidable, su nombre comn mas utilizado es el alcohol, corresponde a un liquido incoloro e inflamable cuyo punto de ebullicin es de aproximadamente 78 C Este compuesto es el principal componente de las bebidas alcohlicas, algunos productos cosmticos y de higiene. El alcohol etlico puede obtenerse industrialmente por medio de varios procesos, los ms utilizados debido a su rendimiento y facilidad son la fermentacin y la destilacin. El porcentaje de alcohol etlico presente en estos productos es variable de acuerdo a las especificaciones de cada producto (ver tabla 1).
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Tabla 1. Contenido de Alcohol en algunas bebidas alcohlicas CONTENIDO DE ETANOL EN BEBIDAS ALCOHLICAS Cerveza nacional 3-6 % v/v Cerveza importada 4-7 % v/v Vinos 10-12 % Coac, Whisky, 35-45% Aguardiente, Ron Ginebra 40-51 % Vodka 50 % Tequila 35-60 % Desde el mbito toxicolgico es de gran importancia, dada su accin farmacolgica depresora del sistema nervioso central (SNC) y el abuso creciente del consumo de bebidas alcohlicas. Esto ltimo se encuentra asociado a su vez, a una gran cantidad de accidentes donde se encuentran involucrados individuos en estado de embriaguez. En la ingestin aguda de alcohol etlico la sintomatologa vara de acuerdo con la concentracin de esta sustancia en sangre y por ende la concentracin que alcanza nivel del sistema nervioso central.
Metabolismo del Etanol

Las vas de penetracin posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria, y la absorcin a travs de la piel. En el caso del etanol, la intoxicacin ms frecuente ocurre cuando el individuo ingiere cantidades excesivas de esta sustancia por el consumo de bebidas alcohlicas fermentadas y/o destiladas. El alcohol se absorbe, de ordinario, por la va digestiva. Se inicia en el estmago, en donde tiene lugar en su mayor proporcin, y se contina en el intestino delgado. La rapidez de esta absorcin depende de varios factores: La cantidad de alcohol ingerido. El grado alcohlico de la bebida ingerida. La presencia, y su naturaleza, de los alimentos que haya en el estmago. La habituacin del sujeto. Inmediatamente despus de la ingestin, se inicia la absorcin a travs de la mucosa digestiva, pasa a la vena porta, atraviesa el hgado y alcanza la circulacin

general sangunea y linftica. Se trata de un simple proceso de difusin en el que se contina cediendo el alcohol de la sangre a los tejidos. En este proceso se observa como la concentracin del alcohol en la sangre aumenta rpidamente despus de la ingestin; aumento que se mantiene, pues aunque en virtud de la difusin lo va cediendo a los tejidos, tal cesin viene compensada con el nuevo paso del alcohol que sigue absorbindose. Llega, no obstante, un momento en que se equilibran la absorcin y la difusin, con lo que la concentracin se mantiene uniforme. En este momento, llamado de equilibrio de difusin, la difusin del alcohol en el organismo es bastante uniforme, con diferencias entre los diversos tejidos que dependen de su riqueza en agua. Conforme va llegando el alcohol a los tejidos se inicia el proceso de detoxicacin, constituido por oxidaciones sucesivas que transforman inicialmente el alcohol en acetaldehdo, despus en cido actico, para terminar en bixido de carbono y agua; en este proceso se desprenden 7.2 caloras por gramo de alcohol. Desaparecido parte del alcohol de los tejidos, la sangre lo difunde nuevamente hasta volver a alcanzar nuevamente el equilibrio de difusin que se rompe una vez ms por destruccin oxidativa, con paso acto seguido de alcohol sanguneo. Este factor, oxidacin tisular, se aade a la estructura de cada tejido (con su respectiva riqueza en agua) para determinar la cantidad de alcohol que presenta en un momento determinado. Segn su concentracin alcohlica a los largo de todo el proceso metablico, los tejidos pueden clasificarse en un orden: Sangre > Cerebro y riones > Pulmones y corazn > Paredes duodenales > Msculos estriados > Hgado En un lugar sensiblemente distanciado figuran dos tejidos: el tejido adiposo y el tejido seo, cuya proporcin en alcohol es mnima. El proceso metablico del alcohol se reduce en tres pasos: absorcin, difusin, oxidacin. El elemento intermediario es la sangre, cuya concentracin alcohlica, una vez establecido el equilibrio de difusin, indica la marcha del proceso, e indirectamente el estado clnico del sujeto. Dicho de otra forma, si los efectos clnicos del alcohol dependen de la cantidad de ste presente en los tejidos y la misma determina la alcoholemia existente en cada momento, el estudio de la concentracin del alcohol en sangre y la curva de alcoholemia tendrn un evidente valor diagnstico mdico legal.
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Su eliminacin se realiza en un promedio de 10 a 15 mg% de la cantidad circulante por hora, en una persona de 70 kg.
Fundamentos toxicolgicos
Aspectos clnicos Cantidades mnimas de alcohol normalmente son detectables, aun sin antecedentes de ingestin, resultado de los procesos metablicos. A continuacin se describen cules son las manifestaciones principales de acuerdo a la concentracin encontrada en sangre (ver tabla 2). Tabla 2. Manifestaciones de toxicidad en ingestin aguda de alcohol. mg% alcohol Hasta 20 Entre 20-50 Entre 50-85 85-100 Manifestaciones No existe ninguna alteracin Puede existir alguna locuacidad y disminucin de reflejos Disminucin de los reflejos y alteracin en la percepcin En una tercera parte de las personas ya pueden existir sntoma de embriaguez, y las inhibiciones sociales se encuentran disminuidas; las respuestas se tornan lentas y se presenta incoordinacin La mitad de las personas estn ebrias y existe una diminucin definida de reflejos y de la coordinacin motora. Llevan a alteraciones sicomotrices incompatibles con el manejo adecuado de un vehculo. El 80% est francamente ebrio Cualquiera est completamente ebrio Llevan a coma, hipotermia e hiporreflexia, anestesia y colapso, y ya son frecuentemente fatales Sobreviene depresin del centro respiratorio y vasomotor y rpidamente la muerte. Coma profundo con muerte rpida Incompatibles con la vida
100-155
150-200 200 Mayor a 400 Mayor a 500 600-700 Mayor a 700
Importancia en el sistema mdico legal El diagnstico de la embriaguez agua es de crucial importancia, puesto que en Colombia no permite la excarcelacin de personas que causen lesiones u homicidios en accidentes de trnsito. Adems, es importante en otros campos. Homicidios en ria, como potencializador de otros frmacos y drogas, y en siquiatra forense.
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Ley 1548 del 05 de julio 2012 Por la cual se modifica la Ley 769 de 2002 y la Ley 1383 de 2010 en temas de embriaguez y reincidencia y se dictan otras disposiciones.
mg% alcohol 20-39 40-99 100-149 150
Sancin Suspensin de la licencia de conduccin entre 6 y 12 meses Primer grado-Suspensin de la licencia de conduccin entre 1 ao y tres aos. Segundo grado-Suspensin de la licencia de conduccin entre 3 aos y 5 aos. Tercer grado-Suspensin de la licencia de conduccin entre 5 aos y 10 aos.
Nota: 51 a 99 mg% se debe realizar examen clnico, para determinar si est bajo los efectos del alcohol. A partir de 100 mg%, cualquier persona est impedida para conducir un vehculo automotor.
Anlisis de etanol
La determinacin del alcohol etlico tiene importancia en el ambiente regulacin de circulacin y trnsito, como en la conduccin de vehculos pblicos y privados, medios de transporte masivo como aviones, trenes y barcos. En la actualidad se cuenta con mtodos de determinacin rpidos que se aplican en aire expirado, en las carreteras y vas por parte de los funcionarios de control de trnsito. Algunos de estos equipos determinan agentes voltiles reductores entre ellos el etanol, otros son ms especficos y determinan la molcula de etanol y no otros voltiles. Los equipos se conocen con los nombres de borrachmetros, alcosensores, alcotest, etc. El dato obtenido en aire expirado, si se encuentra cerca o en el valor contravencional de 50 mg%, debe ser confirmado en la muestra de sangre, por otro mtodo de otra categora confirmativa y cuantitativa. Existen mtodos qumicos, enzimticos e instrumentales para la determinacin de etanol en fluidos biolgicos.

En el pas, 50mg% es el valor a partir del cual se infligen las normas de transito. Los tipos de muestras generalmente usados para estas determinaciones son: sangre (alcoholemia), orina, otros fluidos biolgicos, vsceras, alimentos, etc. Fundamento El etanol es una sustancia voltil reductora que puede ser valorada en reacciones de oxidorreduccin y medir la intensidad de los complejos coloreados formados, con propsitos cuantitativos. Muestra Sangre entera total anticoagulada. La toma de la muestra debe garantizar que el etanol determinado es exclusivamente de origen exgeno. La adecuada preservacin para inhibir la formacin de alcohol por microorganismos se logra con fluoruro de sodio, el in mercrico y almacenamiento en fro. El etanol se pierde por volatilizacin y destruccin por microorganismos. La oxidacin de la hemoglobina puede ser inhibida por azida sdica.
SECCIN EXPERIMENTAL
Mtodo cualitativo Tomar 2 ml de la muestra a analizar en un tubo de ensayo pequeo. Adicionar 3 gotas de Dicromato de Potasio al 5% directamente en la muestra. Agitar suavemente hasta garantizar completa homogenizacin de la muestra. Agregar por las paredes del tubo Acido Sulfrico concentrado (tratar que los dos lquidos no se mezclen). La aparicin de un anillo verde o azul por la reduccin del cromo en la zona de contacto, es una prueba positiva para una sustancia voltil. Los compuestos de inters toxicolgico que tambin reducen la mezcla sulfocrmica son: metanol, acetaldehdo, acetona, formaldehdo y en general otros solventes orgnicos.
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Mtodo Feldstein y klendshoj-Microdifusin La microdifusin se realiza en cmaras de Conway, en las que se deposita en el compartimiento externo la muestra y agente liberador (CaC03) y en el interno el agente fijador, la mezcla sulfocrmica: K2Cr207/H2SO4. El Etanol se oxida a acido actico en presencia de dicromato de potasio. La reaccin de oxido-reduccin completa se da a temperatura ambiente (25C) en 3 horas. Dispensar en el compartimiento interno de la celda de microdifusin (conway) 2 ml de la mezcla sulfocrmica (Reactivo de Feldstein). Tomar 2.0 ml de la muestra problema y dispensarla en uno de los extremos del compartimiento externo de la celda de microdifusin (conway). Agregar 1 ml de la solucin saturada de carbonato de calcio, en el extremo opuesto a la muestra en el compartimiento externo. Sellar la celda de microdifusin con agua destilada. Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda. Dejar 3 horas la difusin a temperatura ambiente o en el bao mara o estufa de secado a 70 C durante 30 minutos. Pasado el tiempo de microdifusin, continuar con la cuantificacin espectrofotomtrica de Etanol. Nota: Esta prueba se le debe realizar a cada una de las muestras y a cada una de las soluciones calibrantes y se debe preparar un blanco procesado bajo las mismas circunstancias de las muestras.
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Cuantificacin espectrofotomtrica (mg%) Transferir el contenido del compartimiento interno con pipeta pasteur a un baln de 10.0 ml y lavar con agua destilada este compartimento para retirar toda la muestra. Finalmente, completar a volumen con agua destilada. Leer la absorbancia de cada una de las soluciones asignadas a una longitud de onda de 450 nm (si es posible realizar un barrido previo). Como referencia para la lectura en el espectrofotmetro usar agua destilada. Con las absorbancias corregidas y las concentraciones de cada una de las soluciones calibrantes, se debe construir la grafica y determinar la ecuacin de la recta.
Nota: La dilucin de cada estndar se debe realizar en un baln volumtrico de 50 ml
Curva de Calibracin Calibrante 1 2 3 4 5 6 Blanco Muestra # ____

C (mg%) 25 50 100 150 200 250 0 mg %
Absorbancia
Absorbancia corregida
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Clculos
Obtener mediante interpolacin sobre la curva realizada la concentracin (mg %) de Etanol en la dilucin. Recuerde tener en cuenta esta ltima para determinar la concentracin en la muestra original y expresarlo en mg%.
Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de toxicologa. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Gisbert Calabuig Juan A. Medicina Legal y Toxicologa. Ed. 4ta. Salvat Editores, S.A. Barcelona. Pag 617. Giraldo C. Medicina Forense. XIII edicin. Medelln: Colombia, 2009. P. 475491. Repblica de Colombia. Por la cual se modifica la Ley 769 de 2002 y la Ley 1383 de 2010 en temas de embriaguez y reincidencia y se dictan otras disposiciones
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Practica # 6: Determinacin de Metanol

Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la deteccin, confirmacin y cuantificacin espectrofotomtrica de metanol, sustancia reductora de importancia en el mbito clnico-teraputico, patolgico, analtico, laboral, bromatolgico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Metanol en una muestra problema. Realizar una curva de calibracin para la cuantificacin de Metanol en una muestra problema.
Generalidades
El metanol es un alcohol primario, el cual es utilizado ampliamente en diferentes industrias como solvente o en la elaboracin de pinturas y barnices, soluciones congelantes, tambin es utilizado para la desnaturalizacin del etanol y para la adulteracin de bebidas embriagantes. Lo que ha dado lugar a numerosas intoxicaciones de carcter masivo dado el uso fraudulento de estas mezclas en bebidas alcohlicas.
Metabolismo
El alcohol metlico es rpidamente absorbido en el tracto gastrointestinal y tambin puede hacerlo por piel y va respiratoria. Una vez absorbido se distribuye rpidamente por los tejidos. Se pueden encontrar niveles de metanol en sangre 30 a 90 minutos despus de ser ingerido y su vida media se ha calculado en promedio de 2 a 24 horas, pero en presencia de etanol puede prolongarse hasta 30 o 52 horas. El metanol es eliminado en un 3 a 10% inmodificado por orina y en menor proporcin por el aire espirado.
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La mayor parte del metanol que ingresa al organismo es metabolizado en el hgado en un 90 a 95%, es oxidado por la enzima alcohol deshidrogenasa para ser transformado en formaldehido, el cual es rpidamente convertido en cido frmico por la enzima aldehdo deshidrogenasa. ste ltimo se convertir en anhdrido carbnico (CO2) y agua mediante una oxidacin dependiente del folato. El formaldehdo y el cido frmico son los metabolitos causantes del cuadro clnico presente en la intoxicacin. La administracin de folatos durante el tratamiento ejerce una accin protectora, estimulando la transformacin del cido frmico en CO2. La afinidad de la alcohol deshidrogenasa por el etanol sobre el metanol es 20 veces mayor. Por tanto, en este principio radica el principal tratamiento de la intoxicacin por este ltimo. La eliminacin del metanol puede darse desde diferente rganos y en diferentes proporciones, a travs del pulmn puede eliminarse cerca del 10-20% sin metabolizar, cerca del 3 % por rin y hasta el 60% es oxidado a formaldehdo que no se encuentra en orina, el cido frmico presente en orina puede ser del 2 al 5 %. La acumulacin de cido frmico es responsable de la acidosis metablica y de las dems complicaciones subsecuentes a la intoxicacin por metanol. La acidosis lctica tambin se puede presentar debido a la inhibicin de la citocromo-oxidasa por parte del acido frmico y la hipoxia tisular.
Fundamentos Toxicolgicos
Aspectos Clnicos La susceptibilidad a los efectos txicos del metanol es variable, pero la ingesta de una pequea cantidad (15 a 30 ml al 100%), puede dar lugar a una intoxicacin grave. La dosis txica de metanol presenta variaciones individuales; para un adulto es de 60250 ml de metanol al 40%, aunque se ha reportado sobrevida con 500-600 ml y muerte con tan slo 15 ml. El intervalo entre la ingesta y la aparicin de las manifestaciones clnicas es variable (de pocos minutos hasta 72 horas). En la mayora de los casos los sntomas iniciales (embriaguez, somnolencia y vrtigo) se siguen de un periodo asintomtico, especialmente si el metanol se ingiere mezclado con etanol. Concentraciones de etanol entre 100 y 150 mg/ml pueden retrasar la instauracin de los sntomas hasta que se haya metabolizado una cantidad suficiente de etanol como para que el metanol
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empiece a transformarse en sus metabolitos txicos. Sin embargo, incluso si el metanol se consume solo, pueden transcurrir de 12 a 24 horas hasta que se produzcan concentraciones de metabolitos txicos en cantidad suficiente como para producir sntomas. Debe tenerse en cuenta que la ausencia de clnica inicial no excluye el posterior desarrollo de toxicidad importante. Para una mejor comprensin en la evolucin del cuadro clnico de la intoxicacin por metanol, se han caracterizado tres perodos. Se distinguen usualmente 3 fases en la intoxicacin por metanol: Periodo latente Periodo en el cual los pacientes pueden presentarse asintomticos a la intoxicacin y puede estar en un lapso de 6 a 36 horas luego de la ingestin o exposicin. Fase narctica Presentarse sntomas de embriaguez como en la intoxicacin por etanol, ligera depresin del sistema nervioso central, confusin, ataxia. La irritacin gastrointestinal puede dar como resultado nuseas, vmitos, y dolor epigstrico. Todos estos sntomas se pueden presentar hasta 8 horas despus de la intoxicacin por metanol. Acidosis/neurotoxicidad Puede producir dolor de cabeza, mareos, vmitos, respiracin peridica, y coma con fallo respiratorio, que conduce eventualmente a la muerte. Los trastornos visuales son inmediatos al ataque de la acidosis metablica. La retina se congestiona, pupilas dilatadas y no reactivas y visin borrosa, el dao en el nervio ptico puede conducir a la ceguera permanente. Todos los sntomas asociados a la acidosis son dependientes al grado de sta y por consecuencia a mayor acidosis mayor toxicidad y dao funcional. Se pueden presentar a su vez ms daos en diferentes rganos asociados a su eliminacin y metabolismo. Sistema Aparato Respiratorio Sistema Cardiovascular Sistema Gastrointestinal Sistema Neurolgico Sistema Ocular Sintomatologa Taquipnea-Fallo respiratorio Bradicardia-Hipotensin-Fallo cardiaco Dolor abdominal-Anorexia-Nauseas-Vomito Convulsiones-Coma-Guayabo como por etanol Visin borrosa-Disminucin del campo visualAtrofia ptica-Nistagmos-Pupilas dilatadas fijasCeguera
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Diagnstico Antecedente o sospecha de exposicin a la sustancia Cuadro clnico compatible con la intoxicacin aguda por metanol Presencia de alteraciones visuales. Aparicin de acidosis metablica. Anin Gap osmolar elevado (>10-12 mOsm/kg H20) La confirmacin se obtiene mediante la determinacin de niveles de metanol en sangre o niveles de formaldehido y acido frmico en orina/sangre Niveles sricos> 20mg/dl son txicos Niveles sricos> 40 mg/dl son letales Niveles sricos bajos o ausentes de metanol no descartan la intoxicacin
Seccin Experimental
Mtodo Cualitativo Corresponde a una reaccin de oxido-reduccin con K2Cr2O7. Este tipo de reaccin es general para alcoholes primarios y secundarios, por lo cual no es considerada una reaccin confirmatoria, sino presuntiva. 2 ml de muestra + 3 gotas de K2CrO7 al 5% Homogenizar Adicionar por las paredes 1 ml de H2SO4 concentrado y homogenizar nuevamente. (+) Aparicin de anillo verde-azul (Cr+3)
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Mtodo Feldstein y klendshoj-Microdifusin La microdifusin se realiza en cmaras de Conway, en las que se deposita en el compartimiento externo la muestra problema y el agente liberador (CaCO3) y en el interno el agente fijador (H2SO4 10%). El Metanol se oxida a acido frmico en presencia de dicromato de potasio. La reaccin de oxido-reduccin completa se da a temperatura ambiente (25C) en 3 horas. Dispensar en el compartimiento interno de la celda de microdifusin (conway) 2 ml de cido sulfrico 10%. Tomar 2.0 ml de la muestra problema y dispensarla en uno de los extremos del compartimiento externo de la celda de microdifusin (conway). Agregar 1 ml de la solucin saturada de carbonato de calcio, en el extremo opuesto a la muestra en el compartimiento externo. Sellar la celda de microdifusin con agua destilada. Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda. Dejar 3 horas la difusin a temperatura ambiente o en el bao mara o estufa de secado a 70 C durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo de microdifusin, tomar el contenido del compartimiento interno y llevarlo a un tubo de ensayo. Luego, agregar 2 gotas de Permanganato de potasio 3% en cido fosfrico 15% (agente oxidante). Esperar un minuto a que se de la oxidacin del metanol. Adicionar: a. 1-2 mg de bisulfito de sodio para decolorar el exceso de permanganato. b. 1-2 mg de cido cromotrpico para formar un complejo coloreado con el producto de la oxidacin del metanol. c. 2 mL de cido sulfrico concentrado, por las paredes del tubo para revelar el color. Observar el anillo de color morado que se forma en la interfase si la muestra contiene metanol. Esperar 20 minutos a que se complete la reaccin y leer en el espectrofotmetro a 570 nm.
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Cuantificacin espectrofotomtrica (mg/ml) (Curva de calibracin) Tomar en un tubo de ensayo 1.0 ml de muestra problema o de la solucin calibrante. Adicionar 2 ml cido sulfrico 10 % para precipitar las protenas. Tomar 1.0 ml de la solucin sobrenadante con la micropipeta y llevarla a otro tubo de ensayo. Agregar: o 2 gotas de Permanganato de potasio 3% en cido fosfrico 15% y esperar un minuto. o 1-2 mg de bisulfito de sodio para decolorar. o 1-2 mg cido cromotrpico o 2.0 ml de cido sulfrico concentrado por las paredes (volumtricos)
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observar el anillo formado en la interfase. Agitar y esperar 20 minutos el desarrollo del color. Tomar 1.0 ml y llevar a un baln de 25 ml y aforar Leer en el espectrofotmetro a 570 nm (si es posible realizar un barrido previo).
Nota: Esta prueba se le debe realizar a cada una de las muestras y a cada una de las soluciones calibrantes y se debe preparar un blanco procesado bajo las mismas circunstancias de las muestras. Si la muestra presenta una absorbancia por encima de las registradas en la curva de calibracin, esta se debe diluir. Se recomienda diluciones 1/2 y luego 1/5 y sucesivamente.
Interpretacin
Iguales cantidades de color en ambos filtrados oxidados y sin oxidar deben ser consideradas como negativos. El mtodo es sensible y detecta aproximadamente 10 mg de metanol /100 ml de sangre. Se debe hacer control negativo el cual no debe presentar ninguna coloracin.
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Interferencias
Falsos positivos: formalina, heparina, metenamina y EDTA. El efecto deshidratante del cido sulfrico concentrado puede producir formaldehdo a partir de determinados compuestos orgnicos y obtenerse falsos positivos. Esta interferencia se observa ocasionalmente en pacientes con severa acidosis. Por esta razn se debe realizar un ensayo con filtrado no oxidado.
Clculos
Representar la curva de calibracin para la determinacin de metanol y determinar por el mtodo grfico y matemtico la concentracin (mg/ml) de metanol en la muestra problema.
Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Giraldo C. Medicina Forense. XIII edicin. Medelln: Colombia, 2009. P. 475491. CLARKES ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DR UGS. In Pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior Consulting Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press. 1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Pg. 593-594. Surez LA, Arellano R, Bernal E. Metanol como marcador de abuso en el consumo de alcohol en muestras forenses. Revista de Toxicologa. 2009; 26(2-3):137-140.
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Practica # 7: Determinacin de Psicofrmacos en Muestras No Biolgicas

Objeto
Comprender las caractersticas de las pruebas presuntivas y confirmativas utilizadas a nivel de toxicologa para la identificacin de psicofrmacos presentes en muestras no biolgicas.
Realizar una marcha para establecer la presencia o ausencia de algunos psicofrmacos en muestras no biolgicas. Aplicar las pruebas cualitativas ms comunes que direccionan el proceso de identificacin de algunos psicofrmacos en muestras no biolgicas.
Pruebas de orientacin
Las pruebas de tamizaje permiten orientar los anlisis de una determinada muestra. Permite saber si en una determinada muestra hay o no la presencia de un analito de inters. Estas pruebas se caracterizan por su fcil realizacin y rapidez de los resultados. Existen una serie de factores que pueden afectar los resultados obtenidos cuando se aplica una prueba de orientacin a una muestra, entre ellos tenemos la apariencia fsica, concentracin de la sustancia activa, cantidad o tamao de la muestra (ej. LSD ), presencia de adulterantes coloreados o sustancias naturales ( opio, cannabis ), presencia de mezclas de drogas.
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Pautas a seguir para obtener la mxima fiabilidad en las pruebas Si la cantidad de muestra es muy pequea, mejor realizar las pruebas de confirmacin Para muestras en polvo, utilizar hasta miligramos Tabletas u otros materiales slidos o resinosos (hachs, opio), reducir a polvo una pequea porcin de la muestra a analizar. Cpsulas: utilizar una pequea cantidad de polvo de la muestra. Vegetales: Moler una cantidad y realizar el ensayo. Cigarrillos: Abrirlos, tomar una pequea cantidad de sustancia vegetal, molerla y analizar. Sustancias vegetales que den resultados negativos con anlisis usuales y que parezcan haber sido tratados con otros productos qumicos o drogas, hacer pruebas de confirmacin. Pruebas de campo Son pruebas de orientacin que se realizan en el lugar donde se han encontrado alguna sustancia sospechosa de ser un psicofrmaco. Normalmente pueden realizarse: En placa de gotas En tubos de ensayo En papel filtro Tiras de papel indicador Reactivos previamente envasados en un recipiente ( ampollas ) Mnimo dos ensayos rpidos para cada sustancia o grupo de sustancias a investigar.
Interpretacin de los ensayos

Un resultado positivo de la prueba slo significa la posible presencia de la(s) sustancia(s) detectada, se debe realizar una prueba de confirmacin. Si el resultado de la prueba de orientacin es dudoso, se debe realizar una prueba de confirmacin. Un resultado negativo, indica la ausencia del analito que se busca en la muestra, para el lmite de deteccin de dicha prueba.
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Toda muestra que llega al laboratorio debe ser correctamente descrita desde su empaque, hasta el aspecto de la muestra. Luego, se procede a hacer el pesaje de la misma para obtener su peso neto.
Generalidades de las muestras

Marihuana Cannabis sativa L. Su principal componente activo es el 9-tetrahidrocanabinol Productos del cannabis: o Planta de cannabis o Resina de cannabis: la resina separada, en bruto o purificada, obtenida de la planta de cannabis. o Aceite de cannabis: concentrado de cannabis obtenido por extraccin de la planta o de la resina que contiene generalmente un aceite vegetal. Coca Arbusto de coca" es cualquier especie del gnero erythroxylum. Productos de la coca: o Hojas de coca o Pasta de coca: es un extracto de las hojas del arbusto de coca. Contiene alcaloides de la coca y tambin se denomina cocana base. Purificndola se obtiene la cocana. o Cocana: alcaloide extrado de la hoja de coca o sintetizado a partir de la ecgonina. o Crack: es la cocana base " base libre " obtenida a partir del clorhidrato de cocana por un procedimiento especial de transformacin para poderla fumar. Opiceos En sentido estricto, las drogas derivadas inmediatas del opio tales como la morfina y la codena. o Morfina base o Herona: opiceo semisinttico obtenido a partir de la morfina.
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Frmacos o Anfetaminas y otras drogas de diseo: sustancias sintticas, qumicamente afines con efectos estimulantes sobre el sistema nervioso central. o Anfetaminas de diseo: Se diferencian de las anfetaminas convencionales en la rapidez del comienzo de efectos, su duracin y su potencia; y pueden actuar como alucingenos. MDA: Tenanfetamina MDMA: 4,4- metilendioximetanfetamina MDE: N-etil-3,4-metilendioxianfetamina Se presentan en forma de polvo blanco o marrn claro o en tabletas y cpsulas de formas y colores diferentes, con logotipos sugestivos impresos. Alucingenos LSD ( Dietil amida del cido lisrgico ) Droga semisinttica derivada del cido lisrgico, alcaloide que se encuentra en el Claviceps purpurea, hongo del centeno y otros cereales (cornezuelo). Es incolora, insabora, inodora, cristalina, soluble en agua o alcohol. Benzodiacepinas Depresores del sistema nervioso central. Diazepam, Clordiazepxido, Flunitrazepam, Oxazepam, Medazepam, Clonazepam. Se presentan en tabletas o cpsulas de diversos tamaos y colores y en preparados farmacuticos listos para inyeccin o ingestin. Fenotiazinas Depresores del sistema nervioso central. Tranquilizantes. Clorpromazina, Levomepromazina (methotrimeprazine), trifluoperazina. En tabletas o en otras formas farmacuticas. Antidepresivos triciclicos Amitriptilina, Imipramina, Nortriptilina. En tabletas o en otras formas farmacuticas. Barbitricos Depresor del sistema nervioso central. Fenobarbital, Tiobarbital, Pentobarbital. En tabletas o en otras formas farmacuticas.
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Anlisis de muestras para detectar e identificar marihuana cannabis

Examen Microscpico Se refiere a la determinacin de caractersticas botnicas de la planta de cannabis por observacin al estereomicroscopio o al microscopio. Muestra: Material vegetal pulverizado o desmenuzado. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad del material vegetal desmenuzado sobre un portaobjetos. o Observar al microscopio bajo aumento de 10 X o Observar la presencia de estructuras de carbonato de calcio como tricomas y cistolitos, en forma de ua de gato. Prueba de Duquenoise - Levine Es una prueba de coloracin que evidencia la presencia de fluoroglucinol en la muestra. Reactivo Duquenoise-Levine. Disolver 2 gramos de vainillina en 100 ml de etanol al 95 %. Agregar seguidamente 2.5 ml de acetaldehdo. Acido clorhdrico concentrado. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad de muestra en un tubo de ensayo. o Agregar 20 gotas del reactivo de Duquenoise y agitar durante un minuto. o Agregar 10 gotas de cido clorhdrico concentrado. Dejar en reposo durante un minuto la muestra as tratada. o Observar la aparicin de un color en la gama del azul al violeta oscuro en la parte inferior del tubo, este indica la posible presencia de cannabis. Prueba de confirmacin Se realiza por separacin por cromatografa de capa delgada comparando con patrones o por HPLC
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Anlisis de muestras para detectar e identificar cocana

Prueba de tanred Es una prueba general para la identificacin de alcaloides. Es una prueba de orientacin basada en la precipitacin de los alcaloides presentes en una muestra, evidenciado por la aparicin de un precipitado amarillo lechoso. Muestra: Mnima cantidad de sustancia slida triturada hasta polvo fino. Reactivo Tanred Mezclar 20 ml de cido actico con 1.3 gramos de cloruro mercrico y 3.3 gramos de yoduro de potasio, completando con agua hasta un volumen de 64 ml. Procedimiento o Colocar una mnima cantidad de muestra en un tubo de ensayo. o Agregar 1 ml de agua destilada o Agitar y agregar 2 gotas del reactivo de Tanred. Prueba de Scott Prueba del Tiocianato de cobalto modificada. Es una prueba de precipitacin que detecta desde 1 % de cocana. Como se realiza en secuencia, slo muy pocas sustancias diferentes a cocana presentan la secuencia de color similar. Reactivo de Scott Tiocianato de cobalto (II) en 50 ml de cido de cido actico al 10 5 y agregar seguidamente 50 ml de glicerina. Acido clorhdrico concentrado. Cloroformo Procedimiento o Colocar una fraccin de muestra en un tubo de ensayo. o Agregar cinco gotas del reactivo de Scott. o La formacin de un precipitado azul turquesa indica prueba parcialmente positiva. o Agregar mximo dos (2) gotas de cido clorhdrico concentrado, al mezclar, el color azul turquesa desaparecer y la solucin toma coloracin rosada.
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o Agregar varias gotas de cloroformo para observar la separacin de las fases. La capa clorofrmica adquiere color azul intenso si la muestra contiene cocana. NOTA: Realizar la prueba con un blanco simultneamente con la muestra. Prueba espectrofotomtrica La cocana en solucin cida diluida exhibe un espectro en la regin ultravioleta con un mximo de absorbancia a 233 nm y otro de menor intensidad a 275 nm. Reactivos Solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad de la muestra a disolver en solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N. o Correr un espectro de la muestra entre 325 y 200 nm. o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrn de cocana.
Anlisis de muestras para detectar e identificar opiceos (opio, morfina, codena, herona)
Prueba de Tanred o Colocar una mnima cantidad de muestra en un tubo de ensayo. o Agregar 1 ml de agua destilada o Agitar y agregar 2 gotas del reactivo de Tanred. Prueba de Marquis Una 1 gota de formaldehdo mezclada con 1 ml de cido sulfrico. Procedimiento o Colocar una mnima cantidad de una placa de pruebas a la gota. o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Marquis. o La aparicin de un color violeta oscuro se considera prueba de orientacin positiva para opiceos.
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NOTA: Es una prueba de coloracin de alcaloides opiceos.
Prueba espectrofotomtrica En solucin cida diluida, exhiben los siguientes mximos de absorbancia: En solucin cida En solucin alcalina Codena: 285 nm Herona: 279 nm 299 nm Morfina: 285 nm 298 nm
Reactivos Solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad de la muestra a disolver en solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N o Correr un espectro de la muestra entre 325 y 200 nm. o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrn.
Anlisis de muestras para detectar e identificar anfetaminas

Prueba de marquis Es una prueba de coloracin para anfetaminas en la que vara el color producido en la reaccin segn la estructura qumica de cada una. Reactivos Marquis Una 1 gota de formaldehdo mezclada con 1 ml de cido sulfrico. Procedimiento o Colocar una mnima cantidad de una placa de pruebas a la gota. o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Marquis. o La aparicin de colores naranja, amarillo, marrn sugiere la posible presencia de anfetaminas en la muestra. La aparicin de color negro es prueba de orientacin que indica la posible presencia de anfetaminas con sustitucin en el anillo.
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Prueba de coloracin de Simon Es una prueba de coloracin para anfetaminas con sustitucin en N - como MDMA y otros derivados. Reactivo de Simon A - Disolver 0.9 gramos de nitroprusiato sdico en 90 ml de aguay agregarle 10 ml de acetaldehdo. B - Solucin de carbonato de sodio al 2 % en agua. Procedimiento o Colocar una mnima cantidad de una placa de pruebas a la gota. o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Simon A. o Agregar 2 gotas de Simon B o La aparicin de un color azul se considera prueba de orientacin positiva para metanfetamina. Prueba espectrofotomtrica Las anfetaminas metiladas, en solucin cida diluida exhiben un espectro en la regin ultravioleta con mximos de absorbancia a 275 nm y a 235 nm. Reactivos Solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad de la muestra a disolver en solucin diluida de cido sulfrico 0.5 N o Correr un espectro de la muestra entre 325 y 200 nm. o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrn de anfetaminas.
Anlisis de muestras para detectar e identificar benzodiacepinas

Prueba de coloracin con el reactivo formaldehido - acido sulfrico. Es una prueba de orientacin por precipitacin de benzodiacepinas en general. Reactivo Formaldehdo - cido sulfrico A cuatro volmenes de cido sulfrico agregar seis volmenes de solucin de formaldehdo, utilizando una pipeta con la punta sumergida en el cido, con agitacin y enfriamiento apropiado.
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El reactivo puede permanecer claro por cerca de una hora Si se desarrolla turbidez, esta puede eliminarse calentando en bao de agua a 100C por un minuto aproximadamente. Este reactivo es diferente del reactivo de Marquis. Procedimiento o Colocar una pequea cantidad de la muestra en un tubo de ensayo o Mezclar con el reactivo de formaldehido - acido sulfrico 2 gotas. o Si es necesario, calentar a 100 C por un minuto.
Seccin Experimental
Psicofrmacos en muestras no biolgicas Las sustancias pueden ser:
10 gotas de Cloroformo
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Recomendaciones generales: Examen microscpico si corresponde a un material vegetal Confirmacin con CCD con patrones, HPLC y dems tcnicas analticas que ofrecen mayor confiabilidad.
Pruebas
Solubilidad en agua Alcaloides (Tanred) Scott directa Scott completa Marquis Morfina-Herona Simon`s FPN Acido Sulfrico Libermann`s
Resultado
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Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Clarkes isolation and identification of drugs. In pharmaceutic als, body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior consulting editor. A. C. Moffat. London the pharmaceutical press. 1986. The pharmaceutical society of great britain. Pg. 3-34. Fanny Cuesta y otros. Manual de toxicologa. Universidad de Antioquia. Medelln. Luz Amparo Arenas de Arenas y Esperanza Vesga Torres. Toxicologa analtica. Universidad industrial de Santander. Departamento de ciencias fisiolgicas. Pginas 154-1995. Liu Ray H. Daniel E. Gadzala. Handbook Of Drug Analysis. Applications In Forensic And Clinical Laboratories. American Chemical Society. Washington, Dc.1997. Pg. 35-50.
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Practica # 8: Determinacin de psicofrmacos en muestras biolgicas

Objeto
Analizar y seleccionar la metodologa de extraccin de psicofrmacos presentes en muestras biolgicas, de acuerdo a sus caractersticas cidas, bsicas o anfteras.
Determinar el efecto del pH en los procesos de extraccin lquido-lquido de diferentes psicofrmacos. Determinar el efecto del pH en la solubilidad de diferentes psicofrmacos. Establecer cul de los mtodos tiene mejor adecuabilidad de acuerdo a los parmetros anteriormente calculados para cada uno de ellos.
Anlisis de drogas en fluidos biolgicos

Para analizar las drogas y sus metabolitos en los fluidos biolgicos se debe tener en cuenta la estructura de las molculas, su carcter cido o bsico, sus constantes de disociacin coeficientes de particin, solubilidad y todos los dems parmetros fisicoqumicos necesarios que garanticen la completa recuperacin de los analitos desde las matrices biolgicas. Teniendo en cuenta los grupos funcionales que afectan los coeficientes de particin en los solventes orgnicos, las drogas de inters toxicolgico se agrupan en cuatro grupos fundamentales: CIDAS, BSICAS, ANFOTRAS Y NEUTRAS. Una clasificacin adicional la constituyen el grupo de los VOLTILES. Durante el anlisis, el control del pH permite el paso de las drogas desde el fluido biolgico hacia el solvente de extraccin. Por ejemplo, las drogas alcalinas como cafena, cocana, escopolamina, anfetaminas, imipramina, codena, morfina, herona,
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efedrina, fenotiazinas, deben extraerse en medio BSICO, para as insolubilizar la sustancia en el medio acuoso y hacerla soluble en los solventes orgnicos. En el caso de drogas como barbitricos, salicilatos, difenilhidantona, Fenitoina, Paracetamol, se debe ACIDIFICAR el medio para ser extradas de las muestras biolgicas. Las sustancias anfoteras se comportan como cidas y bsicas y el control de pH es crtico porque su forma no polar se logra en el punto isoelctrico. Ejemplo la Fenilefrina. Sustancias como Meprobamato, Clordiazepxido, Flurazepam, se extraen en medio neutro. Los alucingenos son considerados por muchos como otro grupo, pero realmente su comportamiento es alcalino, por lo cual sern extrados en el sistema BSICO.
Mtodos de extraccin
Extraccin lquido / lquido (l/l) Implica la transferencia de una sustancia desde una fase lquida a una segunda fase tambin lquida inmiscible con la primera. El compuesto que va extraerse debe ser soluble o parcialmente soluble en un solvente, pero muy insoluble en el otro solvente. Generalmente el agua es uno de los solventes porque la mayora de los compuestos orgnicos son insolubles en ella, pero disuelve los compuestos inicos polares. Entre los solventes orgnicos ms utilizados se tienen: ter etlico, Hexano, Diclorometano, Cloroformo, ter de Petrleo, Pentano, Tetracloruro de Carbono. La extraccin liquido / liquido es un proceso de particin que esta basado en las solubilidades relativas de los compuestos en dos solventes inmiscibles. Una de las utilidades ms importante de la tcnica es la separacin de sustancias cidas o bsicas de muestras y fluidos biolgicos. El mtodo utiliza diferentes pH y diferentes caractersticas de solubilidad de los analitos. Un compuesto bsico estar en su forma no ionizada en medio alcalino, ser insoluble en el agua del medio biolgico y soluble en el solvente orgnico. Los compuestos ionizados y las protenas permanecern en la fase acuosa mientras que las drogas bsicas no ionizadas pasaran al solvente orgnico. Igualmente sucede con un compuesto cido en medio cido.
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La mayora de los procedimientos de extraccin emplean proporciones de solvente orgnico mayor que la fase acuosa para disminuir la formacin de emulsiones. Lo ideal es una proporcin de 10:1 solvente: muestra. La seleccin del solvente requiere considerar los parmetros de densidad, volatilidad, polaridad, selectividad y solubilidad de las drogas que se van a extraer. Obviamente los solventes muy txicos para la propia salud y para el medio ambiente no deben ser utilizados y en lo posible reemplazarse por otras alternativas de mezclas con solventes menos dainas. Las extracciones se realizan por lo general en embudos de separacin de manipulacin manual que permiten manejar volmenes relativamente grandes de muestras; pero la operacin se puede llevar a cabo en tubos de centrfuga, tubos de tapa rosca de capacidades desde 10, 20, 50 ml que facilitan la automatizacin.
Extraccin slido / liquido (SPE)

Est basada en la interaccin de los analitos con una fase slida y la matriz de las muestras. Estas interacciones pueden ser para retener y concentrar los analitos o los componentes que interfieren en los anlisis y se encuentran en la matriz de la muestra. Las principales ventajas de la SPE son: menor cantidad de solventes orgnicos, no hay problemas de emulsiones, menor tiempo en la preparacin de la muestra, fcil adaptacin para automatizar el proceso y obtencin de extractos ms limpios. La SPE tiene los mismos fundamentos de la cromatografa liquida de baja presin. Los mecanismos de separacin son debidos a interacciones intermoleculares entre las molculas del analito y los grupos funcionales de la fase slida. Estas pueden ser: fuerzas inicas, puentes de hidrgeno, fuerzas Dipolo-Dipolo, fuerzas Dipolo-Dipolo inducido, fuerzas de dispersin o de Van der Waals. Un material convencional es el Extrelut (E. Merck) a partir de tierras diatomeas es usado con tres tcnicas de elucin: 1) Elucin diferencial a pH 2 para drogas cidas y a pH 10 para drogas bsicas, 2) elucin nica a pH 9 para todas las drogas no conjugadas y 3) Hidrlisis y elucin a pH 9 para drogas conjugadas. Actualmente se cuenta con numerosas fases slidas a partir de slica o slica modificada disponible en cartuchos o columnas, de diferentes polaridades y marcas que permiten elegir la mejor opcin para la necesidad analtica que se tenga.
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Existen otras metodologas de extraccin con las cuales se optimizan los porcentajes de recuperacin de los analitos presentes en muestras complejas y/o se logran extractos ms limpios: Microextraccin en fase slida (SPME), Extraccin con fluidos supercrticos, Extraccin Headspace.
Esquemas y metodologas de extraccin de drogas en fluidos biolgicos Sustancias Alcalinas

Analgsicos, antidepresivos tricclicos (Amitriptilina, nortriptilina, imipramina), Fenotiazinas (levo-clor), anfetaminas,(MDMA-MDA), alcaloides (cocana, morfina, herona, tramadol, lidocana, procaina). La mayora de los alcaloides son removidos rpidamente de la sangre, por esto la muestra de ORINA es la adecuada para el anlisis de metabolitos y droga sin biotransformar.
Prueba de color para fenotiazinas Medir 2 mL de orina en un tubo de ensayo Adicionarle 5 gotas del reactivo F.P.N. (Cloruro Frrico al 5%, cido Perclrico al 20%, cido Ntrico al 50%) Observar el color inmediatamente: o Violeta: Levomepromazina o Rosa: Clorpromazina o Azul: Trifluorperazina Determinacin de sustancias bsicas: Servir 10 ml del material biolgico (sangre, plasma, orina, contenido gstrico) en un embudo de separacin. Adicionar 10 ml de solucin saturada de carbonato de sodio Verificar un pH entre 8-9 con papel indicador. Realizar la primera extraccin con 20 ml de la mezcla Hexano:Acetato de etilo (1:1). Agitar por 1 minuto.

Observar la formacin de las dos fases; orgnica y acuosa. Separar la fase orgnica en un Erlenmeyer. Realizar dos extracciones adicionales, con volmenes iguales de la mezcla Hexano:Acetato de etilo (1:1). Reunir las fases orgnicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase acuosa se descarta. Filtrar y recibir directamente en una cpsula de porcelana. Dejar evaporar el solvente en cmara de extraccin de vapores o bajo corriente de nitrgeno. Esquema general de extraccin alcalina en fluidos biolgicos
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Sustancias Acidas
Pentobarbital, secobarbital, amobarbital, alobarbital, fenobarbital, acido acetil salicilico, fenitona, carbamazepina, meprobamato, ibuprofeno , Ac Valproco, Acetaminofn. Prueba de color: parri-koppanyi Servir 2 ml de orina en una capsula de porcelana y acidificar con H 2SO4 al 10 % hasta un pH de 4-5. Extraer con ter y filtrar. Evaporar la solucin etrea y redisolver el residuo con 1 ml de cloroformo. A esta solucin agregar 2 gotas de solucin de acetato de cobalto, seguido de solucin de hidrxido de litio gota a gota. La presencia de un anillo azul en la unin de las dos capas es prueba preliminar positiva para barbitricos. Prueba de color para salicilatos Servir 2 ml de orina en una cpsula de porcelana Adicionar 5 gotas de cloruro frrico al 10% Un color violeta es prueba presuntiva para salicilatos, un color rosa dbil es presuntiva para Fenotiazinas Adicionar una gota de Acido sulfrico al 50% El color violeta de los salicilatos desaparece, y la coloracin debida a Fenotiazinas se intensifica Determinacin de sustancias cidas: Servir 10 ml del material biolgico (sangre, plasma, orina, contenido gstrico) en un embudo de separacin. Ajustar pH de 3-4 con cido sulfrico 0.5 N. Verificar con papel indicador. Agregar 20 ml de cloroformo y agitar por 1 minuto. Observar la formacin de las dos fases: orgnica y acuosa. Separar la fase orgnica en un Erlenmeyer. Realizar dos extracciones adicionales, con volmenes iguales de cloroformo. Reunir las fases orgnicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase acuosa se descarta. Filtrar y recibir directamente en una cpsula de porcelana.

Dejar evaporar el solvente en cmara de extraccin de vapores o bajo corriente de nitrgeno. Esquema general de extraccin acida en fluidos biolgicos
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Sustancias Conjugadas
Lorazepam, diazepam, flunitrazepam, bromazepam (BDZ), M- Ac. Glucurnico Durante el proceso de biotransformacin algunas drogas pueden sufrir reacciones catalizadas enzimticamente y formar conjugados con sustancias endgenas como el cido glucurnico. El glucuronido de morfina y el de las benzodiazepinas son los ejemplos ms conocidos. El conjugado no es extrado dentro de la fase orgnica y tampoco es fcilmente manipulable en los mtodos de anlisis, debe ser hidrolizado para dejar la molcula de droga libre y fcilmente extrable con los solventes orgnicos. La hidrlisis se lleva a cabo generalmente con HCl en condiciones rigurosas, que causan la descomposicin de otros compuestos concomitantes y se generan una mezcla de reacciones. El uso de enzimas para realizar la hidrlisis actualmente est bien documentado y se disponen de varias preparaciones que ofrecen efectividad y altos porcentajes de recuperacin. Por ejemplo la -glucoronidasa de la Patella vulgate es activa a 65 C, es muy efectiva y produce rendimientos del 90% o ms con dos horas de incubacin. La hidrlisis cida convencional es efectiva y tiene altos porcentajes de recuperacin y consume menos tiempo, pero tiende a causar descomposicin de algunos compuestos cidos lbiles. Determinacin de benzodiazepinas Su toxicidad es relativamente baja, porque no producen depresin importante del centro respiratorio, son usadas como hipnticos y en la actualidad son los frmacos de mayor importancia en los casos de lesiones personales y de abuso en la automedicacin y adiccin. En el proceso de excrecin se encuentran como glucuronidos en la orina, para su anlisis deben ser antes hidrolizadas.
Determinacin de sustancias conjugadas: Servir 10 ml del material biolgico (sangre, plasma, orina, contenido gstrico) en un embudo de separacin. Adicionar 3 ml de HCl concentrado. Colocar al bao mara a 100 C por 15 minutos.
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Dejar enfriar a temperatura ambiente. Alcalinizar con NaOH al 20 %, 10-12 ml deben ser suficientes. Verificar pH 9-10 con papel indicador. Adicionar 20 mL de la mezcla Diclorometano:Isopropanol (85:15). Agitar por 1 minuto. Observar la formacin de las dos fases; orgnica y acuosa. Separar la fase orgnica en un Erlenmeyer. Realizar dos extracciones adicionales, con volmenes iguales de. Diclorometano:Isopropanol (85:15). Reunir las fases orgnicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase acuosa se descarta. Filtrar y recibir directamente en una cpsula de porcelana. Dejar evaporar el solvente en cmara de extraccin de vapores o bajo corriente de nitrgeno.
Esquema general de extraccin conjugada en fluidos biolgicos
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Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. CLARKES ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS. In Pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior Consulting Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press. 1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Pg. 3-34. FANNY CUESTA Y OTROS. MANUAL DE TOXICOLOGA. Universidad de Antioquia. Medelln. LUZ AMPARO ARENAS DE ARENAS y ESPERANZA VESGA TORRES. TOXICOLOGA ANALTICA. Universidad Industrial de Santander. Departamento de Ciencias Fisiolgicas. Pginas 154-1995. LIU RAY H. DANIEL E. GADZALA. HANDBOOK OF DRUG ANALYSIS. APPLICATIONS IN FORENSIC AND CLINICAL LABORATORIES. American Chemical Society. Washington, DC.1997. Pg. 35-50.
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Practica # 9: Cromatografa de sustancias psicoactivas

Objeto
Realizar un perfil cromatogrfico con el objeto de evaluar la presencia de sustancias psicoactivas en muestras biolgicas y no biolgicas.
Cromatografa de capa delgada

Es una tcnica de separacin cormatogrfica donde la fase estacionaria corresponde a una capa uniforme de un material absorbente, el cual se soporta sobre una placa, que puede ser de diversos materiales como vidrio, aluminio u otro material y la fase mvil es lquida. En cromatografa fase normal, la fase estacionaria es polar y el eluente ser apolar o de polaridad intermedia, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Existen algunos aspectos importantes a considerar para el desarrollo de la cromatografa: Las muestras se deben procesar de acuerdo a su procedencia (biolgica no biolgica), de acuerdo a las directrices de las prcticas 8 y 9. Posteriormente, se debe redisolver la muestra en solventes orgnicos, con bajo punto de ebullicin, facilitando as su evaporacin luego de la aplicacin. Elegir el tipo de eluente a utilizar, por ende es necesario considerar la polaridad de los solventes. A continuacin, se describe el orden creciente de polaridad de los solventes ms utilizados a nivel de laboratorio.
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Eter de petrleo < Hexano <Diclorometano< Cloroformo<Acetato de etilo < Etanol <Metanol<Agua As mismo, en el caso del eluente se deben considerar los siguientes factores: Precio Pureza (Evitar trazas de metales,catalizadores) Laboratorio fabricante La eleccin del eluente se realiza de forma emprica. Es necesario estudiar la polaridad del componente. Al aplicar en primer lugar eluentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluentes ms polares, hasta encontrar el ms apropiado.
Cromatografa de sustancias alcalinas Redisolver el residuo con 1 ml de metanol y aplicar sobre una placa de slica gel. Sembrar los patrones (ejm: cocana, escopolamina, cafena, levomepromazina, clorpromazina, morfina, codena, anfetamina, imipramina) y las muestras utilizadas en la prueba. Utilizar como Eluente: metanol:acetona (80:20) o MeOH: NH3 (100:0.5). Dejar correr la placa. Observar con la lmpara UV. Aplicar el revelador en la siguiente placa. o cido Sulfrico al 5%. Secar la placa. Verificar la formacin de manchas de color violetas, rosas y azules, lo que indica que la muestra corresponde a una fenotiazina. o Dragendorff Secar la placa. Verificar la formacin de manchas de color naranja, caf, marrn y ocre, lo que indica que la muestra corresponde a un alcaloide tipo: cocana, escopolamina, morfina, codena. Determinar y comparar los RF con los patrones y color de las manchas.
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Cromatografa de sustancias cidas Disolver el residuo con 1 ml de cloroformo y aplicar sobre una placa de slica gel. Sembrar los patrones (ejm: Fenobarbital, Pentobarbital, Secobarbital, Fenitoina, cido Acetilsaliclico, Meprobamato) y las muestras utilizadas en la prueba. Eluentes prueba: Hexano:Acetato de etilo (50:50), Diclorometano:acetato de etilo (35:15) y Cloroformo: Metanol (95:5)

Dejar correr la placa. Observar con la lmpara UV. Aplicar el revelador en la siguiente secuencia: o Nitrato de mercurio Secar la placa. Verificar la formacin de manchas blancas lo que indica que la muestra puede contener barbitricos. o Difenilcarbazona 0.01% Secar la placa Verificar la formacin de manchas color rosa lo que indica que la muestra puede corresponder a Fenitoina, ASA, ibuprofeno, Carbamazepina o Acetaminofn. Determinar y comparar los RF con los patrones y color de las manchas.
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Segunda etapa conjugadas (benzodiacepinas) Disolver el residuo con 1 ml de Metanol y aplicar sobre una placa de slica gel. Sembrar los patrones (ejm: Diazepam, Lorazepam, Bromazepam, Flunitrazepam, Oxazepam, y Nitrazepam) y las muestras utilizadas en la prueba. Eluentes prueba Hexano:Acetato de etilo (50:50) y Diclorometano:Acetato de etilo (35:15) y Cloroformo:Metanol (95:5).
Dejar correr la placa.
Observar con la lmpara UV. Aplicar el revelador en la siguiente secuencia: o Nitrito de Sodio al 1%. (1) Dejar secar la placa. o Clorhidrato de N-naftiletilendiamina 0.04% o Verificar la formacin de manchas de color violeta, rosa y amarillas lo que indica que la muestra corresponde a benzofenonas, para visualizar mejor el Flunitrazepam aplicar solucin de KOH al 20% y calentar la placa en estufa a 100 C por 15 minutos. La benzofenona del flunitrazepam se apreciar de color amarillo y las otras se tornaran de color rojo naranja. Determinar y comparar los RF con los patrones y color de las manchas.
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Bibliografa
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. CLARKES ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRU GS. In Pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior Consulting Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press. 1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Pg. 3-34. FANNY CUESTA Y OTROS. MANUAL DE TOXICOLOGA. Universidad de Antioquia. Medelln. LUZ AMPARO ARENAS DE ARENAS y ESPERANZA VESGA TORRES. TOXICOLOGA ANALTICA. Universidad Industrial de Santander. Departamento de Ciencias Fisiolgicas. Pginas 154-1995. LIU RAY H. DANIEL E. GADZALA. HANDBOOK OF DRUG ANALYSIS. APPLICATIONS IN FORENSIC AND CLINICAL LABORATORIES. American Chemical Society. Washington, DC.1997. Pg. 35-50.

Practica # 10: Extraccin de plaguicidas en muestras biolgicas y no biolgicas

Objeto
Seleccionar el pretratamiento de la muestra de acuerdo a la complejidad de la matriz, con el objeto de extraer plaguicidas.
Introduccin
En nuestro medio los plaguicidas son comercializados para su uso en diferentes reas como: jardinera, cultivos agrcolas, control de roedores; los cuales son comercializados con los siguientes nombres: DDT, Bin Laden, Gamezan, Malation, Neocid 50%, Folidol, Baygon, Matarapido, Racumin, Zelio, El zorro, Campen y El Demoledor. Los plaguicidas se clasifican de acuerdo a su estructura qumica y se dividen en:
Herbicidas
Organofosforados o Paratihion o Malathion o Clorpirifos o Roxion Carbamatos o Baygon o Carbaryl o Lannate o Carbofurano Piretrinas y Piretroides o Deltametrina o Cipermetrina o Flunipiretrina o o o Paracuat (altamente alcalino pH ~14) Diquat Glifosfato (son sales)
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MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGIA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 El anlisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas reas: Forense Diagnstico de urgencia Control de poblaciones expuestas y no expuestas. Contaminacin ambiental. Si el plaguicida fue causa de muerte, estar en alta concentracin, al igual que en una intoxicacin aguda grave. En las dos ltimas reas se trabaja con muestras con niveles muy bajos de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de residuos de plaguicidas. De todos ellos estudiaremos los insecticidas organofosforados y carbamatos, por ser los ms utilizados actualmente y producir efectos txicos muy caractersticos. Adems, la comercializacin de los organoclorados en Colombia se encuentra prohibida. Los mtodos para extraer plaguicidas deben ser aplicables a matrices complejas, como es el caso de fluidos biolgicos (orina, suero, sangre y contenido gstrico), preparaciones comerciales, alimentos, bebidas y muestras ambientales. Algunos de estos mtodos corresponden a destilacin, extraccin lquido-lquido, extraccin en fase slida, extraccin slido-lquido. Al producto del destilado, se pueden aplicar pruebas de orientacin como la del p-nitrofenol y la prueba de Marquis. La prueba del p-nitrofenol se utiliza para detectar metabolitos de los fosforados orgnicos. Consiste en tratar una porcin de la muestra destilada con NaOH para hidrolizar a un pH 9.9 el parathion que est presente en la muestra, produciendo la sal sdica del cido dietilfosfrico y pnitrofenol. El p-nitrofenol en medio alcalino produce nitroderivados de color amarillo. La Prueba de Marquis se basa en una reaccin de orientacin para hidrocarburos que se utilizan como solventes y vehculos en los preparados comerciales de plaguicidas como los carbonatos y otros. En la Extraccin Lquido-Lquido, se hace la transferencia de analito(s) de la muestra en fase lquida del destilado a una segunda fase lquida de polaridad adecuada para extraerlo. Otra alternativa para la extraccin de plaguicidas en fluidos biolgicos, corresponde a la extraccin en fase slida, en la que se disminuye el uso de solventes y es ms fcil de automatizar. Solo se requiere la eleccin del adsorbente apropiado que permita retener los plaguicidas. Posteriormente con el uso del eluente apropiado se eluye el respectivo analito.
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Tcnicas de anlisis
En caso de intoxicaciones agudas por ingestin, la muestra ideal es el contenido gstrico, y en ella se aplican con muy buenos resultados las pruebas de coloracin, seguidas de las dems tcnicas, puesto que se cuenta con altas concentraciones de los analitos. Esto no ocurre igual con las muestras de vsceras que si requieren tcnicas de mayor sensibilidad y especificidad, as como de tratamientos de la muestra ms cuidadosos para extraer los analitos de la matriz. La orina es una muestra indicada en algunos casos como en intoxicacin con herbicidas como el Paraquat y Diquat, dependiendo eso s, del tiempo transcurrido entre la entrada del txico al organismo y la toma de la muestra, as como de la conservacin de sta y la rapidez del anlisis. Las muestras no biolgicas como los preparados comerciales se asemejan al contenido gstrico en intoxicaciones agudas, en cuanto a su alta concentracin de analito. Entre las pruebas de coloracin utilizadas en la deteccin de plaguicidas estn: Acido sulfricocido ntrico para dicofano (clorado), Prueba de fsforo para compuestos organonofosforados, ditionito de sodio para diquat y paraquat, cido sulfrico/acido sulfrico fumante para los organoclorados dieldrin, aldrin y endrin, entre otras.
Parte experimental Destilacin de voltiles en mezclas acuosas

Tomar 40 mL de muestra en un baln de cuello esmerilado y fondo redondo. Llevarlo al montaje de destilacin. Adicionar un volumen equivalente a la muestra de agua caliente. Si se desconoce por completo la composicin de la muestra agregar 30 mL de Acido Tartrico al 20% para evitar la hidrlisis del parathion que pueda estar presente en la muestra. Agregar suficientes perlas de ebullicin. Destilar en el equipo apropiado hasta obtener mnimo 40 mL de destilado. Si es necesario analizar para cianuro, se deben recibir los 5 primeros mL del destilado sobre 1 mL de NaOH al 5%.
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Pruebas de orientacin Prueba del Paranitrofenol

o Tomar 3 mL del destilado en un tubo de ensayo y adicionar 2 perlas de NaOH. o Calentar al Bao Mara durante 2 minutos. o Observar si ocurre un cambio de color al amarillo canario de la muestra, que persista; esto en el caso de contener parathion. o Hacer el anlisis simultneo a un control positivo y uno negativo.
Prueba de Marquis.
o Tomar 3 ml del destilado en un tubo de ensayo de capacidad 20 mL y agregarle 3 mL de tetracloruro de carbono. o Agitar para extraer y separar llevando a otro tubo la fase orgnica. o Repetir la extraccin con una segunda porcin igual de tetracloruro de carbono. o Reunir la fase orgnica con la obtenida primero y aplicarles el Reactivo de Marquis. o La formacin de un color rojo-caf indica la presencia de hidrocarburos en la muestra. o Realizar la prueba simultneamente con un control positivo y otro negativo.
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Extraccin liquido-liquido
Tomar alrededor de 30 mL del destilado y llevarla a un embudo de separacin. Realizar la primera extraccin con 60 ml de la mezcla de ter de petrleo:acetato de etilo (4:1) Agitar por 1 minuto. Observar la formacin de las dos fases; orgnica y acuosa. Separar la fase orgnica en un Erlenmeyer. Realizar si es necesario otra(s) extraccin(es) adicionales, con volmenes iguales de la mezcla de ter de petrleo. Reunir las fases orgnicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase acuosa se descarta. Filtrar y recibir directamente en una cpsula de porcelana. Dejar evaporar el solvente en cmara de extraccin de vapores o bajo corriente de nitrgeno. NOTA: Cuando la cantidad de muestra es del orden de 10 mL o menos, se comienza el proceso directamente en la extraccin liquido-liquido, sin hacer la destilacin.
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Determinacin de paraquat y diquat en orina

Tomar 5 mL de orina en un tubo de ensayo de 10 mL Agregar 4 lentejas de Hidrxido de sodio. Mezclar bien. Dejar en reposo por 2 minutos. Adicionar 1-2 mg de Ditionito de sodio a la muestra alcalinizada y mezclar bien. Observar si ocurre la formacin inmediata de un coloreado que con la presencia de Paraquat en la muestra es de color azul, y en presencia de Diquat es verde. De otro lado, realizar a la orina sin tratar un barrido espectrofotomtrico en el ultravioleta entre 200 y 350 nm, mezclndola con cido sulfrico 0.5 N. Si hay presencia de cierta cantidad de Paraquat en la muestra, esta exhibe un mximo de absorbancia a 257 nm, y en presencia de Diquat, un mximo a 310 nm. Para ambas pruebas, desarrollar un blanco y un control positivo con una solucin acuosa de Paraquat y de Diquat al 0.2%,respectivamente.
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BIBLIOGRAFA
Medina MM, Torres AH, Rodrguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicologa. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. CLARKES ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS In Pharmaceuticals, Body Fluids and post-mortem material. Second Edition. Senior Consulting Editor. A.C. Moffat. London. The Pharmaceutical Press. 1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Pginas 70 - 86. MANUAL DE TOXICOLOGA. Fanny Cuesta y otros. Universidad de Antioquia. Medelln. Pginas 14 a 24. TOXICOLOGA ANALTICA. Luz Amparo Arenas de Arenas y Esperanza Vesga Torres. Universidad Industrial de Santander. Departamento de ciencias Fisiologicas. Pginas 82107. MEDICINA LEGAL Y TOXICOLOGA. Juan Antonio Gisbert Calabuig. Cuarta Edicin. Salvat Editores S.A. Barcelona (Espaa). 1991. Pginas 696 - 707.
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Practica # 11: Perfil cromatogrfico de plaguicidas en muestras biolgicas y no biolgicas

Objeto
Realizar un perfil cromatogrfico con el objeto de evaluar la presencia de plaguicidas en muestras biolgicas y no biolgicas.
Introduccin
Cromatografa de capa delgada
Es una tcnica de separacin cromatogrfica donde la fase estacionaria corresponde a una capa uniforme de un material absorbente, el cual se soporta sobre una placa, que puede ser de diversos materiales como vidrio, aluminio u otro material y la fase mvil es lquida. En cromatografa fase normal, la fase estacionaria es polar y el eluente ser apolar o de polaridad intermedia, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Existen algunos aspectos importantes a considerar para el desarrollo de la cromatografa: Las muestras se deben procesar de acuerdo a su procedencia (biolgica no biolgica), de acuerdo a las directrices de la prctica 11. Posteriormente, se debe redisolver la muestra en solventes orgnicos, con bajo punto de ebullicin, facilitando as su evaporacin luego de la aplicacin. Elegir el tipo de eluente a utilizar, por ende es necesario considerar la polaridad de los solventes. A continuacin, se describe el orden creciente de polaridad de los solventes ms utilizados a nivel de laboratorio.
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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 ter de petrleo < Hexano <Diclorometano< Cloroformo<Acetato de etilo < Etanol <Metanol<Agua As mismo, en el caso del eluente se deben considerar los siguientes factores: Precio Pureza (Evitar trazas de metales, catalizadores) Laboratorio fabricante La eleccin del eluente se realiza de forma emprica. Es necesario estudiar la polaridad del componente. Al aplicar en primer lugar eluentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluentes ms polares, hasta encontrar el ms apropiado. En el caso de la muestra procesada de acuerdo a las indicaciones establecidas en la practica 11. Se debe sembrar en 3 placas cromatogrficas diferentes para aplicar diferentes reveladores direccionados a verificar la presencia de organofosforados, carbonatos y organoclorados. A los extractos que resulten positivos en la Cromatografa en capa fina se les debe realizar un espectro en el Ultravioleta entre 200 y 300 nm, comparando con los patrones o con datos de la literatura.
ESTRUCTURAS DE LOS PLAGUICIDAS

PLAGUICIDAS Insecticidas Organofosforados Carbamatos Organoclorados Piretrinas y piretroides Ureas sustituidas Organoestao Compuestos Heterocclicos Herbicidas Ac. Fenoxiclorados Ureas sustituidas Triazinas Uracilos Comp. Amonio cuaternario Carbamatos Fungicidas Otros Compuestos ESTRUCTURA 1 2-3 4 5-6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
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Tcnicas de anlisis
Preparacin de la muestra Disolver la muestra procesada de acuerdo a las directrices de la prctica No. 11 con suficiente Cloroformo (500 uL) y aplicar por iguales cantidades sobre 3 placas de slica gel HF-254, para la deteccin de: o Organofosforados. o Carbamatos y piretrinas. o Organoclorados (debido a que no estn aprobados en Colombia, en este caso no se realiza)
Deteccin por cromatografa en capa delgada Deteccin de compuestos Organofosforados o Aplicar en esta placa patrones disueltos de organofosforados como: Parathion (FOLIDOL), Metil Parathion ( FOLIDOL - M), clorpyrifos (LORSBAN; DURSBAN), metilclorpyrifos, dimetoato (ROXION, SYSTEMIN), ethion (GARAFOS), methamidofos (TAMARON), fenthion (Tiguvon), diazinon (BASUDIN, TERMINATOR), fenitrothion (SUMITHION). o Sumergir la placa en una cmara dispuesta con el eluente, Hexano:Acetato de etilo (80:20), cerrar bien la cmara. o Dejar eludir la placa hasta una altura del eluente mayor de 10 cm. o Retirar la placa de la cmara y dejarle secar el eluente bajo cabina de extraccin o estufa de secado. o Observar la placa bajo lmpara de luz ultravioleta (corta/larga). o Revelar la placa con solucin alcohlica de Rodamina al 0.5% o Observar las manchas obtenidas en cuanto a su Rf, color y forma, comparando con los patrones. Deteccin de compuestos de tipo Carbamato y piretrinas o Aplicar esta placa patrones disueltos de carbamatos como: propoxur (BAYGON), carbofuran (FURADAN) carbaryl (SEVIN), metomyl (LANNATE); piretrinas como cipermetrina y deltametrina, entre otras. o Sumergir la placa en una cmara dispuesta con el eluente Hexano:Acetato de etilo (80:20), cerrar bien la cmara. o Dejar eluir la placa hasta una altura de la fase mvil mayor de 10 cm.
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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 o Retirar la placa de la cmara y dejarle secar el eluente bajo la cmara de extraccin o estufa de secado. o Observar la placa bajo lmpara de luz ultravioleta (corta/larga). o Revelar la placa con una solucin de vainillina/H2SO4 o Observar las manchas obtenidas en cuanto a su Rf, color y forma, comparando con los patrones. Deteccin de compuestos organoclorados. o Aplicar en esta placa patrones disueltos de pesticidas organoclorados como: aldrin, dieldrin, endrin (HEXADRIN), chlordano, heptaclor, endosulfan (THIODAN), lindano, DDT: o Sumergir la placa en una cmara dispuesta con el eluente ter de petrleo. o Dejar eluir la placa hasta una altura de la fase mvil mayor de 10 cm. o Retirar la placa de la cmara y dejarle secar el eluente bajo la cmara de extraccin o estufa de secado. o Observar la placa bajo lmpara de luz ultravioleta (corta/larga). o Revelar la placa con solucin alcohlica de Rodamina al 0.5% o Asperjar luego la placa con solucin de Hidrxido de sodio al 4%. o Observar las manchas obtenidas en cuanto a su Rf, color y forma, comparando con los patrones.
Visualizacin de plaguicidas para CCD

Fase mvil Organofosforados Hexano:Acetato de etilo (80:20) Ext. Destilado Ext directa 1. UV-Vis 2. Rodamina(rosados) RF Formas Muestras vs patrn Parathion, Malathion,cloro,rifoscuracron lorsban Carbamatos-piretroides Hexano:Acetato de etilo (80:20) Ext. Destilado Ext directa 1. UV-vis 2. Vainillina/H2SO4 (rosa-violeta-azul) RF Formas Muestras vs patrn Baygon-carbaryl, furaden-lipermetrina, deltametrina
revelador
Patrones
Anlisis al ultravioleta A los extractos que resulten positivos, hacer un barrido espectrofotomtrico ultravioleta entre 200 y 300 nm, utilizando como solvente ter de petrleo o el indicado en la
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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 literatura, de acuerdo al patrn con el cual coincidan las manchas obtenidas en la placa Cromatografa.
Otros sistemas de deteccin

Carbamatos y piretroides Solventes Extractores o Cloroformo: Acetona (1:1) o ter dietilico o Hexano: Acetona (3:1) Reveladores o Vainillina al 5% en cido sulfrico concentrado: Agua (1:1) calentando luego en estufa a 110C por 10 minutos. o 2,6-Dibromoquinona clorimida al 0.5% en ciclohexano, calentando luego en estufa a 110C por 10 minutos. Organofosforados Solventes Extractores o N-Hexano o Hexano: Cloroformo (1:1) o Diclorometano:Acetato de etilo (40:10) Reveladores o KOH al 5% en metanol o NaOH al 5% en metanol, calentando luego la placa por 10 minutos a 110C, observando manchas amarillas. o Cloruro de Paladio al 0.5% en HCl al 10% solo o seguido de aspersin de solucin de KOH al 20% y calentar en estufa por 15 minutos a 100 C. Organoclorados Solventes Extractores o Eter de Petroleo o Hexano Reveladores o KOH 1 N en metanol, calentando a 100C por 10 minutos y observndose manchas de color pardo o Etanolamina calentando a 100C por 10 minutos o KMnO4 0.1 N, observndose manchas amarillas en fondo rosado Fecha Elab: 05/03/2013 Feche Rev: 05/03/2013 Versin 1 Pgina 83 de 85

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 ESPECTROS DE PLAGUICIDAS Carbaryl (Etanol) 279nm
Paraquat (acuosa/medio cido)
257 nm
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Parathion (Etanol)
274 nm
Aldicarb (Acetonitrilo)
249 nm
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Practica # 1: BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO (BPL) Y BIOSEGURIDAD

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Buenas prcticas de laboratorio

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Practica # 2: ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LOS MTODOS ANALTICOS

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Coeficiente de regresin: S X Y Varianza del error experimental total Varianza de la pendiente: S

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Practica # 3: VALIDACIN DE MTODOS CUALITATIVOS

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