Laboratorio 4: Tincin de microorganismos Biol 3725L

Repaso de diluciones
1 ml
1 ml 0.1 ml 1 ml 1 ml

9 ml 1 / 10 10-1

99 ml 1 / 100 10-3

9 .9ml 0.1/ 10 1/ 100 10-5

9 ml 1/10 10-6 1 ml

9 ml 1/10 10-7 1 ml 0.1 ml

1 ml

Cuntas colonias viables tengo? 1. Escojo el plato que tenga entre 25 250 UFC. 2. Utilizo la frmula de: UFC * (1/factor de dilucin)

10-8

TMTC

10-6

10-7

2 UFC

265 UFC

25 UFC

Reportar datos:
1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas 2. Dilucin en serie: reporte UFC/mL para las tres placas utilizadas en su sub-grupo (incluya los clculos)

Objetivos
Conocer el mecanismo bsico y ventajas de una tincin. Aprender conceptos bsicos relacionados a:
Proceso de preparacin de un frotis Tincin Gram Tincin cido-Resistente Tincin de Esporas Tincin de Cpsula (negativa).

Identificar caractersticas en las bacterias en estudio en base a las diferentes tinciones.

Tinciones de microorganismos
Tincin Gram (prctica) Tincin de Cpsulas - Tincin Negativa (prctica) Tincin de Esporas (prctica) Tincin cido-Resistente (teora) Tincin de flagelos (teora)

Morfologa y agrupacin de bacterias

Ya se han discutido mtodos de clasificacin por morfologa y medios de cultivo. Ahora utilizaremos tinciones con el fin de poder seguir caracterizando a las bacterias.

Espiroquetas Coco Bacilo

Morfologa y agrupacin de bacterias: Tincin

La tincin es una de las tcnicas ms utilizadas en los laboratorios de microbiologa para clasificar microorganismos. El tinte es un compuesto orgnico que le da contraste a la clula. cromgeno (solvente orgnico que le provee las propiedades de color) auxcromo (grupo qumico que se ioniza con el cromgeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos). La adhesin del tinte va a depender de la carga que posea.

Tincin

Tipos de Tinciones
Simple
Tamao, arreglo y forma Un solo tinte Directa Tie bacteria Negativa tie el fondo pero no a la bacteria

Diferencial
Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus caractersticas Ms de un tinte

Especfica
Para identificar estructuras: Ejemplos: Tincin de flagelos, cpsulas y esporas.

Ejemplos: Tincin Gram y cido resistente

Tincin simple: un solo tinte , afinidad por carga con componentes de la superficie de la clula Ejemplo : azul de metileno (+) (-) (-) (-) methylene blue (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Tincin diferencial: permite detectar tipos distintos de clulas

Azul-Violeta Rojo

Pasos de la Tincin Gram

Cristal violeta (1 minuto) Lavar con agua (Streptococcus sp.) Yodo (1 minuto) Lavar con agua Alcohol etlico al 95% (20 segundos) Lavar con agua Safranina (1 minuto) Lavar con agua Secar con bibolous paper

(Escherichia coli)
Desventajas de tcnicas de tincin:

requieren fijar la muestra con calor: (clulas mueren) calor + qumicos pueden distorsionar la forma original de las clulas

Gram+= azul-violeta, Gram = rojo

Tincin Gram
Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tie la bacteria color violeta. Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin. Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, sirve como solvente de lpidos y agente deshidratante de protenas. Remueve el cristal violeta. Contratinte- Safranina, tie de rojo la bacteria.

Resultados - Tincin Gram

Gram Negativo

Gram Positivo

Su pared celular contiene una capa gruesa de peptidoglicano

Gram +

Reaccin se basa en la diferencia en la composicin qumica de la pared bacteriana.

Gram Su pared celular contiene una capa fina de peptidoglicano

Pared celular procariota

Peptidoglicano: polmero de dos azcares modificadas (N-acetil glucosamina y N-acetil cido murmico ) y tetrapptidos enlace , 1-4

G
3

G
4

G = N-acetil glucosamina M = N-acetil cido murmico (murena)

tetrapptido (4 amino cidos)

Pared celular procariota

M G

G M

M G

G M

M G

G M

M G

G M

M
G M G M G M G M

M G

G M

M G

G M

M G

G M

M G

G M

Tincin Gram
Fundamento
Membrana externa de las Gram
es soluble en solventes orgnicos como el alcohol la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el complejo cristal violeta/yodo que se form por lo que va perdindose el color azul-violeta.

Las Gram + no tienen su capa susceptible a la accin de solventes orgnicos

se deshidratan los poros y se cierran retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-violeta.

Preparacin de la muestra para proceso de Tincin

Preparacin de frotis: Limpiar la laminilla con papel de lentes. Prepara el frotis Medio lquido- solo se coloca una porcin del cultivo con el loop en la laminilla. Medio slido- se coloca una gotita de agua destilada en la laminilla y se diluye la porcin de cultivo en ella. Se esparce bien. Secar a temperatura ambiente Fijacin por calor

Tincin Gram
Laminilla

Control positivo Gram + (Bacillus cereus) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Desconocido

Control negativo Gram (E. coli)

Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto). Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte. Cubrir frotis con yodo (1 minuto). Enjuague con agua destilada. Enjuague la laminilla con alcohol etlico 95% (no exceder los 30 seg). Enjuague la laminilla con agua destilada. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto). Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte. Secar laminillas con papel bibulous para remover el exceso de agua.

Secuencia de reacciones

Tincin de Cpsulas
Cpsula- estructura gelatinosa secretada por algunas bacterias
capas de polisacridos o protenas que revisten el exterior de un bacteria Funcin: adherencia y formacin de biopelculas (capas de crecimiento bacteriano) y proteccin contra fagocitosis (macrfagos, sistema inmunolgico)

La cpsula se compone de polisacridos, glicoprotenas y polipptidos. La mayora de las cpsulas estn compuestas de polisacridos, por lo que son solubles en agua.

Tincin de Cpsulas

cpsula

Tincin de Cpsulas
Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el frotis color oscuro Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario

No se enjuaga con agua porque la cpsula es soluble en agua funcin de decolorante El CuSO4 es absorbido en el material de la cpsula que ha sido decolorada - funcin de contratinte. La cpsula aparece azul clara en un fondo oscuro.

Tincin de Cpsulas
Preparacin de un frotis cargado (heavy). Dejar secar a temperatura ambiente. Cristal violeta 1% (5-7 minutos). Enjuagar con CuSO4 Secar con bibulous paper

Cryptococccus laurentii

Tincin de Cpsulas
Tincin simple-negativa
La tincin se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria. El tinte utilizado es India Ink (Se puede utilizar tambin

eosina o nigrosina).
Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

Efecto de Cielo estrellado

Tincin de Cpsulas
Tincin simple-negativa

 Clula vegetativa- forma metablicamente activa = bacterias. Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente resistente. Los miembros del gnero anaerobio Clostridium y del gnero aerobio Bacillus pueden existir metablicamente activos o inactivos.

Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

En condiciones ambientales hostiles ocurre esporognesis la cual forma la endospora. En condiciones ambientales favorables, ocurre germinacin, lo cual forma la clula vegetativa (bacteria).

Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

Endosporas
La esporognesis y la germinacin no son medios de reproduccin, son mecanismos de supervivencia de la clula. La composicin qumica de la bacteria la hace resistente a:
Calor extremo o excesivo Congelacin Radiacin Desecacin Agentes qumicos

Tincin de Esporas
Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la penetracin de este tinte. Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la clula vegetativa. Contratinte- Safranina, tie las clulas vegetativas. Note: De obtener una coloracin roja al final del proceso de tincin observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se tienen clulas vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso sera otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es Gram + o -.

Tincin de Esporas
Parrilla de metal Laminilla con frotis 1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y permita que el colorante humee, pero no hierva. 2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos el tinte se seca aada ms tinte. 3. Enjuague la laminilla con agua destilada. 4. Coloque tinte safranina (30 seg). Hot Plate 5. Seque la laminilla en papel bibulous. 6. Observe y dibuje la coloracin, morfologa y arreglo de las bacterias bajo el microscopio.

Beaker Agua

Resultado

Bacillus cereus
Espora (color verde) Clula vegetativa (color rojo)

Tincin cido-Resistente
Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son cido resistente. Los microorganismos cidoresistentes se caracterizan por tener una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene cido miclico.

Tincin cido-Resistente
Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenlico (5%). Puede penetrar la pared celular de las micobacterias. Agente decolorizante- alcohol cido (3% HCl +95% alcohol etlico). Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teir de azul las bacterias que quedaron incoloras. Los organismos que son decolorados por el alcohol cido no son cido resistente.
Azules: no son cido resistentes (no tienen cido miclico en la pared)

Tincin cido-Resistente

Mycobacterium tuberculosis
Observar laminillas!!!

Tincin de flagelos
Tipo de tincin en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s). Utiliza 2 tintes:
cido tnico (agente mordante: engruesa los flagelos) Rosalina (colorante que los define)

Mobiluncus spp.

Resumen resultados de tinciones

Tincin Gram (estructura de pared celular)

Tincin de esporas

Tincin de cpsula

Recapitulacin
Cul es la diferencia entre una tincin simple y una diferencial? Qu tipo de tincin es la Gram? Cul es el fundamento? Reactivos utilizados en la tincin Gram Qu otro tipo de tinciones puede mencionar? Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?