Sunteți pe pagina 1din 47

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJNAPOCA

Micropropagare
Notite de curs

Cluj-Napoca 2010

INTRODUCERE
Cursul de Microprpropagare i i propune s asigure concepte i elemente de practic pentru studenii acestui curs.

Obiectivele propuse:

s discute importana i potenialul culturilor de celule i esuturi ca metodologie de multiplicare i producere a materialului vegetal; s identifice i s aplice teoriile fundamentale ale tehnicilor i sistemelor de cultur in vitro n funcie de diferite specii vegetale sau condiii de producie; dobndirea capacitilor teoretice i practice pentru realizarea unor culturi de celule i esuturi vegetale simple dar eficiente, n condiii de laborator; nsuirea unui limbaj de specialitate care s permit comunicarea n cazul unor discuii cu caracter experimental sau tiinific, n cazul necesitii achiziionrii unor echipamente i consumabile specifice, care presupun identificarea, studierea i cumprarea din surse specializate (firme productoare de chimicale/ echipamente, cutarea surselor de informare pe internet sau cri i reviste de specialitate)

NOT: La activitile de laborator este necesar purtarea unui halat de protecie. Fumatul i consumul de alimente n laborator sunt STRICT interzise.

1. Noiuni introductive n cultura in vitro


Cultura de esuturi vegetale este tiina (sau arta) cultivrii celulelor, esuturilor sau a organelor vegetale izolate din planta mam, pe un mediu artificial. Noiunea de cultur de esuturi vegetale este sinonim cu cultura in vitro (n sticl) i se refer la: Cultura in vitro (n sticl) se refer la: 1. Cultura n condiii aseptice a unor: Organisme

Organe esuturi Celule, suspensii celulare Protoplaste Organite celulare, etc. Cultura aseptic (axenic) Lips de contaminare (bacterii, ciuperci, virusuri, drojdii) Mediu sterilizat Lipsit de microorganisme Suport nutritiv artificial (mediu lichid, semilichid solid, etc.) Fizice (temperatur, lumin, umiditate)

2. Cultura n condiii controlate:

Condiii controlate de cultur


-

3. Cultura care se practic n recipiente de sticl sau plastic special Cultura in vivo (n via) se refer la: 1. Evoluia n condiii naturale, septice. Cultura ex vitro (afar din sticl) se refer la:
1.

Reluarea activitii n condiii naturale (prin aclimatizare) n urma culturii in vitro.

Ali termeni utilizai n culturile de esuturi: Calus in vivo esut cicatrizant, cu rol de aprare in vitro esut nedifereniat, neorganizat, cu cretere nelimitat, format n urma diviziunii dezorganizate a celulelor sub influena unei auxine Calusogenez Caulogenez Citogenez Clona formarea calusului. formarea de lstari (stimulat de citochinine). difereniere de structuri celulare noi. copie perfect din punct de vedere genetic a plantei din care provine explantul iniial.

Clonarea

nmulirea asexuat, fr fecundare, prin mitoze succesive n care, pe baza totipotenei celulare, se obin indivizi identici cu planta mam. mrirea cantitativ i ireversibil a numrului de elemente constitutive care alctuiesc planta, organul, esutul. reversia progresiv a celulelor nespecializate de tip calus specializate spre celule

Creterea Dedifereniere celular Dediferenierea tisular Dezvoltarea

ncepe de la un esut specializat care ndeplinete o anumit funcie i care i oprete creterea.fiind transformat n esut meristematic, care se nmulete. totalitatea schimbrilor cantitative (creterea) i calitative, reprezentate de diferenierea celular pe care le sufer planta de la faza de embrion pn la maturitate. pierderea progresiv a caracterelor morfologice i citologice a celulei embrionare i dobndirea de caractere adulte urmate de ncetarea diviziunii celulare. meristem tipic, 0,1mm, n form de cupol. embrioni somatici formai direct din ali embrioni sau organe formai de gametofilul mascul (microspori, grunciori de polen) formai din celule ou nefertilizate Formai din alte celule dect cele zigotice formai de celulele sporofitice, cu excepia zigotului Formai prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului fragment de organ sau esut iniial, utilizat n cultura in vitro. detaarea din planta mam a unui fragment mare de esut foliar, radicular, internod, nod, boboc, mugure. inserarea in vitro a unui fragment de plant pe un alt esut.

Difereniere celular

Dom meristematic Embrioni adventivi Embrioni androgenetici Embrioni partenogenetici Embrioni somatici Embrioni somatici Embrioni zigotici Explant Explantarea Implantare

Implantul Linia celular Meristem

fragmentul de esut (recalcitrant) cultivat in vitro pe un alt esut. reprezint o clonare perfect, fiind descendena unei singure celule. formaiune tisular format din celule n diviziune mitotic, care poate forma toate categoriile de esuturi i organe, inclusiv planta ntreag. terminale, axilare (la baza frunzei sau bracteelor), adventive (se pot forma n zone internodale, pe explante din frunz sau rdcin, etc.) meristemele (radiculare sau caulinare) formate in vitro pe un calus i sunt forme particulare de meristeme adventive (sau apicale)- definesc axa plantei terminale, laterale, adventive (induc formarea rdcinilor pe alte organe dect rdcina- explante caulinare, foliare, etc.) (1) dezvoltarea ontologic a esuturilor difereniate. (2) dezvoltarea unei structuri organizate, dintr-un esut neorganizat termenul a fost introdus n anul 1966 de ctre Torrey i definete o structur morfogenic plastic, sferic, format din 6-24 celule nespecializate mici, izodiametrice, cu perete celular subire, fr vacuole, cu nuclei mari i citoplasm foarte dens, capabile s se dezvolte n diferite tipuri de celule primordiale. Sunt localizai n alte pri dect n meristeme. zona localizat a diviziunii celulare continue (micronmulire,micromultiplicare) tehnic de nmulire vegetativ in vitro, n mediu artificial, aseptic, prin care se obin plante identice cu planta mam.

Meristeme caulinare

Meristeme neoformate Meristeme primare Meristeme radiculare Morfogenez Meristemoizi

Meristemul Micropropagare

Morfogenez

dezvoltarea formei prin difereniere histologic i individualizarea plantei ca form i structur pe baza informaiei ereditare, se formeaz esut nou, care d form i structur. Celule care nc nu au fixat o anumit cale a dezvoltrii sau specializrii funcionaleunei anumite ci

Nedeterminat

Neoplantule Organogenez Pasare Plantule Prelevare Primordii foliare Promeristem Propangule Protocormi Rediferenierea Regenerarea Rizogenez Subcultivare esut nedifereniat (calus) esut recalcitrant Totipotena celular (omnipoten) Transplantare Variant

plantule nou regenerate (de novo) prin organogenez direct sau indirect. formarea de organe. trecerea n condiiile in vitro de pe un mediu de cultur pe alt mediu de cultur cu coninut identic sau diferit. plante obinute n cultur in vitro care nu au fost aclimatizate. detaarea la microscop a unui fragment mic, sub 3 mm: meristem, vrf de cretere. formaiune existent la baza domului cu scop de protecie. Pot fi primare, secundare, teriare. celule care structureaz viitorul meristem. formaiuni tipice, lstari fr rdcini. formaiuni asemntoare seminelor. procesul de refacere a procesului de difereniere (specializare). refacerea unor structuri celulare care duc la formarea unei noi plante. formarea de rdcini (stimulat de auxine). repetarea culturii in vitro pe parcursul mai multor cicluri (primar, secundar, teriar). esut fr caracteristici de difereniere sau de dedifereniere, dar cu o continu diviziune celular. esut care rspunde cu greu procedurilor de regenerare in vitro. capacitatea celulei de a regenera, pe baza informaiei genetice ereditare, toate tipurile de esuturi, organe, inclusiv planta ntreag, identice cu ale plantei mam. trecerea de pe un mediu aseptic pe un alt mediu septic. O cultur de celule sau o plant care prezint o schimbare fenotipic stabil, de natur genetic sau epigenetic

Principiile de baz ale micropropagrii sunt : 1. Totipotena celular 1902 Haberland 2. Asepsia 3. Mediul de cultur 4. Reglarea hormonal 5. Etapizarea culturii Clasificarea culturilor in vitro:
1. dup tipul de cultur: culturi de plante culturi de organe culturi de esuturi culturi de celule suspensie celular culturi de meristem culturi de calus culturi de antere culturi de ovule culturi de rdcini

1922 Robbins 1934 White 1957 Skoog i Miller 1964 Murashige.

2. dup tipul de esut:

Scurt istoric al evoluiei culturii in vitro


Perioada de pionerat a culturilor in vitro: numai ipoteze 1838 Schwann celula poate evolua independent 1853 Trecul experiene cu esut izolat 1878 difereniere calus 1893 Rechinger teoria minimului necesar, esut de 1,5mm poate regenera o plant 1898 Haberlandit cultur pe mediu artificial in vitro 1902 Haberlandit creatorul teoriei totipotenei celulare

1904 Hanning prima soluie mineral cu zaharoz Perioada primelor regenerri de culturi aseptice 1924 culturi de rdcini in vitro 1934 White vitamine din complexul B, primul mediu sintetic 1939 Gautheret, Nobecourt, White prinii culturilor in vitro 1957 Scoog i Heller teoria balanei hormonale Perioada industrializrii: Mitsui Petrochemical Ind. Ltd. fondat n 1983 cu obiectul n producia industrial de metabolii secundari (shikonim din Lithospermum) Grupul EBI grup de cercetare n domeniul biotehnologiei. Chrysalis fondat n 1984. Chrysalis este deintoarea patentului pentru tehnologia microinjeciei pronuclear, realizare a grupului EBI. Sensus companie fondat n 1993, cu activitatea de cercetare direcionat n domeniul tehnologiei compuilor antagonici hormonilor de cretere (GHA- Growth Hormone Antagonist technology). Copernicus companie fondat n 1997 pe baza semnrii unei licene de utilizare a tehnologiilor dezvoltate n programele de cercetare bilateral ale companiilor EBI i Case Western Reserve University (din Cleveland, Ohio)

Cultura heterotrof, mixotrof i fotoautotrof


Noiunea de organism fotoautotrof (foto= lumin + auto=propriu + trof=nutriie) red capacitatea acelui organism de a produce carbon organic (sursa sa energetic) prin transformarea CO2 atmosferic cu ajutorul luminii. Cultur autotrof este o cultur alctuit din celule capabile s utilizeze CO2 ca surs de carbon. Noiunea de organism heterotrof (hetero=altul, diferit + trof=nutriie) red capacitatea acelui organism de a consuma molecule organice produse de alte organisme vii. Cultur heterotrof este o cultur alctuit din celule care se hrnesc cu elementele nutritive din mediu deoarece nu ii pot produce singure necesarul de substane nutritive.

Noiunea de organism mixotrof (mix=amestec+ trof=nutriie) red capacitatea acelui organism de a asimila compui organici Prin natura lor, sistemele de cultur in vitro nu asigur condiii optime pentru realizarea proceselor de fotosintez. Este un fapt cunoscut c prezena hidrailor de carbon, asigurai exogen, prin mediul de cultur, reduc procesul de fotosintez, probabil printr-un efect de inhibiie de tip feedback. Factorii interni care afecteaz fixarea CO2 in vitro, sunt: anatomia frunzei, stomatele, coninutul de pigmeni, stadiul de cretere i dezvoltare, predeterminarea genetic a speciei, metabolismul vegetal, activitile de tip PEPC (fosfoenolpiruvat carboxilaza) i rubisco (Desjardins, 1995). Factorii externi, din camerele de vegetaie, care joac un rol hotrtor n procesele de fixare a CO2, sunt reprezentai de:

intensitatea luminoas (150-250 mol/m2/s pentru cultura autotrof, 20-65 mol/m2/s pentru creterea mixotrof) compoziia gazelor in vitro (cu referire special la cantitatea de CO2 din: atmosfera camerei (suplimentat la 5000 v.p.m. pentru autotrofe i 500 v.p.mpentru mixotrofe- nefiind necesar adugarea n plus fa deceea ce este normal ntr-o astfel de camer)

atmosfera din interiorul vasului de cultur (350 v.p.m. pentru autotrofe i de la 30 la 5000 v.p.m. pentru mixotrofe)* prezena zaharurilor exogene (fr zaharuri pentru autotrofe i 20-30 g/l pentru mixotrofe). * aceste diferene foarte mari pentru cultura mixotrof sunt rezultatul efectului combinat al cantitii de lumin asociat suplimentrii cu CO2: n condiii de iluminat inadecvat - cazul unor heterotrofe crescute la ntuneric se poate acumula o cantitate mare de CO 2 n interiorul vasului de cultur. Fig. 1 Relaia de reversabilitate n culturile hetero, mixo i fotoautotrofe (adaptat dup Barz, 1988

n condiii de cultur in vitro majoritatea speciilor vegetale cresc i prolifereaz n condiii mixotrofe. Chiar dac cultura este destinat unui sistem autotrof, n primele faze pn la acomodarea explantului cu condiiile in vitro i mai ales n cazul utilizrii pentru iniiere a unor explante de dimensiuni mici, este obligatoriu s se practice un sistem mixotrof. O intensitate luminoas foarte mare (condiie necesar n sistemul autotrof) are ca efect o fotoinhibiie a celulelor, n etapa de iniiere. Procesele de aclimatizare ale plantelor obinute prin micropropagare in vitro pun serioase probleme datorit dificultii trecerii de la sistemul heterotrof la cel autotrof, n momentul transferului ex vitro. Rezultatele experimentale au demonstrat c sistemul autotrof poate fi folosit n sistemul de micropropagare comercial, la anumite specii nregistrdu-se mbuntirea ratei de micromultiplicare i calitatea plantelor. Procentul de supravieuire dup transferul ex vitro este mai bun n comparaie cu sistemul hetero/mixotrof deoarece i nivelul optim de temperatur cerut n sistemul autotrof este mai redus fa de cel utilizat n sistemul mixotrof,

fiind mai apropiat de condiiile naturale (Grout i Price, 1987). Unele rezultate experimentale (Zobayed, 1999) demonstreaz c la plantulele crescute n sistem autotrof stomatele sunt n stare de funcionare, fiind nchise n ntuneric i deschise pe intervalul de lumin. Totodat, plantele crescute autotrof prezint un numr dublu de stomate n comparaie cu cele mixotrofe, frunze mai groase, o concentraie de pn la 7 ori mai mare cear epicuticular, un strat palisadic mai bine dezvoltat, compact cu spaii intercelulare reduse; rata de transpiraie este mai sczut i crete proporional cu creterea intensitii luminoase. n ceea ce privete rata de transpiraie, n cazul plantulelor crescute n sistem mixotrof, valoarea acesteia rmne constant n raport cu variaia fluxului fotonic, fapt care demonstreaz clar c stomatele mixotrofelor sunt nefuncionale pe durata meninerii in vitro, ele ncepnd s funcioneze dup transferul ex vitro. Alte experimente (la Nicotiana tabacum) demonstreaz c plantulele crescute n sistem mixotrof asigur mbuntirea ratei de cretere i a acumulrii substanei uscate n esuturile foliare (Ticha i Schfer,1998). Chiar mai mult, absena zaharului din mediu i intensitatea luminoas prea mare au inhibat procesul de cretere n timp ce prezena zaharurilor n mediu (sistemul mixotrof) a avut un efect protector pentru plantule. Aceste rezultate contradictorii le interpretm ca fiind expresia difereniat a plantelor fa de sistemul de micromultiplicare rspunsul fiind determinat n funcie de specie.

2: nfiinarea unei uniti de micropropagare


Un laborator-unitate de culturi de esuturi vegetale, destinat doar scopurilor de multiplicare, nu trebuie s fie scump. Unitatea de micropropagare trebuie s dein ns obligatoriu un numr de ncperi separate, cu destinaie precis, elemente eseniale pentru reuita operaiunilor. Amenajarea corect, ntr-o ordine logic i eficient, asigur nu numai meninerea asepsiei dar i un nivel de standard ridicat al muncii. Amplasarea unei uniti de producie trebuie s in cond de gsirea unei locaii potrivite, de aproximativ 150 mp. Aceast locaie trebuie s fie amplasat ntr-o zon, luminoas, izolat de trafic, s mpiedice transmiterea contaminrilor de la o ncpere la alta, s dein un sistem de control al temperaturii, s fie legat la o surs de ap permanent i de calitate, precum i la o structur de alimentare cu curent electric (minimum 100 amp). Instalaiile electrice trebuie realizate de electricieni de profesie, (majoritatea firelor cerute fiind de 110 voli). De asemenea, pentru asigurarea securitii este indicat instalarea unor sisteme de

detectare a incendiilor i a controlului temperaturii, conectate la o linie telefonic pentru intervenie urgent. Pentru situaii incidentale se recomand i instalarea unui generator de curent independent. Este recomandat ca unitatea de micropropagare s fie construit ca spaiu independent. Chiar dac aceasta implic cheltuieli suplimentare, izolarea este o garanie a meninerii condiiilor de curenie i asepsie. n prezent exist posibilitatea utilizrii prefabricatelor, disponibile n mrimile dorite, materiale care pot reduce costurile de nfiinare ale unitii. La instalarea unuei uniti de producie trebuie luat n vedere obinerea autorizaiei, amplasarea separat i la distan fa de zonele care reprezint surse de contaminare (zona de transfer postaclimatizare, zona de pregtire a amestecurilor de pmnt, zona de depozitare a pesticidelor, ngrmintelor sau a altor substane chimice). n interior este obligatoriu utilizarea gresiei i a faianei pentru realizarea unor suprafee uor de curat. Asigurarea cureniei permanente este un principiu de baz. Contaminarea datorat murdriei poate duce la pierderi de la 1% pn la 50%. Avnd n vedere valoarea plantelor multiplicate in vitro nu pot fi acceptabile pierderi datorate murdriei mai mari de 1%. Sistemul de nclzire trebuie s permit realizarea unor temperaturi constante mai ales pe timpul iernii (min. 25C), iar pe timpul verii este necesar utilizarea unui sistem de ventilaie pentru controlul temperaturilor prea ridicate. Suprafaa total a unitii de micropropagare este compartimentat ntr-o camer destinat splrii vaselor, o ncpere pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc prevzut cu o incint, separat exclusiv pentru autoclav, o camer steril pentru inoculri, camere de vegetaie i uniti pentru aclimatizare. Camera pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc, precum i zona de splare a sticlriei trebuie amplasate separat de camera de inoculare i de cea de vegetaie. Zonele cele mai curate trebuie s fie camera de vegetaie i camera de inoculat. Aceste dou sectoare trebuie s fie amplasate astfel nct intrarea s nu se fac direct din afara cdirii. Mai mult, ele trebuiesc separate i ntre ele prin instalarea unor ui, cu rolul de reducere a traficului. Camera destinat splrii vaselor Camera pentru splarea sticlriei trebuie s fie dotat cu surs permanent de ap rece i cald, de calitate, cel puin un bazin-chiuvet mare cu evi din materiale rezistente la soluii

acide i alcaline, rafturi i dulapuri pentru uscarea i pstrarea sticlriei, aparatele pentru producerea apei distilate i deionizate. Camera pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc Camera pentru preparat mediile de cultur i a altor soluii trebuie s fie lng camera de splat, avnd astfel acces direct la sursa de ap distilat i la vase. Aceast ncpere este prevzut cu console sau mese de lucru foarte stabile. Suprafaa lor trebuie s fie din materiale rezistente i uor de curat. Camera trebuie s fie ncptoare deoarece n aceast zon se gsete majoritatea echipamentelor cerute n unitatea de micropropagare. Necesarul de echipamente se stabilete n funcie de mrimea unitii de producie i se completeaz adecvat dac n aceast unitate se realizeaz i activiti de cercetare. Din tot necesarul de nfiinare, cele mai costisitoare sunt aparatele, pentru un laborator de culturi fiind necesar achiziionarea a minimum urmtoarelor echipamente:

Cantitate 100 buc.

Descriere produs

Utilizare produs

sticlrie
Vase de cultur din sticl, Vesel pentru autoclavabile, cu posibilitate meninerea de inchidere ermetic materialului vegetal prin subculturi Capace pentru vasele de nchiderea ermetic a cultur, autoclavabile, cel mai vaselor de cultur indicat din polipropilen Cutii Petri sau plci de faian Suprafa steril autoclavabile pentru fasonarea explantelor n timpul transferului pe mediu proaspt Sticle cu capac pentru ap, Ap steril pentru autoclavabile (500 mL) cltire Vas Erlenmeyer, 1000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 2000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 4000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 6000 mL Pregtirea mediului/soluii

100 buc. 15 buc

10 buc. 1 buc. 1 buc. 1 buc. 1 buc.

1 cutie

1 buc. 1 buc. 1 buc. 100 buc. 100 buc. 100 buc. 10 buc. 500 buc.

Sistem de filtrare cu pomp de vacuum, pentru lichide, din polistiren; 200 mL; 47 mm n diametru/ membrane filtrante de nailon cu pori de 0,22 m Cilindru de sticl/plastic gradat; 10 mL Cilindru de sticl/plastic gradat; 100 mL Cilindru de sticl/plastic gradat; 1000 mL Pipete gradate, 1 mL, sterile sau autoclavabile Pipete gradate, 5 mL, sterile sau autoclavabile Pipete gradate, 10 mL, sterile sau autoclavabile Pipete gradate, 25 mL, sterile sau autoclavabile eprubete

Sterilizarea soluiilor stoc fierbini

Preparare soluii stoc Preparare soluii stoc Preparare soluii stoc Msurare soluii stoc Msurare soluii stoc Msurare soluii stoc Msurare soluii stoc Iniierea (Etapa 1) culturii

echipamente
1 buc. 1 buc. 1 buc. Sistem de purificare a apei; apa trebuie s aib o rezisten de cel puin 200.000 ohms/cm Balan electronic (cu trei zecimale, max.200 g capacitate) pH-metru (scara 0-140,01; conversie automat n funcie de temperatur (0-60C), cu 12 valori de calibrare Plit electric cu agitator magnetic; valoarea de nclzire pn la 400 C; vitez variabil de agitare (50150 rpm); rezistent chimic Combin frigorific pentru temperaturi de 2-6C n frigider i respectiv, -20C n congelator Autoclav cu operare la 121C, cu control presiune i durat Purificarea apei pentru mediul de cultur Cntrirea substanelor chimice Msurarea i corectarea valorii pH a soluiilor Amestecarea i nclzirea mediului de cultur /soluii stoc

1 buc.

1 buc.

1 buc. 1 buc. 1 buc.

Pstrarea soluiilor stoc, mediilor, hormonilor, substanelor chimice Sterilizarea mediilor, soluiilor, sticlriei, instrumentarului Oal sub presiune cu operare Sterilizarea volumelor ntre 116-126 C; 10-20 psi mici de mediu, soluii, obiecte mici Etuv 120V (S636) sau 240V Presterilizare,

1 buc. 1 buc. 1 buc.

(S637) Cronometru electronic, cu alarm Stereo-lup prevzut cu surs de luminare Aparat fotografiat

sterilizare uscat Alarm i cronometrare Observare material biologic Observare material biologic

chimicale
1L 1L 4L Detergent Splarea vaselor de sticl Dezinfectant (hipoclorit) Sterilizarea suprafeei explantului Alcool 70 % Pentru sterilizarea suprafeelor de lucru i a instrumentarului solutii standard de calibrare Calibrarea pHpentru valorile 4,0 si 7,0 metrului Vat, tifon Uz general

instrumentar
3 buc. 2 buc. 100 buc. 2 buc. 2 buc. 1 buc. 1 buc. 2-3 buc. 1 rol 1 pereche 1 rol 2-3 buc. Foarfece din inox, autoclavabil Bisturiu din inox, autoclavabil, Lame bisturiu Nr. 11 Spatul mare Fasonat explante Fasonare explante

2-3 buc.

Fasonare explante Msurare volume mari de substane chimice Spatul mijlocie, 30 Msurare volume mari de cm lungime substane chimice Micropipet i vrfuri Msurare volume mici 0-20 l Micropipet i vrfuri Msurare volume mici 20-1000 l Marker colorat, 2-3 Etichetarea culturilor culori Parafilm(4``x250 ft) Sigilare vase de cultur Mnui de protecie Pentru manevrarea n pentru autoclav siguran a autoclavului i a vaselor fierbini Folie aluminiu Pentru mpachetarea instrumentarului n vederea autoclavrii Magnei de agitare Amestecarea soluiilor pe ( pentru volume de agitator magnetic 250 mL, 1000 mL, 2000 mL) Perie de sticl Splare eprubete i vase de

25 buc. 1000 buc. 100 coli 1 rol

1 buc. 25 buc.

sticl Suport eprubete Suport eprubete n camera de vegetaie erveele Pot fi sterilizate , sau pentru uz general n laborator Hrtie Pentru mpachetat, la sterilizare Band adeziv pentru Marcare autoclavare, autoclav, se etichetare difereniaz dup 15 min. de expunere la 121 C Termometru -20 /+150 Msurare temperatura C lichidelor sau n camera de vegetaie Tvie pentru Cntrirea substanelor cntrire, volume chimice diferite

n categoria echipamentelor opionale, n funcie de bugetul alocat dotrii, se pot achiziiona i altele, cum este cazul unui cuptor cu microunde- necesar pentru dezghearea rapid sau pentru topirea rapid a mediilor de cultur ce trebuie suplimentate postautoclavare cu diferite componente termosensibile; laboratorul poate fi dotat i cu o main de splat vasele de cultur, un sistem automat de dispersie a mediului de cultur, etc.

Camera steril pentru inoculri Alturi de camera de preparat mediul de cultur, exist camera steril, destinat inoculrilor, care trebuie s fie cea mai curat i izolat ncpere. Izolarea eficient a acestei ncperi asigur condiii de transfer aseptic i mpiedic circulaia sporilor microorganismelor. n aceast incint este obligatorie purtarea unui echipament de laborator corespunztor (halat, pantofi, bonet, etc.). n aceast camer sunt montate hotele de suflat aer steril astfel nct toate operaiunile s se execute obligatoriu n condiii de asepsie. Pentru meninerea gradului de steril camera este prevzut cu un sistem de ultraviolete, lumina UV fiind ns utilizat, nainte sau ntre perioadele de inoculare i doar cnd personalul i materialul biologic nu se afl n ncpere. Pentru o protecie sporit a personalului, este indicat s fie avertizat prezena i funcionarea UV-ului iar nchiderea/deschiderea lmpilor UV s fie practicabile din exteriorul camerei, Suprafaa interioar a hotelor trebuie s fie din materiale perfect netede (sticl) pentru a reduce depunerile de praf i eventualele surse de depozitare a microrganismelor, uor de curat i rezistente. Camera trebuie s fie dotat cu

surse de curent electric pentru hote, lupe, microscop i aparatele bacto-incineratoare (aparatele de sterilizat instrumentarul). Camera de vegetaie Camera de vegetaie este locul unde se pstrez materialul vegetal (plante, calus, suspensii, protoplati) n vasele de cultur n intervalul dintre dou subculturi. Elementele caracteristice pentru aceast ncpere sunt definite de temperatur, umiditatea relativ, sistemul de iluminare i tipul de rafturi pentru culturi. Toate aceste elemente se stabilesc n funcie de mrimea camerei, locaie i tipul de cultur pentru care este destinat. Elementul esenial n camera de vegetaie l reprezint temperatura. n funcie de aceasta se stabilesc i ali parametrii cum sunt lumina, umiditatea relativ i tipurile de rafturi (simple, cu oglind sau cu system de rcire) pentru vasele de cultur.Valoarea medie a temperaturii n camera de vegetaie este cuprins ntre 22 i 25 C. nclzirea camerelor de vegetaie nu prezint o problem n sine; mult mai dificil este ns rcirea i meninerea unei temperature constante aceasta se realizeaz prin instalarea sistemelor de aer condiionat sau a unor ventilatoare. Nu este indicat apelarea la geamuri pentru camerele de vegetaie deoarece aceasta ar spori riscul contaminrii culturilor n timpul verii i ar crea variaii de umiditate n timpul iernii. Unele camere de vegetaie pot fi meninute n ntuneric dar majoritatea culturilor au nevoie de lumin. Camerele de vegetaie sunt prevzute cu sisteme de iluminat neincandescent, asigurndu-se o intensitate medie de 1- 5 klux, aceast valoare fiind stabilit n funcie de specia cultivat i de sistemul de cultur practicat. Calitatea luminii este i ea o component esenial n procesele de culturi de celule i esuturi vegetale : majoritatea culturilor se practic sub lumin florescent alb. Stadiul de dezvoltare a culturii poate necesita ns utilizarea unui spectru variat de lumin. Culturile pot manifesta cerine specifice i fa de fotoperioad astfel nct orice camer de vegetaie va fi dotat cu un sistem automat pentru programarea fotoperioadei. Utilizarea unor surse de lumin de tipul reflectoarelor este limitat deoarece cldura generat de acestea poate determina condensarea sau concentrarea mediilor de cultur. Dac prezena reflectoarelor direct pe vasele de cultur este absolut necesar atunci trebuie s se asigure o circulaie corespunztoare a aerului cu ajutorul ventilatoarelor.

Umiditatea relativ este foarte greu de controlat n interiorul vaselor de cultur. Valoarea umiditii relative n camera de vegetaie nu trebuie s scad sub 50 % ; dac valoarea crete peste limitele acceptabile se vor folosi metode de uscare iar pentru situaia invers vor fi folosite cantiti mai reduse de agar la prepararea mediului. Unitatea pentru aclimatizare Aclimatizarea plantelor nrdcinate in vitro se realizeaz n boxe speciale n care toi factorii de stress post transferului ex vitro s poat fi controlai i adaptai n funcie de necesarul i starea plantulelor

Aspecte economice i comerciale ale unitii de micromultiplicare


Etichetare si pstrarea evidenei Laboratorul de culturi de celule i esuturi vegetale, organizat pe principii comerciale necesit utilizarea unui sistem eficient de nregistrare a informaiilor care trebuie s asigure toate informaiile simplu i exact prezentate din toate etapele procesului operaional.Aceasta se realizeaz in scopul eficientizrii planificrii produciei i pentru reducerea la minimum, mentinndu-se costuri sczute de producie. Multe dintre informaii pot fi pstrate n registru, dar ideal este utilizarea unei baze de date pe calculator.Utilizarea calculatorului permite organizarea, accesarea, sortarea i clasificarea pe categorii. Exemple de nregistrri: Metode de cultur Protocoale, proceduri, formule de medii Reete de medii i soluii stoc Activitatea experimental
2.

1.

1. Specii recalcitrante, problematica de rezolvat 2. Evoluia experimentelor (detalii pe faze) Comenzi 1. Lista de furnizori (persoana contact, adrese,etc.) 2. Formulare tipizate 3. Informaii legislative pentru produse cu regim special Contabilitatea 1. 2. 3. Conturi Facturi Alte documente

Control periodic 1. 2. 3. 4. 5. 6. Data verificrii hotelor Filtre schimbate Control biohazard Control instalaie electric Verificare aparate n regim special (autoclav, distilator, pH-metru) Control protecia muncii 7.Control dotri prim-ajutor (acid acetic 2%, acid boric 4%, spirt medicinal, ap oxigenat 3%, bicarbonat de sodiu 2%, comprese sterile, leucoplast, pahar special pentru splat ochii, tinctur de iod, vat hidrofil, fa de tifon)

Micropropagarea
Material: celule organizate, esuturi, fragmente de esuturi, plant ntreag Obiectiv: multiplicarea nelimitat a aceluiai tip de material biologic valoros Procese biologice implicate: creterea i dezvoltarea Stabilitate genetic: obligatorie Metode i tehnici : simple i ieftine Aplicaii imediate: comerciale

Biotehnologia
Material: celule neorganizate: calus, suspensii celulare, celule imobilizate, celule individuale Obiectiv: obinere de material genetic modificat, obinere de metabolii secundari Procese biologioce implicate: metabolismul celular Stabilitate genetic: variabilitate genetic i somaclonal Metode i tehnici: complexe i sofisticate, destul de costisitoare Aplicaii imediate: tiinifice, comerciale i industriale

3. Prepararea mediului de cultur. Soluii stoc


Cuvinte cheie:
pregtirea soluiilor stoc;. prepararea mediului de cultur MSO; fia de mediu;

Necesar echipamente:
Balan analitic Plit cu agitator magnetic pH-metru Autoclav

Necesar consumabile:
Substane chimice Filtre Millipore Ap distilat

Noiuni teoretice
Raportul ntre macroelemente i microelemente este definit de cerinele concentraiei celulare pentru un anumit element i este funcie de capacitatea fiecrui tip de cellule de asimilare a elementului respective. Majoritatea macroelementelor se dau n concentraii de ordinul milimolilor iar cmicroelementele de ordinul micromolilor. Concentraiile foarte reduse de microelemente nu reprezint indicaia c acest tip de compui sunt lipsii de importan; absena unui singur microelement poate determina apariia unor probleme de cretere extrem de severe. n practic, apa necorespunztoare (contaminat) utilizat la prepararea soluiilor stoc, pot aduga cantiti semnificative a acestor elemente n mediul de cultur.. Practica cea mai sigur este utilizarea unor medii condiionate, n amestecuri gata preparate cumprate din surse comerciale autorizate i verificate. Alternativ, pot fi preparate i soluii stoc complexe, n concentraii mari pentru a fi utilizate n amestecurile finale. Un exemplu de astfel de soluie complex poate fi o combinaie de mai multe vitamine. Aceast metod este practicabil doar n cazul n care combinaia respecti este frecvent utilizat n aceeai formul. Cea mai folosit formul de mediu de cultur este cea descris de Murashigie i Skoog care a fost utilizat iniial pentru cultura esutului foliar de tutun. Este o formul bazat pe compoziia mineral a frunzelor de tutun.

Mediul de baz Murashige- Skoog (1962), cod: MSO:

Exerciii practice
Component CaCl2-2H2O NH4NO3 KNO3 KI CoCl2-6H2O KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4 MgSO4-7H2O MnSO4-4H2O pH Cantitate 440 mg/l 1650 mg/l 1900 mg/l 0,83 mg/l 0,025 mg/l 170 mg/l 6,2 mg/l 0,25 mg/l 370 mg/l 22,3 mg/l Component CuSO4-5H2O ZnSO4-7H2O FeSO4-7H2O+ Na2EDTA Glicin Inozitol Acid nicotinic Piridoxin HCl Tiamin HCl Zaharoz 5.7 Cantitate 0,025 mg/l 8,6 mg/l 27,85 mg/l 37,25 mg/l 2,0 mg/l 100 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l 0,1 mg/l 30000 mg/l Exerciiul 1.:

Prepararea soluiilor stoc pentru mediul MS (1962)

a) Macroelemente MS, concentraie 10x, pentru 1L mediu se adaug 100 ml.


- se toarn 250 ml ap bidistilat ntr-un vas de 1L. - se cntresc pe rnd si se adaug n apa din vas urmtoarele substane:

Azotat de K (KNO3).............................19,0 g Azotat de amoniu (NH4NO3)................16,5 g Clorur de Ca (CaCl2.2H2O) .................4,4 g Sulfat de Mg (Mg SO4.7H2O).............. 3,7 g Fosfat monopotasic (KH2PO................ 1,7 g TOTAL..............45,3 g
- se complecteaz cu ap bidistilat steril pn la un litru, - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

b) Microelemente MS, concentraie 100x, pentru 1L mediu se adaug 10 ml


- se toarn 250 ml ap bidistilat steril ntr-un vas de 1L - se cntresc pe rnd i se adaug n apa din vas urmtoarele substane:

Sulfat de Mn (MnSO4.H2O) ............1180 mg Sulfat de Zn (ZnSO4.7H2O) ..............860 mg Acid boric (H3BO..............................620 mg Iodur de potasiu (KI) .........................83 mg Molibdat de Na (NaMoO4.2H2O) ........25 mg Clorur de Co (CoCl2.6H2O)........ 2,5mg Sulfat de Cu (CuSO4.5H2O) ...............2,5 mg TOTAL.........2773.0 mg
- se complecteaz cu ap distilat steril pn la 1L - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

c) Fierul pentru microelemente MS, concentraie 100x, pentru 1L de mediu se


adaug 5 ml - se toarn 400 ap bidistilat steril ntr-un vas de 500 ml . - se cntresc pe rnd i se adaug urmtoarele substane:

Sulfat feros (Fe2SO4.7H2O) ......2,78 g NaEDTA ..................................3,72 g TOTAL.................6,50 g


- se amestec la cald pn la completa dizolvare - se completeaz cu ap bidistilat steril pn la 1L - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

d) Vitamine MS, concentraie 100x, pentru 1L mediu se adaug 10 ml


- se toarn 250 ap distilat steril ntr-un vas de 1L - se cntresc pe rnd i se adaug urmtoarele substane:

Piridoxin HCl (Vitamina B........50 mg

Tiamina HCl (Vitamina B1) .......10 mg Acid nicotinic (Vitamina PP) ......50 mg Glicina (aminoacid) ..................200 mg Mezoinozitol (alcool) ............10000 mg .............TOTAL..................10310 mg
Mediile de cultur pentru subcultivarea explantelor caulinare sau foliare (multiplicarea prin butire sau regenerare prin organogenez direct): MSO MSP1 = MSO + 6 BAP (0,5 mg/l) + ANA (2,0 mg/l) MSD3 = MSO + 6 BAP (1,0 mg/l) + AIA (2,0 mg/l) MSZ = MSO + Z (1,0 mg/l) UM = MSO + 2,4 D (2,0 mg/l) + Kin (0,25 mg/l) +Tiamin (9,9 mg/l) + Piridoxin (9,5 mg/l) + Acid nicotinic (4,5 mg/l) + hidrolizat de cazein (2000 mg/l). Mediul de cultur pentru nrdcinare MS = MSO + ANA (1,0 mg/l)

Medii de cultur folosite n culturile de calus Mediile de cultur pentru iniiere i cretere MS1 MS2 MS3 = MSO + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoz (30 g/l) = MSO + 2,4 D (2,5 mg/l) + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoz (20 g/l) = MSO + BAP (1,0 3,0 mg/l) + 2,4 D (2,5 mg/l) + zaharoz (40 g/l)

Mediul de cultur pentru inducerea embriogenezei somatice MS120 = MSO + 2,4 D (2,5 mg/l) + zaharoz (120 g/l) Mediul de cultur pentru regenerare MS4 = MSO + Kin (1,0 - 3,0 mg/l) + Z (1,0 - 3,0 mg/l)

Exerciiul 2.: Prepararea mediilor de cultur Mediile de cultur sunt fie solide (gelificate), fie lichide, compoziia lor variind de la un autor la altul n limite destul de restrnse. Dup cum s-a vzut mai nainte n compoziia

lor intr substane anorganice (macroelemente, microelemente i Fe chelatizat) precum i o serie de substane organice (vitamine, aminoacizi, glucide, hormoni) i dup caz un agent gelifiant. n general se prepar soluii stoc, separate pe: macroelemente, microelemente, FeEDTA, vitamine, aminoacizi i hormoni, care n momentul utilizrii necesit diluarea lor. Hormonii se folosesc n soluii pure i nu n amestec. Soluiile de substane anorganice se vor pstra n frigider la 4C, vitaminele n congelator, iar hormonii n apropierea congelatorului. Alegerea compoziiei mediului de cultur se face n raport cu scopul urmrit iar unul dintre cele mai folosite medii de cultur ar fi: Murashige - Skoog (1962) (MS), Gaborg & colab. (1968) (B5), Linsmeier - Scoog (1965) (LS), Knop, Heller, Nitsch & Nitsch. Nu se recomand scimbarea cantitailor din reetele de soluii anorganice, ntruct se produc modificari n ceea ce privete proporia diferiilor compui, alternd echilibrul ionic fixat ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilitii n timp a pH-ului.

Exerciiul 3: Prepararea unor soluii stoc de fitoregulatori de cretere La prepararea soluiilor stoc reinem cteva reguli generale: a. dizolvarea substanelor se face numai n ap bidistilat b. fiecare compus se dizolv ntr-o anumit cantitate de ap proporional cu c. numrul ingredientelor ce urmeaz a fi amestecate i cu volumul final al d. soluiei stoc, dup care soluiile obinute se amesteca succesiv, n ordinea e. indicat n reetar f. la substantele greu hidrosolubile, amestecul se nclzete uor pe baia de g. ap (dac reeta prevede aceast indicaie), agitnd h. regulatorii de cretere - hormonii - vor fi solubilizai fiecare n parte, potrivit i. j. indicaiilor din literatura de specialitate deoarece autorii exprim concentraia n maniera diferit (g, mg%, g/l sau

k. ppm) se are n vedere calcularea cantitii de substan ce trebuie cntrit

l.

pentru a asigura echivalena

m. se are n vedere asigurarea echivalenei unui compus introdus n mediu n. cnd aceasta este o sare cu un anumit coninut n ap sau n cazul unor o. sruri cristalizate

p. n prepararea mediului de baz fiecare compus n parte se adaug ealonat,


q. ntr-o anumit cantitate de ap bidistilat apreciat arbitrar, proporional cu r. volumul final al soluiei s. pH-ul mediului se va regla nainte de adugarea agarului t. agarul se va aduga mediului de cultur dup introducerea celorlalte

u. ingrediente, mediul agarizat, cu agarul lichefiat se repartizeaz n recipiente v. de cultur. La pH prea acid sau la autoclavare incorect agarul rmne n w. stare lichid i mediul de cultur nu se mai poate folosi. Fia mediului const n nregistrarea formulelor utilizate ntr-o baz de date proprii. Fiele vor conine obligatoriu codurile nscrise pe flacoane. MS , B5, WPM, etc.)

4: Etapele micropropagrii
Cultura de esuturi reprezint o metod comercial rapid de multiplicare a cultivarelor nou obinute, a speciilor rare i a plantelor cu probleme de multiplicare prin metodele clasice. Datorit cererii tot mai ridicate pentru material vegetal micromultiplicat, de la cele cteva laboratoare existente acum civa ani, n prezent funcioneaz o adevrat industrie. Cu toate c nc funcioneaz uniti strict i limitat specializate pentru producia plantulelor, care sunt vndute mai departe cultivatorilor, tendina general este ca marile uniti cultivatoare s-i includ i etapa de multiplicare in vitro a materialul sditor, prin crearea propiului laborator de micropropagare.

Procesul de micropropagare
O descriere foarte sumar a procesului de micropropagare poate clarifica aspectele specifice cerute de aceste proceduri: un fragment mic de esut vegetal este tiat din planta mam (cea care trebuie clonat) i dezinfectat ntr-o soluie diluat de agent de sterilizare, dup care este cltit n cteva ape sterile i fasonat, adic i se decupeaz zonele marginale afectate de agentul de dezinfecie. Dup aceast procedur explantul este plasat, n condiii de asepsie total (sub hota steril), pe un mediu de cultur adecvat formulat. Dup parcurgerea fazei de acomodare, explantul va da natere unor muguri, lstari sau calus, n aproximativ 412, n funcie de specie. Creterea i dezvoltarea explantului sunt deterinate de tipul fitohormonilor prezeni n mediul de cultur. Dup apariia noilor proliferri acestea sunt transferate pe medii de cultur proaspete, unde la rndul lor prolifereaz i continu multiplicarea rapid fiind i ele subcultivate ulterior. Rata multiplicrii depinde de specie i este determinat de o mulime de factori, dar sunt estimri care atest posibilitatea obinerii unui numr impresionant (de ordinul milioanelor) pornindu-se de la un singur explant. n 1974 T. Murashige descrie etapele succesive care trebuiesc parcurse la producerea de plante in vitro, n regim industrial, distingnd trei stadii principale : - Stadiul I, de nfiinare a culturilor aseptice. - Stadiul II, de multiplicare i propagare in vitro - Stadiul III, de pregtire a plantelor generate in vitro pentru transferarea lor ex vitro n 1982, din raiuni de ordin economic, Debergh i Maene recomand extinderea numrului de etape, prin nfiinarea unui stadiu 0- de pregtire a plantei mame, premergtor explantrii i subdivizarea stadiului III, n dou substadii. Nu exist reguli inviolabile pentru propagarea unei anumite specii vegetale prin culturi de esuturi i adesea este necesar ajustarea i reajustarea compoziiei mediului, a ambientului i chiar a habitatului astfel nct culturile s poat fi determinate s porneasc n cretere i dezvoltere.

Pentru obiectivele micropropagrii poate fi descris o schem ce cuprinde cinci etape de baz:

etapa 0 de pregtire a plantei mam etapa 1 de iniiere a culturii in vitro etapa 2 de micromultiplicare etapa 3 inducere a formrii de rdcini i pregtirea plantulelor pentru transferul ex vitro etapa 4 transferul ex vitro i aclimatizarea Etapa 0 - de pregtire a plantei mam
n general, la multe din speciile dicotiledonate i mai ales la cele ierbacee, nu sunt necesare tratamente de stimulare i activare a celulelor vegetative n scopul pregtirii plantei mam pentru iniierea culturii in vitro. Exist ns unele situaii, de exemplu n cazul speciilor lemnoase, a speciilor cu o activitate metabolic intens, sau cnd momentul de recolotare a explantelor n vederea iniierii se face n faze fiziologice improprii (senescen, repaus, etc.) cnd este nevoie de o pregtire n prealabil a plantei donoare de explante. n cazurile care cer pregtiri speciale, alegerea metodei de pretratament a plantei care urmeaz s fie propagat in vitro reprezint o etap esenial, de care depinde succesul sau insuccesul culturilor in vitro. La alegerea metodei de pretratament se iau n considerare urmtorii factori:

Gradul de contaminare a materialului de pornire. Plantele crescute n cmp, de obicei sunt expuse unui grad ridicat de contaminare bacterian sau viral, fapt ce are ca efect o sterilizare foarte dificil a materialului naintea iniierii culturii in vitro. Cnd explantele necesare iniierii unei culturi sunt recoltate din prile mature ale plantei sunt necesare procedee foarte complicate de sterilizare. Este de dorit ca materialul de iniiere s fie prelevat din stocul de plante crescute ntr-un mediu controlat - spaii protejate - n care nu s-a aplicat o udare excesiv. Gradul de vigurozitate a materialului de pornire. Plantele viguroase pot fi obinute prin diverse metode, inclusiv tieri severe pentru ncurajarea unei creteri viguroase,

aplicarea unor cantiti mari de fertilizani sau practicarea de altoiri pe rsaduri. Aceste metode determin apariia unui esut juvenil caracterizat printr-un grad mare de plasticitate i un nalt potenial morfogenic. Pentru unele specii metoda cea mai bun o reprezint obinerea de explante capabile de regenerare pornind de la materialul iniial, cultivat el nsui n culturi in vitro nainte de a fi folosit ca surs de explante.

Necesitatea aplicrii unor pretratamente speciale.Anumite specii, de exemplu, bulbiferele sau speciile lemnoase necesit tratamente speciale pentru stimularea mugurilor dorminzi. Efectul temperaturii s-a manifestat att pozitiv stimulator ct i inhibitor, depinznd de civa factori: - timpul de pstrare la o anumit temperatur; - concentraia auxinelor n esutul tratat; - temperatura culturii; De exemplu s-a inregistrat un efect stimulator asupra bulbilor de lalea i iris la un

pretratament termic de 30C. Tot n stadiul 0 este necesar pregtirea plantelor - mame donoare de explante. Ele trebuie crescute n condiii speciale de cultur, n spaii protejate, la temperatura de 25C , n umiditatea atmosferic de 70%; plantele vor fi udate numai la nivelul solului. Astfel, se obine creterea considerabil, a numrului de inoculi necontaminai. De regul, procentul de inoculi necontaminai nu depete 50%. Se va persevera n aplicarea acestor metode chiar dac frunzele din poriunea bazal a plantelor - mame se brunific.

Etapa 1 - de iniiere a culturii in vitro


stabilirea (iniierea) culturii axenice, reactivarea esuturilor mature nfiinarea culturii const n exploatarea sau dimensionarea fragmentelor din care vor fi nfiinate culturile sau porionarea inoculilor (calus, culturi de celule ori a suspensiei de protoplati) i n introducerea acestora n mediu, asigurnd pe tot parcursul operaiilor condiii de asepsie total. Un factor cheie care influeneaza iniierea culturilor de esuturi l reprezint momentul recoltrii explantului. S-a dovedit c momentul optim de recoltare este primvara, deoarece vrfurile de cretere sunt caracterizate printr-o vigurozitate considerabil i o rat sczut de infecie.

n aceast etap se practic selectarea cu responsabilitate a explantului, ales ca iniiator al culturii, a mediilor de cultur i a condiiilor de incubare a inoculilor cu meniunea c o atenie cu totul special trebuie acordat momentului sterilizrii materialului biologic. De asemenea este important splarea la jet de ap, timp ndelungat a materialului biologic donator de explante astfel obinndu-se bune rezultate n ntemeierea culturii aseptice la materialele biologice dificile. Aceast etap de iniiere a culturii are o durat mai lung de cca. 6 luni, n dependen cu materialul biologic cu care se lucreaz. Etapa de iniiere este, poate, cea mai dificil faz deoarece presupune detaarea explantului de pe planta ntreag- ceea ce nseamn o rnire inevitabil a esutului, stresarea acestuia prin tratamentul de asepsizare iar mai apoi adaptarea celulelor la condiii noi de via. Asepsizarea explantelor trebuie s se decid prin tatonare i const n identificarea uui echilibru ntre concentraia agentului de sterilizare i timpul de expunere la aciunea acestuia. Nu exist un raport ideal ntre concentraie i timpul de expunere deoarece, n reuita asepsizrii, se ine cond de tipul de material vegetal (esut lignificat, suberizat sau sensibil), de vrsta materialului vegetal, de porozitatea suprafeei de sterilizat, (lis sau ncreit), prezena sau absena periorilor (acetia pot s creeze un strat de izolare ntre soluia de sterilizare i suprafea efectiv a esutului), gradul de contaminare precum i de gradul de integritate al esutului. Etapa de iniiere se parcurge n dou sub-etape: 1. sub-etapa tratamentului cu agentul de sterilizare/asepsizare:const n splarea n prealabil sub jet de ap curent, de robinet, apoi imersia n soluia de dezinfectat;dup parcurgerea minutelor necesar, materialul biologic se cltete succesiv n mai multe (3-4) bi de ap sterilizat, pentru diluarea pn la splarea complet a sterilizantului. Dup cltire se fasoneaz explantele care se introduc n flacoanele cu mediu; n momentul poziionrii explantelor se are n vedere asigurarea contactului unei suprafee ct mai mare (un numr ct mai mare de celule) cu mediul de cultur peentru a facilita accesul la elementele nutritive din substratul de cultur. 2. sub-etapa a 2-a reprezint faz de adaptare propiu-zis a explanztului la noile condiii de via. Aceasta const n trecerea treptat de la sistemul autotrof la ce mixotrof, respectiv, heterotrof i pierderea calitii de parte a unui ntreg. Explantele devin independente, i reduc activitatea de fotosintez la minimum (datorit lipsei schimbului de gaze respiratorii- cultura fiind practicat n flacoane nchise ermetic),

dobndesc capacitatea de absorbie direct a elementelor nutritive asigurate sub form uor asimilabil i ncep s creasc. Etapa de iniiere, ca durat i efort de adaptare, este diferit de la specie la specie sau de la un explant la alt tip de explant. ntr-o prim faz de cultur pe mediul de iniiere are loc cicatrizarea marginilor rnite prin fasonare, acumularea unei cantiti mari de ap n esuturi (explantele cresc n volum dar nu i n numrul de celule. Uneori apare o necrozare mai evident a esutului. Etapa de iniiere poare dura de la cteva zile la cteva sptmni, fiind considerat parcurs cnd pot fi sesizate pe suprafaa explantelor elemente de cretere efectiv a unor celule noi: calus, muguri care se dezvolt. Problemele cele mai frecvente care apar n aceast etap sunt apariia unor contaminri i apariia brunificrii explantelor. Contaminrile aprute pe suprafaa explantului denot o concentraie sau un timp de expunere prea mici; cele aprute la capetele tiate ale explantului (sub form de halou) indic o rezerv de ageni patogeni endogeni, iar cele aprute pe suprafaa mediului dar nu n apropierea explantului indic un viciu de tehnic (instrumentar nesteril sau contaminare prin respirarea asupra flaconului). Dei nu se folosesc n mod obisnuit, n unele cazuri pentru eliminarea microorganismelor sunt necesare tratamente cu antibiotice, mai ales n cazul propagrii clonale a unor caractere particulare a unui anumit tip de explant. a. b. Controlul brunificrii n faza iniierii culturii de explante se face prin subcultura repetat la intervale scurte de timp sau prin utilizarea unor substane precum: crbunele activ, acidul ascorbic, L-cisteina, azotatul de argint, citratul de potasiu Glutatione, Rosmanol

Speciile ierbacee rspund fr probleme iniierii culturilor in vitro folosindu-se ca explante diferite pri ale plantei - rdcini, tulpini, frunze. De obicei, explantul se alege din zonele meristematice sau mugurii axilari, datorit faptului c aceste pri vegetale prezint un nalt grad de stabilitate genetic n cultur i un nalt grad de plasticitate morfogenetic. La speciile de cereale, materialul de iniiere optim l reprezint embrionii imaturi, care vor produce calus embriogenic, dac este cultivat pe mediul MS suplimentat cu o auxin. Dintre auxine, cel mai mare efect pozitiv asupra stimulrii formrii de calus embriogenic l are 2,4 -

D, dar rezultate pozitive s-au inregistrat i n prezena auxinelor CPA, 2, 1, 5, T, picloram, ANA sau Dicamba. Se pare c alturi de efectul informaiei genetice a materialului, prezena auxinelor este al doilea factor determinant pentru iniierea culturii, Cantitatea tipic de auxin pentru speciile ierbacee este cuprins ntre 0,1 - 1 mg/l. Se pot aduga i citochininele BAP i chinetin n cantitate de 0,1 - 1 mg/l. Rezultate pozitive s-au obinut i la adgarea unor cantiti reduse de gibereline 0,03 - 0,3 mg/l. Pentru speciile bulboase sunt folosite n mod obinuit cantiti sczute de auxine (mai puin de 10 micromoli). Protocoalele experimentale desemnate pentru specii cu fructe mici sau vi de vie utilizeaz medii MS suplimentate cu AIB sau ANA i BAP. Pentru cpun folosirea adeninei sulfat n absena citochininei poate mri rata de iniiere a culturii in vitro. n cazul unor specii particulare sunt necesare modificri ale mediului. Astfel, n cazul speciilor de Ribes folosirea mediului MS cu o reducere a proporiei cu 20% a ionilor de nitrat a fost benefic, iar la capun i zmeur se prefer mediile MS (cu reducerea substanelor organice la jumtate). Coniferele, obinuit sunt cultivate pe medii iniiale bogate n sruri, ca de exemplu, MS sau SH (Skoog - Heller), cu nivele de auxine de 0,005 - 0,5 micromoli. Combinaiile regulatorilor de cretere pot mbunti rata reuitei, la unele specii fiind chiar superioare altor tratamente aplicate cu scopul stimulrii iniierii culturilor in vitro. De exemplu, arbuti precum azaleea, sunt crescui pe medii Lloyd i McCown (1980) care se caracterizeaz printr-un nivel sczut de nitrai i un coninut ridicat de calciu. La unele specii, se formeaz produi fenolici cu efect inhibitor, avnd ca rezultat brunificarea esuturilor cultivate. Acest fenomen nedorit poate fi prentmpinat prin tratamente aplicate naintea iniierii culturii in vitro folosind apa saponificat sau ascorbat. De asemenea, rezultate bune s-au obinut n cazul tratamentelor cu crbune activ sau cu polivinilpirolidon. Dei nu se folosesc n mod obisnuit, n unele cazuri pentru eliminarea microorganismelor sunt necesare tratamente cu antibiotice, mai ales n cazul propagrii clonale a unor caractere particulare a unui anumit tip de explant.

Etapa 2 de micromultiplicare
Multiplicarea explantelor este un stadiu crucial pentru propagarea speciilor, n scopuri comerciale i mai ales cnd este cerut o rat rapid de multiplicare. Cel mai adesea, mediul standard de cretere este suplimentat cu citochinin, de obicei BAP sau chinetin. Exist cazuri cnd se nregistreaz un efect negativ la aplicarea citochininelor n concentraii mari recomandate pentru sporirea ratei de multiplicare. Ali factori care afecteaz rata de multiplicare includ intensitatea luminoas, tipul de agar i cantitatea care se folosete, orientarea explantului pe mediu de inducie. n 1986 De Fossard propune introducerea a doua faze n etapa 2 i a trei faze n etapa 3.: n concepia lui n stadiul I de iniere a culturii in vitro se selecteaz: materialul vegetal de iniiere, mediile de cultur , condiiile optime de incubare a explantelor, acordndu-se o importan deosebit sterilizrii materialului vegetal El apreciaz c etapa 2 trebuie s aib o durat mai lung, de aproximativ 6 luni sau chiar mai mult, n funcie de materialul biologic folosit . Pentru etapa 2 el propune dou sisteme de multiplicare: unul dintre acestea presupune scoaterea materialului iniial de sub influena dominaiei apicale, prin folosirea unor medii de cultur adecvate i trecerea direct n etapa 3, de nrdcinare a lstarului, etap care poate dura cca. 2 luni; un rol important l reprezint i modalitatea de inoculare a materialului biologic pe mediul de multiplicare. Minibutaul uninodal d natere unor lstari care ulterior sunt separai i butii la rndul lor. n cazul meristemelor, apexurilor, sau a calusului are loc creterea inoculului, dup care urmeaz separarea coloniei sau a plantei rezultate, genernd minibutai sau propagule, dup care se procedeaz la subcultivarea acestora .

Etapa 3 inducere a formrii de rdcini i pregtirea plantulelor pentru transferul ex vitro


Aceast etap se refera la unele modificri n compoziia mediului de cultur i la schimbarea conditiilor de cultur. Dac n etapa 2 auxinele i citochininele au fost prezente n cantiti foarte mici sau chiar absente din substratul de cultur, n etapa 3 se recomand reinstalarea dominaiei apicale la nivelul tulpinilor generate in vitro si nrdcinarea acestora. Exist 3 ci de abordare a etapei de nrdcinare:

1. cultura poate fi transferat pe medii care s permit alungirea lstarilor: dup care vor fi recoltai i vor fi subcultivai pe un mediu proaspt, pregtit pentru facilitarea rizogenezei la nivelul minibutailor 2. inoculii - vor fi divizai - prin fragmentare n uniti care s dein o capacitate regenerativ rapid - n propagule care apoi vor fi subcultivate, pentru a determina formarea de rdcini, n vederea transferrii culturii ex-vitro. 3. - tulpiniele derivate din etapa 2, vor fi nrdcinate in vitro, pe medii agarizate, avnd o balan hormonal adecvat acestui scop. Etapa 3 se caracterizeaz prin aciuni specifice menite s pregteasc planta pentru transferul ex vitro; aceste activiti presupun: utilizarea n mediul de cultur a auxinelor (mai ales AIB) n asociaie cu o citochinin. utilizarea unei concentraii uor mrit de agar n mediu n scopul intensificrii formrii de rdcini dar i n reducerea accesuluzi la ap pentru concentrarea sucului celular. scderea umiditii relative din camera de vegetaie (sau utilizarea unei camere de vegetaie special reglat pentru aceast etap). n general, n etapa de micromultiplicare, umiditatea din vasul de cultur este foarte ridicat (90-100%) ceea ce mpiedic formarea unui strat protector de cear. trecerea de la iluminatul continuu la meninerea culturilor n sistem de iluminat alternativ (16 ore lumin/ 8 ore ntuneric) creterea intensitii de iluminare i utilizarea (cnd este nevoie) a unor spectre specifice de lumin, n scopul stimulrii formrii cloroplastelor funcionale

scderea temperaturii din camera de vegetaie , de la 25C la 18-20C. alternarea diferitelor regimuri de temperatur n scopul activrii stomatelor utilizarea unor flacoane prevzute cu deschideri la nivelul capacului, pentru egalizarea temperaturii, a presiunii, facilitarea circulaiei aerului, etc. Aceste deschideri sunt obturate cu filtre sau burei, pentru meninerea condiiilor de asepsie)

Plantele crescute n in vitro se adapteaz la mediul artificial n diferite moduri. Forma cea mai extrem o reprezint vitrificarea esuturilor vegetale, ceea ce face ca materialul respectiv s nu fie potrivit pentru transferul direct la conditiile ex vitro. n acest caz este

necesar o perioad de pregtire postregenerativ special pentru asigurarea supravieuirii ex vitro.

Etapa 4 transferul ex vitro i aclimatizarea


Etapa 4 se refer la transferarea n mediul natural a plantelor din recipientele de cultur. Efectiv aceasta const n deschiderea flacoanelor, scoaterea plantelor nrdcinate, splarea resturilor de mediu de pe rdcini i plantarea lor n perlit sau amestec de pmnt i perlit. n primele zile de acimatizare, plantele se menin acoperite pentru protejare, fiind udate cu o soluie nutritiv (de obicei soluia are aceeai compoziie de substane anorganice care au fot utilizate n formula de baz a mediului de cultur). Treptat soluia se diluaz astfel c n final, plantele ajung s fie udate cu ap de robinet. Factorul cel mai critic n momentul ocului de adaptare l constituie funcionarea maxim a rdcinilor. Este necesar de asemenea protejarea tulpinielor mpotriva uscciunii atmosferice. Acest stadiu poate fi prelungit, uneori, pana la 4 luni . n consecin o importan deosebit trebuie acordat momentului transferrii plantulelor, din condiiile in vitro, n condiii naturale de via, precum i modului n care se realizeaz aceast trecere, respectiv realizrii unei acomodri treptate a plantulelor, la condiiile mediului septic. Cerinele sunt n general asemntoare pentru majoritatea speciilor. n condiii in vitro plantele cresc ntr-un mediu cu un nalt grad de umiditate, ca urmare, pentru aclimatizare a devenit o rutin folosirea camerelor izolate sau a sistemului de cea artificial. Umiditatea relativ este meninut la un nivel relativ ridicat, 80%, att n timpul zilei ct i n timpul nopii. Este esenial o splare a rdcinilor plantelor cultivate in vitro pentru ndeprtarea oricrui reziduu de mediu, care reprezint o excelent surs nutriional pentru bacterii. O fertilizare cu un coninut ridicat de fosfor are un rol benefic. Pentru evitarea infeciilor, n special n primele stadii ale aclimatizrii, cnd umiditatea este foarte mare, este necesar folosirea fungicidelor. ansele de supravieuire sunt determinate de pierderile prin transpiraie, datorit lipsei stratului de cear i a activitii aproape inexistente a stomatelor. S-a observat c reducerea umiditii relative la 80% fa de maximum ct este recomandat la unele specii este suficient pentru a asigura formarea stomatelor funcionale i acoperirea cu un strat de cear suficient pentru a asigura reducerea pierderilor de ap.

Aceast reducere a umidittii relative se realizeaz prin deschiderea parial a vasului sau prin rcirea bazei vasului cu 2 - 3C sub temperatura atmosferic. Plantele tratate n acest fel, precum i prin deschiderea repetat, ntr-un mediu relativ umed, dar cu condiii de umbrire, au o rat de supravieuire mult ridicat.

5: Cultura de meristeme
Meristemele sunt celule mici (cca. 20 m), izodiametrice, caracterizate prin perete celular subire, nucleu mare, citoplasm dens, vacuol central, activitate metabolic redus, dar capacitate susinut de diviziune. Datorit spaiilor inter-celulare aproape inexistente, a lipsei totale a structurilor vasculare -ceea ce asigur absena total a agenilor patogeniprecum i a potenialului divizionar foarte ridicat (funcia principal a meristemului fiind mitoza) explantele de acest tip sunt cel mai mult folosite pentru iniierea culturilor in vitro n corpul plantei, esuturile meristematice sunt localizate n zone specifice:

zona meristemelor apicale, fiind punctele de cretere a rdcinilor i a tulpinilor zona meristemelor secundare (mugurii laterali), situate la nivelul nodurilor, fiind locul de iniiere a ramificaiilor n cazul unor specii, zona circular de esut, denumit cambiu, care se regsete n tulpina matur

Cu timpul, celulele produse n meristem devin difereniate. Morfologia tipic a unui meristem apical (n primul stadiu de dezvoltare) i iniierea creterii radiale (al doulea stadiu) const n prezena a dou regiuni tunica i corpus. Cele dou zone ale domului meristematic (distal i subdistal ) sunt caracterizate de prezena masiv a celulelor meristematice tipice care asigur creterea continu a meristemului, precum i nceputul diferenierii celulare.
1.

tunica reprezentnd nveliul periferic format din una sau mai multe straturi de celule i n care planurile diviziunii celulare sunt predominant anticlinale.

2.

corpus reprezentnd zona central format din celule aranjate neregulat n care planurile de diviziune celular variaz; anticlinale i periclinale, deci, dispune att perpendicular ct i paralel cu suprafaa meristemului. Deci, trei zone principale se disting n corpus: (a) zona central, generatoare de celule, situat sub tunic; (b) zona

de delimitare, paralel cu suprafaa meristemului; i (c) zona periferial (epiderma) care se formeaz n stratul extern al tunicii. Folosirea numai a domului meristematic pentru iniierea unei culturi in vitro, dei pare avantajoas (n special, n scopul eliberrii de virusuri), ea este, totui, mai greu de realizat practic. Dificultatea const n tehnica detarii unei poriuni de esut aa de mic (fr a-l distruge sau a-l dezorganiza) i n implicaiile majore ce le genereaz folosirea exclusiv a unor esuturi meristematice cu celule slab difereniate. Datorit acestui fapt, n practic prin noiunea de meristem se nelege ntreaga zon apical, inclusiv cea organogen. Zona apical - constituie sub aspectul diferenierii citologice, un tot unitar, iar zona organogen - zona de expresie a domului meristematic. Apariia protuberanelor foliare, ca urmare a diviziunii periclinale la nivelul zonei organogene ntregete imaginea meristemului cu primul su produs, primordiile foliare. Diferenierea celular ce se manifest plenar n aceast zon are ca rezultat i apariia cordoanelor procambiale, care sunt numai n faza de structurare. Executarea prelevrii apexului prin incorporarea zonei organogene (0,3 mm) ofer, n general, condiii mai bune pentru detaarea explanului, incluznd i proturberanele primordiilor foliare. Practic, izolarea de meristeme se realizeaz sub lupa binocular, prin ndeprtarea succesiv a foliolelor i a primordiilor foliare pn la descoperirea domului meristematic. Acesta este detaat cu ajutorul bisturiului i transferat imediat poe mediu de cultur pentru a nu se oxida.

Cultura in vitro a unor specii agricole i horticole este, probabil, primul exemplu de implicare a cuceririlor biologiei celulare n ameliorarea plantelor. Concret, cultivarea in vitro a materialului vegetal (esuturi meristematice, celule, embrioni) permite obinerea rapid a unui numr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic. Potenialul culturii in vitro este imens, ns incomplet exploatat.

Embriogeneza somatic. Semine artificiale

Obinerea de semine artificiale

Embriogeneza: reprezint procesul iniierii i dezvoltrii unui organism. Se distinge fa de organogenez prin faptul c rezult o structur autonom care nu mai are legtur prin intermediul sistemului vascular, cu nici o alt structur iniial. n practic, termenul include toate procesele (mai mult sau mai puin sincrone) de dezvoltare a celor doi poli: apical i radicular. Embriogeneza somatic: reprezint procesul prin care, pornind de la celule somatice, fr legtur vascular cu esutul de origine, se formeaz o structur bipolar asemntoare embrionului zigotic. Embrionii somatici se pot diferenia dintr-un explant vegetal att direct, din celule somatice organizate ct i indirect, prin trecerea printr-o faz de calus. Organele plantelor se caracterizeaz prin anumite trsturi comune i anume: structura celular i tisular (substratul material i sediul proceselor biochimice), caracterul sistemic al organelor, polaritatea, simetria, orientarea n spaiu i regenerarea. Caracterul sistemic este dat de alctuirea acestora din ansambluri de esuturi specifice, subordonate activitii biologice proprii organismului i subordonarea fiziologic a organelor n cadrul organismului n ansamblul su, ceea ce asigur realizarea funciilor sale biologice. Polaritatea este dat de deosebirea morfologic i fiziologic ntre baza plantei i vrful ei. Aceast trstur prezint o importan deosebit n procesele de microbutire deoarece indiferent de poziionarea unui buta, rdcinile adventive se vor forma numai la baz, crescnd n jos, iar lstririle numai n partea superioar, crescnd n sus. Simetria, necesar pentru meninerea echilibrului plantei n asigurarea verticalitii se realizeaz de la baz (cazul rozetelor de frunze) sau pe tulpina plantei. Precondiiile morfogenezei vegetale Totipotenialitatea celular Competena de regenerare potenialul pentru diviziune efectul de poziie predispoziia Totipotenialitatea celular

La nceputul secolului XX, Gottlieb Haberland (1902) a experimentat cultura celulelor de tip mezofilian pe un mediu de cultur. Dei celulele cultivate nu au intrat n diviziune, acest experiment este important pentru fundamentarea teoriei totipotenialitii celulei vegetale. Totipotenialitatea celular se definete ca fiind capacitatea genetic a celulelor vegetale individuale, nucleate, de a regenera un organism vegetal ntreg, structural i funcional, n mod direct sau prin intermediul unei faze de calus. Teoretic, toate celulele somatice sunt totipotente (Steward et al., 1958; Steward, 1968), dar practic exist diferene mari ntre diversele tipuri de celule, speciile vegetale, gradul de dezvoltare a celulelor de acelai tip, etc. n stadiul difereniat al celulei, expresia capacitii totipoenei se numete competen morfogenetic. Incapacitatea unor specii/grenotipuri de a manifesta totipotena celular este confundat adesea cu lipsa capacitii de regenerare. Expresia variabil a acestei competene este doar rezultatul gradului de specializare i a statutului fiziologic al celulei respective sau a incapacitii cercettorului de a identifica condiiile de cultur optime cerute de acest proces. Competena de regenerare ntr-un organism vegetal intact, la nivelul celulelor nalt specializate, nu mai apar niciodat schimbri, ntruct prin ultraspecializarea lor acestea i pierd capacitatea de a forma plante noi i deci, aceste celule nu pot deveni morfogenice. Unele celule i pstreaz capacitatea pentru diferenieri particulare sau pentru morfogenez, sau pot dobndi aceast capacitate ca rspuns la un stimul adecvat; acest tip de celule se numesc celule competente. Competena reprezint prima condiie a unei celule spre morfogenez, adic de a urma o cale de dezvoltare definit. In vitro competena de regenerare este influenat direct de genotip (genele nucleare, genele citoplasmatice i genele de interaciune), faza ontogenetic a explantului iniial precum i de condiiile de cultur (mediul i factorii fizici) alei. Toi aceti facori sunt folosii n stabilirea unui rspuns morfogenic, relativ comun, n cadrul unei specii vegetale.

potenialul pentru diviziune- reprezint precondiia esenial n alegerea explantului iniial, fiind definit de prezena unei capaciti de diviziune ridicat i o plasticitate morfogenetic pronunat

efectul de poziie n 1878 Vchting sublinia importana poziiei unei celule n organism demonstrnd c destinul ei este n funcie de poziia sa (teoria proximitii celulare). Dei toate celulele specializate sunt derivate dintr-o celul iniial (celula ou) nedifereniat, dar care se divide, forma i polarizarea celulelor, a esuturilor i respectiv, a organelor vegetale ale unui organism, este stabilit nc din faza embrionar. Stadiul de difereniere odat fixat, are un rol determinant n evoluia ulterioar a explantului prelevat. Astfel, explantele prelevate din partea inferioar formeaz muguri vegetativi (lstari) n proporie de 100 %, explantele din zona median formeaz muguri n procent de aproximativ 25 % care evolueaz spre lstari floriferi iar explantele prelevate din zona florifer, sunt capabile s regenereze, pe substratul de cultur, direct structuri florale.

predispoziia- este realizat prin utilizarea esuturilor tinere, aflate n cretere (de exemplu agregate celulare friabile periclinale, celule mari nedifereniate din coleoriz, mezocotil, apex radicular, etc.).

Organogeneza direct
Explant primar Meristemoid Primordii de organe

Organogeneza indirect
Calus Meristemoid Primordii de organe

Explant primar

Formarea organelor de novo prin intermediul organogenezei indirecte poate duce la creterea posibilitii de introducere a variaiei n constituia cromozomial. De exemplu, schimburi poliploidice la nivelul celulelor aflate n faza de calus i astfel, poate determina apariia unor organe care s prezinte att variaii fiziologice ct i morfogenice. Pentru cercetrile care sunt dirijate n scopul determinrii cilor fizio-chimice a procesului de organogenez exist un alt motiv care necesit reducerea sau mcar minimalizarea acestui tip de dezvoltare organogenetic. Prezena unui stadiu de calus aflat n diviziune determin o complicare a analizelor evenimentelor moleculare care nsoesc i care pot determina producia organelor de novo. Grupurile de celule care n mod particular sunt destinate pentru a deveni organogenice se gsesc ntr-un numr relativ redus ntr-o mas mare de celule de calus aflate n diviziune, ceea ce limiteaz foarte mult capacitatea de analiz a fiziologiei i chimiei specifice acestor celule (Schwartz i Beaty, 1996). Organogeneza direct se realizeaz fr o faz intermediar de calus, secvena evenimentelor sintezei organelor de novo fiind urmtoarea: - explantul de iniiere - meristemoidul - primordiul organului. Cea mai mare diferen dintre cele dou ci de sintez de novo o reprezint prezena sau absena unui stadiu intermediar detectabil de calus. esutul de calus coninnd celule care au fost difereniate n forme mai puin specializate din punct de vedere morfologic i care sunt foarte flexibile schimbrilor, pot servi ca material de pornire pentru organogeneza de novo. n absena unui stadiu intermediar de calus, celulele prezente n interiorul explantului au capacitatea de a aciona ca precursori direci ai noului primordiu. (pentru exemple de organogenez direct sau indirect pornind att de la explante de tip meristematic ct i nemeristematic, n sisteme diferite de cultur, vezi Hicks, 1980). Culturile n care se induce organogeneza sunt folosite ca modele sistem pentru a determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rdcinile i tulpinile n mod

direct, iar prin generalizare, de a da rspunsuri proceselor morfogenice. ntr-un astfel de model, procesul de organogenez este mprit n cteva faze, conform schemei adaptate dup Christianson i Warnick, (1985).
competen determinare

EXPLANT
(regenerare)

ORGAN
dedifereniere inducere difereniere (redifereniere)

Punctul de interes n reprezint cele dou faze iniiale care preced faza de difereniere, adic de pierderea caracterului de specializat. Aceste faze cuprind evenimente care ncep cu dediferenierea, ceea ce duce la obinerea competenei, urmat de iniiere care culmineaz cu stadiul complet de determinare. Diferenierile morfologice i de dezvoltare ale organului nou format pot duce la realizarea structurii funcionale dorit. Primele dou faze ale modelului presupun evenimente care se desfoar naintea morfogenezei (Hicks, 1980). Embrionii, meristemele apicale, organele primordiale i straturile de celule ale organelor mature sau fragmente complexe ale organelor mature, chiar organe intacte i protoplati, pot fi folosii ca explantele de iniiere. Dediferenierea (dup Schwartz i Beaty, 1996) Procesul de dedifereniere presupune reversia spre un stadiu mai flexibil, plastic, care poate s dea sau nu natere unui esut de tip calus. n cazul organogenezei directe, celulele competente care nu au produs calus pot fi considerate ca singurele implicate n formarea organelor progenitoare, ceea ce presupune c aceste celule previn procesele de dedifereniere, fie n mod individual, fie n grupuri mici destinate de a produce noi primordii. Explantele foliare de Convolvulus arvensis L. produc rdcini i lstari prin intermediul unei ci organogenice indirecte care implic procese de dedifereniere ce duc la formarea unei cantiti limitate de calus din care sunt generate organe noi (Christianson i Warnick, 1983). Rezultatul completrii acestei prime etape const n obinerea statutului de competen a explantului iniial, statul care se caracterizeaz prin capacitatea de a rspunde la stimulii organogenetici. Atingerea nivelului de competen de ctre esutul implicat nu reprezint totdeauna un proces realizat ntr-o singur etap, uneori

fiind necesar o etap intermediar n care se folosesc fitoregulatorii de cretere. De exemplu, n cazul calusului de Medicago sativa care a fost cultivat timp de 4 zile pe un mediu cu o concentraie relativ ridicat de chinetin i o concentraie sczut de 2,4-D au fost obinute rdcini. Lstarii sunt produi cnd calusul este tratat n acelai regim de cultur, cu excepia faptului c raportul regulatorilor de cretere este schimbat (concentraii mari de 2,4-D i sczute de chinetin). Tratamentul cu fitoregulatori de cretere urmat de transferul pe un mediu lipsit de regulatori de cretere nu este suficient ca s aduc esuturile n faza a doua de iniiere, faz cerut pentru producerea rdcinilor sau a tulpinilor (Walker et al., 1979). Este necesar o anumit mrime cu o limit minim de 105 m, precum i o mrime minim a diametrului agregatelor celulare de calus pentru a fi competente pentru iniierea morfogenezei. C. Regenerare prin embriogenez somatic (nezigotic) Embriogeneza somatic a fost observat pentru prima dat de Reinert (1958) i apoi de Steward i Mearks (1958). Regenerarea prin embriogenez somatic se distinge evident de regenerarea prin meristeme datorit unor caracteristici specifice de dezvoltare i anume: Formarea unui embrion (somatic dar i zigotic) ncepe de la o singur celul i trece obligatoriu prin fazele globular, cordiform, torpedou i de maturare (faza cotiledonal); rezultatul este o structur bipolar, deinnd dou tipuri de meristeme: radicular, la un capt i, caulinar, la cellalt capt, n timp ce organogeneza d natere numai la un singur tip din cele dou meristeme. Embrionii somatici trebuie s ndeplineasc obligatoriu criteriul de baz al unei structuri bipolare, adic formarea unei structuri vasculare proprii i izolate; n cazul organogenezei, vasele conductoare asigur continuitatea legturii cu esutul original (calusul). Proteinele specifice care apar n cotiledoanele embrionilor somatici nu au fost identificate n frunzele regenerate din lstarii adventivi (Crouch, 1982).

Embriogeneza in vitro, pornind de la celule somatice, trebuie vzut ca o proprietate general specific plantelor superioare. Cnd embrionii somatici sunt obinui pornind de la o singur celul procesele decurg de la omogen i general spre heterogen i particular, fenomenul demonstrnd indiscutabil totipotenialitatea celular; prezena unui program de dezvoltare foarte bine conservat este nnscut ntr-un numr mare de tipuri de celule. Culturile de celule embriogenice permit ca ntreg genomul vegetal s poat fi manipulat genetic prin tehnicile biologice. Odat ce celulele prolifereaz, pot fi modificate genetic, iar plantele regenerate din astfel de celule modificate pot fi reconstituite plante modificate. Embriogeneza somatic Un embrion, zigotic, somatic, (direct sau indus), este definit ca un individ nou, rezultat dintr-o singur celul, care nu are legtur vascular cu esutul mam (Haccius, 1978) i este stadiul primar multicelular al unui individ, stadiu care are loc nainte de dezvoltarea structurilor i a organelor caracteristice a unei specii date. n majoritatea organismelor, embrionul este o entitate distinct morfologic care funcioneaz ca un stadiu intermediar n procesul de tranziie de la viaa gametofitic la cea sporofitic (Gray, 1996). La speciile superioare, tipic este embrionul zigotic, care se dezvolt n interiorul seminei. Acest tip de embrion se formeaz ca produs al fuziunii gametice, n urma reproducerii sexuale, fiind denumit embrion zigotic. Caracteristic speciilor vegetale este faptul c din esuturi nedifereniate pot s formeze embrioni nezigotici, perfect formai morfologic i funcional. Deoarece acest tip de embrioni se formeaz apomictic (pe cale asexuat), plantulele care se dezvolt din ei sunt identice genetic cu planta mam. Tipurile de celule din care pot s apar astfel de formaiuni aparin diferitelor esuturi somatice i sunt ntr-un numr diferit att n faza gametofitic ct i sporofitic a ciclului vegetal. Iniial, embrionii somatici au fost denumii embrioizi, pentru a sublinia diferena fa de embrionii zigotici i din pcate acest termen mai este meninut n anumite lucrri. Diferena dintre embrionul zigotic i cel somatic nu este foarte bine neleas i descris n literatur.

Tabel.6. Clasificarea embrinilor (dup Bhojwani i Razdan, 1983)

1.

Embrioni zigotici

Formai prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului Formai din alte celule dect cele zigotice

2. -

Embrioni nezigotici: embrioni somatici

formai de celulele sporofitice, cu excepia zigotului embrioni somatici formai direct din ali embrioni sau organe formai din celule ou nefertilizate de gametofilul mascul (microspori,

embrioni adventivi embrioni partenogenetici embrioni androgenetici formai

grunciori de polen)

Datorit faptului c majoritatea acestor tipuri de embrioni pot fi manipulai n culturile in vitro, sistemele de cultur embriogenice sunt folosite ca baz n metodologiile destinate mbuntirii calitative a plantelor, deoarece permit nu numai clonarea prin propagarea vegetativ, dar i schimbri specifice i direcionate care pot fi introduse n indivizi de elit selecionai. Celulele individuale modificate sau embrionii pot fi dup aceea multiplicai eficient in vitro, ntr-un numr foarte mare de exemplare nainte de dezvoltarea plantei. Aceas modalitate de manipulare genetic elimin consecinele nedorite ale reproducerii sexuale (recombinarea genetic n mas i ciclurile de selecie cerute), astfel nct tehnologia de ameliorare este net superioar prin reducerea timpului i a efortului de execuie. Condiiile de cretere a embrionilor somatici versus embrioni zigotici n smn, n esutul nucelar, embrionul se formeaz ca rezultat al fertilizrii unei celule ou. Unele specii au tendina de a forma mai mult de un embrion, ca urmare a diviziunii celulei embrionice primare, rezultnd poliembrioni (la unele varieti de Citrus). Embrionii somatici pot aprea uneori i n natur, din esut ovular fr fuziunea unor celule sau nuclee, proces denumit apomixie. Originea lor este unicelular (dintr-o

celul somatic diploid a sacului embrionar, fiind denumii apospori- sau dintr-o celul nucelar, fiind denumii embrioni nucelari). Mai rar, embrionii somatici se formeaz direct pe frunzele unor specii ca de exemplu Kalanchoe, Ranunculus Asplenium, etc. n smn, esutul nutritiv, endospermul, mbrac embrionul zigotic aflat n dezvoltare. n primele faze ale embriogenezei, substanele nutritive ajung la embrionul zigotic att prin celulele suspensoare ct i prin suprafaa embrionului propriu-zis. n funcie de specie pot s apar diferene n modul de nutriie prin suspensor sau embrionul propriu-zis, de la o specie la alta. Spre deosebire de aceasta, n cazul embrionilor somatici faptul c se dezvolt fr esut protector (ei nu sunt mbrcai de un esut precum endospermul), face ca ei s nu fie subordonai unui regim nalt controlat i specializat (Gray i Purohit, 1991). Cel mai adesea, suspensorul este singura legtur ntre embrion i mediul de cultur. Aceasta demonstreaz c suspensorul poate servi ca mod de asigurare a nutriiei necesare i c endospermul nu este absolut necesar n timpul embriogenezei i a germinaiei (Gray, 1996). Ce este o smn ? O smn vegetal este o structur generativ, alctuit din embrion, endosperm i un nveli de protecie denumit testa. La dicotiledonate embrionul este alctuit din dou cotiledoane ataate unei axe centrale. Partea apical, plumula, crete sub form de lstar iar partea bazal este alctuit din hipocotil i radicel, viitorul sistem radicular. Endospermul asigur suportul nutritiv pe durata germinaiei, pn cnd plantula este capabil de fotosintez. Testa, asigu protecia embrionului pe durata germinaiei fiind ndeprtat pentru eliberarea rdcinuei i apoi a tulpiniei. Ce este o smn artificial? Seminele arificiale au fost introduce njurul anilor 1970 ca analog seminelor obinuite. Acest produs se adreseaz speciilor care nu produc semine viabile, reprezentnd metoda de multiplicare a acestora. Datorit dimensiunilor lor mici, seminele artificiale prezint i avantaje n ceea ce privete manipularea, depozitarea, transportul i plantarea lor.

Cum se obine o smn artificial? Seminele artificiale se obin prin ncapsularea unui propagul vegetal (embrionul) ntr-un matrix format dintr-un material ce permite creterea lor ulterioar ntr-o plant. Propagulele vegetale utilizate n obinerea seminelor artificiale pot fi meristeme sau, cele mai folosite, embrionii somatici obinui din culturi aseptice prin multiplicarea in vitro, la scar industrial. Endospermul este realizat dintr-un hidrogel obinut natural din alge (agar, carageenan sau alginat), diferite plante (latexuri, guar) sau din microorganisme (dextran, gellan sau gum xantan.). La ncapsulare se pot aduga i elemente nutritive, fitohormoni sau pesticide i fungicide. Bila de alginat, coninnd embrionul somatic, este drajat (testa seminei artificiale). n cultur, aceste propagule vegetale pot fi crescute relativ uor, pe medii nutritive,dnd natere unor plante individuale. Avantajele seminelor artificiale Tehnologia seminelor artificiale prezint un real potenial de asigurare a uneii surse de material vegetal valoros prin combinarea beneficiilor multiplicrii vegetative la scar cu asigurarea uniformitii genetice foarte ridicat( ca urmare a clonrii in vitro) i a posibilitilor de conservare pe termen lung. Seminele artificiale prezint potenial pentru agricultur prin faptul c tehnologia de obinere este relativ simpl, ieftin, pretabil pentru producia industrial. (Gray i Purohit, 1991; Redenbaugh et al., 1991; Redenbaugh, 1993). Tehnologia seminelelor artificiale este folosit i pentru obinerea individual de plante modificate genetic.