La Citometra de flujo: diagnstico y pronstico en las hemopatas malignas

I Simposio Internacional de Hemato-Oncologia. San Jos, 21 julio 2011

Citometra de flujo

Cito : Clula , metra: medicin.

Citometra de flujo

Es el estudio de la expresin de los genes a travs de sus productos: las protenas.

DIANAS TCNICAS
Celular: Citologa/Morfologa Inmunofenotipo

Tejidos: histopatologa Cromosomas: Genes:

Citogentica FISH

PCR (Reaccin en cadena polimerasa). FISH (Fluorescent in situ hybridation).

TCNICAS DE ANLISIS CELULAR

Anlisis
Informacin Informacin basada en en basada Localizacin de las clulas Velocidad Tipo Tipo de de informacin informacin MultiMulti paramtrica Baja Clula

Citometra de flujo
Clula No Alta

Biologa molecular

Media Media de de la la muestra muestra No No Alta Alta Cualitativa Cuantitativa Cunatitativa No

Cualitativa Cualitativa Cuantitativa Cunatitativa

PROCEDIMIENTO
Dispersin lateral (complejidad interna) Dispersin frontal LASER (Tamao)

PROCEDIMIENTO
Eosinofilos
DISPERSIN LATERAL
1110 0010 1011 0010 0101 0010 1001 0101 1010 1010

Neutrfilos Monocitos CD34+

CD45 PERCPCY5.5

Serie Eritroide

Linfocitos

UTILIDAD EN LA HEMATO-ONCOLOGA
1.Diagnstico Normal reactiva/regeneracin malignidad 2.Clasificacin de las hemopatas - asignacin de lnea - estadio de diferenciacin - relacin con el pronstico 3.Evaluacin de la efectividad del tratamiento: Deteccin de la enfermedad mnima residual (EMR): EMR-estratificacin de grupos de riesgo (reduccin o intensificacin del tratamiento)

UTILIDAD EN LA HEMATOONCOLOGA

Sndromes mielodisplsicos (SMD)

SMD: CONTRIBUCIN DEL INMUNOFENOTIPO

La contribucin del inmunofenotipo para el diagnstico de los SMD permanece limitada. OMS 2008: El inmunofenotipo en los SMD puede ser de utilidad diagnstico/pronstico ( en el futuro).

Criterios para el diagnstico de SMD.

Prerrequisitos:
1.Citopenia prolongada ( 6 meses) : Hemoglobina < 10g/dL , < 1800 neutrfilos /ul y plaquetas < 100.000/ul 2.Excluir otras enfermedades.

Criterios diagnsticos :

1.Observacin morfolgica de displasia en >10% serie roja y/o neutrfilos y/o megacariocitos. 2.Identificacin de anormalidades citogenticas caractersticas. 3.Porcentaje de blastos entre 5% a 19%.

Co-criterios diagnstico:

1.Anormalidades inmunofenotpicas. 2.Pruebas de inactivacin del cromosoma X (Test humara). Valent et al, Leuk Res, 2007

APORTE INMUNOFENOTPICO EN SMD

Diagnstico
-Sospecha de SMD

Subclasificacin de SMD
-AR vs CRDM -AREB (% de blastos).

Evaluacin pronostica

-Implementacin de sistemas de puntos.

Monitoreo de la enfermedad

-Seguimiento de las anormalidades inmunofenotpicas luego de la terapia.

HEMATOPOYESIS
Mdula sea
T/NK cell precursor

Sangre perifrica tejidos

B-cell precursor

Clula madre hematopoy?ca

Precursor linfoide

pDC precursor

clulas dendr?cas Neutrlos

G-CSF

IL7
GM-CSF

CFU-GM
M-CSF

CFU-G CFU-M

SCF IL3
Precursor mieloide
IL11 TPO IL9 EPO

CFU-Eo CFU-MC

Monocito/ Macrfago/DC Eosinlos Mastocito

CFU-Bs Baslos BFU-E Eritrocitos CFU-Mk Plaquetas

DISTRIBUCIN DE LAS DIFERENTES POBLACIONES EN MO

Subpoblaciones % CD34+ % CD34+ y/o CD117+ % Serie Roja % Neutrfilos % Monocitos % Eosinfilos % Basfilos % Mastocitos % Plasmocitos % Clulas B maduras % Precursores - B % Linfocitos - T % Clulas NK MO normal (n=12) 1.1 + 0.6 (0.3-2.6) 2.2 + 1.4 (0.6-6) 4.7 + 2.1 (2-9) 67 + 6.1 (57-80) 4.3 + 1.4 (2-6.5) 2.5 + 1.3 (0.8-5) 0.4 + 0.7 (<0.1-2.4) 0.02 + 0.01 (<0.03) 0.2 + 0.2 (0.01-0.5) 2.9 + 1.5 (1.6-6.3) 0.9 + 0.8 (0.1-3.9) 9.2 + 4.5 (2.6-18) 2.8 + 1.4 (0.7-5)

FITC

cControl nTdt cCD3 CD19 sControl HLA-DR HLA-DR CD11b CD15 CD36 CD33 CD71 CD65 CD2 c2D7 cB12

PE

cControl cMPO CD7 cCD79a sControl CD117 CD123 CD13 CD16 CD64 CD61 GphA 7.1 CD56 CD203c

PerCP.Cy5.5

CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45

APC

CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34/CD10 CD34/CD14 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34

Patrn normal de maduracin de lnea neutrfilo en Mdula sea (MO).

MYELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO
METAMIELOCITO

BANDA/ NEUTROFILO

CD13
CD13
103

CD33

CD15

CD11b
CD35

102

CD65 CD64
101

CD10

CD16 CD34

CD117

HLA-DR

CD54

4 estadios maturativos
1,40,7 11,0 2,7 28,6 5,6 58,5 -6,1

CD13

+/-/-

+/+ -/+

CD11b

100 101 102 CD11b FITC -> CD11b 11b/1 17/DR/1 3.108

103

104

100 101 CD13 APC -> 11b/1 17/DR/1 3.108

102

103

104

CD13

4 estadios maturativos

Citometra de flujo (CF) en SMD.

Qu subpoblaciones analizar ?
Generalmente blastos; neutrfilos y monocitos. Menos frecuente : serie roja y megacarioctica.

Qu anticuerpos y que combinaciones utilizar ?. Cules alteraciones fenotpicas deben ser consideradas?.
Aumento de las poblaciones Intensidad de fluorescencia Asincronismo madurativo

Definir un modelo de clasificacin ?.

Citometra de flujo en SMD.

Van de Loosdrecht et al, Haematologica, 2009

PARAMETRS A CONSIDERAR POR CF EN SMD

1. Recuento de blastos. 2. Deteccin de fenotipos aberrantes en blastos, mieloblastos y precursores B. 3. Identificacin de alteraciones en el patrn de maduracin en las poblaciones de neutrfilos, monocitos y clulas eritroides maduras. 4. Enumeracin de las alteraciones/ defectos fenotpicos identificados. (Clasificacin fenotpica).

PARAMETRS A CONSIDERAR POR CF EN SMD

1. Recuento de blastos. 2. Deteccin de fenotipos aberrantes en blastos, mieloblastos y precursores B. 3. Identificacin de alteraciones en el patrn de maduracin en las poblaciones de neutrfilos, monocitos y clulas eritroides maduras. 4. Enumeracin de las alteraciones/ defectos fenotpicos identificados. (Clasificacin fenotpica).

SMD
OMS 2008: Grupo de enfermedades que presentan alteraciones clonales en la clula madre hematopoyetica , caracterizadas por citopenias, displasias.

CLULAS MADRE (CD34+)

Clula madre Precursores linfoide Megacarioblasto Mieloblasto
Proeritroblasto

CD34+ HPC:

DISPERSIN LATERAL

Pre-B

Inmaduras

Neutrfilos

IDENTIFICACIN DEL COMPROMISO DE LNEA DE LAS CLULAS CD34+

Precursores de neutrfilos
TRANSFORMED SSC DISPERSIN LATERAL DISPERSIN LATERAL TRANSFORMED SSC

1024

1024

b CyMPO PE

768

768

512

512

256

256

10

101

102

103

104

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0
101 102 103 104

10 1

10 2

10 3 10 4

CD34 APC

100

CD45 PERCP

nTDT FITC

Precursores B
Matarraz S et al. Leukemia 2008

COMPROMISO INMUNOFENOTPICO DE LAS CD34+HPC

SUBPOBLACIN

FRECUENCIA <1% <1%

Serie Roja Neutrlos Eosinlos Baslos Monocitos Mastocitos pDC

15% (5%-35%) 31% (12-39%) <1% (<1%-3%) 5% (3%-15%) <1% (<1%) 6% (1%-15%) 23% (<1%-45%) 81%

Megacariocitos

Linfocitos B Total:

Utilidad de la CF en SMD (subpoblacin de las clulas CD34).

Cuantificacin de las clulas CD34+ es de utilidad para la clasificacin de los SMD:
Fuchigami K et al Leuk Res 2000; 24 Ogata K et al Blood 2002; 100, Blood 2006;108 Del Caizo et al Haematologica 2003;88 Orfao et al Cytometry A 2004; 58 Mararraz et al Leukemia 2008.

Anormalidades inmunofenotpicas recurrentes detectadas en clulas CD34+

CD34+ progenitores mieloides: Aumento relativo y absoluto de CD34+ Expresin de CD117 Expresin de CD5, CD7, CD19, CD56 Disminucin de CD45 Aumento anormal de la intensidad de CD34+ Disminucin de CD38 CD34+ precursores B Disminucin de las clulas CD34+/CD10+

ALTERACIONES EN SMD PARA LAS CLULAS CD34+

DISPERSIN LATERAL

Citopenia refractaria con displasia multilineal (CRDM) MO normal

DISPERSIN LATERAL

2.3%

0.97%

DISPERSIN LATERAL

Anemia refractaria con exceso de blastos (AREB-1)

6%

CD34+ EN SMD
MO NORMAL
104

CyMPO PE

Anemia refractaria (AR) LMA 2daria A SMD nTDT FITC CRDM

CyMPO PE

102

103

CyMPO PE

10

10

10

10

10

nTDT FITC AREB-2

CyMPO PE nTDT FITC

100

101

nTDT FITC CyMPO PE

nTDT FITC

PARAMETRS A CONSIDERAR POR CF EN SMD

1. Recuento de blastos. 2. Deteccin de fenotipos aberrantes en blastos, mieloblastos y precursores B. 3. Identificacin de alteraciones en el patrn de maduracin en las poblaciones de neutrfilos, monocitos y clulas eritroides maduras. 4. Enumeracin de las alteraciones/ defectos fenotpicos identificados. (Clasificacin fenotpica).

MADURACIN NORMAL DE NEUTRFILOS

Patrn normal de maduracin de lnea neutrfilo en Mdula sea (MO).

MYELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO
METAMIELOCITO

BANDA/ NEUTROFILO

CD13
CD13
103

CD33

CD15

CD11b
CD35

102

CD65 CD64
101

CD10

CD16 CD34

CD117

HLA-DR

CD54

Patrn normal de maduracin de lnea neutrfilo en Mdula sea (MO).

Fin Inicio

CD13-PE

CD13-PE CD11b-FITC CD11b-FITC

DIFERENCIACIN EN NEUTRFILO
Fin MO NORMAL

Inicio

?
CD11b-FITC

CD13-PE

Hipogranularidad en neutrfilos
MO NORMAL DISPERSIN LATERAL DISPERSIN LATERAL SMD

DISPERSIN FRONTAL

DISPERSIN FRONTAL

PARAMETRS A CONSIDERAR POR CF EN SMD

1. Recuento de blastos. 2. Deteccin de fenotipos aberrantes en blastos,mieloblastos y precursores B. 3. Identificacin de alteraciones en el patrn de maduracin en las poblaciones de neutrfilos, monocitos y clulas eritroides maduras. 4. Enumeracin de las alteraciones/ defectos fenotpicos identificados. (Clasificacin fenotpica).

Clasificacin Inmunofenotpica de los SMD Sistema de Puntos:

Wells et al, Blood, 2003. Ogata K et al , Blood, 2006. Matarraz S et al, Leukemia, 2008

-Alteraciones fenotpicas en las clulas mieloides (mieloblastos , monocitos y neutrfilos en maduracin) -Score (Puntaje) Inmunofenotpico:
0-1: normal-leve 2-3: moderado 4-9: displasia severa
Puntaje 0 puntos 1 puntos 2 puntos 3 puntos 4 puntos 1 punto + 2 puntos + 3 puntos + 4 puntos + Definicin Sin aberraciones fenotpicas en todas las subpoblaciones analizadas. -Una aberracin presente en granulocitos o monocitos -Una aberracin presente en las dos lneas granulocitos y monocitos o -Expresin de CD34 o infidelidad de lnea en moncitos o granulocitos. -Cuatro o ms aberraciones en granulocitos o monocitos -Dos o tres aberraciones en granulocitos o monocitos -Disminucin del la razn mieloide/linfoide -porcentaje normal de mieloblastos (<5%) con aberraciones fenotpicas -Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (5-10%) -Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (11-20%) -Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (>20%)

Sistema inmunofenotpico en SMD

80-100% MO normal/reactiva vs Low-R vs High-R (Alteraciones). 100% MO normal/reactiva vs SMD. (Score inmunofenotpico).

Table 5. Example of a screening panel for 4-color flow cytometry of dysplasia in myelodysplastic syndromes

van de Loosdrecht, A. A. et al. Haematologica 2009;94:1124-1134

Copyright 2009 Ferrata Storti Foundation

UTILIDAD DE LA CITOMETRIA EN SMD

MUESTRAS
-Mdula sea (morfologa ?) -< 24 horas -Heparina (EDTA CD10/CD11b/CD16) -Temperatura ambiente. - Historia clnica.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas directamente con la categora y pronstico de la enfermedad. -Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre presente en los SMD. -Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas directamente con la categora y pronstico de la enfermedad. -Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre presente en los SMD. -Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas directamente con la categora y pronstico de la enfermedad. -Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre presente en los SMD. -Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas directamente con la categora y pronstico de la enfermedad. -Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre presente en los SMD. -Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios final.
La Citometra de Flujo no es diagnstico en SMD pero si

SERVICIO DE CITOMETRIA, DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y CENTRO DE INVESTIGACIN DEL CNCER (IBMCC) UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

LABORATORIO DE INVESTIGACIN

GRACIAS

NOVEDADES

OBJETIVO
Desarrollo y estandarizacin de los tests que se llevan a cabo en la citometra para el diagnstico y clasificacin pronstica de las patolgias hematolgicas as como para la evaluacin de la efectividad del tratamiento.

Reproducibilidad y resultados objetivos

Objectives of EuroFlow

Development and validation of new antibodies and detection techniques

immunobead technology for fusion proteins FRET technology for intracellular detection of fusion proteins antibodies against (overexpressed) oncoproteins, novel prognostic markers, and differentiation markers (e.g. identified via gene expression profiling)

Development and standardization of 8-color stainings

diagnosis, classification, and follow-up ALL, AML/MDS, CLL, NHL, and MM

Development and testing of novel flow cytometry software

fast and easy handling of complex data sets easy and automated recognition of staining patterns (novel vs. malignant) integration in one software package

Objectives of EuroFlow

Development and validation of new antibodies and detection techniques

immunobead technology for fusion proteins FRET technology for intracellular detection of fusion proteins antibodies against (overexpressed) oncoproteins, novel prognostic markers, and differentiation markers (e.g. identified via gene expression profiling)

Development and standardization of 8-color stainings

diagnosis, classification, and follow-up ALL, AML/MDS, CLL, NHL, and MM

Development and testing of novel flow cytometry software

fast and easy handling of complex data sets easy and automated recognition of staining patterns (novel vs. malignant) integration in one software package

Multi-tube EuroFlow classification panel for AML/MDS

Responsible scientist: VHJ van der Velden
Tube
AML/ MDS 1 HLADR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 Diagnosis and subclassification of AML and PNH especially focused on neutrophilic lineage Diagnosis and subclassification of AML and PNH especially focussed on monocytic lineage Diagnosis and subclassification of AML especially focused on erythroid lineage Aberrant expression of lymphoid-associated markers and abnormal lymphoid maturation

Pacific Blue

Pacific Orange

FITC

PE

PerCPCy5.5

PE-Cy7

APC

APCH7

Aim**

HLADR

CD45

CD35

CD64

CD34

CD117

IREM2

CD14

HLADR

CD45

CD36

CD105

CD34

CD117

CD33

CD71

HLADR

CD45

nuTdT

CD56

CD34

CD117

CD7

CD19

* Further information about the markers and the availability of hybridoma clones is summarized in Appendix A. Backbone markers are indicated in bold; nu= nuclear. ** The described marker combinations might also be applied for disease staging and monitoring of treatment effectiveness (MRD diagnostics)

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM

Myeloblasts Promyelocytes Neutrophils Bands

Myelocytes

Metamyelocytes

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM

Myeloblasts Promyelocytes Neutrophils Bands

Myelocytes

Metamyelocytes

CD34PerCP

HLADRPE

CD11bAPC

CD16FITC

CD10APC

Maturation stage of neutrophil precursors in normal BM

CD38APC

CD13PE

CD15FITC

CD117PE

CD45PO

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM

CD34PerCP

HLADRPE

CD11bAPC

CD16FITC

CD10APC

Maturation stage of neutrophil precursors in normal BM

CD38APC

CD13PE

CD15FITC

CD117PE

CD45PO

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM VS AML

Maturation stage of AML blasts

Aberrant phenotype of AML blasts

Aberrant markers
CD15 CD117 SSC FSC CD11b 26.6 19.4 19.2 19.0 6.0

EuroFlow consor7um aims at innova7on in ow cytometry

REPRESENTACIN DE LA DIFERENCIACIN HEMATOPOYETICA EN LA MO

A
Eosinfilos Clulas precursores inmaduras CD34+ Basfilos pDC

CD34+ precursores B

Monocitos

Serie roja

SSC

Linfocitos maduros

CD45-PerCP

CD34- precursores B