Inmunofluorescencia

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Microfotografa de un corte histolgico de piel humana preparado por inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti IgA. La piel proviene de un paciente con prpura de Henoch-Schonlein: Los depsitos de IgA se encuentran en las paredes de los pequeos capilares superficiales (flechas amarillas). El rea ondulada de color verde plido en la parte superior es la Epidermis, el rea fibrosa en la parte inferior es la dermis.

Microfotografa de un corte histolgico de piel humana preprado por inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti IgG. La piel proviene de un paciente que padece lupus eritematoso sistmico y muestra depsitos en dos diferentes lugares: el primero es un deposito con forma de banda a lo largo de la membrana basal de la epidermis (por eso se lo denomina "ensayo de la banda de lupus", y en este caso es positivo). El segundo es dentro de los ncleos de las clulas epidrmicas. En este caso el ensayo ha detectado anticuerpos antinucleares.

Microfotografa de un preparado obtenido por IFI, de clulas tumorales de linea Hep-2 expuestas a suero de un paciente con lupus eritematoso sistmico (anticuerpos primarios) y luego marcado con un anticuerpo secundario de ratn anti IgG humana. El preparado muestra un patrn de fluorescencia nuclear debido a la presencia de anticuerpos antinucleares en el suero del paciente y un cierto grado de depsito inespecfico citoplasmtico

La inmunofluorescencia es una tcnica de inmunomarcacin que hace uso de anticuerpos unidos qumicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molcula. Es una tcnica que tiene variantes cuali y cuantitativas, por ejemplo FPIA dentro de las cuantitativas y la inmunotincin de clulas para su observacin por microscopa fluorescente dentro de las cualitativas.

ndice

1 Generalidades 2 Tipos de inmunofluorescencia o 2.1 Primaria o IFD o 2.2 Secundaria o IFI 3 Limitaciones 4 Bibliografa 5 Referencias 6 Enlaces externos

Generalidades
La inmunofluorescencia, como todos los inmunoensayos, aprovecha la capacidad que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a una determinada molcula blanco; pero se diferencia de otras tcnicas inmunoqumicas en que aqu la marca unida al anticuerpo es una molcula fluorescente tal como por ejemplo, el isotiocianato de fluorescena. El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biolgico y luego se expone la muestra asi tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio de un monocromador. Esta luz de onda corta genera un fenmeno de fluorescencia en la molcula marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda mas larga (verde, amarillo o naranja). Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometra o en el caso de tratarse de preparados histolgicos, puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia. En el caso de la utilizacin de la inmunofluorescencia como mtodo de tincin para microscopa ptica, el fluorescente revela la localizacin a nivel celular o subcelular de la molcula diana. La inmunofluorescencia, como tcnica de tincin, puede ser utilizada en cortes de tejidos, lneas celulares cultivadas, clulas individuales y secreciones que contengan clulas en suspensin (por ejemplo esputo) con la finalidad de analizar la presencia y distribucin de protenas, glcidos y molculas pequeas tanto de origen biolgico como no. Esta tcnica puede ser utilizada en combinacin con otras tcnicas de coloracin fluorescente que no hagan uso de anticuerpos, como por ejemplo DAPI para marcar ADN. Existen varios diseos de microscopios que pueden ser utilizados para el anlisis de preparados histolgicos marcados por inmunofluorescencia. El mas simple de todos es el microscopio de epifluorescencia, aunque tamben es ampliamente utilizado el microscopio confocal. Tambin es posible utilizar varios tipos de tcnicas microscpicas de alta resolucin.1

La inmunofluorescencia como tcnica inmunoqumica de cuantificacin se puede utilizar tanto en muestras de origen biolgico como en muestras no biolgicas, siempre que se encuentren en un medio favorable para la unin de los anticuerpos. En general se utiliza una solucin PBS (Buffer fosfato salino) como medio de reaccin. Un ejemplo de este tipo de tcnicas es la FPIA.

Tipos de inmunofluorescencia
Existen dos tipos de tcnicas de inmunofluorescencia; primaria (o directa) y secundaria (o indirecta).

Primaria o IFD
La inmunofluorescencia primaria, o directa, tambin conocida por sus siglas IFD (inmunofluorescencia directa), hace uso de un nico anticuerpo que se encuentra qumicamente unido a un fluorforo. El anticuerpo reconoce la molcula diana y se une a ella directamente. En el caso de utilizarse como tcnica de tincin inmunohistoqumica la regin donde se deposita la molcula diana puede ser identificada al microscopio de fluorescencia como una zona brillante. Esta tcnica presenta algunas ventajas con respecto a la IFI (indirecta). Reduce el nmero de etapas necesarias, por lo tanto es mas rpida y por otro lado es menos sensible a interferencias debidas a reactividad cruzada de los anticuerpos o a reacciones no especficas, las cuales tienden a aumentar el ruido de fondo de la tcnica.

Secundaria o IFI
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta (tambin conocida por sus siglas IFI) hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a al molcula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluorforo, reconoce al primario y se une a l. Esta tcnica es un poco mas compleja que la IFD, requiere mas pasos y es mas posible que sufra interferencias, pero en contrapartida es mucho mas flexible que una tcnica directa y debido a que es posible que un anticuerpo primario una a mas de anticuerpo secundario, implica un efecto de amplificacin que tambin aumenta la sensibilidad de la tcnica. Esta tcnica es posible, debido a que los anticuerpos constan de dos partes, una regin variable (que es la que reconoce al antgeno) y una regin constante (que forma el esqueleto y estructura bsica de la molcula de anticuerpo). Es importante notar sin embargo, que esta divisin es artificial y que en realidad la molcula de anticuerpo se encuentra formada por cuatro cadenas polipeptdicas: dos cadenas pesadas y dos livianas, estas ltimas son las que contienen la regin variable. Es posible que existan varios anticuerpos que reconozcan diferentes antgenos (es decir que tengan diferentes regiones variables) pero que compartan la misma regin constante. Todos estos anticuerpos con diferentes especificidades pueden ser reconocidos a su vez por un nico anticuerpo secundario que reconozca la regin constante. Esto ahorra el esfuerzo tcnico y el costo de modificar cada uno de los anticuerpos primarios para acarrear el fluorforo.

Tipicamente se hace uso de diferents anticuerpos primarios con diferentes regiones constantes generados por la estimulacin en la produccin de anticuerpos en diferentes especies. Por ejemplo, un investigador puede estimular la produccin de un determinado anticuerpo primario en una cabra, y luego emplear un anticuerpo de conejo que reconozca la regin constante de los anticuerpos de cabra (anticuerpos de "conejo anticabra"). Y luego puede crear un segundo juego de anticuerpos en ratn que sean reconocidos por un tipo diferente de anticuerpos "burro anti-ratn". Esto permite reutilizar los anticuerpos marcados, que son muy dificiles de obtener, en mltiples experimentos.

Limitaciones
Al igual que la mayora de las tcnicas de fluorescencia, un problema muy significativo con la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo. Es decir la prdida de la actividad fluorescente causada por la exposicin a la luz. Esta prdida de actividad puede ser controlada reduciendo la intensidad o el tiempo de exposicin a la luz, incrementando la concentracin de fluorforo, o empleando fluorforos mas robustos que que sean menos propensos al fotoblanqueo. Por ejemplo, Alexa Fluor, Seta Fluors, o DyLight Fluor. Las tcnicas de tincin por inmunofluorescencia para la marcacin de estructuras subcelulares se encuentra limitada a su uso en clulas fijadas (muertas) ya que los anticuerpos no son capaces de atravesar las membranas ntegras de las clulas vivas. Sin embargo si es posible detectar protenas o molculas en suspensin en el sobrenadante, en la periferia (membrana) y proximidades de una clula viva, esto posibilita marcar clulas vivas siempre que no se requiera ver su estructura interna. En el caso de clulas fijadas, dependiendo de la tcnica de fijado utilizada, puede ocurrir que las protenas de inters queden unidas por enlaces cruzados a otras protenas, lo que puede causar tanto falsos positivos, como falsos negativos debidos a unin inespecfica. Una tcnica alternativa es aprovechar la sntesis de protenas recombinantes que contengan dominios fluorescentes, por ejemplo dominios de la protena verde fluorescente (GFP). Estas protenas recombinantes funcionan como una marca interna que permite seguir todo el proceso de sntesis y localizacin de la protena original en una clula viva. Esta ltima opcin, aunque puede parecer una alternativa muy elegante a la inmunofluorescencia, requiere que las clulas sean transfectadas con el gen de la GFP, y esto adems de las grandes complicaciones tcnicas, requiere que las clulas (u organismos) recombinantes obtenidos sean mantenidos en condiciones muy estrictas de seguridad biolgica.