Ausencia de genotoxicidad del agua de mar de Coveas: estudio in vitro en eritrocitos y leucocitos humanos

Wilmer Soler T.1 Nelly del Carmen Velsquez E.2 Luis Francisco Miranda R.3 Diana Cristina Zuluaga G.3

Resumen
En Colombia y Amrica latina se ha iniciado recientemente el uso nutricional y teraputico del agua de mar natural, por su contenido de minerales y oligoelementos, prctica ya reconocida en Europa desde hace ms de un siglo. Objetivo: evaluar la posible toxicidad del agua de mar de Coveas (costa atlntica colombiana). Materiales y mtodos: se incubaron clulas humanas en agua de mar recogida en Coveas para determinar fragilidad osmtica de eritrocitos, viabilidad celular y dao en el ADN de linfocitos (ensayo cometa); adems, se determin su capacidad antioxidante. Resultados: los eritrocitos en agua de mar presentaron hemlisis significativamente mayor respecto a la observada en amortiguador PBS hipertnico de concentracin similar (4,3 y 2,8% respectivamente, P = 0,00001); sin embargo, la diferencia de los promedios fue muy pequea. La viabilidad celular de los linfocitos en agua de mar fue de 95%, similar a la observada en PBS isotnico. Dicha agua de mar tampoco produjo dao en el ADN de linfocitos humanos, segn los resultados de los promedios del momento de Olive del ensayo cometa. Tampoco present actividad antioxidante ni prooxidante. Conclusiones: segn estos ensayos, el agua de mar obtenida en Coveas present bioseguridad para el consumo humano; sin embargo, se deber evaluar en el futuro la toxicidad de su componente orgnico concentrado y la genotoxicidad en personas que la consuman.

Palabras clave
Agua de mar, actividad antioxidante, genotoxicidad, ensayo cometa

Absence of genotoxicity of sea water from Coveas: in vitro study on human leukocytes and erythrocytes
Summary
In Latin America, Colombia included, the use of natural sea water has been recently introduced for nutritional and therapeutics purposes due to its high content of minerals and oligoelements. This practice has also been used in Europe during the last century. Objective: to evaluate potential toxicity in sea water from Coveas (Colombian Atlantic coast). Methods: erythrocytes and leukocytes were incubated in sea water samples collected in Coveas to evaluate osmotic fragility, viability, and DNA damage (by comet technique). Atioxidant properties of this water were additionally studied. Results: erythrocytes presented a higher index of hemolysis in sea water compared with phosphate buffer (PBS) with a similar hypertonic concentration (4,3% y 2,8% respectively, P=0,00001); however, median differences were very low. Lymphocytes viability in sea water was 95% after one hour of incubation at 4C and it was similar to the percentage observed in isotonic PBS. Sea water did not cause damage on DNA as tested one hour after treatment of lymphocytes according to the Olive moment averages. Sea water did not present any pro-oxidant or antioxidant capacity as tested with the ABTS+ technique. Conclusions: these results suggest that sea water from this area in the Colombian Atlantic cast is bio-safe for human consumption but it is necessary to test concentrated organic fraction and determine in vivo toxic effects.

Key words
Sea water, antioxidant activity, genotoxicity, comet assay

1 Qumico, mster en bioqumica, profesor de la Universidad de Antioquia. Cibercorreo: wsoler@quimbaya.udea.edu.co 2 Biloga de la Universidad de Antioquia 3 Estudiantes de medicina de la Universidad de Antioquia Recibido: 7 de abril de 2005 Aceptado: 31 de octubre de 2005

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Introduccin
El uso nutricional y teraputico del agua de mar en humanos y animales por va subcutnea, intramuscular e intravenosa se inici en Francia al final del siglo XIX, a partir de las investigaciones del fisilogo Ren Quinton, quien la utiliz en cultivo de linfocitos como sustituto de sangre en perros y luego por va subcutnea en humanos para tratar la desnutricin y una amplia variedad de problemas clnicos.1 Su uso se ha fundamentado en el contenido de toda clase de minerales y oligoelementos esenciales para la vida celular, en proporciones comparables a la del plasma sanguneo, presentes en forma de sales, fijados orgnicamente en microorganismos y elementos prebiticos que aumentan su bio-disponibilidad para el transporte intestinal. 2-4 Tambin se ha descrito la capacidad de las bacterias marinas de sintetizar compuestos orgnicos con actividad antibitica, antitumoral, antiinflamatoria, antiviral, etc.5 Estas propiedades han apoyado la hiptesis ms aceptada cientficamente sobre el origen de la vida en el mar y la conservacin de las condiciones de este origen, en el medio interno de los organismos ms evolucionados, segn la tesis de Quinton.2 Recientemente, el uso oral, nasal y tpico ha sido tema de investigacin en algunos pases desarrollados,6-11 lo que ha sido paralelo con el tratamiento y comercializacin con costos muy elevados e inalcanzables para la poblacin general en pases pobres.12 En Colombia y Amrica Latina, donde se conoce muy poco sobre el tema, se ha iniciado desde hace unos cinco aos la ingesta de agua de mar sin tratar, con beneficios para la salud que se han registrado en informes mdicos. El agua se est obteniendo a unos cinco Km de la playa y 10 m de profundidad y, en lugares ms limpios, se obtiene de manera artesanal en recipientes plsticos y a pocos metros de las playas. Dados los problemas de contaminacin domstica por falta de tratamiento de las aguas servidas y los residuos orgnicos de la agroindustria que llegan al mar, en lugares que adems son tursticos y que a veces carecen de alcantarillados es importante iniciar investigaciones sobre los posibles efectos txicos del agua de mar para la clula, de tal manera que se estimule esta prctica o se le introduzcan correcciones. El ensayo cometa, una prueba muy sensible para medir dao del ADN, se ha utilizado para evaluar la calidad de aguas para consumo humano, toxicidad de productos naturales y estudios de biomonitoreo.13 En este estudio se evalu la viabilidad y el dao en el ADN de linfocitos humanos y se determin la fragilidad osmtica de eritrocitos expuestos a agua de mar obtenida de Coveas (departamento de Sucre), a 5 Km de la playa y 15 m de profundidad.

muestras de agua de mar, cada una en da diferente, con un cilindro de aluminio, en una estacin de muestreo ubicada en el golfo de Morrosquillo, costa atlntica colombiana, a cinco kilmetros de la lnea costera y a 15 m de profundidad. Las muestras se transportaron en nevera porttil de material termoaislante (poliestireno) a unos 4 C. Se midi la salinidad de cada muestra en un conductmetro Schott LF 513 T y luego se filtr en una membrana de 0,22 m. Control microbiolgico para el agua de mar Se realiz el control microbiolgico del agua de mar fresca (menos de 24 horas de la recoleccin) filtrada y sin filtrar por coloracin de Gram y en medio de cultivo BHI, Agar Mac Conkey II y Agar sangre, segn la metodologa utilizada en el trabajo de grado.14 Ninguna de las muestras de agua de mar analizadas indic la presencia de bacterias terrestres. Prueba de genotoxicidad Para determinar el efecto genotxico del agua de mar en el ADN de linfocitos humanos, se utiliz la tcnica SCGE (single cell gel electrophoresis) o ensayo cometa, segn el protocolo descrito por Singh N. et al.15 Se incubaron en agua de mar a 0,9, 1,6 y 2,3% entre 5.000 y 50.000 linfocitos humanos aislados de sangre total por el mtodo de centrifugacin en un gradiente de densidad de Ficoll.16 Se utiliz como control positivo el perxido de hidrgeno (100 M) y amortiguador fosfato salino (PBS) como control negativo. El tratamiento se realiz durante una hora a 4 C, para evitar la reparacin del ADN, despus del cual, 10 l de suspensin celular se mezclaron con 75 l de agarosa de bajo punto de fusin (LMA) a 37 C; la mezcla se coloc en un portaobjetos que haba sido previamente recubierto con una capa de agarosa de punto de fusin normal. La suspensin celular fue cubierta con un cubreobjetos y mantenida a 4 C durante seis minutos. Luego se retir el cubreobjetos y las lminas fueron sumergidas en una solucin de lisis (NaCl 2,5M, Na2EDTA 100M, TRIS 10m, triton X-100 1% y DMSO 10%) a 4 C durante una hora; luego se llevaron las lminas a una solucin de electroforesis alcalina para permitir desenrollamiento del ADN y expresin de sitios lbiles a lcalis (Na2EDTA 1 M, NaOH 300m, pH 13) a 4 C y por 30 minutos. Luego se realiz la electroforesis durante 30 minutos a 25 voltios y 300 A. Al trmino de la electroforesis, las lminas fueron lavadas con amortiguador neutralizante (TRIS 0,4M, pH 7,5) por 15 minutos y deshidratadas con metanol absoluto. Las lminas fueron teidas con 30 l de bromuro de etidio 2 g/ml y examinadas en un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitacin de 515-560 nm y un filtro barrera de 590 nm, usando una magnificacin de 250X. Para cada concentracin fueron analizadas 50 clulas por triplicado, con un programa computarizado de anlisis de imgenes que permite recolectar datos como longitud de la cola, mo26

Metodologa
Recoleccin de las muestras de agua de mar Se utilizaron parte de las muestras de agua de mar tomadas para el trabajo de grado en biologa Evaluacin de la actividad antibacteriana del agua de mar. 14 Se recolectaron cinco

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mento de Olive, relacin entre la distancia desde el centro de gravedad de la cabeza (CGH) al centro de gravedad de la cola (CGT) y el porcentaje de ADN en la cola %ADNT.17 MO = CGT CGH %ADNT Para el anlisis estadstico se realiz el anlisis de varianzas de bloques completos al azar, en el que cada bloque es un experimento con agua de mar de salinidades de 0,9, 1,6 y 2,3% y los controles positivo (PBS con H2O2) y negativo (PBS isotnico). Se utiliz el paquete estadstico Statgraphic. Prueba de viabilidad Para investigar si los efectos en el ADN estn acompaados por efectos citotxicos, la viabilidad de los linfocitos se determin por exclusin con azul tripano (0,2%) antes y despus del tratamiento. Fragilidad osmtica de los eritrocitos en agua de mar. Se sigui el protocolo descrito por Rosemary et al.18 La sangre heparinizada se centrifug a 700 g durante 10 minutos, se descart el plasma y los eritrocitos se lavaron tres veces con seis volmenes de PBS. Se resuspendieron los eritrocitos en diez volmenes de PBS. Se tomaron 100 l de la suspensin de eritrocitos en 3 ml de agua de mar (diferentes muestras cuyas salinidades estuvieron entre 2,6 y 3,0%), o con PBS a una concentracin de NaCl de 3,0% y se incubaron por 2 horas a 37 C; luego se centrifugaron a 1.500g por 3 minutos y se ley la absorbancia del sobrenadante a 543 nm. Cada muestra de agua de mar y control de PBS de 3,0% se midieron por triplicado. Se realiz anlisis de varianzas de bloques al azar, utilizando el paquete estadstico Statgraphic. Actividad antioxidante total. Se sigui el procedimiento descrito por Re et al.19 La sal ABTS (2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) a una concentracin de 7 mM se incub con persulfato de potasio 2,45 mM (concentracin final) toda la noche en oscuridad y temperatura ambiente, para producir el catin radical libre ABTS+. La solucin de ABTS+ se diluy en PBS, pH 7,4 hasta lograr una absorbancia de 0,70 (+/ 0,02) a 734 nm y equilibrada a 30 C. A 1,0 ml de esta dilucin se le adicion 10 l de agua de mar, trolox (10 M), suero o PBS para el blanco. Despus de mezclar se ley la absorbancia a los minutos 1, 4 y 6 a 734 nm, en un equipo Beckman DU 6. Fuera del equipo, la muestra se mantuvo en la cubeta de lectura en bao a 30 C. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado y se calcul la actividad antioxidante como porcentaje de disminucin de la absorbancia respecto al blanco, debido a la reduccin (decoloracin) del radical ABTS+.

AM: agua de mar con salinidades entre 2,6% y 3,0%, PBS: amor-

tiguador de fosfatos hipertnico al 3,0% de NaCl. Cada muestra se midi por triplicado. Figura 1. Promedios de la fragilidad osmtica de los eritrocitos incubados en cinco muestras de agua de mar y del control en PBS

promedio de 4,3% y poca variabilidad, fue significativamente mayor a la observada con PBS hipertnico de concentracin similar (3,0% de NaCl), con un promedio de 2,8% (P = 0,00001). Sin embargo, debe notarse que la diferencia de FOE entre las muestras de agua de mar y PBS hipertnico fue slo de 1,5%. Los resultado con agua de mar sin filtrar fueron similares a los de la filtrada, e igual ocurri cuando se evaluaron muestras frescas de menos de 24 horas de recogida y muestras viejas de cinco meses de recogidas y almacenada a temperatura ambiente (resultados no mostrados).

Muestras (n): 6 agua de mar, 2 suero y 2 trolox. Cada una por triplicado. Figura 2. Actividad antioxidante total del agua de mar, medida como disminucin de absorbancia por reduccin del radical ABTS+

Resultados
La fragilidad osmtica de los eritrocitos (FOE) (figura 1) incubados en 5 muestras de agua de mar filtrada, con una 27

Como se observa en la figura 2, el agua de mar no present actividad antioxidante, en contraste con la actividad que se obtuvo con el trolox y el suero sanguneo. No obstante, es de destacar que tampoco hubo actividad prooxidante. Los ensayos para detectar diferencias entre muestras frescas y viejas, filtradas y sin filtrar, no indicaron diferencias (datos no mostrados).

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El estudio de citotoxicidad, evaluada por la viabilidad celular de los linfocitos humanos, incubados por una hora en agua de mar filtrada a salinidades de 0,9, 1,5 y 2,2%, fue en promedio de 95% y similar a la observada con PBS isotnico. Los ensayos de genotoxicidad en estas mismas clulas, incubadas a las mismas salinidades de agua de mar, no indicaron dao en el ADN, como se puede observar en las fotografas de la figura 3 y en los valores promedio de momento de Olive (MO) (figura 4). Para estos dos tipos de ensayos de toxicidad se analizaron 150 clulas para cada una de las tres diluciones de agua de mar y por cinco muestras tomadas en das diferentes, con un total de 2.250 clulas evaluadas. No hubo diferencias estadsticamente significativas en el MO, entre los ensayos realizados con las cinco muestras de agua de mar.

C+

Discusin
La ausencia de toxicidad del agua de mar evaluada en la presente investigacin, por las pruebas que miden dao de membrana (FOE y viabilidad celular) y del ADN (ensayo cometa), se corresponden con el resultado obtenido en esta misma investigacin, de ausencia de actividad prooxidante o generadora de radicales libres, que no cambi al evaluar agua de mar almacenada hasta por cinco meses a temperatura ambiente. El rea de Coveas, ubicada en el departamento de Sucre, es un sector turstico que no tiene alcantarillado y las aguas servidas llegan al mar sin ningn tratamiento; adems, desembocan en este lugar caos que recogen contaminantes qumicos de la agroindustria, que se suman a las fugas de petrleo que pueden presentarse por la presencia del puerto petrolero.20 Los efectos de esta contaminacin orgnica dependen principalmente de la cantidad de contaminantes introducidos, pero que son modificados por factores tales como la configuracin del fondo, las mareas y las corrientes, que influyen sobre la difusin de los contaminantes y, en especial, por el catabolismo que realizan los microorganismos marinos sobre este componente orgnico.21 La ausencia de bacterias terrestres, como las coliformes, en las muestras de agua de mar de este estudio, indic el papel controlador realizado por los microorganismos marinos,5 adems del efecto hipertnico del agua de mar sobre bacterias que no estn adaptadas a este medio. Por otra parte, es importante el hallazgo de que el agua de mar fresca o almacenada a temperatura ambiente no present actividad prooxidante; algo posible, dada la presencia de una amplio nmero de sales, minerales y elementos traza, los cuales, segn la concentracin y el estado oxidativo, pueden inducir alteraciones de membrana y del ADN, tal como se ha observado en soluciones o medio que contienen Fe+2 y Cu+ (reaccin de Fenton)22 o por la presencia de compuestos como el Cr(VI) y Cr(V), que presentan una potente actividad carcinognica y que al utilizarse en medios de cultivos de linfocitos decrecen la viabilidad celular. 23 Con respecto a la capacidad oxidativa del agua de mar, se conoce que es una 28

C1

C3

C+ control positivo con H2O2, C control negativo con PBS, C1 con agua de mar al 0,9% de salinidad y C3 con agua de mar al 2,2% de salinidad. Figura 3. ADN de leucocitos humanos incubados por una hora en agua de mar (ensayo cometa)

C+: control positivo de PBS con H2O2 , C-: control negativo de

PBS

Cada barra representa el promedio de 50 clulas por triplicado. Figura 4. Promedios del momento de Olive del ADN (ensayo cometa) de leucocitos incubados en agua de mar a tres salinidades y los controles.

solucin altamente oxidante, de manera que en los elementos qumicos disueltos predominan los estados de mayor oxidacin.24 Sin embargo, en zonas prximas a las costas, los organismos agotan el contenido de oxgeno disuelto y bajan as el potencial de reduccin, por lo que se induce la reduccin de algunos elementos. El cromo se presenta principalmente como CrO4= (VI), en agua de mar aireada, pero pasa a Cr (III), en ambiente de poco oxgeno.24 Es interesante observar que el agua de mar almacenada por meses a temperatura ambiente tampoco cambi su color ni su sabor. El ensayo cometa es una prueba validada mundialmente, por su alta sensibilidad y rapidez en el laboratorio para medir

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dao y reparacin en el ADN de clulas individuales, estudios de genotoxicidad y biomonitoreo;25, 26 tambin se ha utilizado localmente para investigaciones en personal expuesto a contaminantes de los laboratorios27 y en la evaluacin de aguas tratadas con cloro para el consumo humano en el acueducto de Medelln, considerada una de las aguas mejor tratadas en Colombia, y sin embargo, se ha descrito la presencia de efecto genotxico por este tratamiento en el material orgnico aislado y concentrado de esta agua.28 Para darle continuidad a nuestras investigaciones y lograr mayor bioseguridad en el consumo de agua de mar, se debe tambin evaluar la genotoxicidad del material orgnico concentrado del agua de mar y realizar otras pruebas genticas, como intercambio de cromtides hermanas y el ensayo de AMES. Tambin es muy importante realizar estudios de toxicidad en personas que la consumen, incluyendo otras pruebas para medir toxicidad heptica y renal.

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Conclusiones
Los resultados preliminares de nuestra investigacin sugieren que hay bioseguridad en el agua de mar obtenida en Coveas a 15 Km de la lnea de playa, respecto de la posible presencia de agentes qumicos que puedan inducir dao a las membranas celulares o al ADN celular an en condiciones extremas de concentracin hipertnica y apoyan as el consumo actual en humanos y animales. Sin embargo, en investigaciones futuras se debern estudiar muestras de la orilla y concentrar la materia orgnica del agua de mar para detectar la presencia de agentes txicos, como tambin hacer la evaluacin de toxicidad en personas que la consuman. 10.

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Reconocimientos
Se agradece a la Fundacin Aquamaris por el apoyo econmico, a la profesora Mara Elena Mrquez F. de la Universidad Nacional, sede de Medelln, y a su estudiante de maestra, Andrs Pareja L., por la asesora en el laboratorio de biotecnologa animal, donde se realiz este trabajo. 14.

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