sumario

AJH (Ed. Esp.) 2001; 3: 296-301 OCTUBRE 1997-VOL. 10, N. 10, PARTE 2 AJH-

Original

Alteraciones del contenido de calcio y magnesio de las membranas de los hemates en pacientes con hipertensin primaria
Markus Kosch, Martin Hausberg, Gerald Westermann, Jens Kneke, Fritz Matzkies, Karl Heinz Rahn, Klaus Kisters
En la patogenia de la hipertensin primaria se cree que participa un antagonismo celular calcio-magnesio. Se determin el contenido total de calcio y magnesio en plasma, y el contenido intracelular y de la membrana de 39 pacientes con hipertensin esencial (HE) no tratados y 40 sujetos sanos normotensos (NT). Se realizaron las medidas del contenido intracelular y de las membranas de los hemates. Los contenidos de Ca y Mg se midieron por espectroscopia de absorcin atmica y se determin la protena de membrana de acuerdo con el mtodo de Bradford, como punto de referencia de la membrana. No hubo diferencias significativas en las concentraciones plasmticas de Ca (NT: 2,60 0,15 frente a HE: 2,64 0,17 mmol/l) y Mg (NT: 0,83 0,12 frente a HE: 0,87 0,14 mmol/l) en los grupos estudiados. Los contenidos intracelulares de Mg (NT: 1,72 0,15 frente a HE: 1,64 0,19 mmol/l) y Ca (NT: 2,06 0,20 mmol/l frente a HE: 2,10 0,24 mmol/l) tampoco fueron significativamente diferentes entre los grupos. El contenido de Ca de la membrana aument significativamente en el grupo HE (2,23 0,32 mol/g de protena de membrana) en comparacin con los controles (1,05 0,30 mol/g de protena de membrana, p<0,01). Por el contrario, el contenido de Mg de la membrana se redujo significativamente en comparacin con los controles (0,31 0,09 frente a 0,50 0,10 mmol/g de protena de membrana, p<0,01). El cociente Ca/Mg en las membranas aument significativamente en HE en comparacin con los sujetos sanos (p<0,01) y se correlacion con los valores medios de la presin arterial (r=0,47, p<0,01). Concluimos que las alteraciones del metabolismo del Ca y del Mg en la membrana, demostradas por el cociente Ca/Mg en las membranas de los hemates de sujetos hipertensos, pueden desempear algn papel en la patogenia de la hipertensin primaria. Am J Hypertens 2001; 14: 254-8. Palabras clave: Magnesio, calcio, hipertensin primaria, membranas celulares.

as variaciones del metabolismo del magnesio y del calcio se han considerado responsables de la patogenia de la hipertensin primaria1-8. Las concentraciones de magnesio en plasma (Mg) reflejan de forma insuficiente los trastornos del manejo del Mg en los seres humanos, puesto que el contenido de Mg constituye slo un 3% del arsenal completo del Mg corporal. Por lo tanto, en hipertensos esenciales tienen especial inters las concentraciones de magnesio libre e intracelular y de las membranas. La mayora de los estudios confirman que el magnesio citoslico libre est suprimido en la hipertensin, mientras que el

Departamento de Medicina Interna Hipertensin y Nefrologa (MK, MH, GW, JK, FM, KHR), Universidad de Mnster, Mnster, Alemania; Hospital de Santa Ana, Departamento de Medicina Interna (KK), Herne, Alemania

contenido de magnesio total intracelular parece ser invariable3,9-11. Est aumentando el nmero de pruebas que indican que el metabolismo del calcio (Ca) ejerce un papel fundamental en la patogenia de las enfermedades hipertensivas. Algunos investigadores han observado trastornos complejos del metabolismo del calcio en modelos desarrollados en animales, cultivos celulares y en pacientes con hipertensin. El papel del aumento de las concentraciones de calcio libre intracelular en el desarrollo y patogenia de la hipertensin primaria se ha estudiado extensamente12-15. Adems, los resultados de experimentos con animales indican que en ratas hipertensas hay una alteracin del manejo del calcio de la membrana16,17. El influjo del calcio a travs de la membrana celular externa en las clulas del msculo liso y en los miocardiocitos desempea un papel fundamental en el control de la excitacin, contraccin y propagacin de los impulsos celu0895-7061/97/$17.00 PII S0895-7061(97)00327-0

2001 by the American Journal of Hypertension, Ltd. Published by Elsevier Science, Inc.

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TABLA 1. Caractersticas clnicas iniciales de pacientes con hipertensin esencial no tratados y sujetos sanos Sujetos normotensos (n = 40) 45.2 3.8 20 M/20 F 26.4 2.1 89.3 1.8 61.2 2.4 84.9 6.2 Sujetos con hipertensin esencial (n = 39) 46.5 4.5 20 M/19 F 25.8 1.8 125.0 4.2* 60.4 2.6 88.7 6.8

Parmetros Edad (aos DE) Sexo ndice de masa corporal (kg/m2) Presin arterial media (mm Hg) Frecuencia cardiaca (latidos/min) Creatinina srica (mmol/l)
Medias DE * P < 0,01.

lares. Las concentraciones de calcio intracelular se controlan por la unin reversible a protenas especficas ligadoras de calcio. El flujo del calcio a travs de la membrana externa se regula por un antiportador Ca-Mg (Ca++/Mg++-ATPasa), canales de calcio y calcio unido a la membrana18. A estas variaciones del metabolismo del calcio y del magnesio pueden contribuir principalmente una alteracin del transporte transmembrana de Ca y Mg a travs de alguno de los sistemas de transporte de Ca y Mg, cambios de Ca y Mg entre los compartimentos celulares o un antagonismo Ca/Mg. Sin embargo, la mayora de los estudios se han centrado en las concentraciones plasmticas e intracelulares y existen pocos datos sobre los contenidos de Ca y Mg de la membrana. Se estudiaron las concentraciones de Ca y Mg en plasma, y el contenido intracelular y de la membrana, el cociente Ca/Mg y una posible relacin con la presin arterial en pacientes con hipertensin esencial y en sujetos sanos.

siones, usando un esfigmomanmetro automtico (Critikon Dinamap, modelo 1846 SX, Tampa, Florida). Estas determinaciones se hicieron con el paciente sentado. Se valoraron tres veces la PA sistlica y diastlica, dejando un intervalo de al menos tres minutos entre las medidas, despus de que el paciente hubiera descansado en una habitacin tranquila al menos durante cinco minutos. La media de los registros se utiliz para todos los anlisis. Las medidas de la presin arterial se realizaron en todos los pacientes entre las 8 y las 10 de la maana. Medidas del calcio y el magnesio Se determinaron los contenidos totales de Ca y Mg mediante espectroscopia de absorcin atmica (Thermo Jarrell Ash Video 12, Laboratorio de Instrumentacin Thermo Jarrell, Andover, MA) de la forma descrita en otros artculos5,6,8. Se extrajeron 10 a 20 ml de sangre de cada paciente, y se colocaron en tubos heparinizados y despus se centrifugaron a 2.500 g. Despus se extrajo el plasma para realizar las determinaciones de Ca y Mg. Los hemates se lavaron con una solucin isotnica de acetato de litio ajustada a pH 7,4. Se midieron los contenidos totales de Ca y Mg a temperatura ambiente despus de congelar y descongelar el sedimento de los eritrocitos en tubos sin Ca y Mg. Se establecieron curvas de calibracin, usando soluciones con concentraciones conocidas de Ca o Mg en el intervalo inferior, superior o intermedio (Seronorm charge n. 176, Pathonorm H charge n. 21, Pathonorm L charge n. 20, Merck, Darmstadt, Germay)5. Para cada muestra se calcul un valor medio de cinco medidas. El coeficiente de variacin intraensayo para el Ca (Mg) fue 5,3% (4,8%) en diez medidas consecutivas y el coeficiente de variacin interensayo estuvo entre el 6% y el 8% para el Ca y el Mg5,6. Se midi el contenido de Ca y Mg de las membranas de los hemates. Los hemates se lavaron tres veces por sedimentacin en un rotor mvil (2.300 g. durante 10 minutos) y se resuspendi el sedimento en cinco volmenes de solucin salina tamponada con fosfato (150 mmol/l de cloruro sdico y 5 mmol/l de fosfato sdico, pH 8,0). El sobrenadante se aspir cuidadosamente cada vez de la superficie del sedimento. Se inici la hemlisis mezclando rpida y vigoro-

Mtodos
Sujetos Nuestro estudio cumple los principios expuestos en La Declaracin de Helsinki y se realiz de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comit de tica Local de la Universidad de Mnster. Todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio. Se seleccionaron para el estudio 39 sujetos con hipertensin esencial (HE) que acudan al Departamento de Medicina Interna de la Policlnica de la Universidad de Mnster y 40 controles normotensos equiparados en edad y sexo. Los criterios de exclusin fueron diabetes mellitus, antecedentes de enfermedad cardiovascular y enfermedades hepticas o renales. Ninguno de los pacientes ni de los controles recibi medicacin al menos dos semanas antes de comenzar el estudio. En la Tabla 1 se muestran los datos demogrficos y clnicos de los pacientes y de los controles. Determinacin de la presin arterial La presin arterial de todos los pacientes se midi en dos oca-

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Calcio total en la membrana (mol/g PM)

Magnesio total en la membrana (mmol/g PM)

FIGURA 1. Concentraciones totales de calcio y magnesio en las membranas celulares de pacientes con hipertensin esencial (r=-0,58, p<0,01). PM = protena de membrana.

samente 1 ml de concentrado celular con aproximadamente 40 ml de 5 mmol/l de fosfato sdico, pH 8,0. Las membranas fantasma se sedimentaron por centrifugacin a 22.000 g durante diez minutos. Los contenidos de Ca y Mg se determinaron por espectroscopia de absorcin atmica en el lisado para ver las concentraciones intracelulares y en los sedimentos de las membranas fantasma para ver las concentraciones de las membranas y, a partir de entonces, se denominaron contenido de la protena de la membrana. Las medidas del contenido de protena se realizaron usando azul Coomasie (Serva, Deisenhofen, Alemania) segn el mtodo de Bradford19. Despus, los contenidos de Ca y Mg se refirieron a la cantidad de protena de membrana, superando la dificultad de tener distintas cantidades de protenas eritrocitarias y de hematocritos. No hubo diferencias significativas en el peso de las protenas de la membrana (media DE) en los dos grupos estudiados. El contenido de Ca de la membrana despus se expres como micromoles por gramo de protena de membrana, y el Mg como milimoles por gramo de protena de membrana. Anlisis estadsticos Los datos se expresan como medias DE. Se realizaron comparaciones entre los grupos mediante anlisis de varianza usando un test adecuado (Fisher PLSD). Las variables nomi-

nales se compararon mediante el test de 2. Se realizaron anlisis de regresin lineal para valorar la relacin entre el cociente Ca/Mg y la PA. Se consider como significacin estadstica un valor de p de dos ramas < 0,05. El poder del estudio se calcul en cooperacin con el Instituto de Biomatemtica, Universidad de Mnster. Se consider que las diferencias entre grupos del 20% de la media son importantes fisiolgicamente. En estudios anteriores se demostr que las desviaciones estndar del parmetro Ca en algunos grupos estn por debajo del 30% de la media. Para detectar una diferencia de la media del 20% entre los grupos, con un poder del 80% y un error de tipo 1 del 5%, son necesarios 25 pacientes en cada grupo.

Resultados
Se determinaron las concentraciones totales de calcio y magnesio en plasma, y el contenido intracelular y de las membranas (hemates) en 39 pacientes con HE no tratados y en 40 sujetos NT. No hubo diferencias significativas en las concentraciones plasmticas de Ca (NT: 2,60 0,15 mmol/l frente a HE: 2,64 0,17 mmol/l) y de Mg ((NT: 0,83 0,12 mmol/l frente a HE: 0,87 0,14 mmol/l) entre los dos grupos estudiados (medias DE). Tampoco fueron significativamente diferentes entre los sujetos HE y los NT las concentraciones intracelulares de Ca (NT: 2,06 0,20 mmol/l frente a HE:

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12 10 Ca++/Mg++x103 8 6 4 0 0

EH

NT

FIGURA 2. Cociente calcio/magnesio en las membranas celulares de pacientes con hipertensin esencial (HE) frente a los sujetos sanos (NT) (media DE, * p<0,01)

2,10 0,24 mmol/l) y Mg (NT: 1,72 0,15 mmol/l frente a HE: 1,64 0,19 mmol/l). El contenido de Ca de la membrana aument significativamente en los pacientes HE (2,23 0,32 mol/g de protena de membrana) en comparacin con los controles (1,05 0,30 mol/g de protena de membrana, p<0,01). El contenido de Mg de la membrana se redujo significativamente en los pacientes HE en comparacin con los pacientes NT (0,31 0,09 mmol/g frente a 0,50 0,10 mmol/g de contenido de protena de membrana, p<0,01). En el grupo HE hubo una correlacin inversa entre las concentraciones de Ca y Mg de la membrana (r=-0,58, p<0,01) (Figura 1). El cociente Ca/Mg en las membranas aument significativamente en HE (8,2 2,4 x 10-3) comparados con los sujetos sanos (1,60 0,42 x 10-3, p<0,01, Figura 2) y se correlacion con los valores medios de la PA arterial (r=0,47, p<0,01).

Discusin
El papel del Ca en la fisiopatologa de la hipertensin primaria se ha investigado en numerosas ocasiones. En algunos estudios12,15,20-22 se ha demostrado que existe una disfuncin compleja del metabolismo del calcio en la hipertensin. Las concentraciones citoslicas de Ca aumentan en diferentes clulas, incluidas las plaquetas y las clulas del msculo liso en las ratas con hipertensin espontnea (RHE) en comparacin con las ratas normotensas Wistar-Kyoto y en individuos hipertensos en comparacin con normotensos23,24. Un nmero considerable de pacientes con hipertensin muestran anomalas en la homeostasis intralinfoctica del Ca, aunque estas anomalas no se comparten por todos los sujetos hipertensos25. Se ha considerado que la alteracin del manejo y del transporte

del calcio por las membranas plasmticas puede explicar este fenmeno16,17,22,26. Sin embargo, existen pocos datos sobre las concentraciones de calcio en la membrana de seres humanos. De acuerdo con los datos de Resnick y otros4, los nuestros no demostraron diferencias significativas en las concentraciones plasmticas o intraeritrocticas de Ca. Sin embargo, las concentraciones de Ca de la membrana aumentaron significativamente en personas hipertensas en relacin con los controles normotensos (p<0,01). El influjo del calcio a travs de la membrana celular externa desempea un papel fundamental en el control de la excitacin, contraccin, propagacin del impulso y en el metabolismo celular. El gradiente intracelular de Ca se mantiene por la unin reversible a protenas especficas ligadoras de Ca++. El flujo del calcio a travs de la membrana celular externa se regula por una bomba de Ca++ (Ca++-Mg++-ATPasa), canales de Ca++, unin de Ca++ a la membrana celular y protenas ligadoras de Ca++. Por tanto, no slo es interesante conocer las concentraciones de calcio total o libre intracelular, sino tambin el contenido de calcio de la membrana. Resnick27 y Altura y Altura28,29 demostraron el concepto del aumento del cociente Ca/Mg en la hipertensin esencial. De acuerdo con este concepto, nuestros datos indican que hay un descenso significativo del contenido total de Mg de la membrana en el grupo de hipertensos frente a normotensos (p<0,01) y un aumento del cociente Ca/Mg en la membrana en pacientes hipertensos. Nuestros resultados demuestran que es posible que haya un defecto especfico en el transporte o en los sistemas de membrana del Ca o Mg, posiblemente un antagonismo especfico Ca/Mg, que participe en la patogenia de la hipertensin primaria. Nuestros resultados tienen algunas limitaciones. No medimos las concentraciones libres de Ca++ y Mg++, que son la frac-

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cin fisiolgicamente activa del depsito celular de Ca y Mg. Por lo tanto, no puede excluirse segn nuestros datos que las concentraciones intracelulares de Ca y Mg libres estuvieran alteradas en los pacientes estudiados, igual que en los sujetos hipertensos, que fueron estudiados por espectroscopia de resonancia magntica nuclear30,31. Sin embargo, nuestros resultados de espectroscopia de absorcin atmica en las membranas celulares de los hemates, demostraron que haba un aumento significativo de Ca y una disminucin de Mg en sujetos hipertensos comparados con los normotensos. Adems, el uso de los hemates como modelo de concentraciones inicas intracelulares y de membrana tiene algunas limitaciones, puesto que estas clulas carecen de ncleo y de protenas contrctiles. Sin embargo, las variaciones en las membranas de los hemates pueden ser marcadores de los cambios en otras clulas, como las clulas del msculo liso vascular, que influyen directamente en la estructura y funcin vascular. Todava permanece sin esclarecerse si estas alteraciones del Ca y Mg de la membrana son una causa o un resultado de la hipertensin. Se ha descrito que la reduccin de la concentracin de magnesio celular desempea algn papel en el tono vascular en la hipertensin primaria3,4,6. En hipertensos esenciales, Resnick et al4 encontraron un descenso del magnesio libre intracelular en los hemates medido por espectroscopia de resonancia magntica nuclear. De esta forma, una deficiencia del Mg++ intracelular, y posiblemente un defecto de los sistemas de transporte de la membrana celular del Mg++, pueden desempear algn papel en la patogenia de la hipertensin. Los datos experimentales demuestran: 1) que se produce una modificacin de la respuesta a las hormonas vasopresoras por las concentraciones de Mg, y 2) que existe una interaccin con el manejo del Ca celular, puesto que la concentracin extracelular de Mg puede influir en el metabolismo del Ca del msculo liso vascular cambiando el influjo de calcio a travs de la membrana plasmtica, dependiendo de la fosforilacin de la adenosina-monofosfatasa cclica2. Un descenso de las concentraciones intracelulares de Mg++ libre produce una disminucin de las actividades Na+, K+-adenosina trifosfatasa y Ca++-ATPasa y, como corolario, mayor intercambio de Na+Ca++ y mayor concentracin intracelular de Na+ y Ca++ 32. Aunque no medimos las concentraciones de iones libres, estos mecanismos pueden contribuir a las alteraciones observadas del contenido de Ca de la membrana. Sin embargo, debe confirmarse que nosotros observamos asociaciones ms que interacciones entre los cationes. Por tanto, no podemos concluir de nuestros datos que exista una relacin mutua entre el Mg y el Ca. Son necesarios nuevos estudios para confirmar una relacin causal con la hipertensin esencial. En conclusin, estos datos indican que las alteraciones de las concentraciones de Ca y Mg de la membrana, posiblemente por un antagonismo de Ca/Mg, pueden desempear algn papel en la patogenia de la hipertensin primaria. Adems, el aumento del cociente Ca/Mg en sujetos con hipertensin esencial se correlacion con los valores medios de la presin arterial.

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