ELECTROPHYSIOLOGIE PRINCIPES ET TECHNIQUES

TRANSPORTS MEMBRANAIRES ELECTROGENIQUE

Fabrice DUPRAT Institut de Pharmacologie Molculaire et Cellulaire Universit de Nice Sophia-Antipolis

Dcembre 2002
1

Objectifs de ce cours
Comprendre le fonctionnement des canaux ioniques.

Comprendre les donnes prsentes dans un article scientifique.

Lecture des reprsentations classiques (courbes courant/potentiel, inactivation, ...) Signification des paramtres mesurs en lectrophysiologie (conductance, seuil dactivation, probabilit douverture, ctes de temps...)

Droulement du cours
Dure du cours 5 h sur les principes et techniques de l'Electrophysiologie. 3 h sur les bases de neurosciences et la plasticit synaptique. Evaluation (examen final du C4): Etude dun ou plusieurs cas concrets (articles de littrature scientifique en Anglais). Questions de cours sur les principales notions. Prvoir un dictionnaire Anglais/Franais et une calculatrice.

Plan du cours

LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIE ETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ORIGINE BIOLOGIQUE TRANSPORTS MEMBRANAIRES LES CANAUX IONIQUES NOTIONS DE BIOPHYSIQUE TECHNIQUES D ETUDE: LE POTENTIEL IMPOSE GATING DES CANAUX IONIQUES LE PATCH CLAMP TECHNIQUE D ETUDE: LE COURANT IMPOSE CANAUX ENDOGENES ET EXOGENES POINTS DE REPERES

LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIE

Les phnomnes lectriques en biologie

L'anguille lectrique

La torpille

ETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ORIGINE BIOLOGIQUE

Animal entier: EEG

E.E.G.: Electroencephalogramme Electrodes externes

Electrodes implantes

Animal entier: ECG

E.C.G.: Electrocardiogramme

Electrodes externes
9

Organe entier: coeur

Cur entier
Cur isol perfus de souris
R P
200 ms

T S

Electrodes
Drici et al Circulation 2002
10

Organe entier: cerveau

Microlectrodes

11

Tissus: tranche de cerveau

Electrodes

12

Tissus: nerf isol

13

Cellules: Neurones en culture

Microlectrode Pipette de patch clamp

14

Protine canal

KcsA

Zhou et al.

15

TRANSPORTS MEMBRANAIRES

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Assymtrie de la membrane plasmique

Bicouche lipidique Protines membranaires Interne Externe Concentrations ioniques dans les cellules de vertbrs Na+ K+ Ca++ Cl14 160 10-4 14 140 3 1 150
17

Protines de la membrane plasmique

x75000

18

Notions gnrales sur les transports membranaires

A C C

Gradient de [A]

Transports passifs

ATP

Diffusion facilite
Qt transporte

Gradient de [C]

Transports actifs secondaires

Transports actifs avec consommation dATP

Gradient de [ ]

19

Transports membranaires
Symports
A B A+ B A+ C A+

Antiports
A

B+ Electroneutre Electrogne Electrogne Electroneutre

B Electroneutre

Uniports
A+ C

Gradients de A et B

ATP

Electrogne

Electroneutre

Gradient de C
20

Synapse lectrique, jonctions Gap

21

Synapse lectrique, jonctions Gap

30 m 30 m

100 m

22

Conclusion sur les transports membranaires

Transports lectrogniques

Possibilit de mesures lectrophysiologiques

Cas des canaux ioniques

23

LES CANAUX IONIQUES

24

Les canaux clons ou exognes

Structure protique connue Nombre de segments transmembranaires Homologies de squence Sites consensus Ralisation danticorps, dantisens, de sonde dhybridation, ...

25

Superfamilles des canaux clons

Canaux

Cl-

Rcepteurs canaux

Canaux Na+
P
+ + + + + + + +

P
+ + + +

P
+ + + +

Canaux Ca2+
P
+ + + + + + + +

P
+ + + +

P
+ + + +

+ sous units , , ,
26

Sous units auxiliaires: Kv2

Van Huizen et al. 1999, FEBS Lett. 457, 107-111.

27

Structure et assemblage des Kv

K v
+ + + +

1 5

2 3 4 6

x4=

28

Structure et assemblage des Kir

29

Structure et assemblage dautres canaux

30

Structure du rcepteur-canal nicotinique

31

Passage des ions K+

Miller et al.
32

Filtre de slectivit

Zhou et al2001
33

Deshydratation des ions K+

Zhou et al 2001

34

Passage des ions K+

Zhou et al 2001
35

Classification des canaux ioniques

Nature du/des principaux ions transports Na+ Ca++ K+
Face externe

Cl-

Face interne

25.10-9 m

36

Rgulation des canaux ioniques

AMPA
Rgulation par un agoniste (ROC)

GABA

+++
Rgulation par le potentiel (VOC)
+ + + +

Face externe

--Rgulation par un ligand intracellulaire (SMOC)

Face interne

Ca++

AMPc
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Biophysique des canaux ioniques

Proprits biophysiques: Canaux rectification entrante Canaux rectification sortante Canaux voltage dpendant Canaux avec une inactivation .

38

Pharmacologie des canaux ioniques

Classification selon la sensibilit

Exemple: Canaux apamine sensible (KCa)

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Pathophysiologie des canaux ioniques

Canaux potassiques
Diabte, Ataxie pisodique de type 1 Syndrome du long QT Syndrome de Bartter La paramyotonie congnitale, la paralysie priodique familiale hyperkalimique Syndrome du long QT Syndrome de Liddle Pseudohypoaldostronisme de type 1

Canaux sodiques

Canaux calciques

La paralysie priodique familiale hypokalimique L'hyperthermie maligne Syndrome de Lambert-Eaton, sclrose latrale amyotrophique, diabte de type I La mucoviscidose La myotonie congnitale et la myopathie pseudohypertrophique de Becker.
40

Canaux chlore

Pharmacologie clinique des canaux ioniques

Canaux sodiques
Anti-arythmiques de la classe IA (quinidine, lidocane, encanide) Anti-arythmiques de la classe IB (lidocane) Anti-arythmiques de la classe IC (encanide) Pyrthrinodes (biopermthrine) Diurtiques (amiloride).

Canaux potassiques
Anti-arythmiques de la classe III (amiodarone) Sulphonylures (glibenclamide) Ouvreurs KATP (nicorandil).

Canaux calciques
Anti-arythmiques de la classe IV (vrapamil).

41

NOTIONS DE BIOPHYSIQUE

42

Analogie lectricit /eau / ion

PHENOMENE ELECTRIQUE Courant lectrique: i ou I Qt de charges (e-) circulant par unit de temps. Porteurs de charges: lectrons Produit par un gnrateur de courant: Sens positif = celui des charges positives Rsistance: R Obstacle au passage des lectrons ANALOGIE AVEC LEAU Courant dun fleuve Dbit deau entre 2 points Pompe pristaltique PHENOMENE IONIQUE Courant ionique: i ou I Quantit de charges (et non dions) par unit de temps = flux global entre 2 points Porteurs de charges: ions Ampres: 10-6 A=1A, 10-9 A=1nA, 10-12A=1pA Rsistance dun canal: Rsistance R ou r en ohm: (109 = 1 M)

Barrage sur un fleuve Les vannes sont ouvertes

Conductance : g= 1/R

Conductance dun canal: r = 1/g Conductance g ou en siemens: 10-12 S = 1 pS = capacit laisser passer des ions

43

Analogie lectricit /eau / ion

PHENOMENE ELECTRIQUE Potentiel lectrique: E (U, V) Quantit de charges en un point

ANALOGIE AVEC LEAU Quantit deau en un point

PHENOMENE IONIQUE

Diffrence de potentiel ou tension: U, V (E) Diffrence en quantit de charges entre 2 points Produit par un gnrateur de tension

Diffrence niveau deau

Diffrence de potentiel Diffrence de quantit de charges Volts: mV: 10-3 V

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Analogie lectricit /eau / ion

PHENOMENE ELECTRIQUE Capacit: C compos dun isolant entour de 2 surfaces de conducteur = capacit daccumuler des charges + + + +
+ + +

ANALOGIE AVEC LEAU 2 rservoirs Capacit membranaire

PHENOMENE IONIQUE

=la membrane plasmique est un isolant entour de 2 conducteurs Capacit spcifique (F/cm2)

+ Loi dohm: U = RI Si U = constante: si R alors I Barrage: si le courant alors la diffrence de niveau

Si I=constante: si R alors U
45

Potentiel dquilibre - Loi de Nernst

Potentiels dinversion dans les cellules de vertbrs Na+ K+ Ca++ ClInterne 14 160 10-4 14 Externe 140 3 1 150 Eion = 58 log [ion]ext / [ion]int + 58 mV - 100 mV + 232 mV + 60 mV

K+ Cl-

+
+

-90 mV Polarise

Na+ Cl- K ClNa+ ClClNa+ Cl- K+ ClNa+ ClK+ ClNa+ ClK+ K+ ClNa+ Cl-

Voltmtre 0 mV Inclusion d un canal K+

Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges

+
ClK+ ClNa+ ClK+ ClNa+ ClK+ ClNa+ ClK+ ClNa+ ClK+ ClNa+ ClK+ Cl-

Na+

+60 mV Dpolarise

Inclusion d un canal Na+

K+ ClK+ ClK+ ClNa+ K+ Cl+ K Cl Na+ K+ ClClNa+ ClClNa+ ClCl Na+ Cl-

Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges

Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges

46

Enonc de la loi de Nernst

Eion RT [ion]ext ln = zF [ion]int

Potentiel dquilibre dun ion Eion

R: constante des gaz parfaits: 8,315 J.K-1.mole-1 (1 J = 1 V.C) T: temprature absolue en K (K = C + 273,16) z: valence de lion (+1 pour Na+ et K+, +2 pour Ca2+ et -1 pour Cl-) F: constante de Faraday: 9,648.104 C.mole-1
Valeurs de RT/F selon la temprature: Temprature (C) RT/F (mV) 23,54 23,97 24,40 24,83 25,26 25,69 26,12 26,55 26,73

Ln = 2,303 Log Si z = +1 et 20C on a:

Eion

[ion]ext = 58 log [ion]int

0 5 10 15 20 25 30 35 37

47

TECHNIQUES D ETUDE LE POTENTIEL IMPOSE

48

Aspect technique du potentiel impos

Double microlectrodes

E = R x I 1/g E I / / E I = g 1 / g Impos Calcul Calcul Mesur

Eimpos Emb

Iinject
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Le modle de lovocyte de xnope

Ovocytes de xnopes

Etude des canaux clons ou exognes

Injection dARN ou dADN Double microlectrodes

50

Prparation des ovocytes de xnopes

51

Ovocytes: Injection dARN ou dADN

52

Le poste denregistrement en double microlectrodes

53

Prparation des pipettes

54

Etude des courants natifs ou endognes

Preparation dun tissu

55

[ K+ ]

Potentiel impos par lexprimentateur [+]

Gradient de charges impos

Externe Interne
Flux net de K+ sortant

[K+]

Flux net de K+ sortant

[-]

Gradient de [K+]

Flux net de K+ nul Flux net de K+ entrant

= tat dquilibre (Nernst)
56

Potentiel impos

E=RxI
Impos Calcul Mesur Courant (A, nA, pA) +5
EK+=-70 mV
Externe Potentiel impos

-100

-50

0 -5

+50
Interne Gradient [K+]
57

Potentiel (mV)

Reprsentation schmatique dun canal

Externe

Externe

Externe

++++

----

gNa = 0

gK = 0 IK = 0

gNa = 0

gK > 0 IK > 0

gNa > 0

gK = 0 IK = 0

INa = 0

INa = 0

INa > 0

---Interne Interne

++++
Interne

Vm = 0 mV

Vm = EK = - 84 mV

Vm = ENa = + 58 mV

58

Loi de Goldman Hodgkin Katz

[K+]int = [K+]ext Total

Flux sortant EK+ Flux sortant

[K+]int > [K+]ext Total

EK+

Flux entrant

Flux entrant

59

Technique dtude: le voltage clamp

Courants totaux

60

Technique dtude: le voltage clamp

Courants totaux

61

GATING DES CANAUX IONIQUES

62

Structure et gating des canaux clons

Biggin & Sansom 2001

63

Canaux voltage-dpendant

[K+]int > [K+]ext

EK+

[K+]int = [K+]ext
EK+

Seuil dactivation

Seuil dactivation

64

Interactions senseur au voltage et pore (Kcsa)

Ferm (rtract)

Ouvert (extrud)

Activation Inactivation

Inactiv (rtract)

Inactiv (extrud)

Gandhi et al. 2000

65

Gating des canaux ioniques

Rectification entrante

Diffusion facilite V

Blocage des courants sortants V

66

Rectification entrante
Milieu externe

K+

Membrane

Spermine 2+ K+ Mg
Milieu interne
67

Canaux temps-dpendant

Activation

Inactivation

68

Patch Clamp
Enregistrements de courants unitaires

69

LE PATCH CLAMP

70

Configurations du Patch Clamp

71

Poste de Patch clamp

72

Courant unitaire

73

Courant unitaire

74

Modle

F1

k2 k-2

F2

k1 k-1

ki

75

Histogramme damplitude

76

Sommation des courants unitaires

77

Courant total

iunitaire = ion . (Vm-Eion) Itotal = iunitaire . N . Po = gion . (Vm-Eion)

78

Cas dune membrane comportant plusieurs conductances

Schma lectrique

Courants du nud de Ranvier

79

TECHNIQUE D ETUDE LE COURANT IMPOSE

80

Current clamp
Potentiel daction en current-clamp

81

CANAUX ENDOGENES ET EXOGENES

82

Etude des canaux natifs ou endognes

Dissociation mcanique et enzymatique

Patch clamp
83

Etuce des canaux clons ou exognes

Cultures de cellules

Transfection, infection, injection

Patch clamp

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POINTS DE REPERES

85

Canaux ioniques des vgtaux: Arabidopsis thaliana

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Historique 1

2600 ans avant JC Les Egyptiens tudient les phnomnes lis languille lectrique. 1790 GALVANI: Existence de phnomnes lectriques au niveau de la matire vivante. 1827: Loi dOHM. 1848 DU BOIS REYMOND: Proprits lectrognique de la peau de grenouille. 1868 BERNSTEIN: Lintrieur et lextrieur des cellules sont composs dlectrolytes de diffrentes concentrations spares par une membrane permable ces lectrolytes. 1888 NERNST: Loi de Nernst donnant le potentiel dquilibre dun ion. 1902 BERNSTEIN: Thorie de la membrane: - le potentiel de repos est du la membrane, - notion de membrane lectrique et de membrane biologique, - les concentrations ioniques sont diffrentes de part et dautres de la membrane - au repos la membrane nest permable quau potassium.

87

Historique 2
1910 EINTHOVEN: Naissance de lECG (lectrocardiogramme) 1920-1945: Naissance de llectrophysiologie, due aux amliorations techniques aprs la II nde guerre mondiale . 1935: Microlectrode intracellulaire. 1937 HODGKIN: Des courants locaux peuvent dpolariser la membrane. 1948 ROSENBERG-USSING: Diffrence entre les transports actifs et les transports passifs, au niveau des pithliums. 1949 LING-GERARD: Premire microlectrode de verre. 1952 HODGKIN-HUXLEY: Technique du voltage clamp 1952 CORABOEUF: Naissance de llectrophysiologie en France. 1958 USSING: Etude des diffrentes permabilits (K+ et Na+) sur les pithliums, chambre de Ussing. 1981 NEHER - SAKMANN: Technique de patch clamp. 2000 NEHER - SAKMANN : Prix Nobel de Mdecine.
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