C5.

Amplificarea genica - PCR i metode derivate

Adrian Onu, Dr. St. Nat. Adriana Costache, Biochim.

Facultatea de Bioinginerie Medical. Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino.

C5. Amplificarea genica - PCR i metode derivate

Reacia de amplificare enzimatic (polimerizare n lan)

Dezvoltarea tehnicii are la baza descoperirea Polimerazei Taq (din Thermus aquaticus) n 1976 polimeraza stabil la temperaturi nalte (~ 94o C), la care moleculele de ADN, n mod normal dublu catenare, disociaz i astfel fiecare catena poate fi copiat. Reacia de amplificare enzimatic permite obinerea unei cantiti semnificative de ADN pornind de la cantiti infime. ADN-ul obinut este identic cu cel iniial, aceasta reprezentnd matria. Reacia n sine a fost inventata de de Kary Mullis n 1983.

SCOP
5.1 nelegerea 5.2.Prezentarea principiilor de baza ale amplificrii genice a amplificrii genice. ARN RT-PCR. Prezentarea metodologiei i a reaciei de amplificarea 5.3. Cuantificarea genica a ADN (Reacia materialului genetic de polimerizare n lan prin metode de PCR). amplificare. Real time PCR.

nelegerea principiilor de baza ale amplificrii genice. Prezentarea metodologiei i a reaciei de amplificarea genica a ADN (Reacia de polimerizare n lan PCR).

Replicarea ADN

Aplicaiile reaciei de amplificare enzimatic (PCR)

Principala aplicaie este cea analitic. Prin amplificarea unei cantiti mici de ADN, se poate detecta prezena sau se pot caracteriza moleculele de studiat. O alt aplicaie este preparativ. Se poate face i modificarea fragmentelor de ADN, pentru introducerea de situsuri de restricie (n scopul clonrii) sau introducerea unor elemente funcionale, n scopul verificrii ipotezelor de lucru. Categoria a doua de experimente se poate numi generic mutagenez dirijat.

PCR reprezint sinteza n vitro unor secvene de ADN. Aceast reacie imit replicarea ADNului n vivo. Diferena const n faptul c pasul de denaturare nu este realizat enzimatic ci termic. Denaturarea fiind termic, se pot folosi pentru PCR diferite polimeraze termostabile, corespunztoare organismelor termofile, n funcie de scop.

Reacia de amplificare
ADN matria

denaturare ampliconi ADN monocatenar denaturare

anelarea primerilor

elongare

PCR multiplicarea exponenial

Tipuri de polimeraze termostabile

Taq-polimeraza fr activitate de exonucleaz 3-5, are vitez de reacie destul de mare. Deoarece nu are activitate de proofreading, se pot strecura erori n copierea moleculelor de ADN. Vent-polimeraza, Pwo-polimeraza, Pfu-polimeraza s. a. au activitate exonucleazic 3'-5' (activitate de proofreading) i pot repara greelile de copiere a matriei. Ele, ns, au o vitez mai mic. Vent-polimeraza are o fidelitate de 5 15 ori mai mare dect cea observat pentru Taq polimeraza. Tth-polimeraza este o ADN-polimeraz care poate folosi i o molecul de ARN drept matria (n prezenta Mn2+). Este util n cazul RT-PCR, reacia realizndu-se ntr-o singur etap.

Conceptul de poofreading

Mini ghid practic pentru reacia de PCR

Ce poate fi amplificat

Pot fi utilizate mai multe tipuri de probe cum ar fi: ADN genomic sau plasmidial, ARN (purificai cu ajutorul kiturilor sau prin metode clasice cu solveni organici de tip: fenol, cloroform, etc.). Se poate folosi i direct materialul biologic, cum ar fi cantiti foarte mici de celule (dintr-o colonie bacterian de ex.). Rezult matria ADN (proba de analizat)

Aparatura necesara:

Termocycler (aparat pentru PCR) Congelator de -200C Cutie ghea Pipete automate Vortex Centrifug (20,000 x g) Main de preparat ghea (sau acces la) Hota (sau spaiu curat).

Termocycler (aparat pentru PCR)

Termocycler (aparat pentru PCR) const ntrun bloc de transfer termic capabil sa rceasc i s nclzeasc foarte repede probele aflate nuntrul lui. Unele aparate au un capac fierbinte (hot lead) pentru a preveni evaporarea

Main PCR home made

http://openpcr.org/the-machine/

Reactivi necesari

Ap purificat steril (cea mai bun calitate de ap disponibil) 10 X Tampon PCR 25 mM MgCl2 / 100mM MgSO4 (n funcie de compoziia tamponului) pentru optimizare Amestec dNTP (ATP, CTP, GTP i TTP) 2mM Primer 1 (Upper) Primer 2 (Lower) ADN polimeraz

Materiale necesare

Tuburi de PCR de 0.2 ml sau 0.5 ml (n funcie de aparatul pentru PCR) Vrfuri pentru pipete automate de preferin cu filtru.

PROCEDURA

n termeni de baz, PCR se realizeaz prin combinarea unei probe de ADN cu primeri oligonucleotidici, deoxiribonucleotidtrifosfai (dNTP) i o ADN-polimeraz termostabil (ex. Taq-polimeraza),ntr-un tampon corespunztor. Apoi, prin nclzirea i rcirea repetat a amestecului, se poate obine nivelul de amplificare dorit. Primeri = fragmente de ADN monocatenare mici de 18 40 de baze, care au corespondent n ADN-ul de analizat.

PROCEDURA - Amestecul de reacie

Se adaug ntr-un tub subire de PCR pe ghea:
Componentele probei Apa deionizat steril 10 X Tampon PCR 2mM dNTP amestec Primer 1 Primer 2 ADN polimeraz 25 mM MgCl2 / 100mM MgSO4 (n funcie de ADN matri compoziia tamponului) 10 pg-1 g variaz 1x 0.2mM din fiecare 0.1-1 M 0.1-1 M 2U/100 l 1-4 mM Concentraia final Cantitatea per 100 l de amestec de reacie variaz 10 l 10 l variaz variaz variaz variaz

PROCEDURA condiii de lucru

Toate soluiile folosite trebuiesc inute n ghea, vortexate uor i centrifugate la turaie mic, pentru a putea fi colectate n fundul tubului. Se acoper proba cu 50 l de ulei mineral sau se adaug o cantitate corespunztoare de cear. Alternativ se poate folosi un aparat pentru PCR, al crui capac se nclzete i care previne condensarea apei pe capac.

PROCEDURA optimizarea PCR

Sunt de preferat concentraiile mai mici de primeri, de matri ADN i polimeraz deoarece astfel se obin produi mai curai. Pentru mai bune rezultate, concentraia Mg2+ se determin empiric, ea depinznd de concentraiile celorlali compui (cum ar fi dNTP).

PROCEDURA optimizarea PCR (2)

Cantitatea de amestec de reacie per tub se poate varia n funcie scopul utilizrii PCR i resursele laboratorului. n acest caz se adapteaz volumul uleiului mineral la volumul amestecului. Dac se dorete obinerea unei cantiti mari de amplicon, atunci se va folosi un volum mai mare. Pentru scopuri analitice sau n scopul economiei de reactivi atunci se vor folosi volume mai mici (ex.: 20l). Condiiile menionate au avantajul fidelitii

Programul de PCR:

Protocolul general const din realizarea unor cicluri (cam 30 40), cu ajutorul unui aparat numit thermocycler. Acest aparat poate nclzi i rci probele ntr-un timp foarte scurt.
Etapa Denaturare Denaturare Renaturare Extensie Extensie final Timp 5 minute 1 minut 1 minut 1 minut 7 minute Temperatura 94oC 94oC Ta 72oC 72oC Numar de cicluri 1 30-40

Fiecare ciclu este alctuit din trei trepte de temperatur. Ta = temperatura de anelare.

Programul de PCR - denaturarea

Denaturarea se realizeaz la 94C:

n timpul denaturrii, ADN dublu-catenar se desface, formndu-se ADN monocatenar. n acest moment, toate reaciile enzimatice se opresc. Cu toate c acest pas lipsete din unele protocoale de PCR, este important din dou motive: 1. Creeaz o cantitate nsemnat de matri, disponibil nc de la iniierea reaciei 2. Previne legrile nespecifice ale primerului la matri

Programul de PCR - anelarea

Anelarea se realizeaz la Ta = 45 72C. La aceast temperatur, primerii sunt liberi n soluie ntre ei i matri se formeaz i se desfac, continuu legturile de hidrogen. Legturile cele mai stabile (care dureaz mai mult) se formeaz ntre fragmente de ADN perfect complementare. De bucile de ADN dublu-catenar rezultate, se poate ataa polimeraza care i ncepe activitatea de copiere a matriei Astfel se stabilizeaz legtura ntre cele dou tipuri de ADN.

Programul de PCR - anelarea

Ta este bine s fie cu aproximativ 5C mai jos de Tm-ul primerilor. Dar exist situaii experimentale n care aceast teorie nu este valabil. Atunci Ta trebuie determinat empiric. Timpul de anelare poate varia. Trebuie inut, ns, cont de faptul c un timp mai lung poate duce la amplificri nespecifice. M = temperatura de melinit (temperatura la care ADN-ul este denaturat).

Programul de PCR - elongarea

Elongarea (extensia) se realizeaz ce obicei la 72C Este temperatura optim la care lucreaz Taq ADN-polimeraza. Ea adaug, catenei n formare (complementar cu matri a), dNTP, n direcia 5'3'. i aici timpul poate fi variabil. El trebuie adaptat mrimii ampliconului (fragmentului de ADN ce urmeaz a fi multiplicat). Se pune cam 1 minut pentru fiecare 1000 perechi de baze. Deoarece sunt copiate ambele catene de ADN utilizate ca matri, numrul de copii creste exponenial De exemplu: dac exist o singur copie a unei gene, dup primul ciclu vor fi 2 copii, dup al doilea vor fi 4 copii, dup al treilea vor fi 8 copii etc. Astfel n 20 de cicluri se realizeaz o amplificare de 1 milion de ori (220 copii).

Condiii de lucru

Pentru reacia de PCR se folosete o diluie adecvat a ADN, care s asigure o contaminare minim cu materialul iniial, evitnd probleme ulterioare legate de eventuala confuzie a benzilor. Cantitatea de ADN este un compromis ntre necesitatea de a avea o band clar a ADN-ului amplificat i necesitatea de a folosi un numr minim de cicluri n scopul reducerii ansei unei mutageneze aleatoare. Pentru verificare se realizeaz controale pozitive (se folosesc primeri sau un alt ADN matri cunoscut, acetia dnd amplitudini tiui) i controale negative (n amestecul de reacie se omite ADN-ul matri). Prin controalele pozitive se verifica dac amestecul de reacie este fcut corect, iar prin cele negative ne asigurm ca nu exist contaminani n mediul de reacie (nu ar trebui s se amplifice nimic).

CRITERII DE VALIDARE/ACCEPTARERESPINGERE

Probele obinute n urma PCR, trebuie analizate prin electroforeza n gel de agaroz. Concentraia gelului depinde de mrimea moleculei. n general se folosete un gel de 1% agaroz. Dup migrare, gelul (care conine bromur de etidiu) se examineaz la UV. ARN-ul, n mod normal migreaz n fa ADN-ului. ADN-ul cromosomal se poate bloca n godeu sau migreaz foarte puin

Exemplu de amplificare enzimatica corect.

Rezultatul unor amplificri enzimatice corecte. Produii obinui sunt foarte buni calitativ (sunt amplificri nespecifice), iar primerii sunt consumai aproape n totalitate.

Exemplu de amplificare nespecific

Exemplu de amplificare nespecific datorat unor primeri greii, n cazul genei pentru guanilat kinaza din E.coli: 1. PCR cu primeri greii 2. PCR cu primeri coreci 3. Marker (100 pb INVITROGEN)

Se observ c n proba 2. s-a obinut o cantitate foarte mare de produs de PCR. S-au folosit aceleai condiii pentru ambele probe.

Tipuri de PCR
Exist mai multe tipuri de PCR:

hot-start PCR; Fusion-PCR; PCR asimetric; long template PCR; nested PCR; touchdown PCR; inverse PCR; RT-PCR, real-time PCR;

Hot-start PCR (1)

Este o metod prin care se obin, n general, produi curai. Astfel, se amestec ADN-matri i primerii i se in la temperatur nalt pentru a evita legarea nespecific (legarea primerilor n zone care nu sunt perfect complementare). La nceput se adaug toate componentele necesare reaciei, cu excepia polimerazei. Aceasta se pune nainte s nceap primul ciclu (dup ce amestecul a fost incubat cteva minute la temperatur nalt).

Hot-start PCR (2)

Acest mod de a lucra este dificil deoarece tuburile trebuie inute la 1000C n timpul lucrului. Se poate recurge la alte moduri de lucru. Unul dintre ele este de a tine tuburile pe ghea n timp ce se adaug reactanii Dup care se pun ntr-un thermocycler prenclzit. Se mai poate utiliza un anumit tip de cear care conine o particul dintr-un reactant, care se pune dup ce s-a fcut amestecul. Cnd se atinge temperatura de ~800C, ceara se topete i se ridic la suprafa, ceea ce permite amestecarea tuturor reactanilor necesari reaciei Se prefer, de obicei, prima variant, cea cu cear fiind utilizat mai rar i, n plus, este scump.

Fusion-PCR (sau PCR de fuziune)

Este util n cazul n care avem dou (sau mai multe) fragmente de ADN dublu-catenar mai mici i vrem s le unim, formnd o molecul de ADN mai lung. Se realizeaz dou reacii polimerazice. Prima este fuziunea propriu-zis, iar n a doua se amplific produsul rezultat din prima.

Fusion-PCR
denaturare regiuni complementare

prima reactie de PCR

a doua reactie de PCR

PCR asimetric

Se folosete pentru obinerea de ADN monocatenar. Se utilizeaz primerii, ntr-un raport molar de 100:1 (ex.: primerul 1 la 0,5M, iar primerul 2 la 0,005M). Astfel se produce ADN sens monocatenar n cantitate mult mai mare, util n cazul secvenierii

Long Template PCR

Long Template PCR - PCR pentru fragmente mari) Este o metod folosit pentru a amplifica fragmente de ADN mari (de peste 5 kb). Este necesar o ADN-polimeraz cu proofreading (are activitate 3' 5' exonucleazic). Se poate lucra cu un amestec de Taq-polimeraz i o alt polimeraz proofreading (ex.: Pwo ADN polimeraza, Pfu ADN polimeraza, Vent ADN polimeraza etc.).

Nested PCR

Este utilizat pentru creterea sensibilit ii reaciei Const din dou reacii PCR, n care se utilizeaz dou perechi de primeri. Cu prima pereche, se amplific un fragment de ADN mai lung. Cu a doua pereche, este amplificat o bucat mai mic de ADN, rezultat din prima.

Nested PCR (din dou reacii succesive)

Denaturare Anelare Denaturare Anelare

Elongare

Elongare

Prima amplificare

A doua amplificare

Touchdown PCR

Necesitatea apare datorit faptului c temperatura de anelare se modific cu cantitatea de ADN. Aceast metod implic 0 scderea temperaturii de anelare cu 10 C la fiecare al doilea ciclu, pn la o anumit temperatur de anelare (touchdown) care este meninut pentru aproximativ 10 cicluri. Astfel se formeaz o cantitate mare din produsul necesar. Se utilizeaz n situaia n care nu se cunoate n totalitate secventa genei respective.

Inverse PCR

Se folosete atunci cnd cunoatem doar secventa din centrul moleculei de ADN. Se taie cu enzime de restricie i apoi se analizeaz fragmentul de interes.

E1

E2

Multiplex-PCR

Este un PCR efectuat cu mai multe seturi primeri ntrun amestec unic pentru a produce amplitudini de diferite dimensiuni, care sunt specifici diferitelor secvente de ADN. Prin orientarea spre mai multe gene dintr-o dat, informaii suplimentare pot fi obinute de la un singur test, care altfel ar avea nevoie de mai multi reactivii i timp pentru a putea fi efectuat. Temperaturile pentru fiecare dintre seturile de primeri trebuie optimizate pentru a funciona corect n reacie Dimensiunile ampliconilor trebuie sa fie suficient de diferite pentru a fi vizualizate prin electroforez n gel de agaroz.

SURSE DE EROARE I EEC

Rezultate fals pozitive pot da probele contaminate. De aceea trebuie lucrat n hot i cu mare atenie Apa, vrfurile, tuburile folosite trebuie s fie sterile, plasticele fiind de unic folosin Reactivii trebuie alicotai n mai multe tuburi pentru a limita o eventual contaminare.

Rezultatele fals negative pot avea mai multe cauze: omiterea a cel puin unuia din reactivi, erori de pipetare, concentraia necorespunztoare a reactivilor (o variaie mic a concentraiei unuia dintre ei poate schimba semnificativ rezultatul), degradarea reactivilor, folosirea unui alt reactiv fa de cel corect, folosirea unei temperaturi de anelare i/sau amplificare necorespunztoare. Reactivii i consumabilele trebuie s fie lipsite de nucleaze. Temperatura de anelare se ajusteaz n funcie de Tm-ul primerilor, iar cea de elongare (amplificare) trebuie s corespund tipului de polimeraz folosit.

Cuantificarea materialului genetic prin metode de amplificare. Real rime PCR.

Real-time PCR

Real-time RT-PCR este o metoda sensibil, specific i reproductibil de RT-PCR care detecteaz cantitatea ampliconilor formai. Real-time PCR monitorizeaz emisia fluorescent din timpul reaciei, aceasta fiind un indicator al amplificrii, la fiecare ciclu PCR (n timp real). Real-time RT-PCR nu detecteaz mrimea ampliconului, deci nu poate face diferen a dintre ADN matri i cel format.

Cuantificarea prin colorani fluoresceni

Un colorant fluorescent se leag la ADN-ul dublu-catenar n timpul reaciei PCR, ducnd la apariia fluorescenei. O cretere a cantitii a ADN-ului de produs n timpul PCR, duce la o cretere a intensit ii fluorescenei msurabile n fiecare fiecare ciclu, permind astfel cuantificarea ADN n timp real Coloranii ADNdc, leg la toate produsele ADNdc inclusiv produsele nespecifice putnd interfera cu cuantificarea exact a secven ei de int.

Colorantul SYBR Green

Cuantificarea prin sonde

Sondele fluorescente reporter detecteaz doar ADN-ul care conine secvena complementar sondei i prin urmare, utilizarea sondei reporter crete semnificativ specificitatea, i permite cuantificarea, chiar n prezena de amplificare a ADN-ului non-specific. Sondele fluorescente pot fi utilizate n teste multiplex pentru detectarea mi multor gene n aceeai reacie, pe baza unor probe specifice marcate diferit, cu condiia ca toate genele vizate sa fie amplificate n mod similar .

TaqMan
(1) n sonde intacte, fluorescenta reporterului este redusa (stins). (2) Sonde ADN complementare sunt hibridizata i fluorescena reporterului este nc stinsa. (3) n timpul PCR, sonda este degradat de polimeraza Taq i reporterul fluorescent este eliberat.

qPCR (Real time PCR)

Real time PCR permite analiza cantitativ prin msurarea fluorescenei totale (stnga) i a specificitii (dreapta) prin evaluare temperaturii de topire.

Designul primerilor pentru PCR

Perechile de primeri ar trebui s aib temperaturi similare de topire, deoarece ambele reac ii au loc simultan. O temperatur de topire semnificativ mai mare dect temperatura de reacie pate produce hibridiza ntr-o zona incorect de-a lungul secvenei de ADN, n timp ce una semnificativ mai mic poate s nu lege ADN-ul la temperatura de reacie i extinderea sa nu aib loc. Secvenele trebuie s fie alese pentru a selecta o unic pentru o regiune a ADN-ului. O metod frecvent utilizat este cutarea BLAST.

Prezentarea amplificrii genice a ARN RTPCR.

RT-PCR

Este o metod care permite studierea ARNului, atunci cnd nu este n cantitate suficient. Se bazeaz pe construcia ADN-ului complementar. Se folosesc 2 primeri. ntr-o prima etap se realizeaz transcrierea invers, cu ajutorul unei revers-transcriptaze, provenite de la un retrovirus.

Transcrierea invers

Transcrierea invers const n obinerea unui lan de ADN folosind ARN ca matri. A fost identificat n retrovirusri, virusuri care folosesc acest tip de reacie pentru multiplicarea lor.

Paii transcrierii inverse n RTPCR

RN-aza 5' ARN (viral sau mesager) 3' 5' Hibrid ARN-ADN 3' 5' ADN monocatenar 3'

ADN Polimeraza PCR 5' 3' ADN dublu catenar 5' ADN monocatenar i primer 3'