GENETICA GENERALA

LUCRARI PRACTICE
CUPRINS 1. Ciclul celular mitotic 2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza 2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare 2.1.1. Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n = 16) 2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n mitoz cu soluie carmin-acetic 2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale 3. Meioza 4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza 4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante 5. Cariotip si idiograma 5.1. Definirea termenilor, nomenclatur 6. Ploidia la plante 7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante 8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura 8.1. Studiul aberaiilor cromosomiale n ana-telofaza mitozei la unele plante de cultur 9. Drosophila melanogaster obiect de studiu in genetica 9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster 8.1.1. Cromosomii uriai 8.1.2. Cromosomii somatici Bibliografie

1. Ciclul celular mitotic

n diviziunea celular se disting dou categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcionale ale celulei, esenial fiind dublarea cromosomilor, i evenimente distributive, prin care materialul rezultat n urma replicaiei este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992). Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaional, este modalitatea de diviziune celular prin care, dintr-o celul somatic rezult dou celule fiice cu numr egal de cromosomi, att ntre ele, ct i cu celula mam. Mitoza este diviziunea ce lular care are loc n celule somatice i asigur transmiterea fidel a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi ns, diferite influene care adaug aparentei stabiliti a caracterelor, noi valene. Ciclul celular mitotic, la plante i animale, cuprinde n principal urmtoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (i a centrozomului la animale) i deplasarea spre poli a cromosomilor fii, dup care, urmeaz diviziunea citoplasmei. n procesul mitozei se organizeaz aparatul mitotic alctuit din structuri cromatice i acromatice, care este complet n metafaz. Pentru realizarea acestuia, sunt ne cesare proteine specifice, a cror sintez necesit un mare consum de energie. Totalitatea proceselor prin care trece celula somatic de la formare i pn la scindarea ei n dou celule fiice, cu numr de cromosomi egal cu numrul de cromosomi al celulei din care au provenit, alctuiesc ciclul celular. Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre dou diviziuni succesive) i cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise - profaza, metafaza, anafaza i telofaza avnd o durat variabil, n funcie de specie, tipul de celule, temperatur etc., de la cteva ore, la zeci i sute de ore. Interfaza Interfaza are cea mai mare durat n timp n ciclul mitotic i este ca racterizat de procese de biosintez. Durata interfazei este variabil, de la cteva ore pn la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza dureaz 70 -110 minute (profaza = 30 - 45 min., metafaza = 5 - 10 min., anafaza = 15 - 20 min. i telofaza = 20 - 30 min.) (Toma i Ni, 1995). La celula animal, un ciclu tipic dureaz 18 - 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (n general variaz cel mai mult), faza S (timpul necesar replicrii genomului) dureaz 6 - 8 ore, iar faza G2 este, de regul, cea mai scurt (mai ales cnd mitozele se succed rapid). Mitoza, de o bicei dureaz mai puin de o or (Lewin, 1994). Cercetrile microfotografice i microradiografice au demonstrat c interfaza es te foarte puin activ din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activ din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dubleaz de la 2C la 4C. Pe baza acestor observaii, Howard i Pelc, n 1953 au mprit interfaza n trei perioade: - perioada G1 (engl. gap = gol) perioad presintetic, n care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sin tetizeaz ARN (n special ARNm) i proteine; - perioada S (engl. synthesis = sintez) perioada de sintez a ADN; pn la sfritul fazei S toat cantitatea de ADN se replic (pe parcursul fazei S cantitatea total de ADN crete de la 2C la 4C). La sfritul acestei perioade, cromosomii sunt alctuii din dou cromatide foarte lungi i subiri; - perioada G2 perioad postsintetic, cnd sinteza ADN se oprete; are loc biosinteza proteinelor i a ARN, care se desfoar i n celelalte perioade ale in terfazei. Celula conine cromosomi bicromatidici.

diviziunea mitotic

2cADN celule fiice 2cADN

4cADN

interfaza

2cADN

Fig. 1. Ciclul celular mitotic (dup Alberts i colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidratai, despiralizai i nu se observ la microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului n interfaz, n celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (dup Hartl i Jones, 1998)

n afar de celulele la care ciclul mitotic se desfoar n mod normal, exist celule n repaus sau n perioada G0, asemntoare fazei G1, dar diferit prin faptul c celulele nu pot intra n faza S. n faza G0 intr celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla n repaus n faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semine), astfel nct, intr direct din G 0 n G2; alteori, din G0 pot intra n G1 timpuriu (Lewin, 1994). n explicarea cauzelor ce determin intrarea celulei n diviziune mitotic (trecerea din G 2 n mitoz) exist diferite ipoteze. Se pare c declanarea mitozei este determinat de modificarea raportului nucleu / citoplasm. Profaza n profaz au loc procesele: mrirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor, stabilirea polilor pentru diviziune , dezorganizarea membranei nucleare , dispariia nucleolilor i formarea fusului acromatic. La nceputul acestei faze, cromosomii se prezint sub form de filamente subiri, lungi, alctuind un spirem. n profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun n tot spaiul nuclear (n celulele vii se observ uor, avnd indicele de refracie 1,50 fa de cel al carioplasmei de 1,37). n profaza trzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor crete i ei devin mai scuri i mai compaci, aprnd formai din dou cromatide, foarte apropiate ntre ele i nfurate una n jurul celeilalte. La nceputul profazei, are loc o prim spiralizare a cromosomilor denumit spiralizarea mic, ce se realizeaz prin micorarea numrului de spire i mrirea diametrului lor. Spre sfritul profazei, are

loc a doua spiralizare denumit spiralizare somatic, n care numrul de spire continu s scad, ele apropiindu-se tot mai mult. n profaz, distana dintre cromosomi crete treptat i are loc dezorganizarea nucleului i a membranei nucleare, dispariia nucleolilor i formarea fusului mitotic. Centriolii migreaz spre polii celulei, plasndu-se n dou puncte opuse. ntre centrioli se organizeaz fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alctuit dintr -un numr mare de filamente, cu extremitile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit t ranzitoriu, cu ajutorul cruia se realizeaz distribuirea egal a cromosomilor n cele dou celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de dou tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiioneaz structura fusului i filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate i pleac de la centromerul fiecrui cromosom i nainteaz simultan, cu aceeai vitez, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Stadiul final al profazei prometafaza, se caracterizeaz prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmenteaz n poriuni relativ mari, ce pstreaz infrastructura de membran dubl i rmn, n parte, n interiorul fusului de diviziune, participnd mai trziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercit micri neregulate ntre polii celulei i planul ecuatorial al acesteia. Metafaza n aceast faz are loc desvrirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizai la maxim, se dispun n placa ecuatorial metafazic ( Fig.5). Micarea de dispunere a cromosomilor n placa ecuatorial, la distan egal de polii fusului de diviziune prezint trei componente: adunarea cromosomilor ntr-o poziie de echilibru ntre cei doi poli, micare datorat interaciunii ntre polii fusului i centromeri; orientarea cromosomilor n placa ecuatorial astfel ca, centromerii s fie situai n axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral; distribuirea cromosomilor n placa metafazic se realizeaz n jurul unui fus central gol (n seciune transversal apare ca un halo), cromosomii fiind dispui la periferia fusului, cu braele orientate n afar. Morfologia cromosomilor se studiaz n metafaz, deoarece n aceast faz ei sunt condensai n cel mai nalt grad. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide i prezint n lungul acestora, spre sfritul metafazei, o fisur longitudinal, care reprezint spaiul dintre cele dou cromatide surori. La sfritu l metafazei (Fig.6), cromatidele surori ncep s se separe (clivarea longitudinal), fcndu -se trecerea spre anafaz.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz trzie(dup Hartl i Jones, 1998)

Anafaza Anafaza se caracterizeaz prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii i migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debuteaz n anafaza timpurie, cnd are loc clivarea centromerilor, cromatidele rmnnd nc apropiate unele de altele. O dat terminat clivarea centromerilor, ncepe separarea cromatidelor n lungul fisurii longitudinale evideniate n metafaz (Fig.7). Dup Lewin (1994), la celulele animale, n anafaz, centromerul este duplicat funcional. Cnd i acest proces se ncheie, cromatidele fiice, fiecare cu cte un centromer propriu, ncep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii. Se admite c micarea cromosomilor spre poli este o consecin a scurtrii filamentelor fusoriale de sprijin, care leag polii fusului (prin pierderea sau adiia de tubulin din microtubuli ). Alungirea determin stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat n micarea cromosomilor spre poli. Aceast micare este posibil datorit existenei n structura fusului mitotic a unor proteine de natur actinic. n cazul n care setul de cromosomi migreaz aproape perfect sincron, se formeaz placa anafazic sau dublul aster. Chiar dac micarea cromosomilor nu este sincron, ea nu ncepe dect dup ce toi cromosomii sunt plasai n placa ecuatorial. n celulele animale, de regul, autosomii migreaz concomitent, iar heterosomii au o vitez de migrare diferit. n celulele plantelor, spre sfritul anafazei, fusul mitotic se mrete n volum n regiunea ecuatorial i ia form de butoia, formnd ulterior fragmoplastul.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Telofaza Telofaza este ultima faz a mitozei, caracterizat prin prezena fenomenelor opuse celor din profaz. Cromosomii sufer un proces de despiralizare i revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membran nuclear migreaz spre periferia fusului de diviziune; numrul lor crete printr-o sintez suplimentar. Aceste vezicule se agreg n jurul masei cromosomiale, se turtesc, nconjoar nucleul interfazic i formeaz noua membran nuclear. O parte din vezic ulele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcaie dintre cele dou celule fiice. Are loc i reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce ndeplinesc funcia de organizatori nucleolari ( Fig.9 i Fig.10).

Fig.9 Celul din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparinnd unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Citochineza n mod obinuit, diviziunea nuclear este urmat de citochinez (plasmodierez, citodierez sau plasmotomie). Citochineza poate avea loc centripet la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra), cnd membrana ce separ cele dou celule fiice apare sub forma unui inel ce crete centripetal, asemntor unei diafragme (Toma i Ni, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. Dup Buvat, n zona ecuatorial a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercaleaz fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migreaz n aceast regiune dinspre poli. mpreun cu elementele microtubulare, se formeaz o structur fibrilar. n jurul fibrelor microtubulare se aglomereaz vezicule mici golgiene ( Fig.11a,b). Veziculele se mresc, se contopesc i vin n contact cu pereii celulei mame, formnd lamela median (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaboreaz membrana primar, strbtut de plasmodesme ( Fig.11d,e). La animale,

separarea celulelor fiice se face prin formarea unu i inel contractil, deci prin trangulare(Fig.12 a, b).

Fig. 11 Formarea peretelui despritor, ntre celulele -fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (dup De Robertis i De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formrii inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (dup De Robertis i De Robertis,1983)

n celulele normale, mitoza i citochineza sunt riguros coordonate. Dac are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfoar normal, producndu -se o celul binucleat. Odat cu replicarea cromosomilor, are loc i replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mam n celulele fiice, dup care acestea i completeaz, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. n profaz, reticulul endoplasmic este transformat ntr-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse n special n regiunile periferice ale citoplasmei. n metafaz, mitocondriile se adun n jurul fusului; n anafaz, ele se grupeaz n jurul regiunii ecuatoriale, odat cu separarea celulelor fiice avnd loc i repartizarea acestora. n interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipic. n diviziunea mitotic, metafaza i anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, n timp ce profaza, uneori i telofaza, sunt cele mai lungi. Desfurarea n timp a mitozei depinde i de tipul celulei, vrst, starea fiziologic, condiii de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate fi blocat prin aciunea ocurilor de temperatur, narcoticelor, otrvurilor etc. ( Raicu i colab., 1973).

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza

2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare
Cromosomii la plantele superioare se evideniaz n celulele aflate n diviziune mitotic din esuturile meristematice, din zonele de cretere ale organelor vegetative (apex radicular, apex caulinar), sau n celulele meristemoide din calus. n lucrrile practice de citogenetic vegetal se folosesc mai ales specii de plante cu cromosomi de dimensiuni mari i n numr relativ mic. Pentru evidenierea cromosomilor, n celulele aflate n diviziune mitotic, se folosesc esuturile meristematice din zona de cretere a rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16), secar Secale cereale L. (2n = 14), bob Vicia faba L. (2n = 12) etc. Materialul biologic tipic, este reprezentat de esutul meristematic din apexul radicular al rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16). Rdcinile de ceap se obin dup o perioad de 2 -3 zile de la punerea ntr-un pahar cu ap a bulbului de ceap, astfel ca numai discul s ptrund n lichid. La temperatura camerei, rdcinile ating n 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm i pot fi detaate (Fig.13).

Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceap, n laborator

Pentru obinerea rdcinielor embrionare, seminele se pun la germinat pe hrtie de filtru, umectat cu ap, n cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea seminelor la unele specii de plante se face n nisip umed , n condiii speciale. Recoltarea rdcinilor se realizeaz cnd acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare cnd un numr mare de celule se afl n diviziune se determin prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei zile este ntre orele 7 - 10, funcie de durata ciclului celular la specia respectiv. 2.1.1. Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n = 16) Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanelor pectice din pereii celulari i colorarea difereniat a constituenilor celulari. Principiul metodei: n celulele n diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv n rou violaceu, de ctre o soluie de fuxin bazic decolorat (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborat de Feulgen i Rossenbeck (1924) i modificat de Tomasi (1936); se aplic pentru evidenierea cromosomilor mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967). Materiale necesare: material biologic (rdcini de ceap de 1 -1,5 cm); sticlrie (pahare Berzelius, flacoane, lame de microscop, lamele, pipete); instrumentar (pensete, lame, bee de chibrit); aparatur (microscop optic, termostat, frigider); hrtie de filtru reactivi prefixatori: soluie apoas de colchicin (0,01 - 0,2%); sau ap rece la 2-4 C fixatori nucleari: alcool etilic absolut acid acetic glacial (3 :1), sau; fixator Carnoy (6 pri alcool etilic absolut : 3 pri cloroform : 1 parte acid acetic glacial), sau; fixator Battaglia (5 pri alcool etilic absolut : 1 parte acid acetic glacial : 1 parte formol : 1 parte cloroform) colorani: reactiv Schiff - preparat dup Darlington i La Cour (1960) (cf. Tudose, 1967). Soluia folosit la colorare se recomand s nu se arunce, deoarece poate fi folosit de nenumrate ori, pn cnd capacitatea ei de colorare scade. Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea este necesar pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinnd acumularea de celule n metafaz. Aceast etap nu se recomand s se execute cnd se urmrete observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesar ns, la

efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realiznd o scurtare prin spiralizare, a cromosomilor. Materialul biologic (rdcinile de ceap de 1 - 1,5 cm lungime) se introduce n flacoane mici de sticl, adugndu-se 2 - 3 ml de prefixator. Dup trecerea timpului necesar prefixrii, prefixatorul se ndeprteaz cu o pipet sau prin decantare. Ca prefixato ri se foloseste de exemplu, soluie apoas de colchicin 0,01 -0,2% sau ap rece la 2 40C, 4 - 24 ore, la frigider. Pentru studiul cromosomilor n mitoz la ceap, recomandm prefixarea bulbilor de ceap germinai, cu rdcini de 1 - 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-40C), sau prefixarea cu soluie de colchicin, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei. Fixarea Fixarea are rolul de a omor celulele, n starea n care se afl n acel moment i de a coagula constituenii celulari, fr a modifica structura intern i extern a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coaguleaz, constituenii celulari putndu -se colora cu diferii colorani. Fixarea se realizeaz prin adugarea peste materialul biologic a 2 -3 ml de fixator, dup ndeprtarea substanei de prefixare. La ceap, se preleveaz rdcinile i se plaseaz ntr -un flacon de sticl, n vederea efecturii fixrii cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura camerei. n general, timpul de fixare variaz n funcie de soluia de fixare i de consistena materialului fixat. Dac prelucrarea materialului biologic nu se continu imediat, el se conserv la frigider (2 40C), n alcool etilic 70%. Splarea Rolul splrii este de a ndeprta urmele de fixator. Splarea se realizeaz cu soluie de HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se ndeprteaz soluia de fixare i se adaug soluia de splare. Hidroliza Rolul hidrolizei este de a uura colorarea, prin dizolvarea parial a substanelor pectice intercelulare, distrugerea parial a pecto -celulozei parietale, precum i uurarea etalrii celulelor ntre lam i lamel. Dup ndeprtarea soluiei de fixare, sau a alcoolului, se realizeaz hidroliza la cald sau la rece. Hidroliza la cald se realizeaz la temperatura de 600C, prin adugarea de 2 - 3 ml HCl 1N. Timpul este variabil, funcie de duritatea esuturilor; se stabilete prin tatonri (la ceap, 7 - 8 min.). Hidroliza la rece se realizeaz prin adugarea de soluie HCl 50%, dup ndeprtarea soluiei de splare. La ceap, hidroliza se realizeaz timp de 10 -15 min., la temperatura camerei. Colorarea Dup ndeprtarea soluiei de hidroliz (cu ajutorul unei hrtii de filtru se ndeprteaz urmele de soluie de hidroliz), se adaug 2 -3 ml de reactiv Schiff, astfel nct rdcinile s fie scufundate n colorant, iar colorantul s rmn incolor. Dup 15 -20 de min., zona meristematic din vrful rdcinii ncepe s se coloreze n rou-violaceu, apoi n violet intens, deoarece aici se afl celule n diviziune; restul rdcinii, unde frecvena diviziunilor este sczut, iar celulele sunt mari i alungite, rmne vizibil necolorat. Pentru o bun colorare sunt necesare 30 min. - 1 or, la temperatura camerei. O colorare intens, uniform, se obine dac materialul introdus n colorant se pstreaz la frigider, cteva ore. Pentru mrirea contrastului ntre cromosomi i citoplasm se recomand meninerea rdcinilor scoase din colorant ntr -o soluie de acid acetic 45%, timp de 10 - 15 min. sau n ap, timp de 30 de min., splnd astfel excesul de colorant. n cazul n care nu s -a realizat o colorare satisfctoare, intensificarea ei se realizeaz prin executarea preparatului ntr -o pictur de carmin acetic. n colorant, la frigider, materialul se poate pstra maxim 1-2 zile, dup care se degradeaz, avnd loc i colorarea citoplasmei. Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash) Preparatele microscopice rapide se obin prin etalarea vrfului colorat al rdcinii (de preferin o poriune de 1 -2 mm), pe o lam de microscop curat i degresat (prin splarea lamelor n amestecuri oxidante speciale folosite n lucrrile de citologie, n alcool etilic 96%, sau n spirt sanitar, urmate de o bun tergere cu o bucat de tifon, naintea efecturii preparatului), nt r-o pictur de acid acetic 45%. n prealabil, vrful colorat al rdcinii se poate trece printr -un cristalizor cu ap. Aeznd deasupra vrfului detaat al rdcinii o lamel i innd cu un deget o latur a lamelei, se etaleaz preparatul prin bti ritmice i sistematice n lamel, cu un b de chibrit, pentru dispunerea celulelor ntr -un singur strat i dispersarea cromosomilor n celule. Eliminarea excesului de soluie i desvrirea dispersrii celulelor i a cromosomilor se

realizeaz cu ajutorul unei hrtii de filtru, apsnd cu degetul mare peste lamel, fr a o mica. Pentru a mpiedica mprtierea cromosomilor i pentru o bun fixare a celulelor pe lam, se recomand ungerea acesteia naintea executrii preparatului cu albumin glicerinat. Lama uns este trecut cu partea uscat deasupra unei flcri, evitnd coagularea albuminei glicerinate. Cu ct etalarea se efectueaz mai bine, cu att preparatul este mai bun, prezentnd cromosomii bine dispersai i individualizai. Trebuie evitat deplasarea lamelei pe lam n timpul etalrii, fapt ce duce la rostogolirea celulelor i la compromiterea parial sau total a preparatului. Dup etalare, ntre lam i lamel, trebuie s se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat n violet. Preparatele astfel obinute, se pot observa la microscop imediat dup efectuare, timp de cteva ore, deoarece la lumin i la temperatura camerei, colorantul va dispersa n citoplasm. Efectuarea preparatelor semipermanente Pentru studiul preparatelor i n ziua urmtoare, acestea se efectueaz semipermanent, pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de preparate se realizeaz prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adugare de glicerin pe marginile acesteia, la contactul cu lama i ndeprtarea excesului de glicerin cu ajutorul unei hrtii de filtru. Lamele semipermanente se pot pstra la frigider timp de 24 - 48 de ore. Dup o pstrare ndelungat, colorarea se intensific, cuprinznd i citoplasma. Efectuarea preparatelor permanente prin includere n balsam de Canada Preparatele microscopice pe care dorim s le pstrm timp ndelungat, cu scopul de a servi drept model, sau ca dovad a unei cercetri tiinifice, se monteaz n balsam de Canada (rin miscibil cu xilenul sau toluenul). n jurul lamelei se pune o pictur de alcool 96% i cu ajutorul unei lame de ras, se desprinde cu atenie lamela de pe lam, printr -o micare de ridicare a lamelei. Materialul de studiu rmne prins de lam i de lamel. Att lama, ct i lamela, se trec prin dou bi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic i dou bi de xilen sau toluen, timp de 2 -5 min., pentru fiecare baie. Rolul alcoolului este acela de a deshidrata esuturile i de a le spla de acidul acetic; xilenul va nlocui apa din esuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul. Lamele se introduc n pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele n capsule de sticl sau porelan, ntotdeauna cu preparatul biologic plasat la faa superioar. Pe lama umed, n regiunea unde sunt celule, se pune o pictur de balsam de Canada, iar deasupra se aplic o lamel curat i degresat. Pe aceeai lam, alturi (n regiunea fr celule) se pune o alt pictur de balsam de Canada peste care se aeaz lamela iniial, cu faa ce conine celulele, n jos. Se ndeprteaz excesul de balsam de Canada printr -o uoar apsare pe lamele, cu o bucat de hrtie de filtru, realizndu -se astfel, i prinderea lamelelor de lam. Preparatul se usuc la termostat, la 400C, timp de cteva zile i se eticheteaz (se noteaz specia i esutul din care s a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat preparatul etc.), putnd fi pstrat apoi timp ndelungat. Examinarea preparatelor la microscopul optic Examinarea preparatelor se efectueaz n lumin puternic, cu folosirea unui filtru verde, care mrete contrastul ntre cromosomi i citoplasm. Se recomand ca observarea s nceap cu obiectivul 10x, apoi, se schimb obiectivele 20x, 40x i chiar 90x (cu imersie n ulei de cedru). Deoarece reactivul Schiff coloreaz selectiv numai ADN -ul, la microscopul optic, se vor observa cromosomii colorai n rou -violet; nucleolii, citoplasma i organitele celulare rmnnd incolore. Pereii celulari nu se coloreaz, fiind greu vizibili, de culoare glbuie; uneori se observ doar cromosomii celulelor n diviziune i nucleii celulelor n interfaz. Pentru a delimita celulele, se poate realiza o uoar colorare a citoplasmei, cu o soluie alcoolic foarte slab de verde de metil. Aceast colorare se realizeaz naintea efecturii preparatului permanent, prin trecerea lamei i a lamelei pentru un timp foarte scurt (cteva secunde), prin soluie alcoolic d e verde de metil. Astfel, citoplasma se coloreaz n verde deschis i celulele pot fi uor delimitate, iar cromosomii se observ mai bine, datorit contrastului de culoare. La microscopul optic se vor observa celule n interfaz cu nuclei mici, colorai n rou-violet, cu nucleoli incolori, ce apar ca nite corpusculi luminoi de form mai mult sau mai puin rotund. Se observ i celule n diferite faze ale diviziunii mitotice: celule n profaz timpurie, cnd cromosomii ncep s devin vizibili la microsc opul optic i au aspectul unor filamente fine i subiri; n profaza trzie, cnd cromosomii se

individualizeaz, fiind situai n nucleu. Spre sfritul profazei se dezorganizeaz membrana nuclear; celule n metafaz (faz cu frecven ridicat n preparatele microscopice, n cazul n care s-a efectuat prefixarea); se pot numra i observa morfologic cromosomii care au atins maximul spiralizrii, fiind bine individualizai. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu uurin i se pot numra 16 cromosomi, de forma unor bastonae, cu capetele mai mult sau mai puin ndoite. Prin studiu mai amnunit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia fiecrui cromosom n parte, putndu -se executa microfotografii; celule n anafaz n anafaz timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se deplaseaz spre polii celulei i anafaz trzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub form de stea - diaster; celule n telofaz timpurie, cnd cromosomii fii au ajuns la polii celulei i telofaz trzie, caracterizat prin formarea nucleilor fii i apariia peretelui despritor (fragmoplastul). 2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n mitoz cu soluie carmin-acetic Metoda a fost elaborat n 1926 de ctre Belling (cf. Tudose, 1967)i se bazeaz pe faptul c acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti), se comport ca un colorant acid n soluie alcalin i se ncarc negativ, iar n soluie acid, ca un colorant bazic, ncrcndu-se pozitiv. Aceast metod este des folosit n studiile de citogenetic vegetal, deoarece este uor de efectuat, necesitnd un timp scurt. Materialul biologic, sticlria, instrumentarul i reactivii utilizai sunt identici cu cei folosii n cazul metodei Feulgen. Colorantul utilizat este soluia carmin acetic (55 cm 3 ap distilat la 1000C, 45 cm3 acid acetic glacial i 0,5 g carmin). Amestecul se pune ntr -un balon de sticl, se agit i se aeaz n bain-marie, lsndu-se s fiarb cteva minute. Se agit din nou i se las s se rceasc; se filtreaz i se adaug cteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolv ncet n soluie, excesul depunndu-se la baza vasului. Se pstreaz la ntuneric i la rece (l a frigider). Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea materialului biologic lipsete, sau poate fi efectuat la fel ca la metoda Feulgen. Fixarea Fixarea nu este necesar; se poate realiza n fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 12 ore, sau cu alt fixator. Dac nu se continu lucrul, materialul poate fi pstrat la rece, n fiole cu alcool 70%, bine nchise. Hidroliza i colorarea Hidroliza i colorarea se efectueaz simultan, n soluia carmin -acetic. ntr-o sticl de ceas sau o capsul de porelan, se pun 3 - 5 cm3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (rdcinie de 10 - 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaug cteva picturi (10 - 15) de HCl 1N; se nclzete 20 - 25 min. la flacra unei lmpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitnd fierberea i agitnd, pn cnd materialul capt culoarea rou nchis, devine moale i se las la baza vasului. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele microscopice se realizeaz pe o lam de microscop, ntr -o pictur de carmin acetic, n care se aeaz vrful unei rdcinie. Pentru intensificarea culorii, se amestec uor colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se aeaz deasupra o lamel, se etaleaz i se ndeprteaz excesul de colorant, n acelai mod ca la metoda Fe ulgen. 2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct n esuturile cu activitate mitotic intens (esut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, es uturi embrionare sau de regenerare, ct i indirect n culturi de esuturi. Metode pentru studiul cromosomilor n diferite esuturi provenite de la animale adulte Studiul cromosomilor la peti (Fam. Cyprinidae). Tehnica Ohno (1965) Material biologic: splin, rinichi, gonade, branhii.

Reactivi: colchicin 0,5%, ap distilat, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa. Instrumentar: lame de microscop, lamele, sering, foarfece, ac spatulat, pensete etc. Etape de lucru: Pretratament Pretratamentul se realizeaz cu colchicin. Colchicina blocheaz celulele n diviziune n stadiul de metafaz, prin inhibarea activitii fusului nuclear, determinnd acumularea n esuturile tratate a unui numr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizai, liberi n citoplasm. Se injecteaz animalele adulte intramuscular (n musculatura dorsal) cu soluie de colchicin 0,5%, n cantitate de 0,5 -1 ml. (n funcie de talie), cu dou ore nainte de sacrificare. Tratament Tratamentul se realizeaz cu soluie hipotonic (hipoton), ce determin o umflare i o fluidizare a citoplasmei celulare, permind astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare superioar. Dup sacrificarea animalului se recolteaz splina, rinichiul, gonadele i branhiile, care se fragmenteaz n buci de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizeaz n ap distilat, la pH neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei. Fixare Fixarea are rolul de a omor celulele, fr s altereze componentele celulare. Drept fixator se folosete soluia de acid ace tic 50%, timp de 15-30 min., la temperatura camerei. Hidroliz Hidroliza se efectueaz n scopul macerrii esuturilor, n vederea facilitrii ptrunderii colorantului n nucleu; se realizeaz cu HCl 1N, la 60 0C, timp de 10-15 min. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie Giemsa, n scopul obinerii contrastului necesar examinrii microscopice a cromosomilor. Efectuare de preparate microscopice de tip squash Pe o lam de microscop, ntr-o pictur de acid acetic 45%, se plaseaz un fragment de esut, se acoper cu lamela i se etaleaz prin bti ritmice cu un b de chibrit. Preparatele se pot realiza permanente n balsam de Canada, dup tehnica descris. Studiul cromosomilor la amfibieni. Tehnica Spurway i Callan (1960) Aceast tehnic este utilizat pentru evidenierea cromosomilor din celulele esutului gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus. Etape de lucru: Tratament Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesar nlocuirea tratamentului hipotonic cu o colchicinizare cu soluie de colchicin 0,04% n ap distilat, timp de 30 min., la 37 0C. Fixare esutul gonadal fragmentat se fixeaz 2 -3 ore n fixator alcool acetic 3/1. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie carmin acetic 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele se efectueaz prin tehnica squash. Se plaseaz o poriune din esutul colorat pe lam i se acoper cu lamela, apoi se preseaz uor pentru etalare. Efectuarea preparatelor permanente Preparatul se introduce n acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei i se trece n alcool acetic 3/1, timp de cteva secunde. Ulterior se trec att lama, ct i lamela prin dou bi de alcool i dou bi de xilol, apoi se monteaz preparatul n balsam de Canada. Studiul cromosomilor la mamifere. Tehnica Fredga (1964) Material biologic: cornee de obolan, oarece, hamster, cobai. Hipotonia Se asfixiaz animalul (obolan, oarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform i se extirp globii oculari cu un foarfece fin i o pens curb, evit nd atingerea corneei. Globii oculari se plaseaz ntr-un vas cu soluie hipoton de citrat de sodiu 0,7% (n ap distilat), la 37 0C, timp de 30 min. Fixarea

Fixarea materialului se realizeaz n soluie de acid acetic 50% - 9 pri i o parte HCl 1N, 5 min. Colorarea Colorarea se realizeaz n soluie de orcein acetic 2%, 2 min. Efectuarea preparatelor microscopice Globul ocular se plaseaz pe o lam de microscop curat i cu un ac spatulat se rzuie celulele din epiteliul cornean ntr-o pictur de colorant. Se acoper cu lamela i se preseaz cu grij, realizndu-se un preparat de tip squash.

3. Meioza
Este procesul complex de diviziune, n urma cruia rezult celule -fiice cu numr de cromosomi redus la jumtate fa de celula -mam (de la care s-a pornit n diviziune). Termenul provine de la grecescul meiosis (reducere). Ca rezultat al meiozei se formeaz gameii la animale i sporii la plante, acest tip de diviziune fcnd trecerea de la un nucleu diploid (2n), la unul haploid (n), diplofaza fiind nlocuit cu haplofaza. Reducerea la jumtate a numrului de cromosomi n cursul meiozei, este un proces indispensabil, pentru c, prin unirea n procesul fecundaiei a gameilor paterni (cu n cromosomi), cu cei materni (tot cu n cromosomi), are loc, n zigot, restabilirea numrului iniial (2n) de cromozomi, i nu dublarea acestuia. Deci, pentru toate organismele ce se nmulesc pe cale sexuat, este obligatoriu procesul alternrii fazelor ce se deosebesc dup numrul de cromosomi (haplofaza i diplofaza); ciclul de via individual cuprinde ambele faze. Meioza reprezint un proces complex, ce implic desfurarea succesiv a dou diviziuni. Cele dou diviziuni, sunt precedate de o interfaz premeiotic (identic cu interfaza mitotic) i separate de o interfaz meiotic scurt, din care lipsete perioada sintetic (replicarea ADN). Prima diviziune meiotic este denumit i reducional (heterotipic), iar a doua diviziune este denumit ecvaional (homeotipic sau de maturaie). Schematic meioza poate fi redat astfel:

n n n
2n

n n

n
Diviziunea I Diviziunea II

Prima diviziune meiotic Ca i n cazul diviziunii mitotice, autoreplicarea ADN -ului precede meioza, astfel nct, la nceputul profazei, fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide surori (este bicromatidic). Profaza Aceast etap este mprit n cinci stadii: leptoten, zigoten, pachiten, diploten i diachinez. Leptotenul (leptonemul) - de la grecescul lepto = subire; tenuis = panglic. Materialul cromatic din interfaz ncepe s se condenseze. Cromosomii sunt nc foarte despiralizai i se individualizeaz sub forma unor filamente lungi i fine de cromatin. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide surori unite la nivelul centromerului i intim asociate, ceea ce confer cromosomului un aspect monocromatidic. Cromosomii sunt ataai cu ambele capete de nveliul nuclear, prin intermediul unor structuri specializate, numite plci de ataare.

ntre leptoten i zigoten, n mod frecvent, se observ un stadiu intermediar, n care filamentele cromatice se adun la un loc, formnd un ghem compact ( spirem). Spre sfritul leptotenului, se observ tendina aezrii paralele a cromosomilor omologi.

Fig. 14 Zea mays L. profaza I - leptoten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Zigotenul (zigonemul) de la grecescul zygo = jug. Acest stadiu se caracterizeaz prin conjugarea cromosomilor omologi (unul de origine matern i cellalt de origine patern), proces denumit sinapsis (sinapsare). Sinapsisul ncepe prin condensarea fiecrui cromosom n jurul unei structuri denumit element axial, care este aparent de natur proteic. Dup aceea, elementele axiale ale cromosomilor corespunztori se dispun fa n fa, i constituie elementele laterale ale unei structuri tripartite ( complexul sinaptonemal), fiind separate de un element central, cu care sunt conectate prin intermediul unor benzi proteice transversale, dispuse n mod similar treptelor unei scri. Conjugarea cromosomilor omologi, ce formeaz bivalenii, are loc treptat. Din punctul de iniiere, conjugarea se extinde progresiv, cuprinznd integral cromosomii prealiniai ntr -o manier zipper - like (engl. zipper = fermoar; like = ca i). Cnd cei doi cromosomi nu sunt perfect omologi, conjugarea se produce numai ntre poriunile omoloage. Conjugarea cromosomilor X i Y, este posibil datorit existenei la cei doi cromosomi de sex a unei regiuni terminale omoloage. Se presupune c forele care determin conjugarea sunt de natur electrostatic sau hidrodinamic. n acest stadiu cromosomii sunt n numr diploid. La autopoliploizi (3x, 4x etc.) numrul cromosomilor mperecheai poate fi mai mare de doi. Deci, n loc de bivaleni, vor fi multivaleni (trivaleni, tetravaleni etc.). Pachitenul (pachinemul) de la grecescul pachy = gros n acest stadiu, continu scurtarea i ngroarea cromosomilor ce formeaz bivalenii. Scurtarea este att de intens, nct devine evident structura dublu cromatidic a fiecrui cromosom. Astfel, cei doi omologi ai bivalentului formeaz o figur tetracromatidic, numit tetrad. Numrul tetradelor este egal cu jumtate din numrul diploid al cromosomilor. Orice modificare n structura cromosomilor, care altereaz omologia, poate fi eventual decelat prin analiza bivalenilor n pachiten. Spre sfritul pachitenului se observ ncruciarea reciproc a celor doi cromosomi omologi din acelai bivalent. Are loc schimbul reciproc de segmente ntre cromosomii omologi, ca rezultat al crossing-overului (recombinarea intracromosomial).

Fig. 15 Zea mays L. profaza I - pachiten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Diplotenul (diplonemul) de la grecescul diplo = dublu Este stadiul n care, ntre cromosomii omologi ncep s acioneze fore de respingere, acetia ndeprtndu-se ntre ei, ncepnd din zona centromerilor spre extremiti. Omologii mai rmn nc unii n anumite puncte, denumite chiasme, considerate a reprezenta locul n care s-a realizat schimbul fizic ntre cromosomi. Dei ncep s se formeze n pachiten, chiasmele devin vizibile numai dup desinapsarea cromosomilor ce alctuiesc bivalentul. S -a constatat absena

chiasmelor n regiunile heterocromatinice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate n evenimente crosing-over. Diachineza n limba greac dia = prin i kinesis = micare. Cromosomii continu contractarea, fiind uor vizibili la microscop i se detaeaz de membrana nuclear. Se remarc fenomenul de terminalizare a chiasmelor (adic migrarea chiasmelor intercalare spre capetele cromosomilor), care face ca bivalenii s capete de regul forme inelare, omologii rmnnd asociai prin capetele lor. n cursul acestei faze, nucleolul i membrana nuclear se dezintegreaz i cei doi centromeri ai fiecrei tetrade se ataeaz de fibrele fusului nuclear, ce a aprut concomitent cu ruperea membranei nucleare.

Fig. 16 Zea mays L. profaza I - diploten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Metafaza I n aceast etap a primei diviziuni, cromosomii ating maximum de scurtare i ngroare. Bivalenii migreaz spre placa metafazic i se dispun ntr -un singur plan, perpendicular pe fibrele fusului. Sunt nc vizibile chiasmele terminale ale fiecrei tetrade. n cadrul fiecrei tetrade, centromerul unuia din cromosomii bivaleni este orientat spre un pol, iar centromerul celuilalt cromosom al aceluiai bivalent, spre cellalt pol al fusului. Orientarea centromerilor cromosomilor de origine matern ori patern, ctre un pol sau cellalt este aleatorie ( recombinare intercromosomial sau dansul cromosomilor). n aceast faz, cromosomii se coloreaz intens, astfel nct pot fi uor numrai i studiai din punct de vedere morfologic. Anafaza I Omologii din cadrul fiecrei tetrade se separ, n urma disjunciei rezultnd cte doi cromosomi univaleni ce ncep s migreze spre polii opui (n funcie de orientarea centromerilor). Segregarea aleatorie a acestor cromosomi, st la baza principiului mendelian al segregrii independente a factorilor ereditari. Jumtatea de origine patern a fiecrei tetrade va migra ctre unul sau cellalt pol (n mod aleatoriu), iar jumtatea de origine matern va migra n fiecare caz ctre polul opus. La sfritul anafazei I, la fiecare pol al fusului, se afl cte un set haploid de cromosomi.

Fig. 17 Zea mays L. profaza I - diakinez (stnga) i metafaza I (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

Dac nu a avut loc nici un crosing-over n profaza I, fiecare cromosom univalent va fi alctuit doar din cromatidele de origine matern ori patern.

Fig. 18 Zea mays L. - anafaza I (Mertens i Hammersmith, 1998)

Telofaza I Cromosomii univaleni, ajuni la cei doi poli, sufer procese inverse celor din profaz (se despiralizeaz). n jurul fiecrui set haploid de cromosomi, se formeaz membrana nuclear. n final, se formeaz cei doi nuclei, n fiecare aflndu -se cte jumtate din cromosomii nucleului celulei iniiale. Apoi, are loc divizarea citoplasmei i apariia a dou celule (denumite celule n diad) cu nuclei haploizi (n). Dup telofaza I, urmeaz o scurt interchinez, i apoi ncepe a doua diviziune meiotic (diviziune de maturaie). La majoritatea speciilor, telofaza I i interchineza sunt foarte scurte. La unele specii aceste faze lipsesc. n aceast scurt interfaz, nu are loc replicarea ADN -ului.

Fig. 19 Zea mays L. telofaza I (stnga) i profaza II (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

A doua diviziune meiotic A doua diviziune a meiozei (diviziunea de maturaie), este de fapt o diviziune mitotic. Prezentm fazele pe scurt: Profaza a II a Lipsete la organismele care nu au nici interchinez. Acolo unde este prezent, are loc simultan n cele dou celule ale diadei. Deci, n fiecare din aceste dou celule, cromosomii se spiralizeaz, se scurteaz i se individualizeaz. Sunt bicromatidici (univaleni). Se formeaz fusul de diviziune. Metafaza a II a Cromosomii se inser pe filamentele fusului de diviziune i migreaz n placa ecuatorial, dispunndu-i centromerii n acelai plan.

Fig. 20 Zea mays L. metafaza II (Mertens i Hammersmith, 1998)

Anafaza a II a Cromatidele surori ale fiecrui bivalent se separ i se deplaseaz ctre polii opui ai fusului. Telofaza a II a Cromosomii ajuni la polii fusului de diviziune se despiralizeaz. n final, dintr -o diad n se formeaz o tetrad (patru celule) n. n urma proceselor morfofiziologice, cele patru celule ale tetradei se transform n gamei.

Fig. 21 Zea mays L. anafaza II (stnga) i telofaza II (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

Fig. 22 Zea mays L. - Citokinez i formarea tetradei (Mertens i Hammersmith, 1998)

A doua diviziune a meiozei, dup mecanismul de desfurare este asemntoare mitozei, dar prezint i deosebiri. Diferena principal const n faptul c, datorit crossing -overelor ce au loc n profaza I, cromatidele surori nu sunt identice. Cromosomii ce au participat la crosing -over sunt o combinaie de informaie genetic de origine matern i patern. O alt deosebire este c, n mitoz unitatea funcional este cromatida, iar n meioz unitatea funcional este cromosomul (dou cromatide).

4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza

4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante
Metoda de colorare rapid carmin-acetic Aceast metod a fost elaborat de Belling (1926) i ea se bazeaz pe capacitatea acidului carminic ca n soluie alcalin s fie ncrcat negativ i s se comporte ca un colorant acid, iar n soluie acid s fie ncrcat pozitiv i s se comporte ca un colorant bazic. Colorantul carmin care se folosete n mod curent n citologie este preparat dintr -un extract al femelelor homopterului Coccus cacti. Acest colorant nu este pur din punct de vedere chimic, acidul carminic fiind ns constituentul pe care se bazeaz activitatea sa. Pentru intensificarea capacitii sale de colorare, n soluia de carmin n acid acetic se adaug acetat de fier. Ca material biologic, se folosete secara Secale cereale L. (2n=14). n general, la secar ca i la alte cereale, meioza are loc n momentele cnd tinerele antere i-au pierdut transluciditatea. Spicele sunt recoltate n faza de burduf cnd au lungimea de 4 -6 cm, fiind nvelite n teaca ultimei frunze. Pentru studiul cromosomilor sunt necesare urmtoarele operaii: Etape de lucru Fixarea Se face n fixator (soluie alcool-acid acetic n proporie de 3 :1), sau n soluie Carnoy, n care anterele se las 24 -48 de ore. Se pot conserva fie n fixator, fie n alcool de 70 0 (n fiole bine nchise i la rece 0-40C, materialul se poate pstra timp ndelungat. Operaia fixrii poate lipsi, dup cum nici hidroliza nu este absolut necesar. Colorarea i efectuarea preparatelor microscopice Se ia un spic, se prelev florile din partea de mijloc i se scot staminele (cte 3 stamine n fiecare floare). Fiecare stamin se plaseaz pe o lam curat, ntr-o pictur de soluie carmin acetic. Cu un ac spatulat se taie transversal la mijloc i apoi se apas ncet pe cele dou jumti pentru a goli antera de coninut, adic de celulele mam ale granulelor de polen unde ar e loc meioza. Se ndeprteaz resturile staminei cu o penset fin. Peste acest material se pune o lamel curat i uscat, (sau uns cu albumin glicerinat i trecut prin flacr), dup care cu o

bucat de hrtie de filtru se apas pe lamel pentru a etala bine celulele i pentru a ndeprta excesul de colorant. Colorarea materialului are loc foarte repede, astfel c imediat poate ncepe observarea la microscop. Pentru intensificarea colorrii, se poate nclzi lama cteva minute deasupra unei flcri de la o lamp de spirt, evitnd fierberea. Pentru a evita evaporarea soluiei, se parafineaz marginile lamelei sau se pune soluie de lipit cauciucul. Examinnd preparatul la microscop, pot fi ntlnite trei situaii: 1. nu a nceput diviziunea, anterele fiind prea tinere n acest caz, celulele mam ale granulelor de polen sunt n interfaz. 2. a nceput diviziunea se observ celule n diferite faze ale meiozei. 3. s-a terminat diviziunea - se vor observa gruncioarele de polen care au form caracteristic. n general se consider c staminele din aceeai floare se afl n aceeai faz de diviziune. Dac la microscop nu am gsit diviziuni meiotice, se caut flori spre baza sau spre vrful spicului (nfloritul n cadrul unui spic ncepe mai nti la mijlocul spicului i se propag apoi spre baza i vrful spicului). Pentru cercetare se recomand folosirea metodei Feulgen pe care o vom descrie n continuare (cromosomii se coloreaz mai bine, contrastul este mai mare ntre cromosomi i citoplasm i n general se obin preparate mai bune). Studiul cromosomilor n meioz prin metoda de colorare Feulgen Aceast metod a fost elaborat de Feulgen i Rossenbeck (1924) i apoi modificat de De Tomasi (1936). n celulele n diviziune numai cromatina cromosomilor se coloreaz efectiv n rou-violaceu de ctre fuxin, n timp ce acidul ribonucleic din nucleoli i citoplasm nu se coloreaz. Reacia Feulgen pozitiv este considerat ca fiind un indice sigur al prezenei acidului dezoxiribonucleic. Pentru studiul meiozei prin metoda Feulgen se poate folosi ca material biologic secara Secale cereale L. (2n=14). n general meioza are loc n momentele cnd tinerele antere i pierd transluciditatea, acest moment coinciznd la gru i la secar cu faza n care spicele sunt n burduf i au o lungime de 3 6 cm. Pentru a repera momentul cnd are loc meioza folosim metoda rapid carmin -acetic (descris anterior). n cazul n care la microscop am gsit diviziuni meiotice se fixeaz ntregul spic. Sunt necesare urmtoarele operaii: Fixarea Se realizeaz n soluie alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3:1). n momentul fixrii se adaug o pictur de soluie de perclorur de fier la cca. 5 cm 3 de fixator. Fixarea se efectueaz n fiole de sticl n care se pun 2 -3 cm3 de fixator. n fixator anterele se las cel puin o or la temperatura camerei, sau cel mult 24-48 de ore n frigider, dup care se trec n alcool absolut pentru o jumtate de or, pentru ndeprtarea acidului acetic din esuturi. De aici materialul se trece n fiole cu alcool de 70 0 care se nchid ermetic prin parafinare i se pun n frigider la 0 -40C, unde se pot pstra timp ndelungat. Dac materialul se pstreaz n alcool de 70 0 timp mai ndelungat, se poate renuna la trecerea prin alcool absolut. Hidroliza Materialul se scoate din alcool 70 0 dup ce a stat cel puin o jumtate de or i se spal cu ap. n acest scop se ndeprteaz alcoolul din fiole, se pune ap i se agit anterele pn ce cad la fund. Materialul se las n ap o jumtate de or, dup care se face hidroliza n acid clorhidric normal, la temperatura de 600C, timp de 12 min. la orz, 8-9 min. n cazul grului etc. Colorarea Se face n soluie de fuxin bazic (reactivul Schiff) n care materialul se las cel puin o jumtate de or. n colorant anterele pot rmne cteva ore, timp n care se fac preparatele microscopice. Nu se recomand ca materialul s rmn prea mult timp n colorant deoarece se reduce contrastul dintre culoarea cromosomilor i a citoplasmei, iar preparatele au o ca litate mai slab. Efectuare preparatelor microscopice

Pe o lam de microscop se pune o pictur de acid acetic 45% i n aceasta se plaseaz o stamin. Cu un ac spatulat se taie transversal stamina n dou jumti. Se apas uor pe ele pn ce ies celulele mame ale granulelor de polen i apoi sacii polinici se ndeprteaz. Peste material se pune o lamel uns cu albumin glicerinat i trecut prin flacra unei lmpi de spirt. Cu o bucat de hrtie de filtru se apas pentru etalarea celulelor i pentru ndeprtarea excesului de soluie. Pentru a pstra preparatele cteva zile se poate parafina marginea lamelei sau se poate pune soluie de lipit cauciucul. Preparatele permanente se pot face prin montarea n euparal sau balsam de Canada.

5. Cariotip si idiograma
5.1. Definirea termenilor, nomenclatur
La conferina de la Denver (1960), termenul de cariotip a fost definit ca fiind o aranjare sistematic a cromosomilor unei singure celule, preparai prin desenare sau fotografiere, n nelesul lrgit conform cruia cromosomii unei singure celule pot reprezenta cromosomii unui individ sau chiar ai unei specii, iar termenul de idiogram ca reprezentarea diagramatic a unui cariotip, care se bazeaz pe msurtori ale cromosomilor din cteva sau din mai multe celule. Cariotipul, reprezint n esen, numrul, forma i mrimea cromosomilor, este constant n ontogenia i chiar n filogenia unei specii, fiind tot mai des utilizat n taxonomie. Studiul cariotipului furnizeaz elemente pentru analiza procesului de speciaie, pentru cunoaterea gradului de nrudire ntre specii etc. Pentru fiecare specie, exist un cariotip standard. Eventualele rearanjamente cromosomiale (eliminri de cromosomi, duplicaii, translocaii, deleii etc.), se pot stabili prin comparaii cu cariotipul standard. Indivizii aceleiai populaii care au o alt aranjare a genelor pe cromosomii omologi (consecin a modificrilor structurale ale cromosomilor), sunt denumii heterocariotipici, antonimii lor fiind cei homocariotipici. n funcie de tipul cromosomilor pe care i conine, un cariotip poate fi simetric (toi cromosomii sunt de acelai tip) sau asimetric. Cariotipul cu cromosomi uniformi, este considerat primitiv comparativ cu cel cu cromosomi neuniformi. Sensul evoluiei cariotipului se consider a fi acela al reducerii numrului de baz al cromosomilor i asimetrizrii lui (prin inversii, translocaii, fuziuni centrice, etc.). Metodologia elaborrii unei analize cromosomiale Indiferent de materialul celular din care au fost preparai cromosomii, sau de proveniena de specie a acestora, pentru a obine maximum de informaii citogenetice este necesar adoptarea unui procedeu de lucru care conine mai multe etape. Stadiul de diviziune cel mai adecvat analizei cariotipului, este metafaza m itotic, cnd cromosomii prezint maximum de condensare i colorabilitate. n continuare, vom prezenta pe scurt etapele de lucru necesare alctuirii cariotipului. Etapa prelucrrii microscopice A. Vizualizarea preparatelor microscopice. Cutarea metafazelor presupune baleierea (micarea lamei microscopice n sens orizontal sau vertical), fr a omite nici o poriune pe care se afl celule. Are ca scop: Alegerea metafazelor potrivite analizei citogenetice . Procentajul metafazelor apte studiului citogenetic, este extrem de variabil, depinznd de materialul celular studiat, de tehnica de preparare a cromosomilor, de abilitatea i experiena examinatorului. Cutarea metafazelor trebuie fcut cu un obiectiv ct mai mic (maxim 10x). Se poate sc himba obiectivul cu unul mai mare (20x sau 40x), pentru a rezolva anumite incertitudini. n alegerea metafazelor utilizabile sunt eseniale dou criterii: s nu existe suprapuneri de cromosomi, sau dac sunt, numrul lor s fie mic i s nu intereseze mai mult de doi cromosomi; cromosomii s nu fie mprtiai pe o suprafa prea mare, iar dispunerea lor s pstreze o form variabil ntre un cerc i un patrulater. Acest ultim criteriu, este deosebit de important, deoarece poate elimina metafazele sparte, c u cromosomi pierdui, care la examenul ulterior pot s sugereze apariia de complemente cromosomiale cu cromosomi lips. B. Studiul microscopic al cromosomilor. Etapa observaiei directe a cromosomilor, urmrete obinerea primelor rezultate citogenetice asupra materialului celular n studiu prin:

 Numrtoarea de cromosomi, care prezint o mare importan, fiind prima caracteristic citogenetic a populaiei celulare examinate. Aceast numrtoare se poate face direct n placa metafazic, delimitnd eventual anumite regiuni, dar mai precis este numrarea dup fotografie. Mai demult, se numra dup desen (se desenau schematic cromosomii pe o coal de hrtie, sau prin procedeul clasic , folosind camera clar). Identificarea cromosomilor aparinnd la diferite grupe (de exemplu din grupele D i G ale cariotipului uman, din grupele M sau S la Vicia faba, etc. Pentru elaborarea unui cariotip, prima condiie este identificarea morfologic a cromosomilor. Metode de identificare a cromosomilor Procedeul cel mai larg folosit n studiul cromosomilor metafazici, este acela al msurtorilor. Se msoar lungimea integral a cromosomilor, lungimea braelor cromosomiale, poziia constriciilor secundare n raport cu aceea a centromerului etc. Dar aceste criterii nu permit ntotdeauna o identificare precis a cromosomilor. Dificultile in mai ales de existena unor fluctuaii care pot masca considerabil diferenele reale dintre cromosomi. La fluctuaiile strict biologice se pot aduga: imprecizia msurtorilor (eroarea personal, eroarea optic), heteropicnoza unor regiuni cromosomiale sau a unor cromosomi ntregi (cromosomii sexului de exemplu), gradul de ntindere al regiunii centromerice, momentul metafazic pe baza cruia se efectueaz analiza etc. Se tie de exemplu c, maximum de contractare este atins de ctre cromosomii mai mari n stadiile mai avansate ale metafazei, n timp ce cromosomii mici ating acest nivel n stadii mai timpurii. Dei metoda analizei cromosomiale prin msurtori a fost contestat ( Patau, 1965) ea a rmas pn n prezent una dintre metodele de baz pentru identificarea cromosomilor. n caracterizarea acestora, conferina de la Denver a adoptat urmtorii trei parametrii: 1. lungimea fiecrui cromosom, raportat la lungimea total a unui complement haploid normal exprimat la 1000; 2. raportul braelor cromosomiale exprimat prin raportul dintre braul lung / braul scurt; 3. indexul centromeric exprimat prin raportul dintre braul scurt i lungimea total a cromosomului, raportat la 100 (braul scurt / cromosom nmulit cu 100). n afara acestor parametrii, Patau, recomanda reprezentarea cromosomilor sub form de puncte ntr-un sistem de coordonate, n care, pe abscis s -ar nota lungimea braului lung, iar pe ordonat lungimea braului scurt, ambele exprimate n procente din lungimea total a complementului cromosomial haploid (cariogram). Pentru identificarea morfologic a cromosomilor, poziia centromerului, una din caracteristicile cele mai constante ale cromosomului, poate fi exprimat prin relaiile: d = l-s; sau r = l/s n care l i s reprezint lungimea braului lung i respectiv a celui scurt al cromosomului, d diferena ntre braul lung i scurt, iar r raportul dintre brae. Putem calcula lungimea braului lung conform relaiei: l = c(100-i)/100 n care c este lungimea cromosomului iar i, indexul centromeric. Poziia centromerului, determinat prin asemenea relaii, este exprimat simbolic ca mai jos: Levan i colab. (1964) au propus denumirea standardizat a cromosomilor n funcie de poziia centromerului: Cromosomi metacentrici, cu centromerul situat n punctul median (M) sau n regiunea median (m) i cu un raport al braelor 1,0 -1,7 Cromosomi telocentrici, cu centromer terminal (T) Cromosomi acrocentrici, cu centromerul n regiunea terminal (t) Cromosomi submetacentrici i subtelocentrici cu centromerul situat n regiunea submedian i respectiv subterminal (raportul braelor 1,7 -3,0 i respectiv 3,0-7,0)

Nomenclatura cromosomilor pe baza poziiei centromerului (dup Levan i colab., 1964) Poziia centromerului Nomenclatura cromosomului Index centromeric Raportul braelor Echivalarea cu nomenclatura citogenetic curent

Median sensu stricto Regiunea median Submedian Subterminal Regiunea terminal Terminal sensu stricto

M m sm st t T

50,0 37,5 25,0 12,5 0,0

1,0 1,7 3,0 7,0 -

Metacentric Submetacentric Subtelocentric Acrocentric Telocentric

Constriciile cromosomiale includ constriciile primare sau centromerice i constriciile secundare. Constriciile secundare, cuprind regiuni cromosomiale diferite ca structur i funcie, cum sunt regiunile organizatoare nucleolare (regiunile SAT), care d elimiteaz sateliii de restul cromosomului i constriciile localizate n general interstiial pe braele cromosomilor. Identificarea aberaiilor cromosomiale are loc n primul rnd n aceast etap. Observaiile privind prezena anumitor aberaii cromos omiale se vor nota pe fotografia (desenul) mitozei examinate, preciznd tipul de aberaie, localizarea sa pe cromosom i pe bra etc. Atunci cnd se urmrete efectul citogenetic al unui agent fizic, chimic sau biologic (radiaii ionizate, substane chimice mutagene, virusuri etc.), nregistrarea aberaiilor cromosomiale reprezint obiectivul central al analizei cromosomiale. Etapa prelucrrii fotografice Microfotografierea se desfoar n mai multe etape: O prim etap este alegerea mitozelor pentru fotografiere (o dat cu studiul microscopic al mitozelor). Se vor alege pentru fotografiat doar metafaze foarte clare (este de dorit ca numrul acestora s fie ct mai mare, minimum 10% din mitozele examinate). A doua etap, fotografierea mitozelor se face cu orice dispozitiv de microfotografie. Se utilizeaz filme alb-negru cu granulaie foarte fin, cu contrast sczut spre mediu. Pentru obinerea de fotografii corespunztoare, calitatea superioar a microscopului este decisiv, n special a lentilelor utilizate la ocular i obiectiv. Pentru fotografiere se aleg doar metafazele extrem de clare. Dup aceea, cromosomii sunt decupai i aranjai n cariotip. Prepararea cariotipurilor Se recomand ca alctuirea cariotipului s se desfoare pe baza a cel puin dou copii fotografice ale metafazei i imaginii microscopice nsi a metafazei, luat cu un obiectiv cu imersie. nainte de a trece la decuparea propriu -zis a cromosomilor, este indicat s se verifice nc o dat toate particularitile metafazei respective, eventualele aberaii, limitele cromosomilor, eventuale suprapuneri, etc. Decuparea cromosomilor se face cu atenie, tind cu foarfeca fiecare cromosom n parte i lsnd ntotdeauna o margine alb n jurul imaginii fotografice negre. Cromosomii decupai se aeaz pe o coal de carton, sau hrtie mai tare, alb, pe care urmeaz s fie aranjat i lipit cariotipul. Pentru decuparea cromosomilor suprapui se taie un cromosom dintr-o copie i al doilea cromosom din alt copie. n aceast situaie, numai imaginea la microscop precizeaz limitele cromosomilor. Aranjarea cromosomilor n cariotip, (cu excepia studiilor ce urmresc stabilirea cariotipului unor specii nestudiate nc), trebuie s porneasc de la cunoaterea cariotipului normal al speciei. Primul criteriu de aranjare a cromosomilor n cariotip este cel al lungimii, cromosomii fiind dispui n ordine descresctoare. Se msoar de obicei ambele cromatide (de -a lungul axelor lor individuale) i se face o medie a rezultatelor. Regiunea centromeric se include n msurtoare, iar sateliii nu se msoar. Al doilea criteriu, este cel al dispunerii pe grupe morfologice. Cariotipurile normale au adesea perechile de cromosomi aranjate pe grupe morfologice, care se noteaz cu litere

majuscule n ordine alfabetic, sau cu cifre. Aceste grupe cuprind dou sau mai multe perechi de cromosomi care se identific greu sau deloc prin mijloace uzuale ale analizei citogenetice. Al treilea criteriu folosit n aranjarea cromosomilor n cariotip, este acela al mperecherii cromosomilor omologi. Plecnd de la premisa c omologia genetic corespunde unei omologii morfologice, cromosomii presupui omologi sunt dispui n perechi sau grupe n funcie de gradul de gradul de poliploidie al celulei respective (diploid, triploid, tetraploid etc.). Aranjarea cromosomilor pe perechi, notate de obicei cu numere n cadrul cariotipului normal, presupune folosirea a cel puin doi parametrii de caracterizare a c romosomilor respectivi: lungimea i raportul braelor. mperecherea cromosomilor omologi, prin simpla observaie vizual, se poate realiza inndu-se seama de anumite condiii: 1. se pot mperechea cu mai mult precizie cromosomii dintr -o metafaz mai puin avansat, cu braele puin contractate; 2. pentru mperecherea cromosomilor din cadrul unei grupe morfologice primul criteriu luat n considerare este raportul braelor i nu cel al lungimii; 3. la cromosomii mici, mperecherea pe criteriul raportului braelor este relativ, deoarece diferenele dintre msurtori la acest indice sunt mici; 4. se va ine cont de condiiile n care fotografierea poate modifica realitatea microscopic, mrind anumii cromosomi sau micorndu -i pe alii, n funcie de gradul de expunere i de copiere. Cariotipul uman normal La Conferina de la Denver (1960), s-a czut de acord asupra unui sistem standard de nomenclatur a cromosomilor din cariotipul uman normal. Principiile enunate la aceast conferin au fost confirmate i dezvoltate la Conferina de la Londra (1963) i cea de la Chicago (1966). Cariotipul uman normal este reprezentat prin 7 grupe distincte de cromosomi autozomali, aranjai n ordine descresctoare a lungimii lor i numerotai de la 1 la 22 ct i o pereche de cromosomi sexuali (X i Y). n cadrul aceluiai grup, cromosomii sunt aranjai dup mrime. Identificarea cromosomilor din aceste grupe nu este foarte simpl. De exemplu, n grupa de cromosomi numerotai 6-12, incluznd i cromosomul X, deosebirile dintre cromosom i sunt extrem de dificil de precizat. Se disting ceva mai uor cromosomii 6 i X de restul grupei. Pentru desemnarea grupelor cromosomiale se folosesc cifrele indicnd extremele fiecrei grupe unite printr-o liniu sau litere de la A la G. Conferina de Londra (1963) a considerat drept caracteristici importante ale cromosomilor constriciile secundare i modul difereniat de ncorporare a timidinei marcate radioactiv demonstrabil prin autoradiografie. Att la Conferina de la Londra (1963), ct i la cea de la Chicago (1966) s-a stabilit c anumii cromosomi umani prezint variaii morfologice la indivizi normali fenotipic. Pentru descrierea complementului cromosomial Conferina de la Chicago (1966) propune folosirea unor simboluri care permit o nelegere uoar, scris i codificat, a acestora. Nomenclatura acestor simboluri este urmtoarea:
A-G 1-22 X, Y (/) (+) sau (-) grupurile de cromosomi numerele autosomilor (sistemul Denver) cromosomii sexuali separ linii celulare la descrierea mozaicismului aezat imediat dup desemnarea numrului de autosomi sau a literei de grup, indic faptul c acel cromosom este n plus sau lipsete; aezat imediat dup indicatorul de bra sau de structur, semnaleaz c acel bra sau acea structur este mai mare sau mai mic dect normal indic o identificare discutabil a cromosomului sau structurii Cromosomiale

(?)

Asterisc ()

indic un cromosom sau o structur cromosomial explicat n text sau n not de subsol acentric centromer dicentric endoduplicaie constricie secundar sau regiune necolorat (colorat negativ) izocromosom inversiune inversiune pericentric cromosom marcher origine matern braul scurt al cromosomului origine patern braul lung al cromosomului cromosom inelar satelit translocaie tricentric duplicare de structur cromosomial.

Ace Cen Dic End Ih Inv inv (p + q - ) sau inv (p q + ) Mar Mat P Pat Q R S T Tri simboluri repetate

Raportul Conferinei de la Chicago completeaz folosirea simbolurilor prezentate att pentru aberaiile numerice, ct i pentru cele structurale. ntr-o descriere de cariotip, primul care trebuie nregistrat este numrul total de cromosomi, inclusiv cromosomii sexuali, desprii printr-o virgul. Constituia cromosomilor sexuali este indicat ulterior. De exemplu: 45,X 45 de cromosomi, un cromosom X; 47,XXY 47 de cromosomi, cromosomi sexuali XXY. Autosomii se specific n cazul n care exist o anomalie. Dac exist o aberaie numeric a autosomilor, litera grupului din care face parte au tosomul extra sau lips este urmat de semnul (+) sau (-), aezat dup indicarea cromosomilor sexuali. De exemplu: 45, XX, C45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lips n grupul C. Atunci cnd cromosomul sau cromosomii lips sau suplimentari pot fi identificai cu siguran, se poate folosi numrul cromosomului: 45, XX, 16- 45 de cromosomi, doi cromosomi X, un cromosom numrul 16 absent. Semnul (?) indic incertitudine. De exemplu: 45, XX, ? C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromos om lips, care face parte probabil din grupul C. O celul triploid sau poliploid este evideniat prin numrul de cromosomi i prin alte indicative. De exemplu: 69, XXY sau 70, XXY, G +. O metafaz endoreduplicat poate fi indicat punnd abrevierea end naintea indicativului cariotipului astfel: end 46, XX. Mozaicisme cromosomiale. Constituia cromosomial a diferitelor linii celulare este nregistrat n ordine numeric sau alfabetic, indiferent de frecvena tipurilor celulare la individul studiat. Indicarea cariotipului se separ printr-o diagonal (/). De exemplu: 45, X / 46, XY mozaicism cromosomial cu dou tipuri celulare, unul cu 45 de cromosomi i un singur X, cellalt cu 46 de cromosomi i cromosomi sexuali XY. Braul scurt al unui cromosom este indicat prin litera p, braul lung prin litera q, un satelit prin litera s, o constricie secundar prin litera h, iar centromerul prin abrevierea cen.

Creterea n lungime a unui bra cromosomial, se indic punnd semnul (+), iar micorarea lungimii, punnd semnul (-) dup indicativul braului. De exemplu: 2p+; Gq-. Pentru o modificare a unui bra la un cromosom mediocentric (1, 3, 19 i 20) se pune un semn de ntrebare ntre indicativul cromosomului i semnul + sau -. De exemplu, un cromosom nr.3 cu un bra alungit va fi indicat astfel: 3?+. Rezultatul unei inversiuni pericentrice se indic prin p+q - sau p-q+, care se nchide n parantez i este precedat de abrevierea inv. De exemplu: inv (D p+q-). O translocaie este indicat prin litera t, urmat de paranteze care includ cromosomul interesat. De exemplu: 46, XY, t (Bp-;Dq+) o translocaie reciproc balansat ntre braul scurt al unui cromosom B i braul lung al unui cromosom D Translocaiile care afecteaz un cromosom sexual i un au tozom, vor fi desemnate astfel: 46, X, t (Xq + ; 16p-) o translocaie reciproc ntre braul lung al unui cromosom X i braul scurt al unui cromosom 16 la o femel. Separarea cromosomilor dintr-o parantez prin punct i virgul (;), indic prezena a doi cromosomi alterai structural i balansarea translocaiei. ntr -o translocaie de tip fuziune centric, n care un singur cromosom translocat este prezent, semnul de punct i virgul se omite. De exemplu: 45, XX, D - ,G - , t (DqGq) + 45 de cromosomi, cromosomii sexuali XX, un cromosom este absent din grupul D i unul din grupul G, braele lor lungi formnd pin unire un cromosom translocat DG. Dac un anume cromosom a fost motenit de la mam sau de la tat, aceasta se poate nota prin abrevierile mat saupat. Structurile cromosomiale duplicate se indic prin repetarea indicativului. Izocromosomii se indic prin litera i aezat dup braul cromosomial interesat. Cromosomii inelari se indic prin litera r aezat dup cromosomul afectat. n cazul celulelor cu complemente cromosomiale profund dezechilibrate i anormale, Conferina de la Chicago propune aplicarea urmtoarei convenii n nomenclatura cariotipurilor: numrul de cromosomi ntr-o celul dat va include toate structurile cromosomiale centric e prezente n celul, indiferent de numrul de centromeri. Cromosomii neidentificai, sunt indicai prin mar (marker). Fragmentele acentrice nu se include n numr, dar se vor indica prin abreviaia ace. Cromosomii dicentrici i tricentrici se vor numra ca unul singur i se vor indica prin dic i tri. Pentru indicative care nu figureaz n sistemul de nomenclatur propus de Conferina de la Chicago, se sugereaz folosirea primelor trei litere mici, definite cu claritate i aezate imediat naintea sau dup simbolul cromosomului sau al indicativului cromosomului la care se refer n paranteze. Cariotipul la animale Cariotipul la hamsterul auriu Cariotipul la hamsterul auriu (Fig.23) (unul dintre animalele de laborator larg studiate n laborator), a fost elaborat de mai multe grupe de cercettori ( Ishihara i colab., 1962, Lehman i colab., 1963 i Nachtigal, 1965). Complementul cromosomial al celulelor somatice este constituit din 44 de cromosomi (21 de perechi de autosomi i 2 cromosomi sexuali heteromorfi, X i Y). Cromosomii autosomali se distribuie n cinci grupe morfologice, notate cu primele litere ale alfabetului. Perechile de autosomi se numeroteaz de la 1 la 21. Cromosomul X este caracteristic i uor de recunoscut. Grupa A (prima grup), cuprinde perechile 1-4. Prima pereche (A1) este mai mare sau de aceeai mrime cu perechea a doua (A2) fiind de asemenea mai submetacentric. Celelalte perechi se dispun n ordinea descresctoare a raportului braelor. Grupa B cuprinde perechile 5-10. Perechile 5 i 10 reprezint cromosomi metacentrici, uor de identificat. Perechea B6 este format din subtelocentrici, cu un raport mare al braelor i se poate relativ uor identifica. Perechile B7 -B9 se dispun n ordinea descresctoare a raportului braelor cromosomiale. Grupa C cuprinde perechile 11-15. Prima pereche a acestei grupe, se poate uor identifica, fiind vorba de cromosomi subtelocentrici. Ultima pereche a grupei se identific mai greu (constituind cei mai mici submetacentrici). n cadrul acestei grupe, perechile 13 i 14 se deosebesc greu, fiind cromosomi submetacentrici asemntori.

Grupa D cuprinde 4 perechi de cromosomi subtelocentrici asemntori ntre ei, dar deosebii uor de toi ceilali. Grupa E este constituit dintr-o singur pereche de cromosomi metacentrici mici, iar grupa F din perechea 21 de cromosomi subtelocentrici.

Fig. 23 Cariotipul (sus) i metafaza care a stat la baza ntocmirii acestuia (jos), la Mesocricetus auratus (2n = 44) (Raicu i Nachtigal, 1969)

Cariotipul la unele plante de cultur Metodele de alctuire a cariotipului sunt relativ diferite n funcie de specie i de autori. Prezentm n cele ce urmeaz cariotipurile la cteva specii de plante cultivate . Cariotipul i idiograma la Allium cepa L. (2n=16) Conform studiilor noastre (utiliznd o prefixare a rdcinilor, timp de 2 ore la temperatura camerei, cu o soluie de colchicin 0,2%; dup prefixare, prelucrarea materialului s -a realizat dup metoda Feulgen), raportnd datele obinute la nomenclatura dup Levan i colab., 1964, am realizat cariotipul i idiograma la Allium cepa L. (2n = 16) (Fig. 25). Utiliznd sistemul de stabilire a tipurilor de cromosomi dup Levan i colab. (1964), am ncadrat cele opt perechi de cromosomi de la ceap n dou grupe: cromosomi metacentrici mediani n sens strict M (perechea VII) - n regiune median m (per. I, II, III, IV, V, VIII); cromosomi subtelocentrici cu satelit, la nivelul braului scurt (perechea VI). Perechile de cromosomi omologi au fost numerotate de la I la VIII n ordinea descresctoare a lungimii totale.

10

II

III IV

VI VII VIII

Fig.25 Metafaz, cariotip (sus) i idiograma (jos) la Allium cepa L. (original)

Cariotipul i idiograma la Secale cereale L. (2n = 14) Secara, ca i ceapa, este un material mult folosit n cercetrile de citogenetic vegetal. Ca atare, descrierea cromosomilor mitotici la secar a fost realizat de muli cercettori; caracteristicile cromosomilor de secar studiai de diferii autori prezint diferene datorate probabil polimorfismului cromosomial al acestei specii, precum i metodelor de lucru. Diferenele ntre autori apar i datorit sistemului diferit de clasificare a cromosomilor. Tudose (1970), utiliznd prefixarea cu soluie de colchicin 0,2% i colorarea prin metoda Feulgen, grupeaz cromosomii la Secale cereale L. (2n = 14), n patru tipuri morfologice (Fig. 26): Tipul A dou perechi de cromosomi (II i III), cu centromer median; Tipul B dou perechi de cromosomi (I i VI), cu centromer submedian; Tipul C o pereche de cromosomi (VIII), cu centromer submedian i satelii mari, constricia secundar fiind uor de evideniat, n regiunea ei formndu -se nucleul; Tipul D dou perechi de cromosomi (IV i V) cu centromer submedian, pe braul scurt cu o constricie secundar i satelii mici care pot fi pui n eviden numai folosind tratamente speciale (temperaturi sczute 0C, timp de 24 -48 ore), ei aprnd ca urmare a evidenierii zonelor heterocromatice.
Caracteristicile cantitative ale cromosomilor la Secale cereale L. (dup I.Gh.Tudose, 1970)
Bra scurt ( m) 4,57 5,22 5,19 3,97 3,76 3,57 2,98 Lungimea total a cromosomului

Perechea de cromosomi

Poziia centromerului

Bra lung ( m) 7,38 5,88 5,72 5,98 5,87 5,75 6,05

Suma braelor 11,95 11,10 10,91 9,95 9,63 9,32 9,03

Indicele braelor 1,61 1,12 1,10 1,50 1,54 1,60 2,03

sx

I Submedian II Median III Median IV* Submedian V* Submedian VI Submedian VII* Submedian cromosomi cu satelit, pe braul scurt.

12,55 0,12 11,74 0,10 11,55 0,09 11,48 0,12 10,96 0,10 9,95 0,11 11,34 0,12

Fig.26 Cariotip (sus) i idiogram (jos la Secale cereale (2n = 14) (Tudose, 1970)

6. Ploidia la plante
n celulele plantelor superioare se gsete un numr dublu de cromosomi 2n (celule diploide), fa de n cromosomi n spori i gamei (celule haploide). Datorit unor dereglri ale diviziunii celulare, produse ca urmare a aciunii diferiilor factori mutageni naturali sau artificiali de exemplu, colchicina numrul de cromosomi din celule se poate modific a. Poliploidia const n multiplicarea numrului de cromosomi din celulele somatice fa de numrul de baz. Numrul de baz sau numrul fundamental (numrul de origine), notat cu x, reprezint setul haploid, cu cel mai mic numr de cromosomi al numrului somatic diploid de cromosomi ai unei specii. n anul 1916, Winkler introduce noiunea de genom (numrul de cromosomi din garnitura de baz x, difereniai morfologic i genetic) i definete poliploidia ca fenomenul de multiplicare a numrului de cromosomi (Anghel i Ignat, 1974). Dup numrul de garnituri de cromosomi n celulele somatice ale plantelor, acestea pot fi: haploide (x), diploide (2x), triploide (3x), tetraploide (4x), pentaploide (5x) etc. Gradul de ploidie (P) al unei specii se apreciaz din relaia 2n/x. De exemplu, aplicnd aceast relaie, se poate afla gradul de ploidie la speciile: Secale cereale L. - secara diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. - secara tetraploid (4x) are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum monococcum grul diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. Triticum durum - grul tetraploid (4x) are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum aestivum - grul hexaploid (6x) are 2n=42; n=21; x=7, deci P=2n/x=6. Prin cercetri de citogenetic s-a constatat c, la plante, n cadrul aceluiai gen numrul de cromosomi este, de obicei, un multiplu al numrului de baz x. n cadrul unor genuri exist mai multe specii cu diferite grade de ploidie, constituind serii (iruri) poliploide, ca n cazul genului Triticum. n cadrul genului Rosa, se ntlnesc specii cu 2n=14; 21; 28; 35; 42; 56 de cromosomi. n natur s-au descoperit o serie de astfel de genuri, ca: genul Chrysantemum cu x=9 - cu specii 2n=18 (2x); 36 (4x); 54 (6x); 72 (8x) i 90 (10x) cromosomi; genul Solanum cu x=12 - cu specii 2n=24 (2x); 36 (3x); 48 (4x); 60 (5x); 72 (6x); 96 (8x); 108 (9x); 120 (10x) i 144 (12x). Seriile poliploide, n funcie de numrul par sau impar de garnituri cromosomiale sau genomuri, pot fi clasificate n: - artioploide (artiopoliploide), cu numr par de genomuri (4x, 6x, 8x etc.); - perisoploide (perisopoliploide), cu numr impar de genomuri (3x, 5x, 7x, 9x etc.), de obicei sterile. Primele organisme poliploide au aprut dup apariia procesului sexual, respectiv a fecundrii, prin care, organismele nou formate dobndesc un numr dublu de cromosomi (2n), fa de cel al gameilor (n) (Tudose, 1967). Dup originea cromosomilor, Kihara i Ono (1926), clasific pentru prima dat fenomenul de poliploidie n: 1. Autopoliploidie (autoploidie) - multiplicarea numrului propriu de genomuri sau de seturi (garnituri) cromosomiale. Forme autopoliploide se cunosc la Secale cereale, Beta vulgaris, Trifolium pratensis etc.

Poliploidia este ntotdeauna nsoit de importante modificri morfo-fiziologice. Creterea numrului de cromosomi determin mrirea nucleului, a celulei, a esutului i organului i / sau a organismului, ajungndu-se astfel la gigantism.Se pare c fiecrui gen de organisme i este caracteristic un nivel optim al efectului pozitiv al poliploidizrii, nivel care dac este depit, poate determina efecte negative (Coman, 1991). La plante, care se nmulesc i vegetativ, poliploidia s-a dovedit a fi avantajoas. La Angiosperme 64% din genurile actuale posed serii poliploide naturale. Pentru speciile ce se nmulesc exclusiv pe cale sexuat, poliploidia este dezavantajoas determinnd dereglarea meiozei i scderea fertilitii. Poliploidia este prezent i n grupul Gimnospermelor i al Pteridofitelor, dar n procente mai mici. Prezena poliploidiei n regnul vegetal este mult mai mare dect n cadrul regnului animal (Coman, 1991). Poliploidia este foarte rspndit n special n special n regiunile cu climat mai aspru: regiuni nordice, montane, deerturi. Un procent ridicat de specii poliploide se ntlnete n flora Saharei, n regiunile de rm ale Japoniei, unde se ntlnesc variaii mari de temperatur, n regiunile srturoase etc. Este interesant de remarcat c procesul de apariie al autopoliploidiei este mai intens la plantele cultivate, deoarece acestea sunt puse n condiii foarte variate de mediu, fapt care mrete posibilitatea de apariie a plantelor poliploide (Anghel i Ignat, 1974). 2. Allopoliploidie (amfipoliploidie) - multiplicarea numrului de genoame prin hibridare interspecific i nsumarea lor la hibrid, urmat de dublarea numrului diploid de cromosomi. De exemplu, la gru s-a demonstrat c formele diploide au genomul A provenit de la specia Triticum monococcum; formele tetraploide au genomul AB, cu genomul B provenit de la specia Aegilops speltoides; formele hexaploide au genomul ABD, cu genomul D provenit de la specia Aegilops squarrosa. n afar de Triticum aestivum (2n=42) se cunosc n natur mai multe specii amfiploide: Gossypium hirsutum (2n=52), provenit din hibridarea speciilor Gossypium arboreum (2n=26) cu Gossypium raimondii (2n=26); Nicotiana tabacum (2n=42) provenit din ncruciarea speciilor Nicotiana silvestris (2n=24) cu Nicotiana tomentosiformis (2n=24) etc. Pseudopoliploidia - multiplicarea numrului de cromosomi are loc prin fragmentarea cromosomilor cu centromeri multipli sau difuzi, fr a avea loc o mrire corespunztoare a cantitii de ADN. Pseudopoliploidia poate fi evideniat prin msurarea lungimii cromosomilor, atunci cnd fragmentarea lor este transversal; prin studiul citofotometric al cantitii de ADN din celule sau prin studiul comportrii cromosomilor n profaza sau metafaza diviziunii mitotice reducionale. Pseudopoliploidia a fost observat la speciile ctorva genuri de plante (Carex) sau animale (Ascaris) etc. Metode pentru inducerea autopoliploidiei la plante n general, pentru ploidizare se folosesc specii de plante ce prezint un numr redus de cromosomi n celulele somatice, plante alogame, plante cultivate pentru organele lor vegetative etc. Obinerea autotetraploizilor se poate realiza prin distrugerea fusului de diviziune sau oprirea plasmodierezei din timpul diviziunii celulare. n acest scop se folosesc mai multe metode: a. Metoda centrifugrii, elaborat de Kostoff (1937) const n centrifugarea plantelor cu esuturi meristematice, n vederea distrugerii fusului de diviziune i formarea celulelor cu numr dublu de cromosomi. Metoda este greoaie i prezint o serie de dezavantaje. Astfel, numai o mic parte din celulele meristematice devin poliploide, ele fiind de obicei eliminate ulterior, deoarece viteza lor de diviziune este mai mic dect a majoritii celulelor diploide. b. Metoda ocurilor de temperatur, elaborat de Randolph (1932) se bazeaz pe influena ocurilor de temperatur ridicat asupra primelor mitoze ale zigotului. Astfel, un oc de temperatur de 43-45, timp de 24 de ore, asupra zigotului la Zea mays produce 5% plante poliploide. c. Metoda poliembrioniei, bazat pe observaiile lui Muntzing (1938) conform crora la majoritatea plantelor superioare se afl un procent redus de semine cu doi sau mai muli embrioni (la Gramineae, aproximativ 0,007-0,15%), dintre care o parte (5%) au un numr diferit de cromosomi. d. Metoda acionrii cu insecte parazite asupra vrfurilor de cretere ale plantelor, bazat pe observaia c galele prezint celule poliploide. Metoda este dificil, obinndu -se un procent mic de plante poliploide. e. Metoda regenerrii, elaborat de Winkler (1916) i Joergensen (1928), se bazeaz pe observaia c o parte din lstarii provenii din rnirea calusului format n urma tierii altoiului de la locul

de altoire, sunt poliploizi. Metoda se utilizeaz la speciile care se preteaz la altoire (din genurile Solanum, Nicotiana etc.). f. Metoda iradierii, utilizat n vederea distrugerii fusului de diviziune, urmat de formarea gameilor diploizi sau a celulelor somatice poliploide (prin autopoliploidie), precum i fragmentarea cromosomilor. Astfel, n mod experimental, n urma iradierii cu radiaii gamma a seminelor uscate de Lactuca sativa soiul "Polul Nord" (2n=18) s-au obinut celule somatice tetraploide (2n=36) i octoploide (2n=72). Celulele tetraploide au fost obinute printr-un proces de autopoliploidie, n urma distrugerii fusului de diviziune, iar celulele octoploide datorit fenomenului de pseudoautopoliploidie, prin fragmentarea ulterioar a tuturor cromosomilor unei celule autotetraploide. g. Aciunea substanelor de tipul paradiclorbenzenului mpiedic plasmodiereza, rezultnd celule cu dou sau mai multe nuclee ce pot fuziona ulterior. h. Metoda colchicinizrii, bazat pe proprietatea colchicinei i a altor substane (acenaften, feniluretan etc.) de a inhiba sau e a distruge fusul de diviziune, rezultnd, n urma diviziunilor, celule al cror nucleu de restituie are numr dublu de cromosomi. Descoperirea n 1937 de ctre Blakeslee i Avery a efectului poliploidizant al colchicinei asupra plantelor a deschis noi perspective de obinere experimental a poliploizilor (Anghel i Igat, 1974). Colchicinizarea se efectueaz cu o soluie de 0,05 -1% colchicin n care se introduc semine negerminate, semine germinate sau plantule. Soluia de colchicin poate fi aplicat i pe vrfurile de cretere: direct (Bragdo, 1955 - la secar; Sears, 1941 - la gru; Mihilescu i Raicu, 1968 - la orz; Raicu i Anghel, 1966 - la Citrullus vulgare) sau n amestec cu agar-agar (Swaminathan, 1951 - la cartof), sau ca past de lanolin-cu acid indolil-3-acetic (Howard i Swaminathan, 1953 - la Solanum demissum), n vederea mpiedicrii evaporrii ei rapide. La pomi i vi de vie se trateaz mugurii cu soluie de colchicin. Timpul de aciune i concentraia difer de la o specie la alta. Soluia de colchicin se consider cu aciune optim atunci cnd: o parte din plante pier, o parte din plantele tratate devin mixoploide (cu celulele n diferite grade de ploidie) datorit unei colchicinizri pariale, iar o parte din plante devin autotetraploide.

7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante

Pentru depistarea organismelor poliploide naturale din cadrul populaiei unei specii sau pentru evidenierea speciilor poliploide ale unui gen, ca i pentru determinarea indivizilor poliploizi produi pe cale artificial n vederea separrii lor dintr-un amestec, au fost elaborate o serie de metode directe i indirecte. Metodele directe sunt metodele prin care se determin cu precizie gradul de ploidie. Prin cercetri de citogenetic s-a constatat c, la plante, n cadrul aceluiai gen numrul de cromosomi este, de obicei, un multiplu al numrului de baz x. Metodele indirecte sunt metodele bazate pe corelaia existent ntre gradul de ploidie i anumite caracteristici macroscopice i microscopice ale plantelor. Dei aceste metode nu sunt att de precise ca metodele directe, ele se pot utiliza cu succes, n special pentru deosebirea plantelor poliploide de cele diploide de la care au provenit, n general pentru trierea materialului biologic. Metode directe de determinare a gradului de ploidie la plante Pentru evidenierea cromosomilor n diviziune mitotic i meiotic la plante au fost descrise n capitolele anterioare o serie de metode. Ca exemplu de determinare a numrului de cromosomi la o serie poliploid natural s-a ales seria amfiploid a genului Triticum, n cadrul creia exist specii diploide, tetraploide i hexaploide. Metoda Feulgen pentru evidenierea i numrarea cromosomilor n diviziune mitotic la Triticum monococcum, Triticum dicoccum i Triticum aestivum Studiul cromosomilor se realizeaz n diviziunea mitotic a celulelor meristematice din apexul radicular, la cele trei specii de gru. Etape de lucru: Germinarea Se pun la germinat cariopse din cele trei specii de Triticum n cutii Petri, pe hrtie de filtru umectata cu ap, la temperatura camerei(se recomand plasarea hrtiei de filtru i pe capacul cutiilor Petri pentru crearea unei atmosfere umede i pentru mpiedicarea ptrunderii luminii puternice).

Germinarea se realizeaz n timp relativ scurt, n 2-3 zile rdciniele atingnd dimensiunea de 10-15 mm. Prefixare Rdciniele se prelev, realizndu-se prefixarea n fiole de sticl, n soluie de colchicin 0,2%, timp de 2 ore, la temperatura camerei. Se poate realiza i o prefixare a cariopselor cu rdcinie (plasate n cutii Petri) la temperaturi sczute (0-4 C), timp de 12-24 de ore. Prefixarea este necesara deoarece, cele trei specii de Triticum, n special Triticum aestivum, prezint un numr relativ mare de cromosomi, cromosomi relativ lungi. Ca urmare a prefixarii se produce o scurtare apreciabil a cromosomilor, o individualizare i colorare intens, astfel nct cromosomii se pot observa i numra uor. Fixarea Fixarea rdcinielor se realizeaz n fixator Battaglia, la temperatura camerei, timp de 20 -25 de minute. Splarea Splarea rdcinielor de urmele de fixator se realizeaz n HCl 1N, timp de 5 minute, la temperatura camerei; se ndeprteaz soluia de fixare i se adaug soluia de splare. Hidroliza Hidroliza se efectueaz n soluie de HCl 50%, timp de 25 -30 de minute, la temperatura camerei. Colorarea Dup ndeprtarea soluiei de hidroliz se efectueaz colorarea cu fuxin bazic decolorat (reactiv Schiff), la temperatura camerei, timp de 15-30 de minute, pn cnd vrfurile rdcinielor prezint culoarea rou-violet nchis. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele microscopice se realizeaz pe o lam de microscop curat i uscat, ntr -o pictur de acid acetic 45%. Se procedeaz ca la metoda Feulgen pentru studiul cromosomilor n mitoz la ceap, dar se recomand realizarea unei ct mai bune etalri pentru dispersarea cromosomilor, n vederea observrii lor individuale i a numrrii cu uurin. Studiul preparatelor la microscop Preparatele se studiaz la microscop, la un obiectiv cu putere de mrire ridicat, n lumin puternic, utiliznd un filtru verde care mrete contrastul ntre cromosomi i citoplasm. Se studiaz doar metafazele, cnd cromosomii sunt spiralizai i contractai, sunt puternic colorai i datorit dispersrii prin etalare, se observ individual i pot fi uor numrai. Pe cele mai bune preparate se pot observa i numra pentru Triticum monococcum 14 cromosomi, pentru Triticum dicoccum 28 de cromosomi i pentru Triticum aestivum 42 de cromosomi. Morfologia cromosomilor poate fi studiat folosind obiectivul de imersie. Atunci cnd dorim s efectum cariotipul i idiograma speciilor studiate se efectueaz microfotografii, se decupeaz cromosomii i se aeaz n ordinea descrescnd a lungimii lor, lundu-se n consideraie poziia centromerului, a constriciilor secundare etc. Astfel se constat originea hexaploid a speciei Triticum aestivum (2n=6x=42), precum i tetraploidia speciei Triticum dicoccum (2n=4x=28) i diploidia speciei Triticum monococcum (2n=2x=14). Efectuarea preparatelor semipermanente i permanente Cele mai reuite preparate, pe care se pot uor numra cromosomii se pot efectua semipermanent sau permanent, dup metodele descrise anterior. Preparatele permanente pot servi drept model. Metode indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante Metodele indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante sunt mai puin precise n comparaie cu metodele directe, dar sunt mai rapide i mai puin costisitoare, folosindu-se cu succes n staiunile de ameliorare a plantelor de cultur pentru a tria plantele poliploide dintr -un amestec sau pentru a separa plantele tetraploide de cele diploide, obinute ca urmare a tratamentului cu colchicin. Aceste metode se bazeaz, n esen, pe corelaia dintre gradul de ploidie al plantelor i diferite caractere morfologice macroscopice i microscopice ale plantelor.

Metoda determinrii gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere morfologice macroscopice Primii cercettori ai fenomenului de poliploidie au remarcat existena unei corelaii ntre numrul de garnituri cromosomiale i unele caractere morfologice macroscopice. Modificrile de ordin morfologic afecteaz diverse organe sau planta n ntregime; ele sunt ntr-o anumit msur diferite la diferitele specii de plante, dar unele prezint un caracter general. Metode de determinare a gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere microscopice Aceste metode se bazeaz pe corelaia existent la plante ntre numrul garniturilor cromosomiale i unele caractere microscopice, cum ar fi: mrimea i densitatea stomatelor, numrul de cloroplaste din celulele stomatelor, numrul cromocentrilor nucleolari, diametrul gruncioarelor de polen, numrul de pori germinativi ai gruncioarelor de polen etc. A. Metoda examinrii stomatelor a. Determinarea mrimii stomatelor De regul, se studiaz lungimea stomatelor, care este mai constant dect limea, care variaz cu gradul de deschidere al ostiolei. Astfel, s-a constatat o corelaie pozitiv ntre lungimea stomatelor i numrul de garnituri cromosomiale din celule la speciile diploide, triploide i tetraploide. Prin studiul comparativ al dimensiunii stomatelor la plantele 2x i 4x, aparinn d la 9 specii diferite Raicu i colab., n 1965, au constatat c la formele tetraploide lungimea stomatelor este cu 29,2-85,7% mai mare dect la speciile diploide, diferenele fiind n toate cazurile semnificative. Mod de lucru: Se aleg frunze de Triticum monococcum L. (2n=2x=14) i Triticum aestivum L. (2n=6x=42); se desprinde cu o lam de brbierit o poriune de civa mm. de epiderm inferioar i se plaseaz pe lam ntr-o pictur de ap; se studiaz la microscop, determinndu-se lungimea stomatelor. Se calculeaz media i abaterea standard a mediei la cel puin 100 de stomate; valorile sunt exprimate n microni. Amplitudinea variaiei lungimii stomatelor la formele poliploide este mai mare dect la formele diploide, recomandndu-se ca numrul msurtorilor efectuate sa fie suficient de mare (peste 100). b. Determinarea densitii stomatelor pe unitatea de suprafa foliar Densitatea stomatelor pe unitatea de suprafa foliar este invers proporional cu gradul de ploidie, fiind mai mic la formele poliploide, datorit faptului c celulele, respectiv stomatele plantelor poliploide au dimensiuni superioare diploizilor. S-a constatat c valorile relative ale frecvenei stomatelor la poliploizi nu reprezint dect 31,5 -71,8% din valoarea de 100% la diploizi. Mod de lucru: Se aleg frunze de sfecl de zahr - Beta vulgaris (2x, 3x i 4x); se desprinde cu o lam de brbierit o poriune de civa mm. de epiderm inferioar i se plaseaz pe o lam de microscop ntr o pictur de ap; se studiaz la microscop, determinndu-se densitatea stomatelor. Pentru calcularea densitii stomatelor se noteaz numrul de stomate din aproximativ 100 de cmpuri microscopice, calculndu-se apoi media i eroarea ei. se calculeaz suprafaa cmpului microscopic dup formula r2 i se raporteaz, utiliznd regula de trei simple, numrul de stomate la unitatea de suprafa folosit (1mm2). c. Stabilirea numrului de cloroplaste din celulele stomatelor Mochizuki i Sueoka, n 1955, au demonstrat existena unei corelaii directe ntre numrul de cloroplaste din celulele stomatelor i gradul de ploidie al plantelor. Cercetrile au artat c numrul de cloroplaste din stomate variaz puin fa de condiiile de mediu; la sfecla de zahr numrul este identic n diferite poriuni ale frunzei (baz, mijloc sau vrf), precum i pe cele dou fee ale frunzei. n schimb, numrul de cloroplaste variaz cu vrsta ontogenetic a plantelor. Materiale necesare: - lame de microscop, lamele, hrtie de filtru, lame de brbierit, pensete Reactivi: - soluie I n KI 1g. iod metalic, 2g. KI la 30 cc ap distilat - fixator alcool - acid acetic (3/1) Mod de lucru: Alegerea plantelor

Pentru studiul cloroplastelor se aleg plante tinere de sfecl de zahr, aflate n aceeai faz de vegetaie (3-4 frunze). Se recomand ca recoltarea frunzelor s se efectueze dimineaa, la o or dup rsritul soarelui, atunci cnd frunzele sunt turgescente i conin maximum de clorofil; excesul de lumin i cldur provoac nchiderea stomatelor. Numrarea cloroplastelor din cele dou celule ale unei stomate poate fi efectuat la frunzele proaspete sau la frunzele conservate. Conservarea materialului Conservarea se realizeaz n fixator alcool - acid acetic (3/1), materialul putnd fi pstrat timp de 2 - 4 ani de la recoltare. Efectuarea preparatelor microscopice Numrarea cloroplastelor se poate efectua direct, cu ajutorul microscopului cu contrast de faz, tehnic ce nu d rezultate precise. De aceea, se recomand evidenierea cloroplastelor prin colorare cu o soluie de I n KI. Cu ajutorul unei pensete cu vrfurile ascuite, cu un bisturiu, ac spatulat sau cu o lam de brbierit, se desprinde o poriune de epiderm inferioar, de aproximativ 0,5 - 1 cm2, i se plaseaz pe o lam de microscop, ntr-o pictur de iod n iodur de potasiu. Se acoper preparatul cu o lamel, evitndu -se formarea bulelor de aer ntre lam i lamel. Colorarea se realizeaz aproape instantaneu, dar se recomand o perioad de 3 -4 minute pentru colorarea intens a cloroplastelor. Cu o bucat de hrtie de filtru se ndeprteaz excesul de substan; nu se recomand etalarea. Examinarea preparatelor la microscop Preparatele se studiaz imediat dup realizare la microscopul optic, n lumin puternic, cu obiective mai mici (pn la 40x) deoarece stomatele sunt mari, cloroplastele sunt evidente, se coloreaz bine i pot fi observate i numrate cu uurin. n cazul n care colorarea s-a efectuat cu iod n iodur de potasiu pe material proaspt, cloroplastele se coloreaz n bleu, datorit coninutului n amidon. Cnd materialul este conservat, amidonul se degradeaz i cloroplastele se coloreaz n brun nchis. Celelalte elemente celulare apar colorate n galben deschis. La microscop se observ celulele epidermice cu perei sinuoi i stomatele reniforme; se numr cloroplastele din cele dou celule stomatice, la minim 25 -30 stomate, calculndu-se media i abaterea ei. n cazul acestei metode, corelaia existent ntre gradul de ploidie la sfecla de zahr i numrul de cloroplaste din cele dou celule ale unei stomate este urmtoarea: Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploid (2x), 18 cromosomi ntr-o celul somatic = 18 cloroplaste (n medie) n cele dou celule ale unei stomate. Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploid (3x), 27 de cromosomi ntr-o celul somatic = 27 cloroplaste (n medie) n cele dou celule ale unei stomate. Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploid (4x), 36 de cromosomi ntr-o celul somatic = 36 cloroplaste (n medie) n cele dou celule ale unei stomate. Subliniem faptul c, la microscop, se pot observa la formele 2x de sfecl de zahr cte 9 cloroplaste n fiecare celul stomatic, ct i celule care au repartizate cloroplastele n mod inegal n cele dou celule stomatice; se ntlnesc adesea i celule stomatice cu un numr mai mic de cloroplaste. ntotdeauna pentru formele diploide (2n=18) se obine o medie a numrului de cloroplaste mai mic de 18 i foarte rar mult apropiat de 18. Atunci cnd media numrului de cloroplaste nu depete 18, se consider c forma respectiv este diploid. Cnd numrul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 27, forma respectiv este triploid, iar cnd numrul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 36 este o form de sfecl de zahr tetraploid. Aceast metod se folosete cu succes la trierea materialului la sfecla de zahr, n vederea separrii formelor triploide i tetraploide de cele diploide, dintr-un amestec. Preparatele microscopice (Fig. 32) se studiaz imediat dup realizare i se pot efectua microfotografii. Preparatele se pot pstra doar un timp scurt, prin efectuarea lor semipermanente.

Fig. 32 Imaginea microscopic a unei stomate i a cloroplastelor la Beta vulgaris (coloraie cu iod n iodur de potasiu, 40x) (original)

B. Metoda evidenierii cromocentrilor nucleolari Metoda a fost elaborat de Reitberger, n 1956, pe baza cercetrilor sale la Beta vulgaris L., i se bazeaz pe corelaia ntre numrul de cromocentri nucleolari i gradul de ploidie al plantelor. La sfecla de zahr fiecare garnitur de cromosomi prezint un cromosom cu satelit (heterocromatic). Constricia secundar este organizatoare nucleolar, astfel c, la nivelul su se formeaz un nucleol. n telofaz, partea heterocromatic reprezentat de satelit rmne ataat de nucleol; formnd un cromocentru, care poate fi evideniat prin colorare cu colorani specifici nucleului, nu numai n timpul diviziunii celulare, ci i n interfaz. Metoda elaborat de Reitberger se bazeaz tocmai pe capacitatea cromocentrilor de a se colora n interfaz i pe existena unui cromocentru pentru fiecare garnitur de cromosomi; mrirea numrului de garnituri cromosomiale implic mrirea numrului de cromocentri nucleolari. Astfel, formele diploide (2x) prezint doi cromocentri, formele triploide (3x) trei cromocentri i formele tetraploide (4x) patru cromocentri nucleolari. Cromocentrii se afl de obicei grupai n jurul unui singur nucleol; uneori, ns, sunt mai muli nucleoli n jurul crora se grupeaz cromocentrii (Fig. 33).

Fig. 33 Schema distribuiei cromocentrilor nucleolari la nivelul nucleului, la Beta vulgaris L. (original)

Cercetrile lui Reitberger au artat c, la plantele diploide, cei doi cromocentri sunt aezai n jurul unui singur nucleol, ntlnindu -se mai rar situaia cnd ei sunt plasai pe cte un nucleol; la fel i pentru plantele triploide, unde se ntlnesc frecvent celule cu trei cromocentri plasai pe un nucleol, mai rar fiind grupai pe doi sau pe trei nucleoli; la plantele tetraploide, n majoritatea cazurilor cei patru cromocentri sunt plasai pe un singur nucleol, mai rar pe doi, pe trei sau patru nucleoli. n general, cromocentrii se dispun simetric n jurul nucleolului, al crui volum este n raport direct cu numrul de cromocentri; astfel, nucleolu l cu patru cromocentri are un volum mai mare fa de nucleolul cu trei, doi sau un cromocentru. Mod de lucru: Alegerea materialului Se utilizeaz frunze de 4 -5 cm. lungime, recoltate de la plante de sfecl de zahr Beta vulgaris L., n vrst de 2 luni, provenite din semine. Fixarea

Fixarea frunzelor se realizeaz n fixatorul alcool -acid acetic (3/1), n care materialul se poate pstra timp ndelungat. Colorarea Colorarea se realizeaz n soluie carmin -acetic, timp de 15 min. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatul se realizeaz pe o lam de microscop, n 1 -2 picturi de carmin acetic. Cu ajutorul unei lame de brbierit, se desprinde o poriune (de 0,5 -1 cm.2) din epiderma inferioar a unei frunze i se plaseaz pe o lam de microscop, n 1 -2 picturi de carmin-acetic. Se agit colorantul cu un ac spatulat n vederea unei mai bune colorri. Colorarea se realizeaz la temperatura camerei, timp de 15-20 de minute (eventual, lama poate fi nclzit 10 -15 min. la flacra unei spirtiere, evitnd fierberea i adugnd noi picturi de colorant). Se acoper preparatul cu lamela, fr a realiza etalarea, ce poate duce la deplasarea cromocentrilor. Examinarea preparatelor la microscop Preparatele se studiaz la microscop, n lumin puternic, cu filtru ver de. Studiul se realizeaz n nucleele celulelor epidermei inferioare, colorate n rou carmin, nucleolii rmnnd slab colorai. Cromocentrii se observ ca nite corpusculi mici, de form sferic, plasai la periferia nucleolului sau a nucleolilor, colorai n rou intens spre negru, mai intens n comparaie cu nucleul i foarte intens fa de nucleol. Prin micarea fin a urubului micrometric, cromocentrii pot fi observai cu uurin. Prin observarea ctorva celule se poate constata gradul de ploidie. La Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploid (2x), 18 cromosomi ntr-o celul somatic (dou garnituri cromosomiale) = 2 cromocentri nucleolari. Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploid (3x), 27 de cromosomi ntr-o celul somatic (3 garnituri cromosomiale) = 3 cromocentri nucleolari. Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploid (4x), 36 de cromosomi ntr-o celul somatic (4 garnituri cromosomiale) = 4 cromocentri nucleolari. Cercetrile au artat c, la plantele 2x, cromocentrii sunt mult mai vizibili la microscopul optic, n comparaie cu cei de la plantele 3x i 4x. S -a constatat c, pentru plantele virozate i bolnave, utilizarea acestei metode d rezultate eronate; n acest caz se recomand folosirea metodei determinrii numrului de cloroplaste din celulele stomatelor. Preparatele microscopice nu se pot efectua permanent, astfel nct se recomand studierea lor imediat dup realizare i efectuarea de microfotografii. Prepa ratele se pot efectua semipermanente i vor fi examinate a doua zi. C. Metoda examinrii gruncioarelor de polen Metoda vizeaz dou aspecte morfologice ale gruncioarelor de polen (diametrul i numrul de pori germinativi) cu ajutorul crora se poate apre cia gradul de ploidie la unele plante.

8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura

Anomaliile de structur sunt evideniate de modificrile morfologiei cromosomilor, nsoite de modificri cantitative ale materialului genetic sau de modificri ale poziiilor genelor n cromosomi. Ele apar fie ca urmare a lezionrii cromosomului n faza G1 prereplicativ a ciclului celular (aberaii de tip cromosomial), fie n urma lezionrii cromatidelor surori n faza S i G2 (aberaii de tip cromatidic).
Anomalii structurale ale cromosomilor i cauzele lor [Socaciu, 1996].

Anomalia

Cauza

A. Aberaii de tip cromosomial Lezionarea cromosomilor n faza G1 I. Intracromosomiale 1. Deleii de fragmente acentrice deleii cromosomiale terminale sau intercalare 2. Inele acentrice deleii ale cromatidelor (asocieri interbrae) 3. Cromosomi inelari deleii ale ambelor brae ale cromosomilor i unirea capetelor o 4. Inversii pericentrice i paracentrice rsuciri de 180 ale segmentelor ntre dou puncte de deleie 5. Translocaia intracromosomial dislocare prin deleie a unui fragment i fixare pe cellalt bra al cromosomului 6. Discontinuiti cromosomiale lipsa materialului genetic (AND) pe poriunile afectate 7. Izocromosomi (cromosomi metacentrici clivaj intercromatidic transversal la nivelul

neomologi)

centromerului II: Intercromosomiale simetrice sau asimetrice 1. Translocaii reciproce schimb de segmente acentrice distale din doi cromosomi neomologi 2. Fuziuni centrice intercromosomiale (translocaie fuziunea a doi cromosomi neomologi acentrici robertsonian) 3. Cromosomi policentrici fuziune de fragmente centrice dup o deleie terminal 4. Cromosomi duplicai fixare pe cromosom a unui fragment acentric, dislocat prin deleie de la un cromosom omolog B. Aberaii de tip cromatidic Lezionarea cromatidelor surori 1. Fragmente izolate lezionarea unei cromatide 2. Translocaia intracromatidic (inversie dislocare de fragmente de la fiecare bra al pericentric) cromatidei i sudare la brae diferite 3. Ruptura cromosomial separarea unui fragment cromatidic de restul cromosomilor 4. Lacuna cromosomial ruptur cromatidic neexteriorizat n metafaz datorit plierii cromatinei

Tipul de aberaie

Diagrama

Tipul de aberaie

Diagrama

1. Gap sau lacun cromosomic

10. Schim intercromosomial simetric

2. Deleie cromosomial - fragment 11. Schimb intracromosomial asimetric 3. Cromosom dicentric i frgament

4. Cromosom inelar i fragment

12. Schimb intracromosomial simetric

5. Inel acentric

6. Gap sau lacun cromatidic

13. Deleie interstiial (la nivelul unei cromatide)

7. Deleie cromatidic fragment cromatidic 14. Schimburi izocromatidice/cromatidice a. Cromosom dicentric triradial i fragment

8. Deleie izocromatidic b. Cromosom monocentric triradial

15. Izocromosomi

9. Schimb intercromosomial asimetric

Fig. 34 Principalele tipuri de aberaii cromosomiale (modificat dup Scott i colab., 1983 i Gavril,1986)

8.1. Studiul aberaiilor cromosomiale n ana-telofaza mitozei la unele plante de cultur

Ca rezultat al deleiilor cromosomiale apar n ana -telofaza mitozei aberaii cromosomiale, vizibile la microscopul optic (colornd materialul biologic mutagenizat cu un colorant specific nuclear), de tipul: - fragmente acentrice (lipsite de centromer) - nu migreaz spre poli, se pierd n cursul diviziunilor succesive, fiind metabolizate. Se produce astfel un dezechilibru n doza genelor, ceea

ce, n general conduce la moartea celulei respective. - fragmente centrice (cromosomi inelari, inele centrice) - formate n urma a dou deleii terminale la nivelul unui cromosom, ca urmare a reunirii capetelor fr telomeri. Fragmentele centrice, deoarece posed centromerul cromosomului, pot participa la diviziune. - inele acentrice - rezultate n urma reunirii capetelor unor fragmente acentrice mari, n cazul n care deleia a fost produs n aa fel nct nici un capt al fragmentului nu posed telomer. - puni (cromosomi dicentrici sau policentrici)- de regul sunt rezultatul reunirii a doi cromosomi ce au suferit deleii terminale. Respectivii cromosomi formeaz una sau mai multe puni, vizibile ntre cele dou mase cromatidice separate la polii celulei. - micronuclee Exist i alte tipuri de aberaii ce se pot evidenia n ana-telofaza mitozei, la microscopul optic: - cromosomi retardartari - sunt cromosomi la care centromerul i-a pierdut capacitatea de cuplare la fibra fusorial. Ei nu pot participa la diviziune, nu pot migra spre polii celulei, dezechilibrnd repartiia cromosomilor ntre cele dou celule fiice. - ana-telofaze tripolare, tetrapolare, multipolare - provocate de formarea defectuoas a fusului de diviziune. Apar fusuri de diviziune cu 3, 4 sau mai muli poli. Cromatidele cromosomilor, dup clivare, migreaz n 3, 4 sau mai multe direcii, ceea ce va conduce la repartizarea inegal a cromatidelor ntre celulele fiice rezultate. Frecvent, multe dintre aberaiile cromosomiale descrise se pot asocia. Cele mai frecvente asocieri sunt de tipul: puni + fragmente, puni + cromosomi retardatari, puni + micronuclee etc. Material biologic: - cariopse de gru Triticum aestivum L.(2n=42) - boabe de bob Vicia faba L. (2n=12) Reactivi: - soluii de cafein de diferite concentraii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%) - soluii de nicotin de diferite concentraii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%) - ap distilat - fixator (alcool-acid acetic 3/1 sau Battaglia) - HCl 1N - HCl 50% - acid acetic 45% - reactiv Schiff Instrumentar, sticlrie: - cutii Petri - hrtie de filtru - pensete - lame - lame i lamele pentru microscop Mod de lucru: 1. Germinarea - n cutii Petri tapetate cu hrtie de filtru, umectat cu ap distilat. Germinarea se va desfura la ntuneric, la 23 -240C, pn n momentul n care rdciniele vor avea cca. 10 m m lungime. 2. Tratamentul mutagen - prin imersia materialului n soluiile de mutagen, timp de expunere 3 ore. 3. Splare -n ap distilat, de trei ori, cte 10 minute 4. Fixarea -detaarea rdcinielor de pe cariopse i fixare n fixator Battaglia pentru 25 minute, la temperatura camerei 5. Splare - cu HCl 1N timp de 5 minute, la temperatura camerei 6. Hidroliz - cu HCl 50%, cca. 30 minute, la temperatura camerei 7. Colorare

- cu reactiv Schiff, 15-30 minute, la temperatura camerei 8. Efectuarea preparatelor microscopice - radcinia la bob, sau rdciniele unei cariopse de gru se plaseaz pe o lam de microscop, ntr-o pictur de acid acetic 45%. Preparatul microscopic se realizeaz prin tehnica squash 9. Studiul preparatelor - se studiaz ana-telofazele normale i aberante, notdu -se tipurile de aberaii i numrul aberaiilor cromosomiale 10. Efectuarea preparatelor permanente - dac materialul prezint frecvente aberaii, preparatele respective se efectueaz permanent. n Fig. 35 38 sunt prezentate aspecte ale aberaiilor cromosomiale n ana -telofaza mitozei la bob, induse prin tratamente cu mutageni chimici.

Fig. 35 Ana-telofaz cu punte la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 36 Ana-telofaz cu punte i fragment la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 37 Ana-telofaz cu puni la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 38 Interfaz cu micronucleu la Vicia faba (40x) (original)

9. Drosophila melanogaster obiect de studiu in genetica

Utilizarea musculiei de oet (Drosophila melanogaster) drept obiect de studiu n genetic se datoreaz ctorva avantaje pe care aceast insect le ofer cercettorilor: cretere relativ uoar n laborator, pe o larg varietate de medii simple;

 timpul scurt necesar obinerii unei noi generaii - 9-11 zile la 25oC; prolificitate mare (cteva sute de descendeni dintr -un singur cuplu de aduli); dimensiuni reduse; caractere de sex bine definite, uor de recunoscut; numrul mic de cromosomi (2n=8), cu morfologie caracteristic; prezena n celulele glandelor salivare de la larve a cromosomilor uriai. Ciclul vital Succesiunea rapid a generaiilor precum i marea prolificitate a unui organism reprezint caracteristici atractive n studiile de genetic. Ciclul vital la Drosophila melanogaster (Ord. Diptera, Fam. Drosophilidae) cuprinde patru stadii (Fig. 39): ou; larv; pup; adult.

ou

larv (stadiul I)

larv (stadiul II)

larv (stadiul III)

pup

Fig.39 Etapele de dezvoltare la Drosophila melanogaster (ou - pup)

Timpul necesar parcurgerii acestor stadii depinde de temperatura la care musculiele sunt meninute. La 250C, ciclul vital se poate derula complet n circa 10 zile, n schimb, la 20 0C se poate prelungi la 15 zile. Cercetrile au demonstrat c expunerea culturilor de Drosophila melanogaster la temperaturi ridicate (cca. 300C), determin sterilitate, n special n rndurile masculilor i moartea culturii respective, iar temperaturile sczute (de exemplu, 10 0C) prelungesc foarte mult ciclul vital (cca. 57 zile) i reduc viabilitatea. Optimul de temperatur pentru creterea musculielor de oet n laborator este deci, 25 0C. Oul Femele adulte de Drosophila melanogaster ncep s depun ou la circa dou zile dup ieirea din pup, n cazul n care au avut la dispoziie parteneri pentru mperechere. Fiecare ou are lungimea de aprox. 0,5 mm, este ovoidal i de culoare alb. Pe faa anterodorsal prezint dou expansiuni, cu regiunile distale lite, sub form de linguri. Aceste structuri au rol n ataarea oului de suprafaa pe care este depus, mpiedicnd, de asemenea, scufundarea acestuia n mediu. Dezvoltarea embrionar se realizeaz foarte rapid, dup o zi la 25 0C, de la momentul depunerii, din ou ieind o larv. Larva Larvele de Drosophila melanogaster au culoarea alb i sunt segmentate. Mandibulele, de culoare neagr, sunt bine vizibile n regiunea cefalic. Larvele sunt lipsite de oric e fel de apendici locomotori, deplasarea realizndu -se prin trre. Stadiul larvar este caracterizat de o hrnire i cretere deosebit de intens. Acest stadiu se submparte n trei periode, separate prin etape de nprlire. Fiecare nprlire conduce la nlocuirea complet a tegumentului i armturii bucale, fenomenul stnd la baza creterii larvei. Cea de-a treia perioad (consecutiv celei de -a doua nprliri) se finalizeaz cu mpuparea. Cu puin timp naintea declanrii acestui proces, larvele nceteaz s se mai hrneasc i caut suprafee relativ uscate (de exemplu, pereii vasului de cultur) de care se fixeaz. Stadiul larvar dureaz (incluznd nprlirile), 4 -5 zile la 250C. In momentul declanrii procesului de mpupare, larvele au o lungime de aprox. 4,5 mm.

Pupa Pupa reprezint stadiul de reorganizare morfo -fiziologic din ciclul vital de la Drosophila melanogaster. In aceast etap, cele mai multe structuri larvare sunt distruse, iar structurile caracteristice adultului se dezvolt pe seama esutului embrionar denumit disc imaginal. Aceste esuturi exist la nivelul larvei, dar de la formarea lor, n embriogenez, rmn n stadiu dormind, pn n faza de pup. Larvele mpupeaz n ultimul lor tegument, care iniial moale i de culoare alb, se ntrete i se brunific progresiv. Transformrile care se petrec n interiorul pupei (deosebit de complexe, fcnd obiectul unei ramuri speciale a geneticii - genetica dezvoltrii), conduc la apariia structurilor caracteristice adultului (imago). Stadiul pupal dureaz circa 4 zile la 25 0C, iar la finele acestuia, din pup va emerge un adult. Adultul Adulii reprezint stadiul reproductiv din ciclul vital la Drosophila melanogaster (Fig. 40). Adulii se elibereaz din pupe fornd regiunea anterioar a acestora. Iniial, orice musculi ieit din pup are corpul foarte alungit, de culoare deschis i aripile pliate (mpachetate). Dup circa o or, aripile se extind la dimensiunea lor normal, iar corpul dobndete formele i culoarea caracteristic adultului. Musculiele adulte se pot mperechea la aproximativ 6 ore de la ieirea din pup. Sperma este depozitat n spermateca i receptaculele ventrale ale femelei, fiind gradual eliberat n oviduct, pe msura producerii oulelor i trecerii acestora prin oviduct spre vagin. Femele depun astfel, cteva zile, cte 50-75 ou pe zi. Producia de ou va descrete apoi n timp, pn la dispariia sa total. Durata de via a unui adult de Drosophila melanogaster, la 250C, este de aprox. 37 zile.

Fig. 40 Aduli de Drosophila melanogaster (stnga mascul i dreapta femel)

Creterea musculielor de oet n laborator Medii Drosophila melanogaster (2n = 8) este frecvent ntlnit n natur pe fructe i legume care au nceput s fermenteze (struguri, pere, prune, banane, roii, etc.). Pentru creterea n laborator a acestei insecte, n mediul de cultur sunt absolut necesare dou componente principale: zahrul i drojdia de bere care realizeaz fermentaia. In laborator, creterea se realizeaz pe medii sintetice din compoziia crora nu trebuie s lipseasc cele dou componente menionate. Mediul cu gris Compoziia acestui mediu este: Gri Zahr Agar fibr Drojdie de bere Ap de robinet Acid propionic 50 g 50 g 10 g 15 g 1000 ml 5 ml

Intr-un vas smluit n care se afl 2/3 din cantitatea de ap, se dizolv prin fierbere agarul, apoi se adaug drojdia, continundu -se fierberea, 45 minute, pn la obinerea unei suspensii. In restul de 1/3 ap se pune griul i zahrul i se adaug suspensiei de agar cu drojdie. Fierberea va fi continuat nc 15 minute, pn la obinerea unui mediu de consistena mierei de albine. Se las cteva minute s se rceasc i se distribuie, ca i n cazul mediului cu fin de porumb n vase de cultur. Similar, se pot pregti medii n care griul sau mlaiul s fie nlocuit de fina de gru, melas, uruial de ovz. Mediul de banane Larg utilizat n rile unde aceste fructe se gsesc din abunden, sau au un pre redus, mediul de banane este cel mai simplu mediu de cultur pentru Drosophila melanogaster. Acest mediu se prepar introducnd un fragment de banan bine coapt, n vasul de cultur, dup ce, n prealabil, banana fusese imersionat ntr-o suspensie de drojdie de bere. Mediul de banane are ns i un dezavantaj - se nmoaie foarte repede la cldur, ceea ce face dificil scoaterea insectelor din vas, n momentul eclozrii, acestea scufundndu -se n mediu. In locul bananelor se pot folosi i alte fructe - fragmente de pere, prune, struguri, imersionate n suspensie de drojdie de bere. Din cele prezentate, putem concluziona c un mediu de cultur pentru Drosophila melanogaster, pentru a putea fi folosit cu bune rezultate, trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s fie consistent, pentru a nu permite scufundarea adulilor; s conin suficient zahr, necesar hrnirii larvelor i adulilor, ct i pentru declanarea nmulirii drojdiilor care s produc fermentaia. Mediul astfel pregtit poate fi folosit imediat, sau poate fi pstrat cteva zile la frigider (+40C). Dac mediul ofer condiii optime de dezvoltare, larvele ieite din ou vor fi n numr mare i foarte active, vorace, brzdnd mediul n toate direciile. Tehnici de manipulare n laborator, la Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster este o insect de dimensiuni destul de mici pentru a putea fi manipulat cu uurin n condiii de laborator, dar pentru aceste manevre este nevoie de: utilizarea unei lupe sau a unui stereomicroscop pentru observaii; eterizarea musculielor, pentru ca acestea s poat fi examinate. Echipamentul necesar pentru cercetrile n laborator efectuate pe Drosophila melanogaster cuprinde: lup binocular (stereomicroscop) cu surs de lumin; flacoane de eterizare; cutii Petri tapetate cu hrtie de filtru pentru re -eterizarea musculielor ce se trezesc n timpul examinrii; plci de sticl n dou culori (alb -negru) pe care vor fi plasate musculiele, pentru efectuarea observaiilor; pensule de dimensiuni mici, din pr moale; ace de disecie (ace entomologice). Eterizarea Musculiele trebuie eterizate pentru a fi meninute inactive, n vederea examinrii sau transferrii n vase de cultur. Eterizatorul const ntr -un flacon ce conine un tampon de vat, care va fi umezit cu eter etilic. Este necesar i o plnie metalic, nchis la extremitatea mai mic cu o plas fin de srm, iar extremitatea opus cu deschiderea de un diametru cu puin superior celui al vasului de cultur. Vasul de cultur va fi rsturnat n plnie, captul nchis cu plas a acesteia fiind introdus n eterizator. Dup introducerea adulilor n plnie, deschiderea acesteia va fi imediat acoperit cu un tifon, sau o plac Petri. Ansamblul va fi ulterior agitat uor, musculiele fiind astfel meninute n partea de jos a plniei, n atmosfera saturat cu vapori de eter. In mai puin de 1 minut insectele vor fi eterizate, putnd fi rsturnate pe placa de observaie. Precauii:

 vata din flaconul eterizatorului nu va fi prea mbibat n eter i n nici un caz n flacon nu trebuie s fie eter lichid, deoarece prin manevrele care se execut, eterul poate ajunge pe corpul insectelor, provocndu -le arsuri; expunerea la eter nu trebuie s fie ndelungat, deoarece poate duce la omorrea musculielor; toate manevrele trebuie fcute cu delicatee, insectele fiind extrem de fragile; eterul etilic este un compus toxic. Se va evita pe ct posibil inhalarea lui direct i expunerea prelungit. Re-eterizarea In cazul n care, pe parcursul observaiilor, musculiele ncep s se trezeasc, deasupra lor se aeaz o plac Petri tapetat cu hrtie de filtru, stropit cu eter. Placa se las cteva zeci de secunde, pe parcursul crora musculiele vor fi re -eterizate. Atenie! Manevra nu poate fi repetat de prea multe ori pentru c omoar insectele. Identificarea sexului la adulii de Drosophila melanogaster Masculii i femelele de Drosophila melanogaster se difereniaz printr-o serie de caractere morfologice, relativ uor de recunoscut, caractere care se genereaz dimorfismul sexual. n cazul efecturii ncrucirilor de analiz genetic, recunoaterea sexului este vital, deoarece, n cele mai multe dintre aceste ncruciri, femelele genitoare trebuie s nu se fi mperecheat n prealabil, deci, trebuie s fie virgine. Aceast stare a femelelor se pstreaz maxim 12 ore de la ieirea din pup, astfel nct, atunci cnd intenionm efectuarea de ncruciri, este important s separm indivizii conform sexului lor. Identificarea sexului adulilor are la baz urmtoarele criterii: 1] pieptenele sexual. Este o formaiune ntlnit doar la mascul, care const dintr -un mnunchi de periori (cca.10) chitinoi, de culoare neagr, reunii, plasai n apropierea ncheieturilor tarsale, pe prima pereche de picioare. Structura poate fi vizualizat din stadiul pupal, cu puin nainte de ieirea adultului din pup, peretele acesteia devenind n acel moment transparent (Fig. 41).

Fig. 41 Identificarea sexului la Drosophila melanogaster pe baza prezenei pieptenului sexual la mascul

2] abdomenul. Femelele au abdomenul format din 7 segmente vizibile, alungite posterior, n timp ce masculii posed doar 5 segmente, ultimul fiind rotunjit. La masculi, ultimele benzi ntunecate ce separ segmentele abdominale fuzioneaz, astfel nct toi masculii au regiunea teminal a abdomenului de culoare mai nchis dect restul corpului. 3] regiunea genital. Armtura genital a femelei include ovopozitorul i este de culoare deschis, n timp ce piesele armturii genitale a masculilor (inclusiv penisul) au culoare nchis. Simboluri utilizate n genetica la Drosophila melanogaster Tipul normal, aa numit - slbatic (wild type) la Drosophila melanogaster are caracterele determinate de gene care se noteaz cu 2-3 litere provenite din denumirea n limba englez a caracterului respectiv, cu indice "+".

In cazul mutantelor, acest indice lipsete. Dac mutaia respectiv este recesiv fa de tipul slbatic, prescurtarea numele su se scrie cu liter mic, iar n cazul mutaiilor dominante, cu liter mare. O musculi poate s fie purttoarea unei singure mutaii, caz n care poart denumirea de mutant, sau a mai multor mutaii, situaie n care se numete linie mutant. Mutaiile morfologice la Drosophila melanogaster se clasific n funcie de organul afectat n mutaii ale formei aripilor, culorii ochilor, corpului, formei periorilor de pe corp, formei ochilor, etc. Exemple: 1] Mutante: ochi de culoare alb - w (engl. white = alb); ochi de culoare normal, roii - w+; aripi vestigiale, rudimentare - vg (engl.vestigial - vestigial); aripi ntregi - vg+; ochi barai, mutaie dominant asupra tipului normal (apare prin reducerea numrului de omatidii) - B (engl.Bar = bar); ochi ntregi - B+; corp de culoare galben - y (engl.yellow = galben); corp de culoare cafenie, normal - y+ 2] Linii mutante: w, vg - linie cu dou caractere mutante, ochi de culoare alb, aripi vestigiale; Cy, L, Pm (Curly = cre; Lobe = lobat; Plume = vineiu, de culoarea prunelor) - linie triplu mutant, cu aripile curbate la capete, ochii redui dimensional, lobai i de culoare vineie; y, ct, v, f (yellow = galben; cut = retezat; vermillon = portocaliu aprins; forked = mciucat) - linie cu patru caractere mutante - corp de culoare galben, aripi retezate la capete (tipul slbatic are aripile rotunjite), ochii de culoare portocaliu aprins i periorii de pe corp mciucai.

9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster

8.1.1. Cromosomii uriai Unul dintre avantajele cele mai importante oferite de Drosophila melanogaster, ca obiect de studiu n genetic, este relativa uurin n studiul cromosomilor acestei specii. Studiile asupra cromosomilor nu ofer doar informaii legate de numrul acestora la diferite specii, ci i posibilitatea elucidrii cauzelor unor anormaliti de ordin fizic sau mental (n cazul omului), care, aa cum s-a dovedit, pot fi puse pe seama variaiilor numerice sau anomaliilor structurale ale cromosomilor fa de complementu l cromosomial normal. Dei de multe ori, studiul cromosomilor se dovedete o ntreprindere destul de dificil, care solicit timp i echipament specific, n cazul musculiei de oet, preparatele microscopice coninnd celule n care se pot observa cromosomii, sunt destul de uor de realizat. Mai mult dect att, la Drosophila melanogaster, la larve, n celulele glandelor salivare, exist cromosomi de dimensiuni foarte mari, cu o structur aparte, care odat evideniai, ofer posibilitatea efecturii de stu dii amnunite de structur precum i de localizare a genelor n cromosomi (ntocmirea hrilor fizice). Aceti cromosomi au primit denumirea de cromosomi uriai (Fig.42).

Fig. 42 Cromosomii uriai la Drosophila melanogaster, vedere de ansamblu

In celulele glandelor salivare de la larve (fenomenul este caracteristic i altor specii de diptere), cromosomii omologi se afl ntr-o stare de permanent sinapsare. Celulele din aceste esuturi nu se divid, crescnd doar n dimensiuni pe parcursul stadiu lui larvar. Cu toate acestea, cromosomii lor sufer runde succesive de replicare . Procesul de replicare a cromosomilor, fr ca respectiva celul s se divid, poart denumirea de endomitoz, cromosomii lor primind denumirea de cromosomi politenici (lat. tenuis = panglic; lat. poly = mai multe). Dimensiunile foarte mari ale acestor cromosomi sunt completate i de o aranjare foarte special a lor. In preparatele microscopice, apar sub forma a 5 brae foarte lungi i unul extrem de scurt, unite la nivelul unei regiuni care se coloreaz cu colorani specifici pentru acizi nucleici, foarte intens, i care a primit denumirea de cromocentru. Cromocentrul reprezint regiunea centromeric a fiecrui cromosom, n timp ce braele corespund dup cum urmeaz: cele cin ci brae lungi reprezint 3 perechi de cromosomi alungii, iar cel de -al aselea bra, scurt, perechea a IV-a de cromosomi. Cromosomii perechii I (XX la femele) sunt strns unii pe toat lungimea lor i avnd centromerul plasat terminal, formeaz un unic bra. La masculi, deoarece cei doi cromosomi ai perechii a-I-a (XY) nu sunt omologi i nu pot sinapsa, braul I este format de fapt doar din cromosomul X, cromosomul Y fiind inclus, alturi de regiunile centromerice ale celorlali cromosomi, n cromocentru (Fig. 43). Cromosomii perechii II, sinapsai pe toat lungimea lor, formeaz dou brae, II dreapta (engl. 2R) i II stnga (engl. 2L), deoarece au centromerii plasai submetacentric ( Fig. 44). Cromosomii perechii III, de asemenea sinapsai pe toat lungimea lor, formeaz dou brae, III dreapta (engl. 2R) i III stnga (engl. 2L), i aceti cromosomi fiind aproximativ submetacentrici (Fig.45). Braul scurt al cromosomilor uriai este format din cromosomii perechii a-IV-a, telocentrici, care n preparatele microscopice cu cromosomi somatici, apar punctiformi ( Fig.46).

Fig. 43 Cromosomii perechii I (braul 1)

Fig. 44 Cromosomii perechii II (braul 2L sus i braul 2R jos)

Fig.45 Cromosomii perechii III (braul 3L sus i braul 3R jos)

Fig. 46 Cromosomii perechii IV

Fiecare bra al unui cromosom uria este deci format din doi cromosomi, omologi, unul de origine matern i altul de origine patern. De obicei, cromosomii omologi care alctuiesc braele sunt foarte greu de identificat, datorit sinapsrii lor extreme, dictat de omologia regiunilor corespunztoare genelor de pe aceti cromosomi (homozigoie). In cazul n care organismul respectiv este heterozigot dup o gen dat, la nivelul regiunii corespunztoare genei respective, sinapsarea nu mai este att de strns, se formeaz bucle, permind vizualizarea celor doi cromosomi ce alctuiesc de fapt, braul. Tot astfel de bucle apar i n cazul n care la nivelul unor regiuni s-au produs inversii, translocaii, deci mutaii structur al cromosomiale. In lungul braelor cromosomilor uriai, apar n urma aplicrii unor metode specifice de colorare (cu colorani selectivi pentru ADN), benzi transversale care se coloreaz mai intens, alternnd cu benzi mai slab colorate. Se consider c re giunile mai intens colorate ar corespunde poriunilor de cromatin cu o spiralizare mai intens, n timp ce cele mai slab colorate, unor poriuni n care cromatina este mai relaxat. Regiunile ar corespunde deci, heterocromatinei (cele mai

dense, care se coloreaz mai intens) i eucromatinei (cele mai relaxate, mai slab colorabile). Dat fiind faptul c virtual fiecare cromatid are aceeai dispoziie a regiunilor eu - i heterocromatice, iar la nivelul unui bra, cei doi omologi s -au replicat de nenumrate ori, iar numrul de cromatide este foarte mare, alturarea acestor regiuni conduce la apariia benzilor. Au fost identificate peste 5000 de benzi. Stabilindu-se o coresponden ntre locii genelor i distribuia benzilor, a fost revizuit i corectat harta genetic la Drosophila melanogaster, fiind ntocmit i harta fizic a cromosomilor uriai la aceast specie. Lungimea total a cromosomilor uriai este de 1180 , ei fiind de 157x mai lungi dect cromosomii somatici. Braele au urmtoarele dimensiuni: perechea I (XX) - 220 perechea II - 215 i 245 perechea III - 210 i 275 perechea IV - 15 Deci, cromosomii uriai au aceste dimensiuni din dou motive: a] se replic normal, dar replicarea lor nefiind urmat de diviziunea celulei, cromatidele surori rmn mpreun, ceea ce conduce la ngroarea lor; b] nu sufer procese de condensare pentru formarea structurii de tip cromosom metafazic, celulele n care se gsesc aflndu -se ntr-o continu interfaz, astfel nct lungimea lor este deosebit de mare, fa de cromosomii somatici obinuii. Evidenierea cromosomilor uriai la Drosophila melanogaster Material biologic larve aflate n stadiul III de cretere, bine dezvoltate, cu o lungime de cca. 4mm. Numrul de larve din mediul de cultur n fiolele destinate pentru aceast lucrare nu trebuie s fie foarte mare, pentru a permite dezvoltarea viguroas a larvelor. de la larve se vor recolta glandele salivare. Recoltarea glandelor salivare se plaseaz larva pe placa de sticl pe care se efectueaz observaiile, n jumtatea neagr, n cteva picturi de ser fiziologic, sau ap; se aeaz placa de observaie la un stereomicroscop binocular i se regleaz imaginea, pn la observarea clar a larvei; cu un ac entomologic se fixeaz bine larva, fr a o nepa, acul fiind plasat imediat sub regiunea armturii bucale, uor vizibile, de culoare neagr; cu un al doilea ac de disecie, plasat transversal peste corpul larvei, fr a o nepa, aproximativ la mijlocul distanei dintre cele dou extremiti, se efectueaz o micare de ntindere n direcia axului longitudinal al corpului larvei; aceast manevr, corect executat, va conduce la decapitarea larvei, de extremitatea cefalic rmnnd ataate i glandele salivare, saciforme, de culoare alb argintie i translucide. Resturile de tub digestiv, eventual antrenate, vor fi ndeprtate ( Fig. 47).

Fig. 47 Larva de Drosophila melanogaster (disecie) (1 glande salivare; 2 ganglioni nervoi)

Colorarea materialului glandele salivare se preiau cu acul de disecie, fiind trecute pe o lam curat i bine degresat de microscop, ntr-o pictur de colorant carmin acetic, sau orcein 2%; colorarea dureaz cca.3-5 minute. Materialul poate fi apoi, eventual, trecut pe o nou lam de microscop, ntr-o pictur de colorant proaspt;

 peste material se aeaz o lamel, peste aceasta o bucat de hrtie de filtru care va absorbi excesul de colorant i se preseaz uor cu degetul mare, sau se trece un rulou de cauciuc pe deasupra, ceea ce va permite etalarea uoar (de tip squash). Sub nici o form nu se va efectua o etalare energic, prin bti repetate n lamel, care conduce inevitabil la fragmentarea cromosomilor i compromiterea preparatului. Observarea preparatelor la microscop metoda de coloraie aplicat va conduce la evidenierea cromosomilor uriai colorai n rou deschis, transversal pe braele acestora aprnd benzi de culoare rou ntunecat; distribuia benzilor este constant i caracteristic fiecrui cromosom; observaiile se efectueaz de preferin, la obiectivul cu imersie, pentru observarea ct mai multor detalii. 8.1.2. Cromosomii somatici Cromosomii somatici pot fi evideniai la Drosophila melanogaster, n celulele neuroblastice din ganglionii nervoi ai larvei aflate n stadiul III de de zvoltare. Celulele din esutul nervos se divid mitotic normal, motiv pentru care, alturi de celulele n interfaz vom putea gsi i celule aflate n diviziune. Vom cuta celule aflate n metafaz, la care cromosomii sunt condensai, eliberai de sub membrana nuclear care s-a fragmentat la finele profazei i dispui n regiunea ecuatorial a celulei. Pentru mai buna lor dispersare este recomandat ca n mediul de cultur n care se afl larvele, s se adauge o soluie de colchicin 0,04%, cu cca. 2 ore nainte de disecia acestora. In acest fel, colchicina ingerat de larve, va produce blocarea formrii fusului mitotic de diviziune, i acumularea de metafaze cu cromosomii dispersai n celul. Numrul de cromosomilor la Drosophila melanogaster este 8. Femela are o pereche de cromosomi de sex omologi XX, n timp ce masculul are o pereche de cromosomi neomologi, XY, aceti cromosomi primind denumirea de perechea a-I-a. Determinismul cromosomial al sexelor la Drosophila melanogaster este identic celui uman. Aceti cromosomi poart denumirea de heterosomi, spre deosebire de ceilali cromosomi din complement autosomii. Cromosomul X are forma unui baston, n timp ce cromosomul Y are form de baston frnt. Autosomii formeaz perechile II, III i IV. Perechile a-II-a i a-III-a, la ambele sexe, sunt reprezentate de cromosomi cu forma literei V, cu brae mai mult sau mai puin egale (cromosomi submetacentrici), n timp ce cromosomii perechii IV sunt extrem de mici, punctiformi (Fig. 48).

Fig. 48 Cromosomii somatici la Drosophila melanogaster (2n = 8)

Materialul biologic , prelevarea sa i colorarea sunt identice ca i n cazul cromosomilor uriai, dar la extremitatea cefalic detaat de corpul larvei, n urma diseciei, se afl ataai, mpreun cu glandele salivare i ganglionii nervoi, care intereseaz n cazul studiului cromosomilor somatici. Acetia sunt dou structuri translucide, gri -albstrui, plasate imediat deasupra glandelor salivare. Ganglionii se detaeaz de restul materialului ( de fapt, disecia larvei se poate finaliza cu prelevarea att a glandelor salivare, ct i a ganglionilor ce rebroizi) i se trec pe o lam de microscop, ntr-o pictur de orcein 2%, sau colorant carmin -acetic. Dup 2-3 minute, materialul se acoper cu o lamel i se etaleaz uor. Observarea preparatelor la microscop Observaiile se vor efectua cu obiectivul de imersie (90x) i n lumin puternic (cu condensorul ridicat) pentru vizualizarea ct mai bun a cromosomilor, care vor avea o coloraie rou nchis.

Bibliografie
Bra, I.I. Butnaru, Gallia Carr, D.H., Walker, J.E. Hartl, D.L., Jones, Elizabeth W. Kao, K.N. 1999 1985 1961 1998 1975 Genetica, Ed. Corson, Iai Genetica, Ed. Institutului Agronomic, Timioara Carbol fuchsin, a dye for human chromosomes. Stain Technol., 36 : 233-236 Genetics Principles and Analysis, 4th edition, Jones and Bartlett Publishers, Boston, London, Singapore A chromosomal staining method for cultured cells. In Plant Tissue Culture Methods (edited by O.L. Gamborg and L.R. Wetter), NRCC, Saskatoon, Saskatchewan, Canada : 63-64 Determination of the frequency of interspecific protoplast fusion by differential staining. Colloq. Int. Cent. Natl. Rech. Sci., 212 : 455-463 Concepts of Genetics, 6th edition, Prentice Hall International, Inc., USA Genetics Laboratory Investigations, 11th edition, Prentice Hall International, Inc., USA Fusion and division of nuclei in multinucleated soybean protoplasts. Can. J. Genet. Cytol., 13 : 347-353 Mutageneza experimental, Ed. Ceres, Bucureti Pesticidele n lumina toxicologiei mediului, Ed. Ceres, Bucureti Genetic general i uman, Ed. Humanitas, Bucureti Principles of Genetics, John Wiley & Sons, Inc., New York Mutageneza chimic, Ed. Genesis, Cluj-Napoca Cytogenetic effects induced by nicotinic acid in Vicia faba L. (2n=12) and Triticum aestivum L. (2n=42). An. t. Univ. Al. I. Cuza Iasi, T XXXVII, s. II. a, Biologie vegetal: 23-25 Cytogenetic action of a new biostimulator on rye - Secale cereale L. (2n=14). An. t. Univ. Al. I. Cuza Iasi, T XXXVIII, s.II.a, Biologie vegetala: 53-56 Bandarea cromosomilor la plante si importana sa. Buletinul SNBC, a XII a Sesiune a SNBC, Tg.Mure, 10-11 iunie, 30 Genetica, vol.II, Ed. Univ. Al.I.Cuza, Iai Genetica ndrumtor de laborator, Lito, Ed. Univ. Al.I.Cuza, Iai

Keller, W.A., Harvey, B.L., Kao, K.N., Miller, R.A., Gamborg, O.L. Klug, S.W., Cummings, M.R. Mertens, T.R., Hammersmith, R.L. Miller, R.A., Gamborg, O.L., Keller, W.A., Kao, K.N. Nicolae, I. Nikonorow, M. Raicu, P. Snustad, P.D., Simmons M.J., Jenkins, J.B. Socaciu, Carmen Tudose, I. Gh., Cmpeanu Pricop Mirela - Mihaela, Maniu - Tudose Marilena Tudose, I. Gh., Megyeri, Cristina, Cmpeanu - Pricop Mirela - Mihaela, Maniu Tudose Marilena Tudose, I. Gh., Tru, Elena, Cmpeanu - Pricop Mirela Mihaela Tudose, I.Gh. Tudose, I.Gh.

1973

2000 1998 1971 1978 1981 1997 1997 1996 1991 1992

1994

1993 1967