En la actualidad, los vertidos accidentales de petrleo constituyen uno de los problemas medioambientales mas preocupantes.

Hace ms de dos dcadas que se empez a actuar sobre los lugares afectados por este tipo de catstrofes. Entre los posibles tratamientos a aplicar para la descontaminacin, merecen una especial atencin los procesos de degradacin biolgica basados en la accin de los microorganismos sobre los productos contaminantes. Los tapetes microbianos son unos ecosistemas, ampliamente distribuidos en las zonas litorales, que se han mostrado como prometedores agentes para la biorremediacin ya que, dadas sus caractersticas, agrupan, en un espacio de pocos milmetros, complejas poblaciones de microorganismos aerobios y anaerobios capaces de colonizar zonas altamente contaminadas. Una aproximacin muy til para evaluar tanto el impacto de una contaminacin de estas caractersticas sobre la diversidad microbiana, como los procesos de biodegradacin que pueden tener lugar en este tipo de comunidades, es reproducirlas de manera miniaturizada en el laboratorio. El verdadero valor de estos sistemas modelo o microcosmos, es que nos proporcionan un instrumento para comprender la funcin del ecosistema y los factores que controlan el flujo de energa y materia, permitiendo, por tanto, el desarrollo de una capacidad predictiva imprescindible a la hora de desarrollar estrategias tiles de biorremediacin. Nowadays, accidental oil spills constitute one of most worrying environmental problems. More than two decades ago, first in situ actions on the places affected by this type of catastrophes were started to be taken. Among the treatments that can be applied for the decontamination of polluted areas, biological degradation processes, based on the action of the microorganisms on polluting petroleum hydrocarbon components, deserve a special attention. Microbial mats are ecosystems, widely distributed along the shorelines, which have been considered as promising agents for bioremediation, because they group in a space of few millimetres complex

populations of aerobic and anaerobic microorganisms able to colonize zones highly contaminated. A very useful approach for evaluating the impact of such a contamination event on the microbial diversity, and the biodegradation processes that take place in this type of communities, is to reproduce them in a laboratory scale. The true value of these model systems, called microcosm, is that they provide an instrument for understanding the function of the ecosystem and the factors that control the flow of energy and matter, allowing, therefore, the development of a predictive capacity, essential for developing useful strategies of bioremediation.

1*- INTRODUCCION

Desde sus orgenes hasta hoy da, el desarrollo de los procesos industriales ha afectado en mayor o menor grado el entorno en el cual se efectan, en el caso especfico de los desechos de perforacin el tratamiento de los slidos y lquidos representan un problema para la industria en general debido a las consecuencias ambientales asociadas a la generacin de tales desechos y la dificultad tcnica y econmica que significa la recuperacin de los medios afectados. Como respuesta a esta situacin, en el mbito mundial, se han implementado tecnologas dirigidas a regular el manejo, tratamiento y disposicin de los desechos txicos los cuales se han transformados, en esta ultima dcada en uno de los problemas ambientales de mayor relevancia, tanto en las naciones industrializadas como aquellas que se encuentran en vas de desarrollo. Cuando un medio natural ha sido modificado en su composicin fsico-qumica por la accin directa del hombre diremos que esta contaminado y a la accin de descontaminar se le conoce como remediacin, en el caso que se utilicen organismos vivos en el proceso se llama biorremediacion. En los aos setenta y ochenta fundamentalmente la gente comenz a reclamar ambientes limpios, exentos de polucin, y afortunadamente los gobiernos han fortalecido su marco legal para prohibir, reducir y minimizar las actividades susceptibles de degradar al ambiente. Sin duda el proceso de industrializacin ha originado un efecto alarmante en los volmenes de los residuos producidos a nivel mundial, los cuales aunados a su toxicidad, complejidad y heterogeneidad qumica, as como a los altos costos para su tratamiento y disposicin final, han ocasionado un impacto negativo al ambiente y a la salud del hombre. En Venezuela la

legislacin ambiental no permite la disposicin final e ningn tipo de desecho sin un tratamiento previo. La tcnica de tratamiento desarrollada en este proyecto, y el manejo efectivo del desecho dentro de la localizacin, tratamiento del desecho por biodegradacin y disposicin segura en el ambiente por medio de reforestacin, permitir aplicar un sistema integral de manejo, con lo cual se lograra minimizar los daos haciendo realidad el concepto de localizacin seca. Esta es propicia para ser aplicada en reas afectadas por la operacin de perforacin, por ser una zona ambientalmente sensible en las cuales las regulaciones prohben la descarga de desechos slidos. Y, no solo limita los vertidos, si no que trata de evitarlos a su vez, El Ministerio del Ambiente es la institucin ms dinmica al respecto pues se actualiza frecuentemente incluyendo protocolos para evitar fugas, derrames y disposicin inadecuada de los subproductos de los procesos de perforacin. Por ultimo toda la legislacin nacional ambiental ordena que se remedie lo antes posible, con coste al productor del vertido y a su vez multar al mismo . En la prctica no es fcil para los administradores de las empresas recuperar el dinero invertido para la limpieza de los vertidos

2*- SUSTENTO TECNICO.

Los Microorganismos Como Agentes de Biorremediacin. La legislacin y la tecnologa orientada a la limpieza del ambiente y la prevencin de su deterioro han sido dos de los mayores avances de finales del siglo XX y han propiciado el nacimiento de la tecnologa de la biorremediacin. Dicha tcnica se basa en la existencia de microorganismos cuyo metabolismo es capaz de transformar los hidrocarburos, convirtiendo los componentes txicos y mutagnicos del petrleo en productos no txicos, los cuales pueden integrarse en los ciclos biogeoqumicos naturales. El xito de la tcnica depende de la existencia, en el lugar contaminado, de microorganismos con las capacidades metablicas apropiadas, concentraciones adecuadas de oxgeno y nutrientes, as como de las caractersticas del petrleo vertido (Leahy y Colwell, 1990). Cuando es aplicable, la biorremediacin suele ser un medio rentable para restablecer la calidad del medio ambiente. No obstante, y a pesar de la relativamente larga historia de la investigacin en el campo de la biorremediacin de vertidos de petrleo, sta contina siendo una disciplina esencialmente emprica, en la cual muchos de los factores biolgicos que controlan los procesos no han sido adecuadamente comprendidos (Korda et al., 1997). Los vertidos de petrleo tienen un profundo impacto sobre la estructura de las comunidades microbianas naturales, el cual se suele traducir en una reduccin de la diversidad, la biomasa y la actividad (Macnaughton et al., 1999). Se ha visto que en los ambientes sometidos a una contaminacin crnica tienden a predominar las poblaciones de microorganismos capaces de utilizar los compuestos contaminantes o con capacidad de sobrevivir en su presencia; pero que bajo condiciones normales

dichos grupos de microorganismos estn presentes a bajas concentraciones . La mayor parte de nuestro conocimiento sobre los efectos ecolgicos derivados de un episodio de estas caractersticas proviene de los datos obtenidos a partir de microorganismos o consorcios, aislados a partir de dichos ambientes, con capacidad de degradar hidrocarburos o compuestos modelo (Kanaly et al., 2000; Ros-Hernndez et al., 2003). Desde los estudios pioneros de ZoBell (1946) en ambientes marinos, se han aislado numerosas cepas bacterianas de ambientes litorales y ocenicos capaces de degradar diferentes hidrocarburos (Atlas, 1981; Leahy y Colwell, 1990; Van Hamme et al., 2003; Watanabe, 2001). Muchas de estas bacterias, tales como Alcalinivorax, o Planococcus, usan un nmero limitado de fuentes de carbono, preferentemente utilizan hidrocarburos de petrleo, y podran considerarse como especialistas (Dyksterhouse et al., 1995; Engelhardt et al., 2001; Golyshin et al., 2002; Yakimov et al., 1998 y 2003). No obstante, tambin se han aislado bacterias que no presentan esta marcada especializacin, como Marinobacter, Staphylococcus, Micrococcus, Sphingomonas o Geobacillus (Gauthier et al., 1992; Gilewicz et al., 1997; Maugeri et al., 2002; Zhuang et al., 2003). El conocimiento de la diversidad microbiana es de importancia capital, tanto para evaluar el impacto que supone una perturbacin de estas caractersticas, como para determinar qu poblaciones microbianas pueden estar implicadas en la biodegradacin de los hidrocarburos. Las metodologas tradicionalmente utilizadas para el estudio de los procesos de biorremediacin consistan en la utilizacin de mtodos microbiolgicos convencionales para la obtencin de cultivos axnicos o consorcios con capacidad de degradar hidrocarburos. Sin embargo, desde hace tiempo se ha puesto de manifiesto la necesidad de utilizar mtodos que no requieran un paso previo de cultivo, dado que una gran parte de los microorganismos presentes en los ambientes naturales no pueden crecer en medios de cultivo sintticos ( Amann et al., 1995).

Las aproximaciones basadas en el anlisis del RNA ribosmico, ya sea mediante la construccin de libreras genticas, la hibridacin in situ o la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante a partir de rDNA amplificado mediante PCR (PCR-DGGE) han revelado una enorme diversidad en los ambientes naturales (Amann et al., 1995; Olsen et al., 1986; Pace et al., 1986; Torsvik et al., 1998). Las bacterias obtenidas a partir de tcnicas convencionales de cultivo suelen ser muy diferentes a las identificadas mediante aproximaciones cultivoindependientes; de hecho, muchas veces las bacterias aisladas en cultivo axnico representan una baja proporcin de las poblaciones microbianas presentes en el ambiente natural (Eilers et al., 2000; Suzuki et al., 1997) . As pues, los mtodos moleculares han permitido detectar numerosas bacterias no cultivables, algunas de las cuales constituyen poblaciones dominantes; tambin pueden proporcionar informacin sobre la funcin de las poblaciones microbianas, de una manera indirecta; y, finalmente, permiten proporcionar medidas para determinar la influencia de la polucin y reforzar las prcticas de biorremediacin basadas en la microbiota autctona (White et al., 1998). Biorremediacin La biorremediacin puede ser definida como el uso de organismos vivos, componentes celulares y enzimas libres, con el fin de realizar una mineralizacin (compuesto blanco CO2 + H2O), una transformacin parcial, la humificacin de los residuos o de agentes contaminantes y una alteracin del estado redox de metales.

Histricamente el compostaje fue una primitiva forma de biorremediacin en donde los residuos por Ej. derivados de la recoleccin domiciliaria (restos orgnicos, inorgnicos, residuos industriales, etc.) son incluidos en containers

permitiendo que puedan ser biodegradados por microorganismos (Senior and Balba, 1990). Los factores que gobiernan la biorremediacin son complejos y pueden variar enormemente dependiendo de la aplicacin. En muchos casos puede llegar a ser difcil distinguir entre los factores biticos y abiticos que contribuyen con la biorremediacin. La biorremediacin es un fenmeno comn en la naturaleza cuando en un ambiente o ecosistema se produce una alteracin del equilibrio como es el caso de una gran tala de rboles, esto origina un aumento considerable de materia orgnica en el suelo. En este caso los factores fsicos y biticos tratan de reponer el dao, se produce entonces un aumento de organismos saprfitos los cuales ocasionan una gran mineralizacin de la materia cada, adems el resto de esa materia puede ser reciclada o humificada. Cabe remarcar que cuanta ms diversidad biolgica exista en un ecosistema con mayor eficiencia podr autodepurarse. Las tcnicas de biorremediacin pueden ser clasificadas segn el tratamiento y a la fase usada. Se denomina biorremediacin in situ cuando el suelo contaminado se trata en el lugar, el sitio permanece prcticamente inalterado durante el tratamiento y la biorremediacin ex situ el suelo es retirado y trasladado hasta una unidad de tratamiento. El tratamiento es efectuado en fase slida si el suelo es tratado sobre un lecho especialmente preparado y no hay lquido libre. Por el contrario se denomina fase barro cuando se lleva en un reactor y se forma barro entre el suelo y agua (Ferrari, 1996). En general existen dos estrategias para ayudar a un ecosistema a remediarse:

.- La primera es agregar nutrientes de forma de estimular las poblaciones naturales y as aumentando su actividad y la segunda es introduciendo

microorganismos exgenos dentro del ecosistema como forma de remediacin. En este ltimo caso con las nuevas tcnicas de la ingeniera gentica se pueden emplear microorganismos genticamente modificados hacindolos ms eficientes en la biorremediacin. La degradacin microbiana de los productos del petrleo, bien sea natural o con mtodos inducidos, es un proceso que es ampliamente utilizado para reducir las concentraciones de los productos a niveles aceptables. Los objetivos de este proyecto son presentar una tcnica general de manejo, tratamiento y disposicin de los desechos slidos de perforacin, bajo el control de la composicin de la poblacin microbiana de degradacin del petrleo en el suelo, los factores del suelo que afectan el proceso de biodegradacin y la estructura qumica de los productos del petrleo y su influencia en el proceso de biodegradacin. Es importante notar que los principios discutidos aqu son aplicables no solamente a la degradacin de origen natural y facilitada que ocurre en la capa superficial del suelo, en la zona insaturada del suelo y en la interfase acutica, sino en una amplia variedad de sistemas ideados, tales como las instalaciones para el tratamiento de suelos, rellenos y tratamientos de aguas subterrneas. Los microorganismos heterogneos o heterotrficos encontrados en el suelo incluyen poblaciones de origen natural mayora de los de los suelos. Muchos son los microorganismos capaces de crecer en productos petrolferos degradndolos hasta en punto incluso de agotarlos. Este proceso llamado Biorremediacion que consiste bsicamente en el aprovechamiento de los que tiene la habilidad de degradar productos del petrleo, esta poblacin imparte una gran capacidad asimilatoria d hidrocarburos a la

hidrocarburos como fuente de nutrientes para general ms masa microbiana, es decir para reproducirse descontaminando a su vez descritos mltiples casos en el ambiente. En la actualidad hay

Los que la biorremediacion se ha mostrado como una herramienta eficaz contra la contaminacin originadas por productos petrolferos. En la actualidad hay dos tipos de tcnicas de biorremediacion: .- Por adicin de nutrientes para incrementar la velocidad de crecimiento de microorganismos presentes en el medio. .- Por inculos de especies no presentes en ese ecosistema, a los cuales tambin se les potencias el crecimiento. Ambas tcnicas son aplicables tanto de manera In situ como ex situ, las cuales han mostrado eficacia con crudos y todo los subproductos de refinacin. La tcnica que emplearemos en nuestro caso es la primera descrita a travs de potencionamiento del crecimiento celular por adicin de nutrientes. Los gneros de bacterias y hongos, que degradan hidrocarburos, aislados del suelo son en orden decreciente, Pseudomonas, Arthrobacterias, alcalgena, Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococus, Nocardia y microbacterium, son las bacterias ms consistentes en el proceso de degradacin de hidrocarburos. La variedad de hongos que de gradan petrleo en orden decreciente tenemos: Trichoderma, Penicilliun, Aspegillus y mortierella. En este consorcio de microorganismos estn presentes las bacterias, hongo y levaduras y a su vez se van a dar procesos aerobios y anaerobios y no solo van a intervenir microorganismos fijadores de carbono, sino tambin fijadores de nitrgeno, de azufre e incluso de hierro.

2.1*- BIORREMEDIACION POR VIA SLIDA Este tipo de biorrecuperacin al igual que en los Biorreactores es un tratamiento ex situ. Pero en este caso el contaminante no esta suspendido en una disolucin, ya sea agitada o no. La biorremediacion por va slida se puede dividir por dos mtodos generales: .- Tratamiento de Lecho. .- Compostaje. La diferencia fundamental entre estos dos procesos es la aireacin. En el tratamiento de Lecho se utilizan equipos de laboreos aplicados usualmente a la agricultura para airear al suelo. Este mtodo solo nos permite airear las capas ms superficiales que pueden ser de unos 30 centmetros, y en consecuencia, para estos tratamientos es necesario mucho espacio. En el compostaje se forman pilas o montones de suelo que pueden alcanzar hasta cinco metros de altura, y su aireacin se realiza por volteos de las pilas con palas esto implica que el espacio requerido ser menor. En los mtodos por va slida se emplean aditivos nutritivos para favorecer el crecimiento microbiano en la pila y normalmente la adicin se realiza en forma de estircol y / o por el agregado de fertilizantes comerciales inorgnicos que son tcnicas de estimulacin de crecimiento microbiano. 2.1.1*- TRATAMIENTO DE LECHOS. El proceso consiste en esparcir el suelo, fango, sedimento o lquidos contaminados en delgadas capas y se laborea como si de un terreno agrcola se tratara. Con el laboreo se consigue la aireacin necesaria para que se lleven a cabo los

procesos de biorremediacion por parte de los microorganismos. Debe hacerse una distribucin correcta de los nutrientes para optimizar el proceso haciendo que sean biodisponibles. En la construccin de un proceso de tratamiento de lechos los puntos que se deben de tener en cuenta son: Capa Impermeable: Para prevenir la infiltracin a las aguas subterrneas de posibles lixiviados. La impermeabilizacin puede ser natural, por la existencia de suelos arcillosos impermeables, o por la utilizacin de geosinteticos, como los usados en los Vertederos. Red de Drenaje: La red sirve para recoger cualquier tipo de lixiviados que se puedan producir. Bolsa de Almacenamiento: Para recoger los lixiviados que se puedan original por las lluvias, para posibles tratamiento posterior. Zona de tratamiento del Suelo: Estas zonas deben de tenerse en cuenta ante la posibilidad de que sea necesario un pretratamiento del suelo, previo a su aplicacin en el suelo. Sistema de Control: Es un sistema de evaluacin de emisiones, lixiviados del contaminante tratado, al aire o aguas subterrneas y control de procesos y evolucin a lo largo del tiempo. El tratamiento de lecho es uno de los procesos mas aplicados en la biorremediacion de zonas contaminadas con residuos peligrosos, tiene bajo costo de inversin y explotacin, se pueden utilizar de forma ptima para el tratamiento de residuos con concentraciones alta de metales pesados, hidrocarburos, explosivos etc. Como desventaja es que presenta la dificultad de controlar algunos parmetros por ser terrenos sometidos a la intemperie.

2.1.2*- COMPOSTAJE. Es una de las tcnicas mas utilizadas en la agricultura para la obtencin de formas biolgicamente estables a partir de slidos orgnicos para obtener humus, este ha sido muy utilizado como enmienda agrcola. El tratamiento de compostaje para el manejo de residuos peligrosos y txicos es relativamente reciente. Los parmetros que se tienen que optimizar para este proceso al igual que el tratamiento de lechos son: pH, humedad y temperatura. Una de las caractersticas con las que nos encontramos en el compostaje es la temperatura que puede alcanzar la pila, esta, para que se lleve a cabo de forma ptima se deben de considerar los siguientes factores: .- Agentes Esponjantes: Estos agentes favorecen la porosidad del suelo, permitiendo una ptima circulacin del agua y de los nutrientes. .- Fuente de Calor: La generacin de calor es importante para la biodegradacin de los contaminantes y adems al aumentar la temperatura se eliminan posibles patgenos, debido a que estos son mesofilos y no termofilos, haciendo que el producto resultante se pueda utilizar como enmienda agrcola. .- composicin de la Pila: Los diseos de pilas se hacen en el laboratorio con el fin de conseguir un modelo para una rpida eliminacin de los Contaminates. .- Humedad y temperatura: Es necesario el mantenimiento de una cierta humedad y temperatura para favorecer el crecimiento microbiano para que se lleve a cabo el proceso.

2.2*-FACTORES QUE AFECTAN LOS PROCESOS DE BIODEGRADACION. Un nmero de factores del suelo afectan los procesos de biodegradacin. El manejo de estos factores es ventajoso para neutralizar la Ley del Mnimo de Llebig. Esta ley establece: que la rata de un proceso biolgico tal como el crecimiento o el metabolismo esta limitada por un valor presente en su nivel mnimo. Esta ley fue inicialmente aplicada solo a los nutrientes minerales, pero es igualmente aplicable a otros Factores tal como la temperatura y presin. Se especifican cinco importantes factores que afectan a los procesos microbianos. El factor primario limitante del crecimiento microbiano en el suelo es la escasez o ausencia de un adecuado y disponible recurso de energa. La gran mayora de los microorganismos del suelo son heterotrficos y emplean el material orgnico como energa. Los microbilogos del suelo han observado desde hace tiempo que donde quiera que sea abundante el material disponible para energa en el suelo, los microbiotas capaces de usar ese material son usualmente abundantes. pH: El pH ptimo es distinto para cada microorganismo pero por regla general, las bacterias necesitan un pH neutro y los hongos filamentosos y levaduras ptimo de crecimiento. La Temperatura: La mayora de los microorganismos son mesofilos al tener la temperatura optima de crecimiento entre 27 grados centgrados y 30 grados Celsius. prefieren un pH ligeramente cido todos ellos secretan sustancias que ayudan a conseguir su pH

Ambientalmente esta temperatura no siempre se tiene, pero la actividad microbiana produce calor, el calor ayuda a mejorar la temperatura del medio aproximndola a la

ideal de crecimiento. Las reacciones bioqumicas siguen la regla general de que la rata de la reaccin qumica aumenta en al medida que aumenta la temperatura. Muchos microorganismos, pero no todos, contienen enzimas esenciales que sern desnaturalizadas a temperaturas de 50 grados Celsius; por consiguiente esta temperatura representa un lmite superior, razonable para la flora microbiana. Las ratas ptimas de degradacin de petrleo por bacterias aerbicas ocurren a temperaturas entre 15 y 40 grados centgrados. Los microorganismos requieren Agua para soportar sus procesos metablicos y condiciones de extrema humedad pueden ser desfavorables para el crecimiento de los microorganismos. Sin embargo, no todos los subgrupos microbianos son igualmente afectados por el bajo contenido de humedad en el suelo y rara vez son eliminadas enteramente especies individuales del suelo seco. El agua o es miscible con los hidrocarburos, lo que supone un escollo puesto que dificulta la accesibilidad de la fuente de carbono. En la interfase agua-combustible es donde se observara la mayor actividad puesto que se estar en presencia de los compuestos imprescindibles. Hay como mnimo, 11 Macronutrientes esenciales y elementos Micronutrientes que deben de estar presentes en el suelo en cantidades, formas y porcentajes propio para sostener el crecimiento de las bacterias aerbicas. Estos incluyen N, P,K, NA, S, CA, Mg, Fe, Mn, Zn, y Cu, varios micronutrientes nutricionales son necesarios para sostener a las bacterias anaerbicas incluyendo Nquel, Cobalto, y azufre, por consiguiente la disponibilidad del suelo y la capacidad del suelo de estos macronutrientes deberan ser optimizados para lograr mximos porcentajes de degradacin. La disponibilidad de nutrientes y oxigeno tiene efectos significante

sobre la degradacin de petrleo, en particular los fertilizantes de nitrgeno y fsforo, como tambin oxigeno aceleran la biodegradacin.

La concentracin de fertilizantes orgnicos puede tener un efecto marcado sobre su rata de degradacin. Las altas concentraciones de algunos qumicos pueden conducir a una degradacin ms rpida debido al reducido tiempo de aclimatacin y / o al rpido incremento en la poblacin microbiana. Antes de ser aplicados al suelo el fertilizante debe estar primero solubilizado antes de entrar en contacto con los microorganismos. Este requerimiento esta controlado por la solubilidad del agua, humedad del suelo y solucin lenta en la materia orgnica, absorcin del compuesto en las partculas del suelo, en particular, para la biorremediacion en los suelos se busca mantener una relacin de nutriente de C:N:P de 100:15:3. Algunas fuentes nutricionales como lo son los Nitratos, los fosfatos, el azufre son aportadas por el medio generalmente; Pero en la mayora de los casos hay que complementar alguno de ellos para acelerar la biodegradacin. FUENTES DE CARBONO: Las fuentes de carbono y energa son esenciales para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos, en este caso el mismo hidrocarburo va a hacer la fuente de carbono y de energa, puesto que el petrleo y todos sus derivados son mezcla complejas de compuestos hidrocarbonados de todo tipo. (Aliftico, cclicos, aromticos con enlaces simples y / o dobles). Los ms accesibles a la biodegradacin son los hidrocarburos alifticos de cadena recta ya sean saturados ( sin doble enlace entre los carbonos) u oleofinas ( con doble y Triple enlace entre los carbonos) de cadena media. Los hidrocarburos de la fuente de carbono marcara el xito o el fracaso del proceso. cclicos son de menos accesibilidad debida a la gran estabilidad qumica de su estructura. El consumo

OXIGENO Y DIOXIDO DE CARBONO: El problema radica en que el oxigeno no abunda en las zonas afectadas por vertidos petrolferos debido precisamente a la propia actividad microbiana que consume lo que pudiera haber inicialmente,

y la dificultad que entraa la aireacin natural. La zona donde el oxigeno es muy escaso o inexistentes presenta actividades anaerbicas, muy importante de cara a degradar los compuestos organohalogenados, pero no lo harn hasta degradar los hidrocarburos que son mas accesible a la biodegradacin. El dixido de carbono es el resultado de la respiracin celular, el cual es excretado al medio. Su concentracin se incrementa a medida Que el proceso de biodegradacin avanza, aadiendo un problema adicional puesto que la mayora de los organismos aerobios no soportan ciertas concentraciones del mismo. Todas las tcnicas de remediacin de suelos contaminados con petrleo tratan de mejorar el intercambio gaseoso ya sea inyectando directamente el aire, o extendindolos en grandes superficies y posteriormente arando el mismo para una mejor aireacin, estos dos ltimos recursos lo vamos a aplicar en nuestro caso. 3.*- RUTAS DEL METABOLISMO MICROBIANO. Las rutas catablicas de degradacin de hidrocarburos son en su mayora oxidativas, es decir que requieren la presencia de oxigeno. Una vez dentro de la membrana, los qumicos tales como los productos del petrleo son catabolizados por los microorganismos empleando tres rutas metablicas generales: Respiracin Aerbica, Respiracin Anaerbica y Fermentacin. En la respiracin aerbica los qumicos orgnicos son oxidados a Dixido de Carbono y agua y otros productos finales empleando el oxigeno molecular como el receptor final de electrones. El oxigeno puede ser incorporado dentro de los productos del metabolismo microbiano a travs de la accin de las enzimas oxidadas. En la respiracin anaerbica, en ausencia de oxigeno molecular se usan sustratos inorgnicos como receptores finales de electrones. Aqu el CO2 es reducido a metano, el sulfato a sulfuro y el nitrgeno

molecular a amonio. Los recursos de hidrocarburos son degradados por fermentacin usando el sustrato del nivel de fosforilacin como el acepto final de electrones, de la fermentacin resulta una amplia gama de productos finales incluyendo el CO2, el acetato, el etanol, propianato y butrato.

4.*- BIODEGRADACION Y ESTRUCTURA QUIMICA. Los Vertidos de Petrleo Desde el ltimo tercio del siglo XIX, el petrleo es la energa primaria ms importante a nivel mundial. Prcticamente todas las actividades econmicas se sustentan en el petrleo, de manera que alrededor del 40% de las necesidades energticas mundiales son cubiertas con esta fuente de energa no renovable. En la actualidad, uno de los problemas medioambientales ms preocupantes son los vertidos de petrleo en el mar y la consecuente contaminacin de la costa (Fig. 1) stos se producen como consecuencia de una combinacin de diferentes acciones y circunstancias. En primer lugar nos encontramos con las diferentes operaciones que, de forma rutinaria, se llevan a cabo en los buques, tales como las operaciones de carga, descarga y almacenamiento del fuel. No obstante, el mayor impacto ocurre cuando se producen accidentes como fallos en el casco, encallado de los buques, incendios o colisiones. En estos casos, los derrames aumentan dramticamente hasta cientos de miles de toneladas, producindose las mareas negras y los desastres ecolgicos, culturales y econmicos tanto en el mar como en las zonas costeras que quedan arrasadas (Exxon Valdez (1989), Nakhodka (1997), Prestige (2002)).

Figura 1. Imagen de la costa gallega despus del vertido de petrleo del Prestige en 2002. Fotografa cortesa de Ingrid Salazar.

El petrleo est compuesto por una mezcla de hidrocarburos que pueden agruparse en cuatro clases: saturados, aromticos, resinas y asfltenos (Colwell y Walker , 1977); los cuales, difieren respecto a su susceptibilidad frente a su posible biodegradacin. Teniendo en cuenta que la composicin del petrleo es altamente variable, el riesgo ambiental que suponen los vertidos de petrleo depender de la naturaleza y proporcin de los diferentes componentes de ste. As pues, las caractersticas fsicoqumicas del crudo y su persistencia y biodegradabilidad en un determinado ambiente son de gran inters para evaluar el posible impacto sobre el ecosistema de un determinado vertido. El impacto ecolgico de un vertido accidental de petrleo incluye efectos tanto a corto como a medio y largo plazo. Cuando tiene lugar un vertido de petrleo, ste puede ser dispersado y degradado de manera natural al cabo de varios aos. Diversas investigaciones realizadas tras accidentes de estas caractersticas han puesto de manifiesto que la eliminacin natural es muy lenta y los depsitos de petrleo permanecen durante muchos aos; de manera que, la recuperacin de los ecosistemas afectados puede llevar mucho tiempo. Este hecho ha determinado que, lo largo del tiempo, se hayan ido desarrollando numerosas estrategias con el objetivo de paliar los

efectos de una contaminacin por vertidos de petrleo y acelerar el proceso de recuperacin de los ambientes daados. Una posibilidad es usar una combinacin de mtodos fsicos y qumicos los cuales son especialmente tiles en situaciones graves; aunque, pueden ser procesos caros cuando la zona afectada es muy extensa. Otra alternativa es la utilizacin de mtodos biolgicos que implican la utilizacin de microorganismos, bacterias, hongos o levaduras, ya sean en cultivo axnico o en forma de consorcios. El trmino que se utiliza para definir este tipo de mtodos es la biorremediacin (Atlas., 1981; Korda et al., 1997; Swannell et al., 1996). Efecto de los Factores Ambientales sobre la Biodegradacin de Hidrocarburos. Muchos de los ambientes marinos susceptibles de ser contaminados como consecuencia de los vertidos de petrleo pueden considerarse ambientes extremos, ya que se caracterizan por estar sometidos a condiciones ambientales extremas, tales como bajas o altas temperaturas, pH cido o alcalino, concentraciones salinas elevadas y/o elevadas presiones. Por lo tanto, en estos casos, los microorganismos adaptados a crecer bajo estas condiciones juegan un papel importante en la biorrecuperacin de los ambientes contaminados. Temperatura. La temperatura es un parmetro fundamental a considerar en la biorremediacin in situ, ya que tanto la biodisponibilidad como la solubilidad de los compuestos ms hidrofbicos dependen de este parmetro. Un incremento de temperatura provoca un descenso de la viscosidad y, por tanto, afecta al grado de dispersin y al aumento de las tasas de difusin de los compuestos orgnicos. Adems, las bajas temperaturas impiden la volatilizacin de alcanos de cadena corta (<C10), por lo que aumenta su solubilidad en la fase acuosa y su toxicidad, lo cual puede ralentizar el proceso de degradacin. En comparacin con los ecosistemas mesoflicos, hay pocos ejemplos de biorremediacin de lugares contaminados sometidos a bajas temperaturas.

El umbral para una degradacin significativa es de 0C (Siron et al., 1995). Se han caracterizado diversos microorganismos adaptados a las bajas temperaturas, capaces de degradar hidrocarburos (Whyte et al., 1996, 1998; MacCormack y Fraile, 1997; Margesin y Schinner, 1999; Foght et al., 1999). De la misma manera, a temperaturas elevadas, como por ejemplo en las zonas litorales de regiones semiridas, tambin se han encontrado microorganismos termfilos, que poseen un determinado potencial para la conversin de hidrocarburos (Mller et al., 1998; Chen y Taylor, 1995, 1997a, 1997b). pH. La mineralizacin de hidrocarburos se ve favorecida a pHs prximos a la neutralidad. En algunas bacterias hetertrofas acidfilas se ha demostrado la adquisicin y expresin de genes que codifican enzimas implicados en la degradacin de hidrocarburos aromticos (Quentmeir y Friedrich, 1994). Respecto a los microorganismos alcalfilos, se sabe que producen una serie de enzimas extracelulares interesantes desde el punto de vista industrial, pero la informacin sobre su capacidad de degradar hidrocarburos es limitada (Kanekar, 1999). Salinidad. Hay una relacin inversa entre salinidad y biodegradacin de hidrocarburos de petrleo (Ward and Brock, 1978). Se ha visto, que a concentraciones salinas superiores al 2,4% (p/v) de NaCl, el efecto inhibidor es mayor para la degradacin de fracciones aromticas y polares que para la fraccin saturada (Mille et al., 1991). No obstante, se conocen microorganismos capaces de oxidar hidrocarburos a una concentracin salina del 30% (p/v) de NaCl (Kuznetsov et al., 1992; Kulichevskaya et al., 1992). Presin.
Contaminantes con densidades mayores a la del agua de mar pueden hundirse

hasta llegar al fondo marino, donde la presin hidrosttica es elevada. La combinacin de presin elevada y baja temperatura en el ocano profundo provoca una baja actividad microbiana (Alexander, 1999). Por ejemplo, la tasa de biodegradacin de un consorcio aislado del fondo marino era unas 10 veces inferior bajo condiciones de ocano profundo que a presin ambiental (Schwarz et al., 1975).

Oxgeno. La eficiencia de los procesos de biodegradacin aerbicos depender de la temperatura, ya que la solubilidad del oxgeno depende de sta. Los pasos iniciales del catabolismo de hidrocarburos alifticos, cclicos y aromticos por parte de bacterias u hongos implican la oxidacin del sustrato mediante oxigenasas, que requieren oxgeno molecular. Normalmente, no existen condiciones limitantes en la superficie de la columna de agua o en las capas superficiales de los ecosistemas bentnicos marinos. Sin embargo, con la profundidad, el sistema se vuelve anxico. Tradicionalmente, se ha considerado que la biodegradacin anaerbica de hidrocarburos tiene lugar a tasas despreciables, y que, por lo tanto, la importancia ecolgica es limitada. No obstante, posteriores investigaciones han puesto de manifiesto la trascendencia de las rutas catablicas anaerbicas en la biorremediacin (Harayama et al., 2004; Van Hamme et al., 2003). Nutrientes. Cuando hay un vertido de petrleo en ambientes que presentan una baja concentracin de nutrientes inorgnicos se suelen producir elevados cocientes C:N y/o C:P, los cuales son desfavorables para el crecimiento microbiano. Es bien conocido que la disponibilidad de N y P limita la degradacin microbiana de hidrocarburos. De esta manera, el ajuste de estas proporciones mediante la adicin de los nutrientes en forma de fertilizantes oleoflicos estimular la biodegradacin (Swannell et al., 1996). El conocimiento de las condiciones ambientales que caracterizan el ecosistema que ha sido contaminado es un paso imprescindible a la hora de disear una estrategia de biorremediacin que permita recuperar la zona afectada por el vertido con xito. No se tiene un profundo conocimiento sobre los microorganismos degradadores de hidrocarburos y los procesos biolgicos que estn involucrados en la recuperacin de los ambientes marinos contaminados. No obstante, se han utilizado diversos mtodos, como por ejemplo la adicin de nutrientes para estimular las poblaciones microbianas naturales capaces de degradar hidrocarburos, o la bioaumentacin o introduccin de microorganismos o agrupaciones de stos, los

cuales han supuesto un incremento de la velocidad de biodegradacin. En cualquier caso, la evaluacin de la eficiencia de las diversas aproximaciones de biorremediacin ha puesto de manifiesto la importancia de los microorganismos degradadores indgenas, ya que estos se han mostrado ms efectivos que los degradadores inoculados (Radwan et al., 1995; 2000; Margesin y Shinner, 1997). 2. Biorremediacin de hidrocarburos La descomposicin microbiana de hidrocarburos es de considerable importancia econmica y ambiental por los perjuicios que ocasiona. Una de las principales causas de contaminacin del ambiente son los derrames de petrleo, tal como ocurri en marzo de 1989 cuando el superpetrolero Exxon Valdez choc con varios icebergs en el estrecho del Prncipe Guillermo en Alaska, derramando 11 millones de galones de petrleo en el agua ocasionando un impacto ecolgico inimaginable cuyo gasto de limpieza se estim en (U$ 1500 millones). Los hidrocarburos varan en su habilidad de ser degradados, los derrames de estos en el agua tienden a formar lminas en la superficie en donde el viento y el oleaje crean microscpicas emulsiones. Esto permite que los microorganismos predominantemente bacterias (pseudomonas, corinebacterias y micobacterias), algunas levaduras y hasta algas verdes tengan una mayor superficie de contacto con la partcula, facilitando el acceso a la misma y permitiendo su degradacin. Pero la biorremediacin en el agua se ve afectada por la disponibilidad de nutrientes debido a que estos generalmente se encuentran en bajas concentraciones, por lo que generalmente tras un derrame se adiciona fsforo y nitrgeno como forma de estimular el crecimiento de los microorganismos que potencialmente degradarn el hidrocarburo. En el caso de que el derrame sea en el suelo el proceso es diferente, la oxidacin es llevada a cabo por hongos y bacterias y el movimiento del hidrocarburo es ms vertical, adems el proceso de humificacin tiende a atrapar el residuo hacindolo ms persistente. En este caso el factor limitante no est en la disponibilidad de nutrientes sino que la disponibilidad de oxigeno es baja, por lo que se debe airear el

suelo o agregar perxido de hidrogeno (H2O2) para mejora el proceso. En los derrames, la fraccin de hidrocarburo ms voltil es evaporada con facilidad dejando a los componentes alifticos y aromticos para ser oxidado por diversos grupos de microorganismos. En experimentos llevados a cabo tras los derrames de petrleo se demuestra que el nmero de bacterias oxidantes aumenta de 10 3 a 106 veces poco despus del mismo y en condiciones favorables ms del 80 % de los componentes no voltiles son oxidados entre 6 meses y un ao del derrame. Algunas fracciones, como los hidrocarburos de cadena ramificada y los policclicos, permanecen mucho ms tiempo en el ambiente principalmente si llegan a zonas anaerobias ocasionando perjuicios a largo plazo. 3. Biorremediacin de Hidrocarburos Aromticos Poli

nucleares Los hidrocarburos aromticos polinucleares (HAPs) constituyen un grupo de contaminantes considerado de estudio prioritario debido a sus propiedades mutagnicas, txicas y cancergenas. En los ltimos aos la acumulacin de estos a ido aumentado (Menzie et al., 1992). Una gran variedad de estos compuestos orgnicos no voltiles pueden ser encontrados en el petrleo contaminante de suelo en donde los niveles de estos varan, pero generalmente altas concentraciones pueden ser encontradas en los derrames de hidrocarburos.

El suelo tiene la capacidad de absorber estos compuestos y muchos son volatilizados en la atmsfera, pero son los microorganismos los principales degradadores de estos compuestos (Crawford et al., 1993).

Los HAPs consisten en 2 o ms anillos bencnicos ya sea en forma simple o mltiple formando cadenas o racimos y cuanto ms anillos tenga el compuesto ms resistente ser a la actividad enzimtica, (ver tabla 1. donde se describen las caractersticas fsicas de los HAPs). Lee and Ryan (Atlas, 1981) not que la biodegradacin del naphtaleno (2 anillos) era ms de 1000 veces superior que la del benzopireno (5 anillos), en general estructuras conteniendo 4 o ms anillos son difciles de degradar. Los estudios de degradacin de los HAPs comenzaron hace ms de 80 aos cuando Sohgen and Stormer aislaron bacterias capaces de degradar compuestos aromticos usndolos como fuente de carbono (Atlas, 1981). En ambientes acuticos los principales gneros de bacterias y hongos hallados son los siguientes, Pseudomonas, Achromobacter, Arthrobacter, Micrococcus, Nocardia, Vibrio, Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flabobacterium, Candida, Rhodotorula y Sporobolomyces. En investigaciones realizadas en el suelo mostraron que 11 gneros de hongos entre los que se destaca Phanerochaetes chrysosporium que es considerado un microorganismo prometedor debido a la produccin de lignasa con alto potencial de degradar compuestos insolubles de alto peso molecular y 6 de bacterias fueron los grupos dominantes en la degradacin de HAPs.

La degradacin bacteriana de estos compuestos normalmente envuelve la formacin cis, dihydrodiol observado por la formacin de un dicido como el cido cis,cis-mucnico mientras que en eucariotas como los hongos la oxidacin da la

formacin de trans,dihydrodiol, en ambos casos un diol es un intermediario indispensable (Alexander, 1977). Cerniglia y Heitkamp (1989) han sugerido los siguientes principios aplicados a la degradacin de los HAPs. Una gran variedad de bacterias, hongos y algas tienen la habilidad de degradarlos. 1) La hidroxylacin de los HAPs envuelve la incorporacin de oxigeno molecular. 2) Los microorganismos procariotas metabolizan los HAPs con un ataque inicial de una dioxigenasa para dar cis,dihydrodiol que adems es oxidado para formar dihydroxidos. 3) HAPs con ms de 3 anillos de benceno no sirven como sustrato para el crecimiento bacteriano lo que hace que deba estar sujeto a una transformacin cometablica. 4) Muchos de los genes son codificados por plsmidos. 5) HAPs de bajos pesos moleculares como el naftaleno son degradados rpidamente mientras que aquellos de alto peso como el anthraceno o el benzopyreno son ms resistentes. 6) La biodegradacin ocurre con mayor eficiencia en la interfase sedimento/agua. 7) La adaptacin microbiana puede ocurrir por continuas exposiciones a los HAPs. ltimamente se han desarrollado tcnicas de compostaje como forma de biorremediacin.

Dado que si los microorganismos son capaces de degradar compuestos txicos en la naturaleza es de esperar que estos hagan lo mismo en un laboratorio bajo condiciones optimas. Este tratamiento consiste en la formacin de un barro con el material contaminado y agua.

Parmetros fsicos de los 16 HAPs de mayor prioridad segn USEPA. (PM=peso molecular, PF=punto fusin (C), PE=punto ebullicin (C), S=solubilidad
Nombre Naftaleno Acenaftileno Acenafteno Fluoreno Fenantreno Antraceno Fluoranteno Benzo(jk)fluoreno 1,2-Benzacenafteno Pireno Benzo(a) antraceno Criseno Benzo(b) fluoranteno 3,4 Benzofluoranteno Benceno(e) acefenantrileno Benzo(k) 8,9 Benzofluoranteno 5 C20H12 252.32 163- 165 0.0014 Benzo(def)fenantreno 1,2-Benzantraceno 1,2-Benzofenantreno 4 4 4 4 C16H10 C16H10 C18H12 C18H12 202.26 202.26 228.29 228.29 107- 384 110 156 0.206 1,8-Etilennafteno 2,3-Bencindeno Sinnimo N de anillos 2 3 3 3 3 3 Formula C10H8 C12H8 C12H10 C13H10 C14H10 C14H10 PM 128.17 152.20 154.21 166.22 178.23 178.23 PF 80 8083 9396 115 PE 218 280 279 293 S 31.7 3.8 1.685 1.00 0.0446

100- 340 101 216 340

393- 0.123 404 0.0094 0.0018

157- 438 155 254 448

fluoranteno Benzo(a)pireno

11,12-Benzofluoranteno Benzo(def)criseno 3,4-Benzopireno

5 5

C20H12 C20H12

252.32 252.32

217 179

480 495

0.0038

Dibenzo(ah) antraceno Benzo(ghi) perileno Indeno(1,2,3-cd) pireno o-fenilenpireno 6 C22H12 276.34 180- 177 1,2,5,6-dibenzantraceno 1,12-Benzoperileno 5 6 C22H14 C22H12 278.35 276.34 266 524 0.0006 0.0002

279- 510 277

El tratamiento se efecta en un biorreactor donde se realiza el proceso en forma controlada, es decir se suministra nutrientes, se inocula con los microorganismos deseados, se mantiene en aireacin continua, as como el mantenimiento del pH y la temperatura. En experimentos en la Universidad de Helsinski con compostaje de suelos contaminados con clorofenol se observ una descontaminacin de los mismos. La concentracin de clorofenol fue reducida de 212 mg Kg -1 a 30 mg Kg -1 durante 4 meses de compostaje ( Valo and Salkijona-Salonene, 1986), adems se observ que el proceso de descomposicin se aceleraba si se inoculaba con Rhodococcus chlorophenolicus. El ambiente que se genera en el compostaje est caracterizado por elevadas temperaturas (>50C), alta concentracin de nutrientes, suficiente oxigeno y un pH neutro. La Shell Research Ltd. deline diferentes factores que limitan la degradacin de hidrocarburos en el suelo (Morgan and Watkinson, 1989). La optimizacin de esos factores puede ser llevada a cabo por un a buen compostaje. Williams and Keehan (1993) indicaron que los microorganismos que

degradan contaminantes no difieren significativamente entre el suelo y el compostaje. Sin embargo la potencial transformacin vara por diferentes razones. Primero, la elevada temperatura que se genera en el compostaje incrementa la cintica enzimtica que envuelve el proceso. Segundo, la oportunidad para la cooxidacin puede ser aumentada debido a la variedad de sustratos presentados. Tercero, las modificaciones en el microambiente fsico y qumico del compostaje

pueden

servir

para

aumentar

la

diversidad

microbiolgica.

Finalmente, las altas temperaturas aumenta la solubilidad y la transferencia de masa, esto hace que sea ms metabolizado por los microorganismos. Las altas temperaturas son el factor ms determinante en el ambiente del compostaje, esto se debe a que la presin de seleccin sobre las bacterias se ve intensificada por el aumento de temperatura. Finstein, report que en compostajes con temperaturas superiores a 61C .las especies bacterianas decaen drsticamente (Racke and Frink, 1989). Bajas poblaciones a altas temperaturas en compostaje de suelo con petrleo han sido demostradas por estudios en la Mankato State University (Goetz, no publicado). Tanto bacteria termfilas gram positivas como negativas son capaces de degradar hidrocarburos tal como el gnero Thermomicrobium y muchos de los termfilos estn obligados a metabolizar hidrocarburos. Se ha descubierto una bacteria termfila Bacillus licheniformis HA1, el cual es muy efectivo para iniciar el compostaje. Su rol sera de prevenir la cada del pH en estadios tempranos del compostaje y permitira el desarrollo de otros termfilos contribuyendo entonces con la descomposicin de la materia orgnica en fase termfila del compostaje. (Kiyohiko et al., 1994)

Para poder utilizar los hidrocarburos como fuente de carbono, es necesario en primer lugar la oxidacin de los mismos para obtener el correspondiente cido graso, para ello hay dos mecanismos en funcin del tipo de microorganismos, como se muestra en la figura 1, en ambos casos se obtiene un cido graso, el cual puede seguir tres vas distintas:

.- Incorporacin a los lpidos celulares. .- Degradacin para la obtencin de energa .-Obtencin de intermediarios para sntesis de azcar a travs del acetilCoA

Pa ra la obtencin de energa y sntesis de azcar, los cidos grasos han de

transformarse en acetilCoA y entrar al Ciclo de Krebs y esto se lleva a cabo a travs de la llamada Beta-oxidacin de los cidos grasos.

En el caso de los Hidrocarburos Aromticos, mucho menos accesibles a los microorganismos, una primera insercin de oxigeno molecular conduce a la formacin del acido Protocatequico o de Catecol de manera que la accin posterior de oxigenasas especificas conducen a la ruptura de l anillo aromtico. Una vez obtenidos los intermediarios difenolicos, esos sufren un a serie de transformaciones conduciendo finalmente a la formacin de acetilCoA y acido Succnico que se oxidan en el ciclo de los cidos Tricarboxilicos o ciclo de Krebs.

figuras 3

El potencial de degradabilidad de los hidrocarburos del petrleo puede ser generalmente estimado basado en la estructura de los qumicos que componen al tipo de petrleo. De los varios componentes del petrleo, los n - alcanos y los alquiaromaticos entre C10 y C22 son generalmente considerados los menos txicos y los ms biodegradables, los componentes en el intervalo C5 a C9 pueden presentar toxicidad de tipo de solvente a la membrana de los microorganismos; sin embargo a bajas concentraciones son biodegradables.

En aguas y suelos impermeables probablemente la mayor parte se pierde por volatizacion ms que por biodegradacin. Los hidrocarburos aromticos tambin son biodegradables, aunque lo son menos en la medida que aumentan el numero de anillo aromticos. Los alcanos, los alquiloaromaticos y los aromticos por encima del C22 presentan baja toxicidad pero sus caractersticas fsicas, incluyendo su baja solubilidad en agua y su estado solid a temperatura optima de 35 grados centgrados desfavorecen su biodegradabilidad Los sistemas aromticos y cicl parafnicos particularmente aquellos con cuatro o mas anillos, tales como Benzo (a) Pyreno (a) y el benzo(a) antraceno, as como otros componentes de la cera, el bitumen y los asfaltos se consideran como los componentes mas biodegradables del petrleo. La presencia de enlaces dobles aumenta la resistencia de la biodegradacin, la presencia de algunos grupos funcionales en la cadena de hidrocarburos o en el anillo aromtico pueden disminuir o aumentar la tasa de bioconversion: Grupos funcionales como el Nitro y el Sulfo retardan la actividad, mientras que los grupos hidroxilo, metoxilo y carboxilo favorecen la degradacin. En general la presencia de dos grupos funcionales en un anillo bencnico disminuye la facilidad de degradacin.

La biodegradacin de los productos del petrleo es generalmente descrita por la ecuacin siguiente: Producto del petrleo + Bacterias + O2 + Nutrientes
+ H2O

Co2

+ Derivados + Biomas

4.*-DESCRIPCION DEL PROYECTO A NIVEL DE CAMPO Los desecho slidos contaminados con hidrocarburos generados durante la perforacin de los pozos de Desarrollo o Prospectivos en el proyecto De Petrozuata y /o Sicor que son descartados por equipos de control de slidos, sern transportados al rea escogidas para tal fin, estos se mezclaran con un Compost orgnico, el cual tiene la propiedad de ser un gran absorbente rico en micro y macro nutrientes, adicional a una gran carga de materia orgnica. Este tendr la funcin de aportar al desecho la energa necesaria para el crecimiento microbiano, esta fase inicial es efectiva para eliminar compuestos orgnicos que contiene altas concentraciones de compuestos voltiles, adicional a lo anterior aumenta la permeabilidad del suelo, mejora la transferencia de oxigeno, la textura, se suministra un recurso de energa para el establecimiento rpido de una gran poblacin bacteriana necesaria para inicial el proceso biodegradativo. La Relacin de Slidos Petrolizados y Compost es de 1: 0.5

Los ripios una vez mezclados sern esparcidos en parcelas de 20 x 20 metros, (o con otro diseo mayor a definir.) Impermeabilizadas con una solucin de bentonita y sobre esta capa de arcilla una cubierta de polietileno para evitar la lixiviacin de fluidos. Con una altura de 30 centmetro ( similar a la capa arable del suelo e ideal para

la mecanizacin a travs del rastreo ) El volumen total de cada parcela ser de aproximadamente de 122 metros cbicos, esto sern bordeadas con pacas de heno introducidas 15 centmetro en el suelo par una mayor estabilizacin de las parcelas. En temporada de lluvia las parcelas sern recubiertas con membranas de polietileno para controlar la humedad. El monitoreo continuo indicara la necesidad de incorporar nutrientes: Nitrgeno, fsforo, Potasio, esta operacin se har por aspersin previa solubilizacion de los mismos. La aireacin en las parcelas ser a travs de mecanizacin que permitirn mantener los niveles de oxigeno y remover el dixido de carbono que permitan la finalizacin del proceso de biodegradacin. En el mismo orden de ideas se incorporara algn material acelerador del proceso, de ser necesario. Luego del procedimiento de mezcla se iniciara el monitoreo analtico regular, recomendado para este tipo de tratamiento, el cual se detalla mas adelante.

5.*- METODOLOGIA DE ANALISIS. Se tomaran muestra de suelos del rea total donde de disearan y construirn las parcela de biorremediacion y se le efectuaran las pruebas clsicas, de lixiviado o percolacin y otras edafologicamente hablando, en el laboratorio de suelos de cualquiera institucin certificada. Una vez realizada la extensin en las parcelas se iniciara el proceso de monitoreo continuo cada 15 das de la mezcla, el cual

contempla: Relacin carbono/oxigeno (C/N), Fsforo, Potasio Anlisis de SARA (Saturados, Aromticos, Resinas, Asfltenos), Respirometria, Conteo en placas, Poblacin bacteriana., Cromatografa de gases, esta se har solamente al inicio y al final de la operacin ( Ver tabla 1 y 2 ).

El establecimiento de la relacin Carbono/Nitrgeno es necesario para facilitar el proceso de biorremediacion, toda vez que un balance inadecuado de estos componentes puedan general variables negativas al proceso y a las bacterias involucradas en el mismo. Cabe destacar que un contenido excesivo de nutrientes como el nitrgeno y el fsforo as como su dficit a afecta globalmente a todo el proceso. Los microorganismos requieren un balance adecuado de nutrientes al igual que el suelo o sustrato donde estas se desarrollan. La determinacin de las fracciones de aromticos, resinas, saturados y asfltenos en el desecho se efectuara a travs de la cromatografa de gases, la cual permite la separacin, aislamiento e identificacin de compuestos individuales en la matriz del desecho. Esta determinacin permitir establecer la facilidad con que contaran las bacterias para metabolizar las cadenas de hidrocarburos es decir el grupo saturado por Ser de cadena mas lineales son los primeros y mas fciles de atacar por las bacterias rpido. degradadotas, si se consigue mayores cantidades de saturados y aromticos en el desecho se podr esperar un proceso de degradacin mas efectivo y

La respirometria a travs de esta prueba se puede cuantificar la cantidad de CO2 producido por las bacterias contenidas en el medio, indicando la actividad microbiana del mismo. Ambas son directamente proporcionales, es decir, a mayor concentracin de bixido de carbono mayor cantidad de masa microbiana. L a prueba consiste en atrapar el CO2 producido por la respiracin de las bacterias en una trampa

de KOH, el cual es valorado contra el HCL y se calcula su concentracin. Luego se efecta las Pruebas de anlisis de colonia para su clasificacin bioqumica y enzimtica, si este proceso de clasificacin no permite una identificacin clara se realiza la misma por mtodos automatizados en tiras de identificacin. La bsqueda va enfocada a la clasificacin de diferentes tipos de especies y gneros, entre ellos: Ancinelobacter, Actinomicetos, Pseudomonas. Entre otras.

7.*- TECNICAS DE MUESTREO El plan de muestreo propuesto involucra la toma de muestras por parcelas de forma compuesta lo que asegurara la representatividad de la misma. De igual modo se pretende formar dentro de la parcela transectas de puntos que permitirn detectar si el proceso se esta llevando a cabo de forma uniforme en toda el rea ocupada. Las

muestras sern captadas de forma similar en cada etapa del muestreo a fin de poder realizar comparaciones validadas en cuanto a la variabilidad de sus componentes. Una vez que se establezca la uniformidad los puntos sern tomados al azar. Las muestras sern captadas con la ayuda de un barreno midiendo en cada punto la profundidad de loa toma. Las muestras puntuales sern mezcladas en una vasija de acero inoxidable, previamente curada en el campo, y sern debidamente envasadas en vidrio de tal manera que se evite la perdida por porosidad de los envases plsticos y debidamente etiquetados con la siguiente informacin: .- Numero de Parcela. .- Profundidad Promedio de la Toma. .- Cantidad de Muestras Puntuales Mezcladas. .- Fecha. .- Hora. .- Supervisor Responsable. De igual modo se llevara una planilla de registros de campo donde se indique cualquier observacin que pudiese interferir con los resultados que se obtengan bien sea de forma positiva o de forma negativa. Las muestras sern llevadas al laboratorio para realizar los anlisis antes descritos para evaluar el avance del proceso.

8.*- UTILIZACION DE LOS SUELOS BIORREMEDIADOS. El estudio de fertilizacin de los suelos se efecta con la finalidad de establecer si sus caractersticas fisicoqumicas son adecuadas para el desarrollo de

cultivo, toda vez

que la cantidad y calidad de la cosecha

estn relacionadas

directamente con las diferentes condiciones que los diversos tipos de suelos ofrecen. El estudio de los desechos generados por la actividad de perforacin petrolera como posible acondicionador del suelo para la siembra, luego de un proceso de biorremediacion de sus componentes txicos conlleva el anlisis como suelo del desecho procesado, cuyas caractersticas involucran un alto contenido de materia orgnica provenientes de los aceites y grasas contenidos en los fluidos de perforacin, contenido de metales pesados en proporciones aceptables, niveles de pH propicios originado por el control de este parmetro en la biorremediacion. Estos procesos de recuperacin involucran. La utilizacin de fertilizantes que permitan proporcionarles al suelo las condiciones necesarias para cumplir con el objetivo propuesto, en funcin de lo anterior, los fertilizantes qumicos nutrientes esenciales son materiales inorgnicos que contienen los y asimilables para la planta. En el en forma concentrada

comercio se encuentran diferentes mezclas de estos fertilizantes con cantidades variables de Nitrgeno, Fsforo y Potasio. .- El Nitrgeno: Favorece el desarrollo de los tallos, ramas y hojas, imprime el color verde oscuro al follaje y estimula un rpido crecimiento de la planta. Una deficiencia marcada de este elemento se manifiesta por que las plantas son pequeas, con hojas pequeas y amarillentas, las hojas inferiores caen prematuramente.

.- El Fsforo: Estimula el desarrollo de las races y favorece la reproduccin de las plantas, su deficiencia se manifiesta en un pobre desarrollo de la misma, con coloraciones broceadas y rojizas en las hojas.

.- El Potasio: Tiene marcada influencia en los procesos vitales de las plantas actuando en la formacin y transporte de los azucares y nutrientes, su deficiencia se manifiesta por un amarillento y quemado de los bordes y punta de las hojas, particularmente en las inferiores. Una vez finalizado el proceso de biodegradacin, se iniciara un estudio del desecho desde el punto de vista de fertilidad, lo cual permitir su utilizacin agronmica: en viveros, regarlas en las sabanas para mejorar la calidad de las mismas etc. Entre las pruebas tenemos: ( Realizado por un laboratorio Certificado ) .- Anlisis fertilidad del suelo intervenido y desechos biodegradables. .- Determinacin de la relacin suelo/Desecho biodegradado en funcin de los resultados Obtenido en el punto (a). .- Esparcimiento de la mezcla segn el criterio seleccionado .- Determinacin de dosis e incorporacin de nutrientes ( de ser necesario ). .- Estudio de germinacin y porcentaje de recuperacin de la capa vegetal. .- anlisis de tejido foliar para determinar los macro y micronutrientes absorbidos o en su defecto contaminates asimilados.

Se emitir un informe por monitoreo, al culminar el proceso se elaborara un informe final, el cual abarcara todas las observaciones y resultados del proyecto con sus respectivas, fotografas, tabulaciones, graficas de datos, planes de control de calidad de los anlisis realizados y conclusiones obtenidas a lo largo del proceso.

ANEXOS

TABLA 1

MONITOREO INICIAL

TIPO DE MUESTRA

TIPO DE ANALISIS

REGULARIDAD DEL ANALISIS

30 a 45 Cmts Proyecto

Cromatografa Anlisis de Lixiviados TPH Y SARA

Inicio y Final del

Desecho sin Compost Proyecto

Cromatografa Anlisis de Lixiviados TPH Y SARA

Inicio y Final del

Desecho + Compost Proyecto

Cromatografa Anlisis de Lixiviados TPH Y SARA

Inicio y Final del

Fuente: Elaboracin Propia

TABLA 2 : Monitoreo Continuo del tratamiento.

TIPO DE MUESTRA ANALISIS

TIPO DE ANALISIS

REGULARIDAD DEL

Mezcla de desecho + Compost de las parcelas ( 9 muestras por parcela) das

Respirometria Conteo de Placas Relacin Carbono-nitrgeno Fsforo, Potasio, Nitrgeno Poblacin Bacteriana Cada 15

Fuente: Elaboracin Propia

Las pruebas fisicoqumicas y bacteriolgicas involucradas en este proceso permitirn determinar el avance del proyecto desde el punto de vista de la eficiencia. La prueba de TPH ( Total de aceites, grasas e hidrocarburos ) se refiere a la cantidad de materia a biodegradar.

9.-*

VALORACION

ECONOMICA

DEL

PROCESO

DE

BIORREMEDIACION DE SLIDOS PETROLIZADOS

DISEO DE UN TRATAMIENTO DE LECHO EN CAMPO

Biorremediacin de Compuestos Xenobiticos

Se denomina compuesto xenobiticos (xeno, vocablo que significa extrao) a aquellos compuestos sintetizados artificialmente por sntesis qumica con fines industriales o agrcolas. Aunque estos compuestos pueden ser semejantes a los compuestos naturales muchos son desconocidos en la naturaleza. As, los organismos capaces incluyen de metabolizarlos herbicidas, no podran existir en la naturaleza!. etc.. Algunos de los xenobiticos ms conocidos son los plaguicidas entre los que se insecticidas, nematicidas, funguicidas,

Dentro de los plaguicidas se encuentran los cidos clorofenoxialquil carboxlicos, ureas sustituidas, nitrofenoles, triacinas, fenilcarbamato, organoclorados, organofosforados. Algunas de estas sustancias pueden actuar como donadores de electrones o como fuente de carbono para ciertos microorganismos. Estos compuestos tienen diferencias en la persistencia en el ambiente pero esa persistencia es aproximada dado que depende de varios factores ambientales como la temperatura, el pH, la aereacin y el contenido de sustancias orgnicas del suelo. Algunos de los insecticidas clorados pueden persistir por ms de 10 aos. Hay que remarcar que en la degradacin de un plaguicida no solo intervienen los microorganismos, sino que tambin puede sufrir volatilizacin, filtracin o degradacin qumica.

Sistemas Bentnicos Estratificados

Los tapetes microbianos son unos ecosistemas naturales donde microorganismos pertenecientes a diferentes grupos fisiolgicos se agrupan en unos pocos milmetros de espesor. En ellos pueden establecerse complejas comunidades microbianas que se estratifican en profundidad, dependiendo de los abruptos gradientes de luz, oxgeno, sulfhdrico y potencial redox que se generan, y de su propia fisiologa; de manera que a nivel macroscpico, pueden observarse una serie de laminaciones de diferentes colores en funcin de la composicin taxonmica que presentan (Cohen et al., 1984; Cohen y Rosenberg, 1989; Stahl y Caumette, 1994). Las capas superficiales consisten en poblaciones fototrficas oxignicas, de cianobacterias y algas eucariotas, principalmente (Fig. 2 A, B, C, D, E). En dichas laminaciones las bacterias heterotrficas consumen materia orgnica y oxgeno. Por debajo de stas, si

las condiciones son adecuadas, se sitan las capas anaerbicas dominadas por bacterias anaerbicas fototrficas (Fig. 2 F) y heterotrficas.

Figura 2. Imgenes de microscopa ptica de contraste de fases que muestran microorganismos fototrficos caractersticos de los tapetes microbianos del Delta del Ebro. A. Amphora eggregia. B. Lyngbya aestuarii. C. Microcoleus chthonplastes. D. Chroococcus sp. un miembro del grupo Gloeocapsa. E. Aphanothece sp. Un miembro del grupo Cyanothece. F. Una nueva bacteria roja del azufre. (A, B, C, E y F, Barra=25 m; D, Barra=50m).

Este tipo de comunidades, debido a su estructura fsica, son capaces de soportar perturbaciones tales como un episodio de contaminacin ocasionado por un vertido de petrleo. Tanto es as que, numerosos estudios han puesto de manifiesto que los tapetes microbianos no slo se desarrollan en ambientes marinos no contaminados; sino que tambin se encuentran en lugares sujetos a una contaminacin crnica. La idea de utilizar los tapetes microbianos para la biorrecuperacin de las zonas litorales contaminadas surgi a raz de diversas observaciones realizadas durante la guerra del Golfo en 1991. Dichos ecosistemas rpidamente cubrieron extensas reas

severamente contaminadas con petrleo y en pocos meses se observ la degradacin de hidrocarburos, tanto aerbica como anaerbicamente. Diferentes investigaciones hablan de la degradacin de hidrocarburos por las cianobacterias (Raghukumar et al., 2001). Adems, se ha visto que tapetes microbianos localizados en zonas litorales contaminadas tienen la capacidad de degradar petrleo, aunque no se han identificado las poblaciones responsables de la metabolizacin de los compuestos de petrleo (Abed et al., 2002; Grtzschel et al. 2002). No hay duda de que las cianobacterias tienen un papel crucial en los tapetes, ya que son los responsables del establecimiento de los gradientes de oxgeno y de la sntesis de materia orgnica que utilizan las bacterias heterotrficas. De todas maneras, no est claro si son las cianobacterias o las bacterias heterotrficas las responsables directas de la biodegradacin de los componentes del petrleo. Diversas investigaciones postulan que las cianobacterias tienen la capacidad de oxidar hidrocarburos. Al-Hasan y colaboradores (1998) mostraron que cultivos no axnicos de Microcoleus chthonoplastes y Phormidium corium aislados a partir de sedimentos contaminados del Golfo de Arabia eran capaces de degradar n-alcanos. Estudios en Oscillatoria sp. y Agmenellum quadruplicatum demostraron su capacidad de oxidar naftaleno (Cerniglia et al., 1979, 1980). Adems, hay otros trabajos que muestran la capacidad de muchas otras cepas de degradar diversos componentes del petrleo (Yan et al., 1998, Radwan y Al-Hasan, 2000, Raghukumar et al., 2001; Mansy y El-Bestway, 2002). Sin embargo, en la mayor parte de estudios realizados con cianobacterias no est claro si los cultivos utilizados son axnicos. En este sentido, se han realizado diversas investigaciones donde las bacterias heterotrficas asociadas a las cianobacterias son las responsables de la biodegradacin. Estos autores postulan que las cianobacterias por s mismas no seran las responsables directas de la degradacin de los componentes del petrleo, pero probablemente juegan un papel esencial indirecto soportando el crecimiento y la actividad de los verdaderos degradadores (Abed et al., 2005; Sorkhoh et al., 1995). De todo lo expuesto se deduce el inters de estudiar la diversidad de los microorganismos indgenas de los tapetes microbianos, tanto para determinar el Impacto de un episodio de contaminacin sobre las comunidades naturales, como para identificar los organismos que juegan un papel clave en los procesos de biodegradacin. La utilizacin del medio ambiente como laboratorio es demasiado

costosa en trminos ecolgicos. As pues, es necesario disear sistemas modelo en el laboratorio, tipo microcosmos, que mimeticen las condiciones ambientales del ecosistema natural y permitan evaluar el efecto de los contaminantes (Pritchard y Bourquin, 1984).
Aproximacin Experimental: Microcosmos

Los microcosmos utilizados en los experimentos de laboratorio son modelos miniaturizados con mltiples componentes, que permiten comprender las relaciones que se establecen entre las poblaciones microbianas, as como la funcin de stas en el ecosistema cuando tiene lugar un episodio de contaminacin (Fig. 3). Estos sistemas, adems de los resultados cualitativos, permiten obtener resultados cuantitativos respecto al comportamiento del contaminante en el medio.

Figura 3. Microcosmos preparados a partir de los tapetes microbianos del Delta del Ebro. Fotografa cortesa de Marc Llirs.

Un aspecto clave a la hora de considerar si los datos obtenidos a partir del modelo experimental pueden extrapolarse a un suceso real, es el grado de fidelidad con el que cada modelo experimental reproduce el ecosistema original. En este sentido, en los tapetes microbianos se han realizado exhaustivos trabajos que presentan una descripcin cualitativa y cuantitativa de este tipo de comunidades, cuya formacin ha sido inducida en el laboratorio, en los cuales se concluye que tanto la estructura bsica como los principales componentes de la biota no se alteran significativamente (Fenchel, 1998a, 1998b, Fenchel y Khl, 2000; Khl y Fenchel, 2000).

Adems, a la hora de disear un experimento utilizando microcosmos, es importante incluir controles apropiados para separar la biodegradacin real de diferentes procesos abiticos tales como la evaporacin de los hidrocarburos, la lixiviacin o la alteracin fotoqumica que pueden ser responsables de la desaparicin de una cantidad importante de diversos hidrocarburos. Para demostrar la utilidad potencial de una tcnica de biorremediacin, un aspecto importante es documentar la degradacin del contaminante en condiciones controladas de laboratorio. Adems de comprobar la eficacia del tratamiento, tambin es muy importante ver que ste no tiene efectos colaterales adversos sobre el ecosistema. Los parmetros comnmente analizados para evaluar la respuesta de los microorganismos frente a una contaminacin por petrleo son los recuentos de microorganismos, ya sea mediante la tcnica del nmero ms probable (MPN), mediante microscopa de fluorescencia o a travs del recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos capaces de crecer en placas de medio selectivo, la medida de la respiracin microbiana (consumo de oxgeno o produccin de dixido de carbono) y la determinacin de la velocidad de degradacin en comparacin con los controles no tratados. Estas tcnicas, a excepcin de los recuentos directos al microscopio, estn limitadas por los problemas asociados a los microorganismos no cultivables, hacindolas inadecuadas para evaluar la estructura de la comunidad de los ambientes afectados. Por lo tanto, la realizacin de un estudio fiable requiere el uso de mtodos de biologa molecular. Dentro de stos, una de las metodologas ms utilizadas para detectar alteraciones de la estructura microbiana de la comunidad es la DGGE (Muyzer et al., 1993). Dicha tcnica permite separar fragmentos del DNA en funcin de su secuencia. As, por ejemplo, tras la amplificacin de los fragmentos del gen del rRNA 16S y la realizacin del gel de DGGE, se obtiene un perfil de bandas caracterstico que constituye la huella gentica de la comunidad (Fig. 4A). Los perfiles que se obtienen de las diferentes muestras pueden compararse considerando cada banda como un carcter que puede estar presente (1) o ausente (0); de manera que, a partir de estos datos, se puede obtener la matriz de disimilitud. Finalmente, se puede utilizar un

mtodo de agrupacin jerrquico unweighted pair-group method (UPGMA) (Sneath and Sokal, 1973), basado en las distancias euclideas, que permite agrupar las muestras segn el grado de similitud y obtener un dendrograma como el que se muestra en la Figura 4B, el cual ha sido elaborado a partir de los perfiles de bandas que se muestran en la misma figura y forma parte de un estudio realizado con el propsito de analizar los cambios de diversidad asociados a la transformacin de petrleo en microcosmos preparados a partir de tapetes microbianos del Delta del del Ebro (Martnez-Alonso et al., 04) Existen numerosos trabajos sobre biodegradacin de hidrocarburos realizados en microcosmos (Bachoon et a., 2001; Evans et al., 2004). Sin embargo, cuando estos estudios se realizan en tapetes microbianos dicho nmero se ve enormemente reducido. Respecto al diseo de estos sistemas modelo, en la bibliografa hay descritas diversas maneras de prepararlos a partir de una muestra recogida del ecosistema natural mnimamente perturbada. Incluso se han diseado sistemas experimentales especialmente apropiados para el estudio de sedimentos contaminados con petrleo (Musat et al., 2004). En el ao 2001 nuestro grupo de investigacin se involucr en un proyecto europeo multidisciplinario, MATBIOPOL, cuyo propsito era evaluar el potencial biorremediador de los tapetes microbianos sujetos a una contaminacin con petrleo. Uno de los objetivos de dicho proyecto era desarrollar sistemas modelo de los tapetes microbianos en el laboratorio que permitieran el estudio del efecto y la respuesta de este tipo de ecosistema a un vertido de petrleo. Las conclusiones ms destacadas obtenidas por los distintos grupos de investigacin que integraban este proyecto se detallan a continuacin. En primer lugar, los tapetes microbianos desarrollados en el laboratorio muestran un comportamiento similar al observado en el ambiente natural ya que, cuando son cubiertos con petrleo, reaccionan, de manera que a las pocas semanas recubren la pelcula de crudo. Las cianobacterias filamentosas migran hasta la superficie y llegan a constituir una nueva capa bacteriana sobre el petrleo. El petrleo queda atrapado en el tapete entre una capa xica por encima y una anxica por debajo, originndose una situacin favorable para la biodegradacin (Martnez-Alonso et al., 2004).

Tras el contacto con el petrleo se observa un cambio de su estructura

comparada con la perteneciente a los no contaminados. Las cianobacterias producen exopolisacridos que forman una matriz que emulsiona el petrleo y permite el desarrollo de la comunidad degradadora de petrleo. Las bacterias aerbicas son ms activas en la matriz por la accesibilidad a los hidrocarburos y por la elevada produccin de oxgeno por parte de las cianobacterias (Benthien et al., 2004). Respecto a las bacterias fototrficas, est claro que las cianobacterias son los elementos estructurales ms importantes de los tapetes, pero su papel en el ataque de los hidrocarburos todava no est claro (Cohen, 2002). Con referencia a las bacterias hetertrofas, varios grupos bacterianos son seleccionados tras la contaminacin, principalmente el gnero aerbico Marinobacter y algunas bacterias reductoras de sulfato (Bonin et al., 2004; McGowan et al., 2004). En los tapetes microbianos, la degradacin biolgica de los componentes del petrleo bajo condiciones anxicas es lenta y, presumiblemente, altamente selectiva (Bonin et al., 2004; Gorgus et al., 2004). En las capas anxicas, bajo el petrleo, las bacterias reductoras de sulfato son ms eficientes cuando coexisten con las bacterias rojas del azufre, para una mejor, aunque todava lenta biodegradacin (Ranchou-Peyruse et al., 2004). Las interacciones entre las bacterias aerobias y anaerobias en la interfase xica-anxica hace que la biodegradacin sea ms eficiente, pero todava no completamente bien entendida. Diversas molculas pueden ser degradadas eficientemente (alcanos lineales y ramificados, compuestos poliaromticos). Estas molculas pueden ser biodegradadas de manera aerbica por bacterias del gnero Marinobacter (McGowan et al., 2004), y anaerbicamente mediante bacterias desnitrificantes o reductoras de sulfato (Bonin et al., 2004; Gorgus et al., 2004). En resumen, los estudios realizados en el marco de este proyecto ponen de manifiesto la eficiencia de los microcosmos para valorar el impacto de un episodio de contaminacin con petrleo sobre los tapetes microbianos, a la vez que muestran la

importancia que pueden tener estos ecosistemas para una buena recuperacin de las zonas litorales que sufren una contaminacin crnica o puntual.