Cours 5 - Les Milieux de Culture - Étudiant

2011-10-05
Cours 5: Les milieux de culture

GCH-2100 lments de Bioprocds, 05 octobre 2011 Bruno Gaillet
Plan du cours
Introduction Les milieux de culture employs principalement lors des analyses microbiologiques Les milieux de culture employs en microbiologie industrielle Les milieux pour la culture de cellules animales Formulation dun milieu de culture microbienne
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Introduction
Pour les analyses microbiologiques
En microbiologie industrielle (alimentaire, pharmaceutique)
Les milieux de culture doivent satisfaire toutes les exigences cites
Analyses microbiologiques
Les besoins nutritifs courants
Environ 97% du poids sec dun organisme vivant est compos de quelques lments majeurs: lment Homme Alfalfa Bactrie Carbone

Hydrogne Oxygne Azote Souffre Phosphore Potassium Calcium Magnsium Fer
Carbone Hydrogne Azote Oxygne Phosphore Souffre Total
19.37% 9.31 5.14 62.81 0.63 0.64 97.9
11.34% 8.72 0.83 77.9 0.71 0.1 99.6
12.14% 9.94 3.04 73.68 0.6 0.32 99.72
Ces lments sont ncessaires aux MO en quantits importantes = macro-lments.
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Les besoins nutritifs courants: les macrolments
Les 6 premiers lments (C, O, H, N, S et P) sont des constituants des glucides, des lipides, des protines et des acides nucliques. Les 4 autres existent dans la cellule ltat de cations et jouent plusieurs rles:
K+ est ncessaire lactivit de plusieurs enzymes y compris celles qui interviennent dans la synthse protique Ca2+ a de nombreuses fonctions dont lune est de contribuer la thermorsistance des endospores bactriennes Mg2+ est un cofacteur de nombreuses enzymes, il forme un complexe avec lATP, stabilise les ribosomes et les membranes cellulaires
Les besoins nutritifs courants: les oligolments et leau
Les oligolments manganse, zinc, cobalt, molybdate, nickel et cuivre sont indispensables la plupart des cellules en quantit tellement faible que les impurets de leau, la verrerie et les composants habituels des milieux de culture sont gnralement suffisantes (en laboratoire). Les oligolments font souvent partie des enzymes et des cofacteurs, ils aident la catalyse des ractions et au maintien de la structure des protines. Par exemple: Le zinc se trouve dans le site actif de quelques enzymes Le manganse peut aider beaucoup denzymes qui catalysent le transfert de groupes P Le molybdne est requis pour la fixation de lN Le cobalt est un composant de la vitamine B12 L'eau joue un rle fondamental en solubilisant les nutriments, en assurant leur transport et en assurant les ractions d'hydrolyse.
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Les milieux de culture
Leur composition doit permettre la croissance des MO et doit donc tenir compte de leurs besoins nutritifs. La composition de base de ces milieux comprend:
Les diffrents types de milieux de culture
On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur composition:
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AM - Les milieux dfinis
Certains germes tels que les cyanobactries et les algues se multiplient sur des milieux assez simples contenant

du CO2 comme source de carbone = bicarbonate de soude du nitrate ou de lammonium comme source dazote du sulfate du phosphate une srie de minraux Milieu dans lequel tous les composants sont connus = Ces milieux sont beaucoup utiliss en recherche afin de dterminer ce que le microorganisme est capable de mtaboliser
AM - Les milieux complexes
Les milieux qui contiennent des ingrdients de composition chimique indtermine sont appels milieux complexes
Ces milieux sont trs utiles, car un seul milieu complexe peut tre suffisamment riche et complet pour satisfaire les besoins nutritifs de nombreux MO diffrents. Ces milieux sont indispensables lorsque les besoins nutritifs dun MO sont inconnus Ces milieux contiennent des composs indfinis:
Peptones: hydrolysats de protines prpars par digestion protolytique partielle de viande, casine, soja, etc = source de carbone, dnergie et dazote Extraits de viande: extraits de viande bovine maigre = source AA, peptides, nuclotides, acides organiques, vitamines, minraux Extraits de levure de bire: source de vitamines B, composs azots et carbons
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AM Classification des milieux
On distingue galement les milieux de culture selon leur fonction: les milieux disolement permettant la croissance de plusieurs espces bactriennes, les milieux denrichissement permettant de favoriser la croissance dune espce en faible quantit dans un chantillon, les milieux enrichis permettant la croissance des bactries exigeantes,
Les milieux comme le bouillon au soja et la glose au soja sont aussi appels milieux de culture utilisation gnrale car ils permettent la croissance de la plupart des MO. Le sang et dautres aliments spciaux peuvent tre ajouts aux milieu de base pour favoriser le dveloppement dhtrotrophes capricieux Ces milieux spciaux sont appels
Les milieux slectifs : ils favorisent la croissance de MO particuliers. Exemples: Les sels biliaires ou les colorants comme la fuchsine basique favorisent la croissance des bactries Gram ngatives. Ils inhibent la croissance des Gram+
Les gloses Endo, osine-bleu de mthylne et Mac Conkey sont utilises pour dtecter E.coli. Elles contiennent des colorants qui empchent la croissance des Gram-
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Les milieux slectifs : ils favorisent la croissance de MO particuliers.
Exemple des milieux slectifs pour les bactries Gram positif contenant des antibiotiques inhibiteurs des bactries Gram ngatif). Les bactries peuvent aussi tre slectionnes en culture avec des lments nutritifs quelles utilisent spcifiquement
Exemple: un milieu ne contenant que de la cellulose comme sources de carbone et dnergie, est trs efficace dans lisolement de bactries digrant la cellulose.
Les possibilits de slection sont sans fin et il existe des dizaines de milieux slectifs spciaux
Les milieux diffrentiels : ils permettent de distinguer diffrents groupes de bactries et mme didentifier des MO sur la base de leurs caractristiques biologiques.

La glose au sang est un milieu diffrentiel et enrichi La glose au sang est un milieu diffrentiel et enrichi. Il permet de distinguer les bactries hmolytiques des bactries non hmolytiques Les bactries hmolytiques (streptocoques, staphylocoques) produisent des zones claires autour de leurs colonies, rsultant de la destruction des globules rouges
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Les milieux diffrentiels : ils permettent de distinguer diffrents groupes de bactries et mme didentifier des MO sur la base de leurs caractristiques biologiques.
La glose Mac Conkey est la fois diffrentielle et slective
Cette glose est utilise pour tester la capacit des bactries Gram fermenter certains sucres ou sources de carbone Ce milieu contient des sels biliaires et du violet de gentiane qui permettent d'liminer les bactries Gram+. Il contient de plus un indicateur de pH (rouge neutre) et le sucre dont on veut tester la fermentation (ex lactose).
AM - Les milieux solides
Les milieux solides ou semi-solides, base d'agar (glose), sont utiliss pour l'isolement et lidentification de microorganismes. Dans ces milieux, ont t ajouts des nutriments favorisants la croissance des microorganismes tudis.
Le gel dagar conserve sa fermet mme lorsque soumis des tempratures frlant 85C, la diffrence des gels base de glatine, qui fondent 37C. Ce large cart entre la temprature laquelle un gel se forme et la temprature laquelle il fond est unique.
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AM - Isolement de cultures pures
Isolement sur bote par talement en surface
Lagar est au pralable strilis et rendu fluide par chauffage; y sont incorpors des nutriments ncessaires la croissance bactrienne. Refroidi une temprature infrieure 40C, lagar se prend en un gel solide. Une goutte dune suspension bactrienne trs dilue dpose sur ce gel est tale de faon uniforme laide dune fine baguette de verre recourbe, servant en quelque sorte de rteau. La boite recouverte de son couvercle est porte ltuve 30C ou 37C. Aprs 24h, on dcouvre la formation de colonies la surface du gel
Daprs:Prescott, Harley,Microbiologie
Isolement sur bote par la technique des stries
Le mlange microbien est transfr au bord dune bote glos laide dune boucle dinoculation ou dun couvillon et tal sur la surface de la bote en suivant un motif dfini certains moments, des cellules isoles se dtachent de la boucle en mouvement et se dveloppent en colonies spares.
Daprs:Prescott,Harley,Microbiologie
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Isolement sur bote par talement en profondeur
Lchantillon de dpart est dilu plusieurs fois pour rduire la population microbienne et obtenir la croissance de colonies spares. De petits volumes de chacun des chantillons dilus sont alors mlangs de la glose liquide refroidie 45C. Les mlanges sont immdiatement verss dans des botes de culture striles. La plupart des bactries et des champignons ne sont pas tus par ce bref contact avec la glose chaude.
Daprs:Prescott,Harley,Microbiologie
AM - Clonage et milieu slectif
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Microbiologie industrielle
Pourquoi formuler le milieu de culture ? Pour fournir une quantit juste de chacun des ingrdients pour la production industrielle
viter la perte sur le cot dachat des ingrdients pour la production industrielle viter le cot de disposition des ingrdients rsiduels dans leffluent industriel
La quantit juste de nutriments est essentielle pour viter:
Pourquoi formuler le milieu de culture ? Appliquer selon la valeur marchande du produit Appliquer selon lchelle de lutilisation

Utiliser dans les laboratoires de recherche: ingrdients grade analytique Utiliser pour la production industrielle:
Ingrdients grade technique ou industriel Produits naturels Rsidus
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Des matires brutes peu coteuses servent de source de carbone, dazote de phosphore et de facteurs de croissance
Hydrolysats vgtaux bruts Les sous produits de brasserie Les mlasses Le petit-lait obtenu lors de la fabrication du fromage Etc.

Les sources de carbone
Les carbohydrates sont dexcellentes sources de carbone, doxygne, dhydrogne et dnergie. Ils sont frquemment prsent dans le milieu de culture des concentrations plus hautes que celles des autres nutriments. La disponibilit des carbohydrates pour le microorganisme dpend de la complexit de la molcule Hexose > disaccharides > pentoses > polysaccharides Les sucres simples sont disponibles en poudre et sous forme liquide diffrents degrs de puret
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Le glucose utilis lors de fermentation industrielle provient: De lhydrolyse de la fcule de mais Du sucrose de la canne et de la betterave sucre
Le sucrose est le plus souvent achet sous forme de mlasses
Les sources de carbone: Procd de fabrication du sucre de table
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Les sources de carbone: les mlasses
La composition des 2 types de mlasses varie beaucoup
(A). Moyenne de 2 chantillons de sugar beet molasse (1 franais + 1 hollandais) provenant de la campagne de 1990 (B). Moyenne de 5 chantillons de sugar beet molasse (US) provenant de 5 usines (campagne de 1991) Blackstrap molasse (1975-1983)
La composition des mlasses varie chaque anne dpendamment:
Du type de betterave ou de canne sucre cultive Du type de sol Des conditions climatiques, etc.
Les sources de carbone: les mlasses
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Les 2 types de mlasses contiennent des oligolments, des vitamines et des facteurs de croissance Les beet molasse ont une odeur dsagrable et un pH = 8 Les blackstrap molasse ont une odeur fruit, pH = 7
Les alcools (glycrol) peuvent tre utiliss comme source de carbone dans les bioconversions. Aussi le mthane, mthanol et les n-alcanes. Les acides gras peuvent tre convertis par les champignons aprs hydrolyse (lipase). Les acides organiques carbons (acides olique, linolnique, linoleique) peuvent tre utiliss comme agents anti-mousse Le CO2 est aussi une source de carbone mais il nest pas utilis en raison des faibles taux de croissance obtenus partir de ce substrat
Les sources dazote et de soufre
La source dazote est, aprs la source de carbone, la substance la plus importante en quantit dans le milieu de culture Quelques organismes peuvent utiliser la source dazote comme source dnergie Lazote et le soufre sont prsents et incorpors sous la forme de composs organique, principalement dans les acides amins et les groupements thiol. Plusieurs fermentations commerciales utilisent des sources de composs organiques complexes qui sont des sous-produits de lindustrie alimentaire et de lagriculture:
Corn steep liquor, protein peptones, hydrolysates and digests from casein, yeast, cotton seed, milk protein, etc.
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Les fermentations industrielles sont en gnral plus rapide et efficace lorsque ces hydrolysats sont employs puisquils rduisent le nombre de composs que la cellule devrait synthtiser de novo. La disponibilit en azote ainsi que sa concentration dans le milieu est du cas par cas:
Les protines peuvent tre assimiles seulement par les MO qui scrtent des protases hydrolyse des protines en aa. Pour les autres apport dhydrolysats
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Autres lments essentiels
Le phosphore est prsent principalement dans les sucres lorigine des nuclotides. Le phosphore est assimil sous sa forme inorganique. Le soufre est prsent dans les acides amins cystine et mthionine. Il est apport sous forme: dH2SO4 pour ajuster le pH Sulfate dammonium Bisulfate de potassium
Le fer (Fe2+, Fe3+), le zinc (Zn2+), le manganse (Mn2+), le molybdne (Mo2+), le cobalt (Co2+), le cuivre (Cu2+) et le Calcium (Ca2+) sont galement requis:
Fonctions de coenzymes, synthse de vitamines, transport de molcules
Les besoins sont tellement faibles que ces composs peuvent tre apports en quantit suffisante par leau ou lquipement
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Les oligolments peuvent contribuer de faon importante la production de mtabolites primaires et secondaires:
Bacillus licheniformis produit le mtabolite secondaire, la bacitracine. [Mn2+] = 0,07 x 10-5 M est requise. Pour [Mn2+] = 4,0 x 10-5 M, Mn devient un inhibiteur
Les lments mtalliques peuvent tre apports comme nutriments sous la forme de cations de sels inorganiques. La combinaison des diffrents minraux rgule galement les proprits osmotiques lintrieur de la cellule. Dans la plupart des cas, les sources complexes de carbone et/ou dazote apportent suffisamment de minraux pour une fermentation adquate
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Les sources de vitamines et les autres facteurs de croissance
Les vitamines sont des composs organiques agissant comme des co-enzymes ou des parties de co-enzymes. Une faible quantit de ces composs est requise. En fermentation industrielle, la balance correcte en vitamines est obtenue en mlangeant adquatement des milieux complexes et, si ncessaire, en ajoutant des vitamines pures. Exemples:
Production de la levure de boulanger: blackstrap molasse (riche en biotine) + beet molasse (riche en vitamines du groupe B) La production dacide glutamique par Corynebacterium glutamicum est fonction de la concentration en biotine dans le milieu. Elle doit tre maintenue entre 2 -5 ug/L.
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Contrle du pH
Un milieu peut tre adapt pour initier la croissance du MO changement au cours de la fermentation en raison du mtabolisme cellulaire !!
Dans le cas dun milieu contenant du glucose, des acides organiques peuvent tre produits la fermentation peut inhiber la croissance La dcomposition cellulaire tend rendre le milieu plus alcalin La dcomposition des aa et des protines production dammonium milieu plus alcalin
Contrle du pH
Pour prvenir des changements excessifs dans la concentration en ions H+, du tampon phosphate ou du carbonate insoluble est ajout au milieu Tampon phosphate: mlange quimolaire de K2HPO4 et de KH2PO4 pH = 6,8 Si une quantit limite dacide fort est ajoute dans le milieu, le sel basique est converti en lacide:
K2HPO4 + HCL KH2PO4 + KCl
Si une base est ajoute, la raction oppose seffectue
KH2PO4 + KOH K2HPO4 + H2O
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Contrle du pH
Consquence: la solution joue le rle de tampon en sopposant au changement de concentration en ions H+ lorsque des composs acides ou basiques sont librs dans le milieu. Les bactries et les fungi peuvent tolrer jusqu 5 g/L de potassium phosphate cela est insuffisant pour maintenir un pH proche de 7 lorsque quune quantit importante dacide est produite dans le milieu de culture Du carbonate en poudre peut tre ajout dans le milieu pour neutraliser les acides forms.
CaCO3 + 2 H+ H2CO3 + Ca2+ CO2 + H2O Contrle du pH lors de la fermentation au moyen dune sonde et dun rservoir dacide ou de base
Contrle du pH Milieux synthtiques
Des prcipits se forment parfois suivant la strilisation du milieu en raison de la concentration leve en phosphate. Ce prcipit rsulte de la formation de complexes insolubles entre les phosphates et les cations fer et calcium En strilisant le calcium et les ions fer sparment et en les associant lorsque le milieu est refroidi le problme peut tre rsolu De lEDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) peut tre ajout dans le milieu pour former un complexe avec ces mtaux
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Culture mixte et mise lchelle
Lorsque 2 ou plusieurs MO sont placs dans un milieu, leurs activits mtaboliques combines peut diffrer la fois qualitativement et quantitativement de la somme des activits mtaboliques des membres cultivs de faon spare dans le mme milieu =
Un fermenteur de laboratoire ou un flacon agit strilis dans un autoclave aura une concentration plus leve en nutriments en raison de lvaporation
MO 1
MO 2
MO 1 MO 2
Mtabolisme 1
Mtabolisme 2
Mtabolisme 1 + 2
Cette diffrence peut certainement altrer le rendement de la fermentation
Culture de cellules animales
Introduction
La culture de cellules animales seffectuait initialement dans des milieux naturels.
Extraits de tissus, dembryons de poulet, fluide corporel, srum, etc.
Avec le dveloppement des lignes cellulaires, il a fallu dvelopper de nouveaux milieux, chimiquement dfinis, dont la composition est base sur lanalyse des fluides corporels et des besoins nutritionnels des cellules
Eagles Basal Medium (Eagle, 1955); Eagles Minimal Essential Medium (MEM) (Eagle, 1959) + supplments: srum humain, bovin, quin, hydrolysats, extraits dembryons
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Introduction
Lisolement et la propagation des cellules issues dune ligne spcifique peut ncessiter un milieu slectif dpourvu de srum
Exemple: le milieu MCDB170 empche la prolifration des fibroblastes dans les cultures de cellules de peau.
Les cellules destines 1) la production de biomolcules, 2) des tudes fonctionnelles non cell-specific se cultive dans
Le MEM, Le DMEM: Dulbeccos modification of Eagles medium (Dulbecco & Freeman, 1959), Le RPMI 1640 (Moore et al, 1967) + srum
De plus en plus, dans le cadre de productions industrielles de biomolcules en culture de cellules animales, le milieu sans srum est utilis pour:
Proprits physico-chimiques: le pH
La plupart des cellules se cultivent bien pH = 7,4. Le rouge de phnol est souvent utilis comme indicateur:
Il est rouge pH = 7,4, devient orange 7,0; jaune pH = 6,5, jaune citron pH = 6,5, plus rose pH = 7,6; violet pH = 7,8 Attention : lestimation de la couleur est subjective !!
Construction dune srie de solutions tampon
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Proprits physico-chimiques: le pH
Le milieu rgule la plage de pH de la culture et tamponne les cellules pour empcher les modifications trop rapides de pH Gnralement, un tampon base de (CO2 bicarbonate) ou un tampon organique, comme l'HEPES, est utilis pour aider conserver le pH du milieu dans une plage comprise entre 7,0 et 7,4 suivant le type de cellules cultives.
Proprits physico-chimiques: Fonctionnement du systme tampon (NaHCO3/CO2)
Le bicarbonate de sodium est en solution dans le milieu de culture Il est en quilibre avec un pourcentage de 5 % en CO2 dans l'atmosphre ambiante de culture ncessit davoir un incubateur CO2 Le pKa de ce systme tampon est de 6,3.
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pH 7 pendant la culture, lquilibre chimique entre les formes acide et basique du systme tampon est:
CO2 + 2H2O H2CO3 + H2O HCO3- + H3O+
H2CO3 tant un produit trs instable, on a donc: CO2 + 2H2O HCO3- + H3O+ La respiration cellulaire engendre du CO2 entrane une acidification du milieu Si on ajoute dans le milieu du bicarbonate de sodium NaHCO3, on dplace l'quilibre et on limite l'acidification
37C, HCO3- est volatil sa dsorption entrane une basification du milieu selon la mme quation. Dans ce cas, le bicarbonate spuiserait dans le milieu, il faut donc le rgnrer et cest le rle de lapport du CO2 Selon la mme quation chimique, le CO2 apport peut tre converti en HCO3Lenrichissement en CO2 5 % dans latmosphre de ltuve permet donc de maintenir le tampon carbonate.
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Proprits physico-chimiques: les systmes tampons
Proprits physico-chimiques: Osmolarit L'osmolarit du milieu de culture est importante car elle aide rguler le flux de substances qui entrent et sortent de la cellule. Elle est contrle par l'addition ou la soustraction de sels dans le milieu de culture. L'vaporation du milieu de culture dans les rcipients de culture ouverts (botes, etc.) conduit rapidement une augmentation de l'osmolarit, entranant un stress, une dgradation ou la mort des cellules. Pour les systmes de culture ouverts (non scells), les tuves niveau d'humidit lev sont essentielles pour rduire l'vaporation Une osmolarit comprise entre 260 mOsm/kg et 320 mOsm/kg est acceptable pour la plupart des cellules
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Proprits physico-chimiques: La temprature
Avec les vertbrs sang froid, une plage de temprature de 18 25C est parfaite ; la plupart des cellules de mammifre ncessitent 36 37C.
Cette plage de temprature est gnralement maintenue l'aide d'tuves soigneusement talonnes et frquemment contrles. La temprature influence galement le pH en raison dune augmentation de la solubilit en CO2 basse temprature
Proprits physico-chimiques: La viscosit La viscosit du milieu de culture est influence principalement par le contenu du srum. La viscosit joue un rle important lorsque les cellules sont cultives en agitation et en suspension. Les dommages cellulaires peuvent tre rduits en augmentant la viscosit du milieu avec du carboxymthylcellulose (CMC) ou du polyvinylpyrrolidone (PVP). En absence de srum, en bioracteur, lajout de Pluronic F68 dans le milieu de culture joue un rle protecteur
Lakhotia et al, 1991
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Proprits physico-chimiques: Tension de surface et mousse La mousse limite la diffusion des gaz. La mousse apparait dans les cultures en suspension lorsque 5 % de CO2 dans lair est bull travers un milieu contenant du srum ou lorsque lagitation est trop importante Laddition de silicone anti-mousse (Dow chemical) ou de Pluronic F68 (Sigma) 0,01 % 0,1 % empche la formation de mousse en rduisant la tension de surface. Cet agent peut galement protger les cellules contre les forces de cisaillement exerces par les bulles de gaz (cf. Cours phnomne dchange).
Les produits tampons Le tampon phosphate salin (PBS, phosphate buffered saline) est une solution tampon. Il s'agit d'un solut physiologique contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique et monopotassique et un peu de chlorure de potassium.
Il est prvu pour un usage sur les cellules maintenues hors de l'incubateur CO2 et n'est pas conu pour des incubations long terme.
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Les produits tampons
Les milieux complets: contient tous les lments ncessaires lusage prvu Il sont constitus:
Les milieux dfinis peuvent se classer selon leur complexit:

Du trs simple: Eagles MEM Au trs complexes: M199 (Morgan et al, 1950), CMRL1066 (Parker et al, 1957), MB 752/1 (Waymouth, 1959), RPMI 1640 (Moore et al, 1967), F12 (Ham, 1965) milieu sans srum
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Les milieux complets: contient tous les lments ncessaires lusage prvu Les milieux complexes contiennent un grand nombre dacides amins diffrents, incluant des acides amins non essentiels + vitamines + mtabolites (nuclosides, acides tricarboxyliques, lipides) + minraux La concentration de nutriments est dans lensemble faible dans le milieu F12 (qui a t optimis pour le clonage) et leve dans le DMEM (optimis pour la production de virus haute densit cellulaire)
Les milieux dfinis
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Les milieux dfinis: les acides amins Essentiels : 8 chez lhomme (lleu, Leu, Lys, Meth, Ph, Thro, Trp, Val). Autres acides amins dont la capacit de synthse a t perdue lors du passage in vitro : au moins cinq autres Gln,Tyr, Cys, Arg et His.
Les milieux dfinis Les vitamines
Les besoins sont variables suivant les types cellulaires. Selon Eagle, 8 vitamines sont indispensables : choline, acide folique, thiamine, pyridoxal, riboflavine, acide nicotinique, inositol, acide panthotnique.
Le glucose
la substance nergtique fondamentale est gnralement le glucose la concentration de 1 g/L (5 mM), concentration semblable celle du srum humain)
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Les milieux dfinis Rouge de phnol
Indicateur color dont la zone de virage est situe aux pH de 7,2-7,6.
Systme tampon. Deux alternatives:
Utilisation du couple (bicarbonate de sodium, dioxyde de carbone), NaHCO3 apport dans le milieu et CO2 ( 5 %) dans latmosphre de ltuve. Utilisation dune molcule organique tampon dans le milieu, lHEPES.
Rle des constituants des milieux dfinis

Sels minraux

cofacteurs denzymes, pression osmotique, le potentiel de membrane, les communications (second messager Ca2+), les transports (co-transport Na+ par exemple), la rgulation du pH, lattachement des cellules (notamment le Ca2+), constitution de certaines molcules (groupement prosthtique, phosphate ou autres), etc.
Acides amins Sous-units constitutives des protines, Parfois source nergtique
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Les antibiotiques Ils ont t introduits lorigine dans les milieux de culture pour rduire la frquence des contaminations. Lutilisation de hottes flux laminaire coupls lutilisation de techniques aseptiques ont rendu lusage des ATB inutile
Leur usage doit tre rserv aux cultures primaires ou les expriences trs couteuses en temps et argent
Les antibiotiques
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Rle des constituants des milieux dfinis Vitamines Cofacteurs denzymes ou prcurseurs pour la synthse de molcules. Glucose Source dnergie et source de carbone. Rouge de phnol Permet de visualiser les variations du pH, adapt car zone de virage situe la valeur du pH rguler. Systme tampon Permet la rgulation du pH : rgulation obligatoire pour les cellules de mammifres notamment qui sont issues dun organisme o rgne lhomostasie.
Le srum Le pourcentage de srum additionn au milieu dfini varie, selon le type cellulaire, de 2 20 %, le plus souvent de lordre de 5 10 %. L'effet cyto-stimulant global du srum est inversement proportionnel l'ge du donneur. Les plus frquemment retrouvs sont : le srum de veau, le srum de veau nouveaun, le srum de veau ftal (SVF). Le srum est un mlange de composition extrmement complexe qui contient, un grand nombre de substances libres par toutes sortes de types cellulaires de l'organisme donneur.
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Avantages du srum Apport de facteurs de croissance permettant la prolifration cellulaire Apport dhormones Apport de facteurs dattachement contribuant la bonne adhrence indispensable la division cellulaire Rle protecteur : augmente la viabilit cellulaire et la stabilit des produits cellulaires Proprits nutritives (nombreux mtabolites, ions, oligolments et lipides en solution) Pouvoir tampon Apport de protines de transport (transportent des substances de faible poids molculaire, fer et acides gras par exemple) Pouvoir dtoxifiant: absorbe et neutralise les toxines
Inconvnients du srum
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Composition partielle du srum
Principales fonctions des constituants du srum Facteurs de croissance et hormones: Facteurs de croissance: Peptides impliqus dans le contrle du cycle cellulaire (messagers chimiques). Ils ont un effet mitogne et permettent la prolifration cellulaire. Hormones: Messager chimique vhicul par le systme circulatoire qui agit distance de son site de production par fixation sur des rcepteurs spcifiques Facteurs d'attachement (fibronectine): Glycoprotines qui favorisent l'adhsion des cellules. Proprit nutritive : Glucose Riche en nombreux oligolments.
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Principales fonctions des constituants du srum Lalbumine Elle remplit diffrentes fonctions dont celle dtre le transporteur de substances lipophiles (acides gras, lments de trace, hormones et vitamines liposolubles), mais aussi de permettre la dtoxification du milieu (transport de H2O2, fixation de toxines). Le srum prsente lavantage d'apporter des inhibiteurs de protases, l2macroglobuline et l'1-antitrypsine, qui inactivent la trypsine que l'on utilise en routine pour le repiquage des cultures.
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Rservation des lots de srum La variation des lots de srum peut tre due :

Une diffrence dans les mthodes de prparation et de filtration du srum Une diffrence dge et de stockage des lots Une diffrence entre les stocks danimaux (matriel brut) Etc.
Un lot de srum se conserve de 6 mois un an -20C. Il est possible de demander aux fournisseurs de rserver un lot de srum
Tests des lots de srum La qualit dun srum est garantie par le fournisseur mais ces contrles sont gnralement effectus partir dun petit nombre de lignes cellulaires
Vous devrez tester le srum sur vos propres lignes !!
Il existe 4 principaux paramtres pour tester le srum

Efficacit de clonage Courbe de croissance Prservation des caractristiques cellulaires Strilit
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Tests des lots de srum: efficacit de clonage Durant le clonage, les cellules sont trs faible densit et sont trs fragiles = meilleure condition pour tester le srum. Ensemencer les cellules raison de 10 100 cellules/mL et regarder les colonies aprs 2 semaines de culture. Marquer et compter les colonies et regarder les diffrences dans lefficacit de clonage (survie) et la taille des colonies (prolifration). Chaque srum devrait tre test pour des valeurs comprises entre 2 et 20 %. Cette mthode rvle si un srum 1) est performant faible concentration (= sauver de largent) et toxique des fortes concentrations.
Tests des lots de srum: Courbe de croissance Une courbe de croissance cellulaire devrait tre ralis pour chaque lot de srum. Une longue phase de latence indique que la culture doit sadapter au srum Un temps de doublement rapide est prfrable si lon souhaite obtenir rapidement un lot de cellules et une concentration cellulaire maximale
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Tests des lots de srum: prservation des caractristiques cellulaires En gros, les cellules doivent faire ce quon leur demande dans le nouveau srum Produire un virus, une protine recombinante, se diffrencier, etc.
Tests des lots de srum: Strilit Principalement les mycoplasmes
Inactivation du srum la chaleur Le srum est inactiv la chaleur en lincubant 30 mn 56C, puis il est aliquot et conserv -20C. Le chauffage est utilis pour inactiver le complment lors dexpriences dimmunologie Par contre, pour certains types dapplications (production de virus, protines recombinantes) cela ne sert pas grand-chose On le fait quand mme par tradition Il semblerait que ce chauffage diminue le nombre de mycoplasmes, mais ne les limine pas.
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Autres supplments Hydrolysats: beaucoup de supplments sont des drivs de milieux utiliss en fermentation Bactopeptone, tryptose, hydrolysate de lactalbumine Digestion protolytique de cur de buf
La bactopeptone et la tryptose peuvent contenir des nuclosides, des acides gras, des carbohydrates = substituts au srum Il est possible de les striliser par autoclave
Pham et al, 2005
Autres supplments Extrait dembryons Milieu conditionn: culture sur couche nourricire Couche de fibroblastes irradis (perte de la capacit se diviser)
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Milieu entirement dfini (sans srum) Diffrents constituants dfinis sont additionns des concentrations dfinies un milieu synthtique de base riche (type HAM F12 ou MCDB 104). L'addition de ces substances varie en fonction des exigences du type cellulaire cultiv. Avantages:
Milieu entirement dfini (sans srum) Inconvnients:

Emploi pouvant ncessiter une adaptation des cellules Emploi souvent limit quant aux types cellulaires et aux applications Moins bonne viabilit cellulaire densit leve Moins bonne protection des cellules et des produits Pas ncessairement moins chers que les milieux supplments en srum
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Quelques exemples de Milieux entirement dfinis (sans srum)
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Milieu entirement dfini (sans srum) Les facteurs de croissance: Leur action sur les cellules est dclenche par la formation d'un complexe spcifique avec un rcepteur. Il en rsulte: soit une augmentation de la taille de la cellule, soit une augmentation de la population cellulaire, soit une induction ou un blocage d'une tape de diffrenciation. Les facteurs de croissance sont des polypeptides dont la majorit d'entre eux sont actuellement la technologie de lADN recombinant. Un milieu sans srum et contenant ces facteurs devient trs onreux. Un tel milieu nest utilisable que pour la recherche, mais rarement pour la production.
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Les facteurs de croissance
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Domaines dutilisation des milieux de culture de cellules animales Obtention de matriel biologique cellulaire pour des tudes en recherche fondamentale et prclinique Production de mtabolites divers Hormones, interfrons, interleukines, facteurs de croissance, anticorps monoclonaux, etc. Culture de tissus ou dorganes tudes physiologiques (recherche fondamentale ou applique) Chirurgie rparatrice (peau, muscle, foie, vaisseaux sanguins, etc. Production de vecteurs viraux et de vaccins
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Construction et slection de clones CHO recombinants
Mammalian cell biotechnology in protein production. Par Hansjrg Hauser, Roland Wagner
Mammalian cell biotechnology in protein production. Par Hansjrg Hauser, Roland Wagner
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Fluorescent labelling in semi-solid medium method
Instead of picking and analyzing blindly hundreds of clones, cells are directly labelled with a fluorescent antibody against the secreted re-protein More efficient than limiting dilution Thousands of clones can be screened rapidly Only positive clones are analyzed for re-protein production Procedure overview: Pool of stable transfectants is generated Cells are plated at low density in semi-solid culture medium in the presence of fluorescent antibody against re-protein Fluorescent colonies are scanned, quantified, selected and picked Clones are amplified and analyzed in batch cultures
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Untreated Flat bottom No autofluorescence with black wall to reduce extraneous light

Cell selector Scanned, Quantified, Picked Transfer into 96 well plates
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Caron et al, 2009
Formulation dun milieu de culture microbien
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Formulation dun milieu de culture microbien
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Cours 5 - Les Milieux de Culture - Étudiant

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Cours 5: Les milieux de culture

Pour les analyses microbiologiques

En microbiologie industrielle (alimentaire, pharmaceutique)

Les milieux de culture doivent satisfaire toutes les exigences cites

Les besoins nutritifs courants

Hydrogne Oxygne Azote Souffre Phosphore Potassium Calcium Magnsium Fer

Carbone Hydrogne Azote Oxygne Phosphore Souffre Total

19.37% 9.31 5.14 62.81 0.63 0.64 97.9

11.34% 8.72 0.83 77.9 0.71 0.1 99.6

12.14% 9.94 3.04 73.68 0.6 0.32 99.72

Ces lments sont ncessaires aux MO en quantits importantes = macro-lments.

Les besoins nutritifs courants: les macrolments

Les besoins nutritifs courants: les oligolments et leau

Les milieux de culture

Les diffrents types de milieux de culture

On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur composition:

AM - Les milieux dfinis

AM - Les milieux complexes

AM Classification des milieux

AM Classification des milieux

AM Classification des milieux

Les milieux slectifs : ils favorisent la croissance de MO particuliers.

AM Classification des milieux

AM Classification des milieux

La glose Mac Conkey est la fois diffrentielle et slective

AM - Les milieux solides

AM - Isolement de cultures pures

Isolement sur bote par talement en surface

AM - Isolement de cultures pures

Isolement sur bote par la technique des stries

AM - Isolement de cultures pures

Isolement sur bote par talement en profondeur

AM - Clonage et milieu slectif

La quantit juste de nutriments est essentielle pour viter:

Ingrdients grade technique ou industriel Produits naturels Rsidus

Les sources de carbone

Les sources de carbone

Le sucrose est le plus souvent achet sous forme de mlasses

Les sources de carbone: Procd de fabrication du sucre de table

Les sources de carbone: les mlasses

La composition des 2 types de mlasses varie beaucoup

La composition des mlasses varie chaque anne dpendamment:

Les sources de carbone: les mlasses

Les sources de carbone

Les sources dazote et de soufre

Les sources dazote et de soufre

Les sources dazote et de soufre

Autres lments essentiels

Autres lments essentiels

Fonctions de coenzymes, synthse de vitamines, transport de molcules

Autres lments essentiels

Autres lments essentiels

Les sources de vitamines et les autres facteurs de croissance

K2HPO4 + HCL KH2PO4 + KCl

Si une base est ajoute, la raction oppose seffectue

KH2PO4 + KOH K2HPO4 + H2O

Contrle du pH Milieux synthtiques

Culture mixte et mise lchelle

Cette diffrence peut certainement altrer le rendement de la fermentation

Culture de cellules animales

La culture de cellules animales seffectuait initialement dans des milieux naturels.

Extraits de tissus, dembryons de poulet, fluide corporel, srum, etc.