794

Toxicologa Tabla 56". Principales tenicas espectrofotomtricas

Aplicaciones

volmenes de disolventes o solucionesy, tras un mnimo tratamiento (para concentrar,derivatizar,etc.),se analizan fundamentalmente por cromatografa de gaseso lquida de alta resolucin con diferentesdetectores. En la actualidad se estn desarollando nuevas tcnicas denominadas de microextraccin en fase slida, las cuales en lugar de un cartucho con relleno poroso utilizan un filamento de polidi(de unas 100 um metilsiloxano o cabowax-divinilbenceno de dimetro y 1 cm de largo, aproximadamente),el cual se deja en contacto con la muestra (plasma, saliva, etc.) durante un perodo de tiempo determinado (unos 30 min de promedio) y posteriormentese deja desorberen el inyector de un cromatgrafo, utilizando un dispositivo especial. De esta manera se produce un ahorro importante de tiempo y se reducen los pasosanalticos que realizar.

Tcnicas

Compestos

Espectrofotometra UV visible luorimetra Espectrof infrarroja Espectrofotometra Especkofotometra de atmica absorcin Esoectrometra de masas

Orgnieos Orgnicos Orgnicos Metales Orgnicos

Cuali/cuantitativo Cuali/cuantitativo Cualitativo Cual/cuantitativo Cualitativo

.Ii: TCNNCAS INSTRUMENTALES

En Ia actualidad existe una gran variedad de tcnicas a disposicin del toxiclogo que abarcandesde los clsicos mtodos no instrumentales (reacciones colorimtricas, testsmicrocristalinos,etc.) hasta los mtodosinstrumentales ms sofisticados. En efecto, el anlisis qumico ha experimentadoen los ltimos aos un considerable desarrollo, caracterizado esencialmentepor el empleo de instrumentos,ms o menos complejos, capaces de medir propiedades fsicas o qumicas, que permiten la identificacin y cuantificacin de los compuestosqumicos. Estastcnicasinstrumentales presentan indudables ventajas sobre los mtodos analticos clsicos, aunque tambin tienen ciertas limitaciones que concretansu campo de aplicacin. La Toxicologaforense,por el extensocampo en que se mueve, ha sido una de las disciplinas ms beneficiadas por el desarrollo de las tcnicas analticasinstrumentales, habiendo incorporado muchas de eilas a sus metdicasde trabajo, lo que le permite una simplificacin de los procedimientos de anIisis y un notable incremento de su sensibilidad y precisin. Dados el elevado nmero de tcnicas instrumentales existentes y la complejidad de algunas de eilas, slo se har referenciaa las de mayor utilidad en el anlisis toxicolgico, con una someradescripcin de sus fundamentos y principales aplicaciones.

culas, de maneraque la frecuenciade la absorcinestrelacionada con la diferencia de energaentre el orbital originalmente ocupado por el electrn y el que ocupa despus de ser excitado:
e

hu eEstado fundamental
Estado excitado Vuelta al estado fundamental

Puesto que las transicioneselectrnicasvan acompaade vibracin y rotacin,la das por cambiosen las energas banda de absorcinresulta ms ancha que si slo el electrn estuvieraimplicado en el proceso. Cuando la luz pasaa travs de una solucin que contiene una sustanciacapaz de absorberla,una parte es absorbida, otra, reflejaday el resto, transmitida, como se muestra en el esquemade la figura 56-5. La cantidad de luz absorbida (absorbanciao densidad ptica de la solucin) es proporcional a la concentracin de la solucin y a ia Iongitud del camino recorrido a travs de aqulla. Esta relacin viene definida por la ley de que en la prctica se puede expresarcomo: Lambert-Beer, DO=E.c.l molar de ia solucin, I el camino siendo c la concentracin recorrido por la luz y E el coeficientede absorcinmolar.

T c n i c ae sspectrofotomtnicas
Las tcnicasespectrofotomhicas se basanen la capacidad que tienen las molculas y los tomos de absorberradiaciones de diferente longitud de onda (1,), caracterstica para cada sustancia, utilizando la energa de dichas radiaciones {hu) para producir cambios energticosen su estructura. En los tomos estoscambios se refieren exclusivamente a transiciones electrnicas.En las molculas los cambios energticosson debidos a movimientos electrnicos, as como a movimientos de vibracin y rotacin de ia molcula. Dentro de este grupo destacanlas tcnicasreseadas en la tabla 56-6.
+I --+F

Espectrofotometra

ultravioleta visible

La absorcin de energaradiante por un compuesto orgnico da origen a transiciones electrnicasen las mol-

lo' Fig. 56"5, Paso de la luz a t."uJ de una solucin: oe (espesor paso ptico luz incidente; l, luz transmtida; l, la solucin que atraviesa la luzJ.

Las aplicacionesde estastcnicasderivan del hecho de oue las transicioneselectrnicasen una molcula dan oria determinadaslongen a bandasde absorcinespecficas gitud"s de onda, que pueden ser usadas para la identifiacin de Ia molcula. Sin embargo,como las bandas de absorcin ultravioleta son en general anchas, una misma seal puede ser manifestadapor diferentescompuestos,lo cual dificulia la identificacin de la molcula. Esta tcnica es, pues, slo orientativa, aunque el estudio de la absorcin inespecficaen Ia regin de 200-400nm, junto con Ia observacinde las variaciones que originan en dicha absorcinlos cambios de pH, puede servir para la identificacin aproximada de un problema haciendo uso de los datos tabuladosde que se dispone (tablas56-7 y 56-8). La intensidad de la absorcin,por su parte, es una medida de la concentracinde la entidad absorbentepresente en una muestra.La construccin de curvas de calibra-

permiconocida' de concentracin cin, usandopatrones los problemas. precisa de una cuantificacin te realizar Espectrofluorimetra
Fluorescencia es el proceso de emisin cle luz que de una molcula o toacompaaIa transicin espontnea mo, desdeel estadoexcitado hastael nivel de menor energa. Este proceso de emisin puede ocurrir directamente n un tiempo del orden de 10-s s o a trar'sde un perodo de tiempo mayor (10-3s). En el primer casose llama fuorescencia y en el segundo,fosforescencia. de fluorescenciade un compuestono Las caractersticas son fciles de predecir, aunque en trminos generalesla fluorescencia de un compuesto orgnico depende de: la naturalezadel esqueletocarbonado,Ia disposicin geomtrica de la molcula y el tipo y posicin de los sustituyentes. Sobre esta base se distinguen varios tipos de ensayos fluorimtricos: 1,. Medida de la fluorescencianativa. 2. Induccin qumica de la fluorescencia,la tcnica ms usada en los anlisis fluorimtricos. de uso ms limitado. 3. Inhibicin de la fluorescencia, La espectrofluorimetra presenta dos ventajas fundamentales respecto a los dems mtodos espectrofotomtricos: sensibilidad y especificidad. La gran sensibilidqd es inherente al propio diseo del instrumental utilizado, Por su parte, la especificidad se debe al hecho de que se utilice para la identificacin de una sustanciatanto el mximo de absorcin como la emisin de fluorescencia, frente al miximo de absorcin,que es el nico parmetro conque se emplea en los mtodos espectrofotomtricos vencionales. En el anlisis toxicolgico la espectrofluorimetraencuentra aplicacin en ensayoscualitativos (tabla 56-9) y cuantitativos, de forma semejantea lo visto en la espectrofotometra ultavioleta. Entre las aplicaciones tpicas de la espectrofluorimetra en Toxicologase pueden cita las siguientesdeterminaciones: fenotiacinas, benzodiacepinas, salicilatos, imipramina y derivados, opiceos,alucingenos,etc.

Tebla 5i-?"

Caracteristicasespectrofotomtricas.Grupo de los txicos cidos dbiles

Inm] de absorbancia Mximo p H= 1 3 p H= 1 0 pH<2

Clorpropamida Barbitricos N-metil-derivados 5,5-Disustituidos Paracetamol Fenilbutazona Tiobarbitricos

246 254 257 264 303

246 239 264

,* 237
285

Tabla

5F-8,

Garacteristicas espectrofotomtrcas. Grupo de los txicos bsicos

[nm] de absorcin Mximo Acdo

ct o

o 6 .! 6 '6 .9

6
I

o o

Amitriptilina Nortriptilina Flurazepam Diazepam Clordiazepxido Desipramina Trimipramina Clomipramina lmipramna Orfenadrina Maprotilina Cafena Oxprenolol Mianserna Dihidrocodena Codena Morfina Propranolol Doxepina Nitrazepam Clormetiazol Fenacetina Metacualona Temazepam

239 239 240 (284) 242 (284) 246 (308) 250 250 251 251 264 (258) 272 273 273 279 283 285 285 288 (305,319) 292 280 258 244 234 (26e) 237 (284',1

239 ,:

239 231 262 250

z+zraa)

?ahe

5"9.

Caracteristieas de fluorescencia de algunos txGos rePresentavos

tnm] Excitacin [nm] Emisin pH ptmo o disolvente

,u,
264 (258)
ZT

Txco

273

,uu
287 2 9 0( 3 0 6 , 3 1 S )

283 298

250 244 265 (306) 230 (314)

Amobarbtal Apomorfina Codena Clordiazepxido AflatoxinaB Oxazepam Warfarina LSD Trifluoperacina Sulfxido Quinina Quinidina Morfina

265 270,305 285,245 310 365 360 342,290 320 390 350,250 350,250 245

410 410 350 530 424 475 385 400 410 450 450 350

14 1 , N a O H0 , 1 N SOoHr-etanol Etanol PO4H3-etanol Metanol Metanol

1 1 1

796

Toxicologa ... aire-metano ... aire-gas natural ... aire-hidrgeno

Esp ectrofoto m etr a infra rroj a Es uno de los mtodosms usadospara Ia identificacin de compuestosdesconocidos. Un espectroinfrarrojo puede obtenerseen menos de 2 min y la muestra no es alterada ni destruida. Cada compuesto produce un espectro diferente, de forma que un espectro infrarrojo es equivalente a una <huella dactilar> de la sustancia examinada. Todos los compuestosorgnicosy algunosinorgnicosabsorben luz en la regin infranoja del espectroelectromagntico. Cada grupo funcional qumico tendr unas frecuencias ca,ractersticas que servirn para identificarlos en una sustancia desconocida. Esasfrecuenciascaractersticas se denominan <frecuencias de grupo> y son ejemplos tpicos: OH, NH, CuO, CuN, CiOiC, CuC, NO, etc. Por ello un espectro infrarrojo puede dar con rapide2 informacin sobre la presenciao ausenciade ciertos grupos funcionales,o caractersticas estructurales, presentesen un compuestodesconocido. La aplicacin fundamental de la espectrofotometra infrarroja es el anlisis cualitativo, debiendo utilizarse espectrosde referenciay datos tabuladospara su interpretacin. Aunque el espectro infrarrojo puede ser el mejor mtodo para la identificacin de una sustancia, presentaun doble problema: por un lado, requiere una gran pureza de la muestray, por otro, necesitauna cantidad de muestraalgo elevada,no por falta de sensibilidad de la tcnica,sino por la dificultad en la manipulacin de dicha muestra.Por todo ello, en Ia actualidad el uso de esta tcnica en Toxicologa encuentra su mayor aplicacin en combinacin con la cromatografade gases. Espectrafotometria de absorcin atomica La espectrofotometra de absorcinatmica (EAA) es un mtodo analtico para determinar la concentracinde elementos metlicos en una matriz determinada.Se basa en el hecho de que los tomos en el estado fundamental de cada elementoabsorben luz monocromticaa una longitud de onda caracterstica del elementoen cuestin proporcionalmente al nmero de tomos presentes.Los elementos metlicospresentes en una muestra son reducidos a su estado fundamentalpor el procesode disociacinen la llama (fis.56-0). La energade una Impara de ctodo hueco emite el espectro caractersticodel elemento que nos interesa, que pasa a travs de la llama donde se encuentra disperso el elemento. La energarequerida para obtener la nbe atmica puede conseguirse con la llama, mediante el empleo de mezclasoxidante-combustible. como:

Ms fras

-l .,.aire-acelileno ,., Mas calrentes ... Nro-acetileno J Otra modalidad de trabajo en espectrofotometra de absorcin atmica estrepresentada por el horno de grafito. En este dispositivo la energarequerida para la atomizacin se consiguemediante Ia aplicacin de una diferencia de potencial elctrico a travs de un tubo de grafito, dentro del cual se ha colocado Ia muestra. Sus principales ventajasson la sensibilidady el requerimiento de una mnima cantidad de muestra. Para el anlisis de determinados elementos existen, adems, dispositivos especiales, como el generadorde hidruros, plataforma de L'vov, etc. Las apiicaciones de esta tcnica son tanto cualitativas como cuantitativas, sobrela basede los mismosprincipios descritos para el resto de las tcnicas espectrofotomtricas: la absorcin especficaa una longitud de onda, mediante la utilizacin de una determinadalmpara,para la identificacin de un elementodesconocidoy la intensidad de Ia absorcinpara la determinacin cuantitativa. Espectrometra de masas La espectrometra de masasest relacionadacon la produccin de iones y la subsiguientefragmentacinde las molculas, as como Ia determinacin de Ias razones rnasa/carga(mlz) y Ia abundancia relativa de Ios iones producidos.Por tanto,estrelacionada con una propiedad fundamental de Ia materia, a saber,la verdaderacomposicin molecular, ms que con la absorcin o emisin de luz. Los grupos funcionales de una molcula determinan Ia fragmentacin,de manera que, conociendo la estructura de la molcula, es posible predecir el patrn de la fragmentacin. Inversamente,conociendo el patrn de fragmentacin se puede sugerir una estructura para la molcula original. Adems, Ia tcnica permite determinar el peso molecular, Io que constituye Ia informacin ms valiosa de un espectrode masas, Inicialmente la espectrometrade masasestabarestringida a la determinacinde estructurasde metabolitosy la caracterizacin de compuestosque no podan ser identificadospor los medios convencionales. Pero ello requerael manejo y Ia interpretacin de los datos por especialistas en esta tcnica. La aparicin de grandesbibliotecasde espectros y la disponibilidad de equipos ms asequiblesy fciles de maneiar han permitido Ia utilizacin rutinaria de esta tcnica en los laboratoriosde Toxicologa. Sus aplicaciones son fundamentalmente cualitativas, aunque tambin pueden utilizarse con fines cuantitativos. En ia actualidadla espectrometra de masas, sola o en combinacin con la cromatografa de gases{o la cromatografa lquida de alta resolucin),es con toda probabilidadel mtodo ms efeciivo para la identificacin de txicos y sus metabolitos.La especificidady sensibilidadde estatcnica permiten obtenerun espectrocompleto y, en muchos casos, una identificacinprecisa,con menos de 50 ng de matenai' Las determinaciones cuantitativaspermiten detecciones a nivel de picogramos e incluso fentogramos,aunque en

Solucin M' + A'

+A'
-t

l^
---\ ,.----''

la

El*

Metal en estado fundamental

Fig.

5S"#"

Proceso de disociacinde Ia llama.

Investigacion

toxicolgica

797

como ya se ha dicho, su princilos anlisistoxicolgicos, desconopal aplicacines Ia identificacinde sustancias cidas.

T c n i c ac sf o m a [ o g r f i c a s
puede definirse como la tcnica de seLa cromatografa oaracin de una mezcla de solutos,basadaen la diferente velocidadcon que se mueve cadauno de los componentes por un disolvena travs de un medio poroso, arrastrados te en movimiento. tuvo su origen en ias experienciasque La cromatografa Tswrpt en 1906, consiguiendo seruso realiz el bilogo y cloroparar una serie de pigmentosvegetales(carotenos iilas) sobre un lecho de sulfato clcico depositado en una columna de vidrio, utilizando como eluyente ter de peha experimentado trleo. Desdeentoncesla cromatografa un notable desarrollo. En primer lugar se desarrollla cromatogtafaen papel, en la que la fase estacionariaest constituida por el agua de hidratacin de las fibras de celulosa. Esta tcnica fue superadapor Ia cromotografaen capa.fina [en la que la faJe estacionariaes una delgada capa dispuesta sobre un sopbrteinerte), ms rpida y fcil que Ia anterior, aplicada sobretodo por SrHal,(1958)., y generalizada "En y Javns sustituyeron el lquido eluMaRrlN 1,952, yente por un gas, apareciendoasIa crontatografade ga' ses,tnicaque requeraIa utilizacin de columnas cerratcnicos,innecesadas, as como muchos otros aspectos Desde1952 hasta ahora Ia rios en las tcnicasanteriores' de gasesha tenido un auge vertiginoso, cromatografa imponindoserpidamentecomo tcnica capaz de Ia sepaiacin y cuantificacinde productos suficientemente hasta molculas tan voletiles, desde gasespermanentes convenientey aminocidos, complejas como azcares mente derivados, desanollada ha sido la La ltima tcnica cromatogrfica (CLARI, en Ia que resolucin alta cramatografalquida de de Ia columna a a travs impulsado es eluyertte lquid-o el elevadas. oresiones se distingue: En toda cromatografa puede ser lquida o slida. Faseestacionaria: Fasemvil: puede ser un lquido (un disolvente o o un gas. una mezclade disolventes) clasificarse sobre pueden Las tcnicas cromatogrficas Ia base de diferentescriterios:
o
o

en PaPel' b) Cromatografa en caPa fina. c) Cromatografa 3. Atendiendo a\ tipo de interaccionesentre el soluto v el lecho cromatogrfico: de reParto, a) Cromatografa de adsorcin. b) Cromatografa de intercambio inico. c) Cromatografa de filtracin sobre gel' d) Cromatografa sobrefasesqumicamenteiigadas' e) Cromatografa En la cromotografa de reparto (lquido-iquido) se alcanzaIa separacinentre varios solutos en funcin de sus coeficientei de reparto entre ei eluyente (fasemvil) y un lquido absorbidoo depositadosobrelas partculas slidas con las dei lecho.La velocidadde avanceestrelacionada solubilidadesrelativasen uno y otro medio. Las fuerzasde interaccin son mucho ms dbiles que en la cromatografa de adsorcin e idnticas a las existentesen disolucin: atracciones electrostticasmediante dipolos, fuerzas de dispersin[VaN nanWaals, LoNoon.etc.)' n la cromotografade adsotcin (lquido-slido) el Iecho cromatogrficoest constituido por partculas de un (slica,almina, florisil, adsorbente slido con cpacidad entre las por competencia consigue se separacin La etc.). fuerzas de adsorcin del soluto y el eluyente por el lecho cromatogrfico. Enla cromatografade intetcambio inico se consigue seoarar distintos solutos de naturalezainica, por las distintas iorrrut de interaccin electrostticaentre las cargasdel soIuto y las existentesen ias superficie del lecho cromatogrficon el disoivente. co, en competencia Enla crmatografa de filtracin sobre gel Ia separacin se consigueen funcin del tamao molecuiar de los comoonentesde Ia mezcla, sobte fasesqumicamenteligadas: stees Cromatografa el campo onde la cromatografaha experimentado un mayor desarrollo,en ntima conexin con Ia CLAR' Aunq.r ,u considera cromatografade reparto, dentro de la qnr rt incluye Ia denominada <fasereversa>,en el proceso de separacinparticipan fenmenos de adsorcin, reoarto e intercamblo inico as como efectos de impedimento estricoal paso de las molculas. En la tabla 56-10 se resumen las principales caractersticas de las diferentestcnicas cromatogrficas'

'1..

Cromatografa en columna ICCJ Est introducida en una columna de Fase estacionorio. vidrio cuya longitud depende de ia complejidad de la mezcla qe hay qr.e ttp"t"t. El tamao de -la columna deoende tambin de la cantidad de muestra (fig' 56-7)' Fase mvi1. Normalmente es un disoivente orgnico, depenaunquetambin pueden usarsesolucionesacuosas, y de las sustanciasque van diendo de la fase estacionaria a ser analizadas.Su utilizacin en el anlisis toxicolgico se reduce a la extracciny purificacin de los extractos' Cromatografa en PaPel [CP) Es similar a la anterior: la fase estacionariaest sostenida agua;esto puede modificarpor el papei y es, generalmente, u otras sustanciasinsolusales con rr i*pt"gtt"ttdo ef papei

c o

6 a

a
o

I
a a a

o
o

L. Atendiendo a Ia naturaleza de la fase mvi) y la fose eslacionaria: a) Cromatografalquida: - Cromatografa lquido-Iquido. - Cromatografa lquido-slido. gaseosa: b) Cromatografa - Cromatografa gas-lquido, - Cromatografa gas-slido. 2. Atendiendo aI tipo de soporte sobre el que se disoone la fase estacionaria: en columnal l Cromatografa - Convencional. - Gases' - CLAR.

794

Toxicologa Tabls 5-*" Principales caractersticas de las diferentes tcncas cromatogrficas

Faseestacionara Interaccin soluto-lecho Vent6as
lnc0nvententes

Cnomatografa

Fase mvil

En columna(CC)

Lquido

Slido Lquido

Adsorcin Reparto lntercambio inico Exclusin nrolecular Reparto

Equipoy espacios mnimos Facilidad de operacin

Pocaeficacia Muchamuestra Lentilud

En papel (CP)

Lquido

Lquido

Poca muestra Sencillez Rapidez Sencillez Buenaresolucin Especificidad Equipoy espacio mnimos personal No requiere especializado Rapidez Excelente resolucin y cuantldentificacin ficacin Poca muestra

Mala resolucin Lenla Diiicultad en la cuantificacin

En capa fina (CCF)

Lquido

Lquido Slido

Reparto Adsorcin Intercambio inico Exclusin molecular

De gases (GLC)

ud5

(a presin)

Lquido Slido

Reparto Adsorcin

Equipocostoso personal Requiere especializado No aplicable a sustancias alterables trmicamente o de PM elevado Equipocostoso personal Requiere especializado

Lquidade alta resolucin (CLAR)

Lquido (a presin)

Slido Lquido

Reparto Adsorcin Intercambio inico Exclusin molecular Fasesqumicamente ligadas

Las de GLC y, adems: Mayor rapidez Mejorresolucin Aplicable a mayor nmerode sustancias

bles en agua. La fase mvil se sita en la cubeta de desarroIlo. La muesha se coloca sobre una lnea trazadaen uno de los extremosdel papel. Se colocanmanchasde 1-10rl (contenido ptimo de muestra:1-10 pd. Las machas de muestra se secancon una corriente de aire caliente (sirve para ello

Adsorbente (almina, slica gel, florisil. almidn, sephadex, sacarosa)

Faseestacionaria
Cambiador inico

un secadorde pelo) y a continuacinse introducela muestra en la cubeta que contiene la fase mvil, sujetrndolaadecuadamentepara que se mantengaen posicin vertical. La fase mvil discurre por el papel por capilaridad y por efecto de la gravedad,en el caso de la cromatografa Los en papel <descendente>, originando as Ia separacin. componentesde la mezcla, de acuerdo con su coeficiente de particin, se mueven a una velocidad ms baja de Ia que io hace el frente de disolvente.Es deseable que la temperatura se mantengaen un rango de + 3'C. El tiempo de desarollo vara con el disolvente usado y la medida del papel; normalmentees de 12 a 18 h. Finalizado el desarrollo, se secala hoja de papel y se procedea iocalizarlas manchasmedianteluz ultravioletao con reveladoresapropiados.[Jna vez localizadaslas manchas, pueden recortarse o eluirse y utilizar el eluato para corroborar la identidad de la sustancia. Cromatografa en capa fina ICCFJ Esta variedad es particularmente adecuadapara cualquier laboratorio, grndeo pequeo,por su rapidez,facilidad de operacin, buena resoiucin y especificidad' Adems,requiereun equipo y espaciomnimos,no se ney permite la determinacion cesitapersonalespecializado simultnea de varias muestras.Et l.tttuexcelentesolucin intermedia entre la cromatografaen papel (ms barata,

Algodn o filtro poroso

trEg.

S9"3,

Cromatografa en columna: sus cornponentes.

pero que requiere mucho tiempo para su realizacin) y la iromatografade gases(ms sensible,pero ms cara). en capa fina es semejante a Ia cromatoLa cromatografa Aqu se utiliza una fina grafaen papel en muchos aspectos. que se aplica sobreuna piaca de vidrio capade adsorbente puede llevar una o polister.La capa fina (faseestacionaria) como sulfato cicico, que asegureIa fijacin del sustancia, material sobre el soporte. El adsorbentepuede contener tambin compuestos orgnicos fluorescentesque sirven como indicadoresde la presenciade sustanciasincoloras. puede secarse al aire o a temperatuLa capa de adsorbente ra elevada,si necesitacalor para su activacin. La aplicacin de la muestray el desarrolloen una cubeta se hacen en papel (fig. 56-8),El como en el casode Ia cromatografa desarrollose consigueen 45-90min. Una vez secaia placa, las manchaspor mtodos fsicos o qupueden detectarse micos. Un aspectoque hay que destacaren la cromatografaen capa fina es su gran capacidad para separar sustancias procedentes de artefactos bioigicos que son extrados por los procedimientosde extraccin.Otro conjuntamente de sus atributos es la seguridadque ofrece al analista:si el resultadoes negativo, esta informacin puede ser tan significativa como un resultado positivo. 1, Factoresimplicados en la cromatogt'afaen capa fina: slica gel {esel material de eleccin a) Adsorbentes: en Toxicologa),almina (xido de aluminio), silicato magnkieselguhr(tierra de diatomeasJ, sephadex,celulosa. sico, resinascambiadoras, b) Ligantes:sulfato clcico,aimidn, carboximetilcelulosa. c) Colocacinde la muestra:extractosde la muestra en etanol, cloroformo, acetonao ter. Aplicacin con tubo capiiar o micropipeta. Las muestrasse coloca unos 2 cm por encima del borde de la placa, procurando que Ia mancha no supere un dimetro de 5 mm. d) Desarrollo: unos 10-12 cm. Las placas suelen ser de 20 x 20 cm, que se desarrollan en cubeIas de 22 x 22 x 4 cm. Se necesitaun voiumen de disolvente de 100 ml. 2. Localizacinde Lasmanchas.Una vez secala placa, conse examinaa la luz ultravioleta:si el adsorbente o despusde puivetena un indicador fluorescente,

rizar con spray de fluorescena,se pueclendetectar muestras;otras sustanciasabsorben la luz aigr,rnas ultravioleta indicando as su presencia.Existe un elevado nmero de reveladorespara cromatografa en capa fina, entre los que se pueden destacar:
a)

Luz LIV (254 nm -absorcin-

y 360 nm -fluorescencia-).

b ) Reveladores especficos de grupos:

Txicos cidos y neutros: . Acido diluido [SO4H, 2 N) + UV - 360 = fluorescencia amarllla (benzodiacepinas). . Vapores de amonaco + UV 254 = manchas azul violeta (babitricosJ. c Reactivo mercurio/difenilcarbazona + ca.lor = manchas azul violeta (barbitricos). . o-Dimetilaminobenzaldehdo+calor = manchas amaiillas fcarbamatos). o Vapores de ClH + furfural = manchas negras (carba-

matosl. Txicosbsicos: . Ninhidrina = manchasrosadas{aminas). . SO.H, al s % = manchas azul-verde (fenotiacinas)o fluorescenciaamariila (benzodiacepinas), o UV-360 nm = fluorescenciaazul (quinina y quiriidina). Reactivo de Dragendorf= manchas naranja (benzodiacepinas)o marrn roiizo (alcaloides). . Yodoplatinato= manchasmarn rojizo (general). ' Reactivo de Folin = manchasazules (compuestosfenlicos).

3.

se Despus de cada pulverizacin Identificacin anotan las Rf de las manchas que aparecen, as como el color, que constituyen la base de la identificacin. La Rf (<relacin frontal>) se define como el cociente entre la distancia recorrida por la mancha problema y la que ha recorrido el frente del disolvente (Rf = Rx/Rs, fig. 56-8). No siempre es posible la identificacin absoluta por cromatografa en capa fina, lo que hace aconsejable determinar los valores de Rf con dos o tres sistemas de disolventes. En las tablas 56-11 y 56-1,2 se muestran algunos de los sistemas de cromatografa en capa fina para los diferentes grupos de txicos.

TsbEe

Sistemas de cromatografa en capa fina *ffi" e '! " Bara txicos cidos V neutros
Fase eslacionana Apicdciones

Fasemvilfvlvl

o11 i
:9
d ,! o f

Cloroformo/ acetona, 80:20

-\*-Placafina

lr r"""r'".-lI
.E o

lsopropanol/ cloroformo Amonaco 0,88 45:45:10 Cloroformo/ '| acetona,90: 0

Slicagel G activadaa 120 "C/30 min Desarrollo: cm 30 mn/10 Como el anteror Desarrollo: 45-60 min Como el anteror Desarrollo: 30-45 min Como el anteror

Todoslos tipos

Barbitricos

Anticonvulsivos no barbiticos Sedantes Analgsicos

Solvente
b u i z' * Fatrones. Froblemas

A8C

XYZ

A8C
Patoncs

XYZ
Problemas

o a

FEg. S#"#.

Gromatografa en capa fina. Aplicacin de la rnuestra y desarrollo,

cido aciico/ benceno/ter etlico/metanol, 18:120:20:1 Como el anterior Acetatode etilo

Anticonvulsivos no barbitricos Sedantes

clo

Toxicologa Sistemas de cromatografia en capa fina para txcos bsicos

Fase estacionania Pretfatamiento

TmbFs ffi*"t,

Fasemvil[v/v]

Cloroformo/ 4:1 metanol, Metanoli amonaco 0,88, 100:1,5 Metanol n-Butanol/cido ctricoal 5 %, 9:1

Slicagel (15-20min)

Sumergirlas placas en sosa metanlica

Slicagel

gel Slica Celulosa

lgual que cloroformo/melanol Sumergir/ pulverizar las placascon ctrato monosdico al 5 "/"

Cromatografa de gases IGLC] En estesistemaia fasemvil es un gas inerte (hidrgeno, argn, nitrgeno) que fluye a travs de una columna que contiene la faseestacionaria; sta puede ser un adsorbente (cromatografa gas-slido) o un soporteinerte recubiertopor un lquido relativamente poco voltil (cromatografagas-lquido). El tubo de la columna tiene entre 3 y 6 mm de dimetro y puede ser de cobre,aluminio, aceroinoxidable,vidrio o cuarzo.Est lleno de un soporte finamente tamizado que puede habersido lavado con un cido o una basey tra-

tado con un silano como el hexametildisilazano Darareducir los sitios de absorcin. La silanizacinreemplza los hidrgenosdel soportepor el radical trimetil-silil. El soporte, tratado o no, est recubierto con una fase estacionariaadecuada. Paragases y solutosno polaresde alta volatilidad puede usarse crornatografagas-slido. As no se requiere ningn lquido sobre la gran rea superficiai del adsorbentede reileno. Tcnicasrecientes han eliminado la necesidad de empaqueta-r con un soporteslido, al utilizar un tubo capilar cuyas paredes estn recubiertas con la fase estacionarialquida. La columna es solamenteuna parte del sistemacromatogrfico. La unidad debe disponer, adems,de un horno perfectamenteregulado que albergue la columna; un in* yector a travs del cual se pueda introducir la muestra en ia coiumna; un detector {tambin con temperaturaregulable); un medio de programar y regular el flujo de la fase mvil y cuaiquier otro gas que pueda necesitarel detector, y un medio adecuadopara amplificar y registrar aquello que el detector <descubre> en el efluente (fig. 56-3). En la prctica se introduce una muestra en el inyector, donde es volatilizada inmediatamentey de donde es recogida por ei gas portador y transportadaa travs de la columna. Los componentesde la mezcla se mueven a travs de la columna a velocidadesdistintas que dependende su volatilidad relativa y su solubilidad en la faseestacionaria. Los componentesms solubles son retenidos ms tiempo y los menos soiubles atraviesancon en ia faseestacionaria mayor rapidez la columna.

Bloquede inyeccin

Columna de separacin

Registrador

Detector
Amplificador

Salida de

Introduccn de la mustra

Gas vector A = Horno del bloque de inyeccin B = Horno dg la columna de separacin

trEg" #ffi-S.

Esquema de r-rnequipo de crornatografa de gases.

Investi gacin La resolucin, es decir, la separacin de los componentes de una mezcla, es funcin de: 1. 2. 3. 4. 5. Longitud y dimetro de la columna. Soporte especfico y concentracin de la fase estacionaria. Naturaleza y velocidad del gas portador. Tamao de ia muestra' Propiedades fsicas y qumicas de los componentes de la mezcla.

toxicolgica

E3Ol

Cada componente de la mezcla es detectado a un tiempo especfico y caracterstico en unas determinadas condiilon"r de trabajo {tiempo de rctencin, TR). El tiempo de retencin es equivalente a la Rf en cromatografa en capa fina y se define como el tiempo transcurrido desde la introduccin de una muestra en la columna hasta que sale de ella y es detectada. La deteccin de la seal puede conseguirse con varios tipos de detectores: L. 2. 3. 4. De De De De conductividad trmica (TCD). ionizacin de llama (FID). captura electrnica (ECD). nitrgeno-fsforo (NPD).

La gran cantidad de fases estacionarias disponibles y ia posibilidad de trabajar a distintas temperaturas permiten su aplicacin a la casi totalidad de las sustancias con que se plede encontrar el toxiclogo. La limitacin inicial de su plicacin, exclusiva para las sustancias volatilizables, se h solventado con la posibilidad adicional de obtener derivados voltiles para aquellas sustancias que no lo son en principio, mediante la adicin de un reactivo que forma un compuesto intermedio voltil (proceso de derivacin). Esto, junto a la utilizacin de distintos tipos de detectores, hace su aplicacin prcticamente universal' A pesar de la gran variedad de fases estacionarias de qne r dispone en el mercado, las caractersticas fisicoqumicas de los .omprestos ms frecuentemente implicados en los anlisis toxicolgicos permiten cubrir un amplio espectro de necesidades con unas pocas fases estacionarias, umentando as la versatilidad de Ia tcnica con las ventajas econmicas y tcnicas derivadas de utilizar unas pocas condiciones analticas para la determinacin de un gran nmero de txicos. En la tabla 56-13 se recogen algunas aplicaciones de las fases estacionarias ms usuales. Cromatografa lquida de alta resolucn \CARI

Posteriormente, Ia seal es amplificada electrnicamente y registrada como una serie de picos, obtenindose as un cromatograma. El anlisis cualitativo se basa en los tiempos de retenin de cada pico, mientras que Ia intensidad de la seal (en irea de pico o altura de pico) es funcin de la concentracin de cada componente. As es posible la cuantificacin mediante ia utilizacin de patrones de concentracin conocida, en cualquiera de las modalidades normalmente empleadas (patrn interno, curva de calibracin)' La cromatografa de gases representa sin duda una de las ms impoitantes herramientas con que ha contado el analista desde su introduccin hasta nuestros das' Sus aplicaciones al anlisis cualitativo y cuantitativo son muy .rr,-urot"t, habiendo desplazado las otras tcnicas cromatogrficas por las ventaias que presenta. La precisin de un anlisis por cromatografa de Sases se sita por trmino medio aliededor de +2o/o, con un lmite de sensibilidad de aproximadamente 1-5 Pg/ml'

La diferencia esencial entre la cromatografa lquida de alta resolucin y la cromatografa en columna convencional es nicamente de tecnologa y de conocimiento de los parmetros que gobiernan Ia separacin. EI cromatgrafo lquido es prcticamente igual que eI cromatgrafo d" g"t.t, con la salvedad de sustituir la botella de gas a presin (fase mvil) por un sistema de impulsin e liquido (bomba) y de que el sistema de inyeciitt 1"*u.u de vaporizacin en cromatografa de gases) es un simple introductor de muestras en cromatografa lquida. Presentan en comn: la columna permanente y reutilizable de alta eficacia, el sistema de termostatizacin de la columna (no imprescindible en CLAR), la circulacin continua de eluyenie, la deteccin e4 continuo a nivel de microgramo de ios solutos eluidos y la visualizacin grfica del resultado en el <cromatograma>. El tratamiento cuaIitativo y cuantitativo es esencialmente idntico. La precisin es mayor en la cromatografa lquida. La diferencia bsica est en su utilidad'

Tebl*

F#-tG"

Fases estacionarias utilizadas en cromatografia de gases y principales aplicaciones

lmitet"Cl Temperctura

=
c I o '6 .N o d c .g o o

estaconarlas Fases

I rpo

Aplicaciones

I @

o a
a

L al 10 %-KOHal 10 % Apiezon al 10 % Carbowax al 0,2"k Carbowax Dexsil 300 al 5 % OV-1 al 3 % OV-17al 3 "/" al 3"/" OV-210 PPE-20al 3 % QF-1al 3 % SE-30al 3 % al 10 % Escualeno XE-60al 3 %

Hidrocarburo Poliglicol Poligicol Silicona Metil-silicona al 50 "k Fenil-silicona luoropropil-slicona Trif PolifeniFter luoropropil-silicona Trif Metil-silicona Ciano-silicona

50 60 40 50 100 0 0 125 0 100 20 0

250 259 150 450

2trn J3U

275 375 250 300 100 225

Apolar Polar Polar Intermedia Apolar Apolar Polar lntermedia Polar Apolar Apolar Polar

Anfetaminas Uso general de C1-Clo Compuestos Uso general Uso general Uso general Uso general Txicos cidos Uso general Uso general Hidrocarburos Uso general

EclP

Toxicologa Tabla 56-54. Aplicaciones de la cromaografia lquida de alta resoluein

Txcos detectados

Con la cromatografa gas-lquido(GCL)podemos separar eficazmenteaquellas sustanciasque posean una presin de vapor suficiente, sin sobrepasar los 350 "C y sin sufrir descomposicintrmica apreciable. La cromatografalquida es aplicable, en general, a aquellas sustanciasque poseanun peso molecular medio o alto (> 2S0 hasta 106). Ambas tcnicasposeensu zona exclusiva: 'L. Gasespermanentes y sustanciasvoltiles: GLC. 2. Compuestos de alto pesomolecular y polares:CLAR. No obstante,existe una gran zona intermedia de solapamiento de ambastcnicas,En esta parte la cromatograffalquida poseela gran ventaia de poder aplicarsea todas aquellas sustancias susceptibles de alterarsetrmicamente,permitiendo en generalseparaciones mucho ms rpidas de grupos de sustancias dispersasdesdeel punto de vista funcional. La cromatografalquida proporciona mayor precisin, mejor resolucin y menor tiempo de anlisis. Otras ventaias seran: No destruyela muestra,lo que permite la deteccin por distintos sistemasdispuestosen serie e incluso su combinacin con otras tcnicas, 2. Requieremnima preparacinde las muestrasy utiliza pequeascantidadesde stas. Entre las distintas modalidades de cromatografalquida de alta resolucin, la cromatografa sobrc fases qumicamente ligadas es capaz de resolver ms del 90 % de los problemas analticos,de los cuales el B0 % se resuelven en <fasereversa>(faseestacionaraapolar/fasemvil polar). Debido a su gran facilidad de manejo, crecientecampo de aplicacin, mnimo nmero de eluyentes a escogery reproductibilidad superior, se est imponiendo a otras tcnicas cromatogrficas. Los cuatro detectoresms usados en CLAR son los de ndice de refraccin,ultravioleta, de fluorescenciay electroqumico. De ellos, ios ms empleados son e1 detector ultravioleta de longitud de onda variable y el detector de fluorescencia. Varias razones importantes justifican esta amplia utilizacin: 1. Compatibilidad con una amplia gama de eluyentes. 2. Posibilidad de seleccionar distintas longitudes de onda para conseguir deteccionesms sensiblesy/o especficas. 3. Excelenterespuestay facilidad de manejo. La mayora de los compuestos orgnicos pueden ser analizadoscon el detector UV de longitud de onda variable. La posibilidad de utilizar estosdetectores en el UV lesu utilidad iano (195-210nm) extiende considerablemente para la deteccin. Para aquelloscompuestosque exhiben fluorescencianativa o pueden presentarlaobteniendo sus derivados fluorescentesadecuados,la deteccin por fluorescenciaes la ms sensible.La aplicacin de esta tcnica est ganando aceptacincomo resultado de los numerosostrabajos que se vienen desarrollandosobremtodos de modificacin de Ias sustancias, antes o despusde la separacin,para obtener los fluorforos correspondientes. En la tabla56-14se indican algunas aplicaciones tpicasde la cromatografa iquida de alta resolucin en Toxicologa. ')..

Fase reversa RP-8/C-18

UV/FL

Analgsicos,antiasmticos, anticonvulsivos, antidepresivos tricclicos, cidovalproico, antihipertensivos, antiinflamatoros,benzodiazepnas, diurticos, sedantes, estimulantes, antibticos, hipoglucemantes orales,etc.

Fasenormal SlicaB-5 Intercambio inico

porfirinas, tricclicos, UV/FL Antidepresivos etc.

UV

Paraquat

FL, detector de fluorescencia;UV detector ultravioleta-

,N TCNICAS INMUNOGUM ICAS

Todas ellas se basanen los procedimientosinmunoqumicos clsicosy utilizan como principio analtico la reaccin antgeno-anticuerpo. Utilizan un complejo antgenoanticuerpo, donde el antgeno es el txico convenientemente marcado. El ensayoconsisteen el desplazamiento competitivo del txico marcado del complejo antgeno-anticuerpo por el txico libre presente en la muestra analizada. El txico marcado, Iiberado al medio, se utiliza para determinar la presencia y/o concentracin del txico presente en la muestra problema (fig. 56-10). Los mtodos inmunoqumicos ms importantes para el anlisis de txicos son: 1,. Radioinmunoanlisis. 2. Enzimoinmunoanlisis. 3. Inhibicin de la hemaglutinacin. Radioinmu noa nlis is IRIA] Estatcnicautiliza un txico marcadocon un istoporadiactivo, como I12s, Ctno Ht. En el ensayose equilibra una mezcla que contieneanticuerpo{Ac), txico marcado(Ag*) y txico no marcado.Ei complejo anticuerpo-txicoes separado por precipitacin. El txico marcado <liberado>

\Txico marcado
Txics libre lxico marcado +AC --+TxiceAc libre \ Txco marcado

F;g.

5"-G.

Fundamento de las tcnicas inmunoqulmtcas.

Investigacin

toxicolglca

E|CIB

donde se determinasu conen el sobrenadante, ermanece por medicin de la radiactividad (fig' 56-11)' Lentracin --La principal ventaia del RIA es su gran sensibilidad' udemsde poder aplicarsea muestrasmuy variadas' Enzimoinmunoanliss(EMlTl Esta tcnica utiliza txicos marcados con lisozima' enLa zima capazde lisar las paredes celulares.bacterianas' el con la unin por afecta se no lisozima la activida de txico, pero su centro activo no es asequible al sustrato en la muestra probleiitg s-izl. El txico libre presente un lo cual se produc-e con marcado, *i drtpl""u el txico manifiesta que se enzimtica actividad la de ir"r"*ttto ptica (DO) de.las soluciones' for cambiosen Ia densidad no hay txico' la densiproblema brrando en la muestra no cambia esencialreaccin de mezcl la de JuJ-opti"" indicando poca o ninguna actividad enzimtica' mente, gluAdems de la liiozima se utiliza como marcador la interfe(G6P-DH)' La coru-o-forfuto-deshidrogenasa .posible rencia de la GOP-DHsrica se previene utilizando NAD*' q"" fo".io"u slo con la G6P-DHbacterianausada en el ensayo. 'Esta tcnica puede aplicarse directamentesobre orina o pfut*", e incluso tamtin sobre extractos de materiales sus LlolOgi.o, como sangre,tejidos, etc', aumentando as tabletas' pldoras' como materiales, Otros apliciciones. p""a"" analizarsetambin con EMIT disolvindolos "i"prevmente en el tampn utilizado en el ensayo' tnhibicin de la hemaglutinacin |HJ El marcador utilizado en este sistema est constituido por glbulos rojos estabilizadosmediante tratamiento con iorm"aldehdo1iig. so-ra). En ausenciadel toxico' los eritrocitos que han iido sensibilizadoscon dicho compuesto (antitxicos)y ,"u..io.rn con los anticuerpos especficos fondo de la el en uniforme r"-p.oa"." una aglutinacin

c%-+%+w +l
% Txicolibre

f A"l

fAd

,-\Txicomareado

Badiactvidad

tr!g, 5G-1tr "

(RIAJ' Radioinmunoanlisis

(r {
\
@

h ;u"lt%"

o3

o
Txico libre (problema)

/\

N-d Enzimainactiva
Sustrato

A \n

\ /nc\

{f

1 "g
Enzima actva Destruccindel sustrato Cambioen la DO

del Desplazamiento txico marcadoPor el txico libre

Fig" 5S"1P'

IEMIT)' Enzimoinmunoanlisis

Eritrocitos sensibilizados

o = o

Di-* %
Anticuerpo

Aglutinacin

@
rl
I

o '6

''6 ,9 o o

M
..4

Eritroctos

f-"---Yta-/1l t-l

I
a

o o

Txico

lnhibicin de,a hemaglutinxin

Fig.

5"f 3"

Inhibicin de la hemaglutinacin(lHl'

Eto4

Toxieologa

ampolla en la que se lleva a cabo la reaccin.Si Ia muestra problema contiene el txico, ste se une al anticuerpo impidiendo la unin con los glbulos rojos sensibilizados, que de esta manera sedimentany forman un <anillo> caractersticoen el fondo de Ia amoolla. La aplicacin de estastcnicases tanto cualitativa como cuantitativa, mediante la utilizacin de patrones de concentracinconocida.El mayor defectode los inmunoanlisis es la falta de especificidad,con posibilidad de reacciopor lo que requierensiemprela confirmacin nes cruzadas, por otras tcnicas alternativas.Esto es especiaimenteimportante en muestrasde intersjudicial. Otro inconveniente es el elevado coste de los reactivosutilizados en estos ensayos. Por el contrario, su gran rapidez y sensibilidadhacen de estastcnicas el mtodo de eleccin para el screeningde gran nmero de muestras,en situacionesconcretas.