PRACTICA N 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL

I. INTRODUCCION: La glucosa sangunea es una de las fuentes de energa ms importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. En el cerebro y los glbulos rojos es la nica fuente de energa. Por todo esto, el organismo dispone de una compleja maquinaria metablica que permite asegurar la constancia de la concentracin de glucosa en la sangre y, con ella, la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. La glucosa en sangre, proviene de dos orgenes: de origen exgeno de los alimentos, y de origen endgeno, que proviene del hgado por glucogenlisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos perifricos (para su consumo) y por excrecin renal por la orina, por lo tanto la concentracin de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. Diversos factores que inciden sobre la absorcin, produccin endgena de glucosa as como la utilizacin y excrecin de la misma, contribuyen a mantener constante la concentracin de glucosa en sangre. En el caso del hgado, el transporte de glucosa al interior de las clulas es por difusin pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los dems tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las clulas por simple difusin, sino que lo hace por un mecanismo de difusin controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazn y el msculo esqueltico. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a travs de las clulas de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que est ntimamente ligado al transporte de sodio. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentracin de sodio en fludo extracelular. En este caso la glucosa entra en la clula, posiblemente porque se une a la misma protena transportadora que lleva el sodio. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvera a salir de la clula. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energa. La entrada de la glucosa en estas clulas est supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentracin en el lquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a travs de la membrana favorecera a otro. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al mtodo utilizado. Segn el mtodo de Folin Wu. Vara entre los 80 120 mg%; con el mtodo de la glucosa oxidasa la concentracin vara entre 70 110 mg/dl. El conocimiento de la glicemia es importante no slo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metablica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patolgicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.

La finalidad de la siguiente prctica es demostrar la digestin y absorcin de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el mtodo de Glucosa oxidasa; tanto en personas normales como en casos patolgicos. 29

II. FUNDAMENTO TERICO La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidacin de glucosa a cido glucnico. El perxido de hidrogeno(H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromo gnico de oxgeno, fenol-ampirona en presencia deperoxidasa (POD): REACCIN : En el mtodo GOD-POD, en unprimer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico conformacin de perxido dehidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4aminofenazona y al fenol, dandolugar a una quinonaiminacoloreada. La intensidad de color ser proporcional a laconcentracin de glucosapresente inicialmente. (Enocasiones se utilizan otrossustratos en lugar de 4-aminofenazona+fenol, tales comoo-dianisidina, guayacol y ABTS.)Esquema de la reaccin

III. REACTIVOS A UTILIZAR - Estndar: Solucin de glucosa 1 g/l - GOD/POD: Solucin de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Perxidasa (120 U/ml). - Reactivo 4- AF: Solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. - Reactivo Fenol: Solucin de Fenol 55 mmol/l. - Preparacin del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo 4- AF, 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversin sin agitar. Rotular y fechar. IV. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarn dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. La segunda: Esta muestra se tomar despus de una hora, como mximo, despus de la ingesta alimenticia. En esos momentos, se extraern 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodrmica de 10 ml. y con aguja N 20. Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Separar el suero. La determinacin de la glicemia se realizar por el mtodo Enzimtico de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo:

COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo

B ------------2 ml

Dpre. ----20 ul ----2 ml

Dpost. --------20 ul 2 ml

Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C Leer en Espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.

Clculo de los resultados : 1.00 g/l Glucosa (g/l) = D x f donde f = ----------S y D = Dpre. y Dpost. Antes de multiplicar D x f, Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.

IV. CUESTIONARIO: CUESTIONARIO

1. Actualmente, cul es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores, que Ud. puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. -La glicemia basal es 70-110 mg/dl para la prueba de la glucosa oxidasa Glucosa basal alta Las causas de unos niveles altos de glucosa en ayunas son un mal funcionamiento del pncreas. Los sntomas de niveles altos de glucosa en sangre (hiperglucemia: niveles superiores a 110 mg/dl) son prdida de peso, sed, aumento de apetito, de orina, cansancio y debilidad. Ante un resultado alto en los niveles de glucosa es recomendable seguir una serie de pautas, como realizar ejercicio fsico, eliminar en la medida de lo posible los

hidratos de carbono de la dieta. En este enlace encontrareis un montn de consejos sobre cmo bajar los niveles de azcar. Glucosa basal baja Los sntomas de niveles bajos de glucosa (hipoglucemia: niveles inferiores a 60 mg/dl) son dificultades en la concentracin y en el habla, confusin, dolor de cabeza, palidez, palpitaciones, irritabilidad, sudores, sensacin de hambre y la posibilidad de desencadenar en un coma. Las causas ms comunes que provocan hipoglucemia son el consumo inadecuado de medicamentos hipoglucemiantes, carencias alimentarias, ejercicio fsico excesivo y, en el peor de los casos, tumores pancreticos.

2. Cmo esperara encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? La concentracin de glucosa en la sangre arterial es ms elevada que en la sangre venosa debido al consumo de glucosa por parte de las clulas. En ayunas estas diferencias son del orden de 0.10-0.25 mmol/L, pero despus de la ingestin de alimentos puede ser de hasta 0.80 mml/L.

3. Conoce otros mtodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento Los mtodos para la determinacin de la glucosa sangunea se basan en el uso de glucosa como agente reductor o en su oxidacin enzimtica para formara cido glucornico. En la tcnica de Folin Wu la glucosa se determina en un filtrado de sangre libre de protenas por reduccin del sulfato cprico alcalino y la reaccin ulterior con el reactivo de cido fosfomolibdico o arsenomolibdico, para formar un complejo color azul que puede estimarse por colorimetra. El mtodo de Nelson-Somogyi se basa en el uso de un filtrado de sangre libre de protenas preparado con hidrxido de cinc para remover la mayora de las sustancias reductoras interferentes.

La presencia de un grupo aldehdo terminal en la molcula de glucosa es la base de una determinacin colorimtrica con reactivos hidroxifenolicos(fenol en metilsalicilato acuoso o 1,3-dihidroxibenceno fosforilado) en presencia de cido sulfrico fuerte y calor. El procedimiento de la o toluidina es una reaccin de color especfica para las hexosas. Dado que normalmente las aldohexosas que no sean glucosa se encuentran en muy bajas concentraciones, los resultados de este mtodo se aproximan al verdadero valor de la glucosa. En acido glacial la o toluidina se

condensa con la glucosa para dar un cromgeno verde a travs de la formacin de una mezcla en equilibrio de una glucosamina y una base de Schiff.

4. Cules son los criterios bioqumicos relacionados con la glicemia para el diagnstico de la diabetes mellitus?

A1C 6,5%. La prueba debe realizarse en un laboratorio que use un mtodo certificado y estandarizado. FPG 126mg/dl. El ayuno se define como la no ingesta calrica por lo menos 8horas. Glucemia 2 horas posprandial 200mg/dl durante la prueba de tolerancia a la glucosa. La prueba debe realizarse como lo indica la OMS, con una carga de glucosa que contiene el equivalente de 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua. En un paciente con sntomas clsicos de crisis de hiperglucemia o hiperglicemia; una glucemia al azar >200 mg/dl. En ausencia de hiperglucemia inequvoca, los criterios deben ser confirmados por pruebas repetidas.