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Biotecnología Aplicada a la Identificación y Validación de Dianas Terapéuticas Informe de Vigilancia Tecnológica
Biotecnología Aplicada a la Identificación y Validación de Dianas Terapéuticas Informe de Vigilancia Tecnológica

Biotecnología Aplicada a la Identificación y Validación de Dianas Terapéuticas

Informe de Vigilancia Tecnológica

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Informe de Vigilancia Tecnológica

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS El presente informe de Vigilancia
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS El presente informe de Vigilancia

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología (CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional de la Innovación MADRID+D.

Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboración ofrecida a:

– Dr. Miguel Ángel Piris Pinilla Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)

– Dr. Arcadio García de Castro Andrews PharmaMar

– Dr. Luis del Peso Ovalle Hospital Universitario de la Princesa

– D.ª Rosario Ambite Domínguez Círculo de Innovación en Biotecnología

La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:

Biotecnología aplicada a la identificación y validación de dianas terapéuticas. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM.

Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo.

© Copyright: Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica/Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid.

Autores: Marta López (CIBT) Paloma Mallorquín (CIBT) Ion Arocena (CIBT) José Antonio Mesa (Genoma España) Miguel Vega (Genoma España)

Edición: Silvia Enríquez (Genoma España) Referencia: GEN-ES05009 Fecha: Abril 2005 Depósito Legal: M-51618-2005 ISBN: 84-609-8741-8 Diseño y realización: Spainfo, S.A.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Índice de contenido

• RESUMEN EJECUTIVO

7

1. INTRODUCCIÓN A LA VALIDACIÓN DE DIANAS

8

2. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE DIANAS

11

2.1. Análisis de la expresión génica

11

2.1.1. Análisis serial de la expresión génica (SAGE)

12

2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

13

2.1.3. Microarrays de ADN

13

2.2. Interacciones proteína-proteína

14

2.2.1. Microarrays de proteínas

15

2.2.2. Sistema doble híbrido

16

3. TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS

17

3.1. Modulación de la expresión génica

17

3.1.1. Oligonucleótidos antisentido

17

3.1.2. ARN de interferencia

18

3.1.3. Ribozimas

20

3.1.4. Proteínas de dedos de zinc

21

3.2. Inactivación de proteínas

22

3.2.1. Química genética

22

3.2.2. Anticuerpos monoclonales

23

3.2.3. Aptómeros

24

3.2.4. Péptidos

24

3.2.5. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos

25

3.3. Análisis de la expresión génica in situ

25

3.3.1. Microarrays de tejidos

26

3.3.2. Microarrays de células

26

3.4. Modelos vivos de la enfermedad

27

3.4.1. Ratones knock-out y knock-in

28

3.4.2. Ratones transgénicos

29

3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar

30

3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad

30

3.4.5. Otros organismos modelo

31

3.4.6. Células madre embrionarias

32

3.5. Técnicas bioinformáticas

34

4. ESTRATEGIAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS

37

5. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 40 5.1. Enfermedades que requieren nuevas
5. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 40 5.1. Enfermedades que requieren nuevas

5. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS

40

5.1.

Enfermedades que requieren nuevas dianas

40

5.1.1. Enfermedades neurodegenerativas

40

5.1.2. Enfermedades cardiovasculares

42

5.1.3. Enfermedades psiquiátricas

43

5.1.4. Enfermedades metabólicas

45

5.1.5. Enfermedades autoinmunes

46

5.1.6. Cáncer

48

5.2.

Naturaleza de las dianas terapéuticas para los fármacos actuales

49

6. ENTORNO ECONÓMICO EN LA VALIDACIÓN DE DIANAS

51

6.1. Validación de dianas en el desarrollo de fármacos

52

6.2. Estrategias de implantación de validación de dianas en la industria farmacéutica

54

6.3. Estrategias comerciales en la validación de dianas

55

7. EMPRESAS Y PROYECTOS EN VALIDACIÓN DE DIANAS

58

7.1. Empresas internacionales en validación de dianas

58

7.2. Empresas españolas en validación de dianas

59

7.3. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas

60

8. CONCLUSIONES

61

ANEXOS

65

ANEXO I. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas ANEXO II. Empresas internacionales en validación de dianas ANEXO III. Empresas españolas en validación de dianas ANEXO IV. Principales dianas terapéuticas

65

92

103

111

REFERENCIAS

116

GLOSARIO

119

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Resumen ejecutivo

Las dianas terapéuticas son moléculas localizadas en cualquier parte de la célula, capaces de reconocer un fármaco y producir una respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad. La evaluación de dianas terapéuticas constituye un proceso que incluye las etapas de identificación, caracterización y validación de dianas, siendo este último el paso final en la determinación de la implicación de la diana en el proceso patológico. La secuenciación del genoma humano ha revelado la presencia de un gran número de potenciales dianas terapéuticas, sin embargo, la mayoría de estas dianas no han sido completamente caracterizadas ni se ha establecido su asociación con una enfermedad concreta. Se ha estimado que el número de dianas potenciales terapéuticas se encuentra en torno a 600 y 1.500, no obstante, los fármacos que actualmente se encuentran en el mercado actúan sobre alrededor de 500 dianas diferentes. El reto actual consiste en seleccionar a partir del conjunto de genes del genoma humano aquellos genes que dan lugar a proteínas que pueden llegar a ser dianas terapéuticas.

La tasa de fracaso a lo largo del proceso de investigación farmacéutica es elevada, más del 80% de los proyectos se abandonan durante la fase de descubrimiento anterior a los ensayos clínicos, de modo que sólo uno de cada cinco proyectos consigue iniciar los ensayos clínicos. Una

correcta validación de dianas terapéuticas reduce por tanto el tiempo y coste necesario para el desarrollo de un fármaco eficaz, ya que se evita continuar con los esfuerzos empleados en el desarrollo de fármacos cuyas dianas no han sido validadas adecuadamente. De este modo, la industria farmacéutica conseguiría optimizar sus esfuerzos de I+D orientándolos hacia los proyectos basados en dianas validadas correctamente, con mayores posibilidades de salir adelante.

Las técnicas genómicas y proteómicas que se emplean en la identificación y validación de dianas son de diversa naturaleza, y se emplean generalmente en combinación con otras técnicas complementarias. La identificación de dianas se realiza principalmente mediante técnicas de análisis de la expresión génica o bien mediante el análisis de interacciones proteína-proteína, como los microarrays de ADN y microarrays de proteínas respectivamente. En cuando a las tecnologías relacionadas con la validación de dianas, la modulación de la expresión génica mediante tecnologías antisentido y el empleo de modelos vivos de la enfermedad como los ratones knock-out son las técnicas más relevantes. No obstante, otras tecnologías complementarias como los microarrays de células y tejidos, células madre embrionarias, y técnicas de inactivación de proteínas como CALI/FALI, son alternativas cada vez más empleadas en las etapas de validación de dianas.

1. Introducción a la validación de dianas El presente informe tiene por objeto el estudio
1. Introducción a la validación de dianas El presente informe tiene por objeto el estudio

1. Introducción a la validación de dianas

El presente informe tiene por objeto el estudio de las

técnicas que se emplean en la actualidad en la validación de dianas prestando especial atención a las aplicaciones de las técnicas genómicas y proteómicas.

Los fármacos se componen de sustancias activas

o compuestos responsables del efecto terapéutico,

los cuales ejercen su acción sobre la enfermedad cuando el compuesto es absorbido y distribuido

por el organismo. Las moléculas que reconocen

estos fármacos se denominan dianas terapéuticas,

y su modulación permite modificar el curso de un

proceso patológico. Las dianas sobre las que actúan los fármacos pueden ser de diferente naturaleza, pudiendo ser azúcares, proteínas o ácidos nucleicos (ADN o ARN), sin embargo, la mayoría de los fármacos que se encuentran en el mercado actúan sobre dianas proteicas 1 .

Diana terapéutica Molécula localizada en cualquier parte de la célula, capaz de reconocer a un
Diana terapéutica
Molécula localizada en cualquier parte de la célula, capaz de reconocer a un fármaco y producir una
respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad.

El desarrollo de nuevos fármacos constituye un largo

proceso que se puede dividir en una serie de fases,

la primera de las cuales consiste en la identificación

de nuevas dianas terapéuticas. La identificación de compuestos activos con actividad biológica relacionada con las dianas previamente descritas conforma la segunda etapa de este proceso. El último paso consiste en el desarrollo y optimización del fármaco a lo largo de las distintas fases

preclínicas y clínicas. Por tanto, una buena caracterización de la actividad biológica de las

dianas moleculares que han sido identificadas en las primeras fases, es fundamental para la obtención de un mayor número de fármacos. No obstante, debido

a la complejidad de los procesos biológicos que dan

lugar a distintas patologías, no siempre es posible identificar una diana que permita desarrollar un fármaco eficaz.

Validación de dianas Proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular está
Validación de dianas
Proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular está implicada en la
aparición y progresión de una enfermedad. La validación de una diana permite establecer una
relación entre la alteración de la diana y su potencial terapéutico.

La validación de dianas consiste por tanto en determinar si una diana molecular está implicada en una enfermedad concreta, y por tanto es potencialmente susceptible de ser considerada como diana terapéutica a la hora de diseñar nuevos fármacos. Para algunos autores la validación de una diana se consigue únicamente cuando un fármaco se emplea con éxito para

alterar el curso de una enfermedad. Sin embargo, la validación de dianas puede realizarse igualmente tanto a nivel molecular como genético mediante herramientas genómicas y proteómicas, que permiten relacionar una diana con un estado patológico determinado. El grado de validación de una diana estará por tanto relacionado con la cantidad de datos preclínicos y clínicos que se

1 Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

reúnan respecto al mecanismo biológico de la diana y su relación con la eficacia del fármaco 2 . El paso de una fase a otra del desarrollo de fármacos depende en gran medida del grado de validación de la diana en cuestión y del avance en el descubrimiento de potenciales compuestos

activos 3 . Sin embargo, no se debe olvidar que en la realidad muy pocas dianas identificadas durante las primeras fases del proceso de I+D conducen al desarrollo de un fármaco eficaz, por lo que el grado de incertidumbre del proceso de desarrollo farmacológico es muy elevado.

Descubrimiento Descubrimiento Desarrollo de dianas de fármacos de fármacos Optimización Identificación
Descubrimiento
Descubrimiento
Desarrollo
de dianas
de fármacos
de fármacos
Optimización
Identificación
Validación
Selección de
Fase
Fase
de
de dianas
de dianas
compuestos
Preclínica
Clínica
compuestos

Figura 1. Fases principales del desarrollo farmacológico. Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8):434-439.

La identificación y desarrollo de fármacos ha sido tradicionalmente un proceso lineal que consistía en la búsqueda de compuestos químicos mediante ensayos sobre cultivos celulares, tejidos o animales 4 . Las dianas no se validaban con las tecnologías complejas que se emplean hoy en día, y se desconocían los mecanismos moleculares responsables de las enfermedades. Los avances en genómica y proteómica han permitido a la industria farmacéutica descubrir un gran número de fármacos por medio del estudio de las relaciones existentes entre los genes y las enfermedades. Como consecuencia, la validación de dianas al nivel del genoma ha surgido como una necesidad que a su vez ofrece numerosas ventajas, ya que permite la posibilidad de conocer de antemano algunos de los efectos biológicos de las proteínas, que mediante las técnicas clásicas de validación no era posible anticipar 5 .

Los fármacos que actualmente se encuentran en el mercado actúan sobre aproximadamente 500 dianas diferentes. Las estimaciones más recientes calculan que existen entre 20.000 y 25.000 genes en el genoma humano, de los cuales en torno a 5.000 podrían estar implicados en procesos patológicos. De estos últimos, sólo ciertos genes y las proteínas que codifican serán de interés para el desarrollo de fármacos que modifiquen el proceso patológico. De este modo, el número de dianas terapéuticas potenciales se estima en torno a 600 y 1.500 dianas 6 . La secuenciación del genoma humano en el año 2001 7 supuso el descubrimiento de la secuencia de un gran número de dianas terapéuticas potenciales. El reto actual consiste en seleccionar a partir del conjunto de genes del genoma humano aquellos genes que dan lugar a proteínas y que pueden llegar a ser dianas terapéuticas.

2 Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.

3 Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8), 434-439.

4 Douglas S. A., et al. (2004). Techniques: Cardiovascular pharmacology and drug discovery in the 21st century. Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 25 Nº 4: 225-233.

5 Liu, R., et al. (2004). New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Seminars in Cancer Biology 14: 13-21.

6 Hopkins. A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1 727-730.

7 Lander, E. S., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822), 860-921. Venter, J. C., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science. 291(5507). 1304-51.

Genoma humano: 20.000-25.000 genes 5.000 fármacos que actúan sobre el genoma 5.000 Genes implicados en
Genoma humano: 20.000-25.000 genes 5.000 fármacos que actúan sobre el genoma 5.000 Genes implicados en
Genoma humano: 20.000-25.000 genes 5.000 fármacos que actúan sobre el genoma 5.000 Genes implicados en
Genoma humano: 20.000-25.000 genes
5.000 fármacos que
actúan sobre el
genoma
5.000 Genes
implicados en
patologías
600-1.500
dianas terapéuticas

Figura 2. Estimación del número de dianas terapéuticas del genoma humano. Fuente: Adaptado de Hopkins, A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1, 727-730.

Debido a que existen múltiples técnicas moleculares que permiten relacionar genes y proteínas con un determinado efecto ligado a una enfermedad, las técnicas con una aplicación potencial a la validación de dianas son muy diversas. Por esta razón, algunas técnicas moleculares de identificación de nuevas dianas terapéuticas pueden emplearse en etapas

tempranas como técnicas de apoyo en la validación de dianas.

El presente informe realiza una descripción de estas últimas técnicas, para posteriormente describir con más detalle las técnicas de validación de dianas relacionadas con la genómica y proteómica, clasificadas en función de las estrategias empleadas.

Múltiples dianas

candidatas

de las estrategias empleadas. Múltiples dianas candidatas Algunas dianas potenciales Múltiples compuestos

Algunas dianas

potenciales

Múltiples

compuestos

candidatos

potenciales Múltiples compuestos candidatos Fármaco candidato Identificación de dianas Interacciones

Fármaco

candidato

Identificación de dianas

Interacciones Cribado virtual Análisis de la proteína-proteína (“in silico”) expresión génica

Interacciones

Cribado virtual

Análisis de la

proteína-proteína

(“in silico”)

expresión génica

Validación de dianas

Modulación Inactivación de la transcripción de proteínas Modelos “in vitro” Modelos “in vivo”

Modulación

Inactivación

de la transcripción

de proteínas

Modelos “in vitro”

Modelos “in vivo”

Cribado de compuestos

vitro” Modelos “in vivo” Cribado de compuestos Desarrollo clínico Seguridad Dosificación Efectividad
vitro” Modelos “in vivo” Cribado de compuestos Desarrollo clínico Seguridad Dosificación Efectividad
vitro” Modelos “in vivo” Cribado de compuestos Desarrollo clínico Seguridad Dosificación Efectividad

Desarrollo clínico

Seguridad Dosificación Efectividad
Seguridad
Dosificación
Efectividad

Fármaco final

Figura 3. Papel de la validación de dianas en el proceso de desarrollo de nuevos fármacos. Fuente: elaboración propia.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

2. Técnicas de identificación de dianas

Al buscar un gen asociado a una enfermedad genética, los investigadores se concentran generalmente en genes candidatos 8 . Se considera que un gen es candidato si la proteína que codifica representa una posibilidad lógica de que esté involucrado en la enfermedad, o bien si el gen está localizado físicamente dentro de una región del genoma asociada o ligada a la enfermedad. La segunda situación se encuentra frecuentemente en proyectos de clonaje posicional, donde el gen buscado se identifica de acuerdo a su posición dentro del genoma.

En un proyecto de clonaje posicional típico, se identifica primero una región pequeña del genoma que contiene el gen que estamos buscando. Entonces todos los genes ubicados en esa región se convierten inmediatamente en posibles genes candidatos. Si se sabe o se puede deducir algo de la proteína codificada de un determinado gen candidato o si se puede demostrar que la proteína está involucrada en la enfermedad, entonces ese gen se puede considerar un candidato fuerte y se intensifican los esfuerzos para encontrar mutaciones en él 9 .

Las técnicas genómicas y proteómicas más destacadas que se emplean en la identificación de nuevas dianas terapéuticas se pueden clasificar en tres grupos en función de la estrategia que siguen. El análisis de la expresión génica, el estudio de las interacciones proteína-proteína, y el cribado virtual, son las tres estrategias principales descritas en el presente informe.

2.1. Análisis de la expresión génica

El estudio del perfil de expresión de genes engloba un conjunto de técnicas que permiten identificar los genes implicados en el proceso patológico mediante la observación de su fenotipo 10 molecular. La expresión génica es el proceso por medio del cual la información codificada en el ADN se transforma en las proteínas necesarias para el desarrollo y funcionamiento de la célula. Este proceso tiene lugar por medio de una molécula intermediaria que transmite la información genética denominada ARN mensajero (ARNm) 11 .

genética denominada ARN mensajero (ARNm) 1 1 . ADN Transcripción Traducción ARNm Análisis de la

ADN

Transcripción

Traducción

mensajero (ARNm) 1 1 . ADN Transcripción Traducción ARNm Análisis de la expresión génica al nivel

ARNm

Análisis de la expresión génica al nivel de la transcripción
Análisis de la expresión
génica al nivel de la
transcripción
de la expresión génica al nivel de la transcripción Proteína Figura 4. Análisis de la expresión

Proteína

Figura 4. Análisis de la expresión génica en la validación de dianas. Fuente: elaboración propia.

8 Gen candidato: gen localizado en una región de un cromosoma sospechosa de estar involucrada en una enfermedad y cuyos productos proteicos sugieren que podría ser el gen de la enfermedad en cuestión

9 ConocimientosWeb.net (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html). 10 Fenotipo: rasgos o características visibles de un organismo, determinado por su constitución genética (genotipo) y por el ambiente en el que crece y se desarrolla. 11 El ADN (ácido desoxirribonucleico) es una molécula de gran tamaño que se encuentra en todos los seres vivos y que es portadora de la información genética. El ARN (ácido ribonucleico) es una molécula parecida al ADN en cuanto a sus características químicas, que también está relacionada con la transmisión de la información genética, ya que actúa como intermediario en el proceso de traducción o formación de proteínas.

Aunque todas las células contienen la misma información genética, los genes se expresan en diferentes
Aunque todas las células contienen la misma información genética, los genes se expresan en diferentes

Aunque todas las células contienen la misma información genética, los genes se expresan en diferentes momentos dependiendo de la función de la célula o tejido y de su estado fisiológico. El análisis del perfil de expresión de genes consiste en la identificación y cuantificación de los genes que se expresan en una célula o tejido concreto en un determinado momento. El estudio del perfil de expresión de genes se puede realizar a partir de la identificación y cuantificación del ARN o bien de las proteínas expresadas directamente.

Las técnicas de análisis de la expresión génica emplean el primer tipo de abordaje, de modo que la comparación de los genes expresados en muestras distintas permite descubrir los genes que se encuentran activados e inactivados en diferentes estados metabólicos y patológicos. Por tanto, comparando la expresión de genes de tejidos sanos y enfermos, es posible descubrir los genes implicados en el desarrollo y progresión de la enfermedad, así como establecer una asociación entre el estado patológico y determinados genes que se encuentran alterados en esa enfermedad, y por tanto validar posibles dianas terapéuticas.

Las principales técnicas de identificación de dianas basadas en el análisis de la expresión génica son los microarrays de ADN, el Análisis serial de expresión génica (SAGE), y la Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Otras técnicas alternativas de análisis de la expresión génica son variantes de la PCR como RaSH, RDA, RSDD, DDRT-PCR 12 . La principal limitación de estas últimas radica en que son laboriosas y requieren la inversión de un tiempo considerable para identificar los genes que se

expresan de modo diferencial en dos muestras diferentes. Los resultados que se obtienen no proporcionan información acerca de la cantidad de ARNm y no se pueden comparar resultados obtenidos en experimentos distintos 13 . Por este motivo, aunque son de gran utilidad en las primeras etapas de identificación de dianas, no se suelen emplear con el fin de validar dianas 14 .

2.1.1. Análisis serial de la expresión génica (SAGE TM )

El análisis serial de la expresión génica (SAGE TM ) se basa en la presunción por la cual un segmento corto procedente de ARNm posee una complejidad suficiente como para identificar un gen completo. Esta técnica fue desarrollada por la empresa Genzyme como plataforma tecnológica de descubrimiento de nuevas dianas oncológicas 15 , y ha sido adoptada por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) como método de análisis de la expresión génica dentro del Proyecto Anatomía del Genoma del Cáncer 16 .

Estos segmentos cortos se obtienen mediante la acción de enzimas de restricción, que cortan en lugares específicos el ADN complementario sintetizado a partir del ARN mensajero total de la muestra. Midiendo la cantidad de copias de cada fragmento específico se puede estudiar el nivel de expresión de un gen concreto, identificar simultáneamente miles de fragmentos de este tipo en una célula o tejido y cuantificar sus niveles de expresión. La comparación de dichos perfiles en muestras sanas y enfermas permite asociar la presencia de genes con enfermedades concretas 17 .

12 Pillutla, R. C. et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517-531.

13 Chanda, S. K. et Caldwell, J. S. (2003). Fulfulling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery today. Vol. 8, Nº 4. 168-174. Allen, N. L. et al. (2003). Representational difference análisis: critical appraisal and metod development for the identification of unique DNA sequences from prokaryotes. Journal of microbiological methods. 55: 73-81.

14 Coleman, R. A. and Clark, K. L. (2003). Target validation using human tissue. Targets Vol. 2, No. 2: 58-64.

15 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Genzyme

16 SAGE Genie, Cancer Genome Anatomy Project, CGAP. (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE).

17 Serial Analysis of Gene Expression, Sagenet web page (http://www.sagenet.org).

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

La electroforesis en gel de poliacrilamida es una técnica que permite la separación de proteínas de una muestra compleja en función de su masa molecular mediante la aplicación de corrientes eléctricas. La distribución de las proteínas en el gel y la intensidad de los puntos permite obtener un perfil de la expresión de proteínas así como la identificación y cuantificación de las mismas. Este último paso se suele realizar mediante espectrometría de masas, una técnica analítica que brinda información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición atómica y molecular de materiales inorgánicos y orgánicos.

La comparación de los perfiles de expresión en un tejido enfermo y uno sano permite analizar los cambios en la expresión de proteínas. De esta forma, aquellas proteínas implicadas en procesos patológicos se expresarán en cantidades diferentes en tejidos enfermos en comparación con los tejidos normales, y por tanto podrían constituir dianas potenciales. La principal limitación de esta técnica se debe a que el procedimiento resulta laborioso y consiste en una técnica de bajo rendimiento 18 .

2.1.3. Microarrays de ADN

Las técnicas de análisis de la expresión génica mediante microarrays se basan en la capacidad de los ácidos nucleicos para hibridar entre sí, es decir, para unirse a otros ácidos nucleicos de forma específica mediante un fenómeno denominado complementariedad 19 .

Los microarrays de ADN son herramientas moleculares que permiten analizar la expresión génica por medio de la cuantificación del ARN expresado en una muestra concreta 20 . Un microarray de ADN consiste en un soporte sobre el cual se inmovilizan en posiciones concretas pequeños fragmentos de ADN de secuencia conocida denominados sondas. El ARN procedente de la muestra que se desea analizar se transcribe a ADN copia mediante transcripción inversa, ya que estas moléculas son más estables que el ARN y es posible añadir marcadores que permitan su detección. Mediante la hibridación del ADNc procedente de muestras diferentes con las sondas inmovilizadas en el soporte, es posible identificar el gen concreto que se expresa en cada muestra. La intensidad de los puntos del microarray indicará la cantidad de ARN presente en ese punto. Las principales limitaciones de los microarrays se refieren a su elevado coste por unidad.

18 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.

19 El ADN está compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de sí mismas que forman una “doble hélice”, cada una de ellas formada por millones de bloques químicos llamados “bases”, y denominadas por las letras A, T, G y C. Estas bases poseen la capacidad de unirse entre sí de forma específica, de modo que las uniones entre las bases A-T y G-C son complentarias entre sí.

20 López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Microarrays y Biochips de ADN: Informe de Vigilancia Tecnológica. Genoma España, Círculo de Innovación en Biotecnología y Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid.

Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica Técnicas basadas en la
Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica Técnicas basadas en la

Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica

Técnicas basadas en la PCR

Técnicas basadas en la secuenciación

Técnicas basadas en la hibridación

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) ARN Transcripción inversa ADN copia Análisis serial de

ARN

Transcripción inversa ADN copia Análisis serial de expresión génica (SAGE) Microarrays
Transcripción inversa
ADN copia
Análisis serial de expresión
génica (SAGE)
Microarrays

Proteína A

Proteína B

génica (SAGE) Microarrays Proteína A Proteína B – S-S– ARN Desnaturalización Liberación de fragmentos
– S-S–
– S-S–

ARN

Desnaturalización Liberación de fragmentos específicos de cada ARN –SH HS– Secuenciación –
Desnaturalización
Liberación de fragmentos
específicos de cada ARN
–SH
HS–
Secuenciación
Cuantificación
+

Separación mediante

electroforesis

Hibridación sobre un soporte con sondas de ADN complementarias

sobre un soporte con sondas de ADN complementarias Detección por fluorescencia Fig. 5. Validación de dianas

Detección por fluorescencia

sondas de ADN complementarias Detección por fluorescencia Fig. 5. Validación de dianas mediante técnicas de

Fig. 5. Validación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica.

Fuente: Velculescu, V. E. et al. (2000). Analysing uncharted transcriptomes with SAGE. Trends Genet. Oct;16(10): 423-5; University of Miami Department of Biology Homepage

2.2. Interacciones proteína-proteína

Las técnicas genómicas anteriormente mencionadas determinan la expresión de los genes en una célula o tejido, pero no permiten el estudio de las interacciones entre proteínas 21 . Las proteínas son las moléculas responsables de desempeñar las funciones controladas por los

genes presentes en el ADN. Dado que la mayoría de las dianas de fármacos son proteínas, su estudio resulta esencial en el proceso de validación de dianas.

La proteómica permite comprender el funcionamiento de la célula a través del estudio del conjunto de proteínas que contiene una célula o tejido o proteoma 22 . Por medio de técnicas proteómicas es posible comparar perfiles de

21 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Drug discovery. Vol. 3: 965-972. 22 Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 831-838.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

expresión de proteínas de tejidos y células sanas con los perfiles de expresión en muestras enfermas, lo que permite asociar dianas proteicas a determinados procesos patológicos. Por otro lado, existen técnicas que permiten estudiar las interacciones entre proteínas a gran escala y establecer redes de interacciones entre las proteínas de la célula. El conocimiento de estas redes permite conocer las rutas implicadas en procesos patológicos y el conjunto de las proteínas implicadas en una determinada enfermedad, es decir, potenciales dianas terapéuticas 23 .

2.2.1 Microarrays de proteínas

Los microarrays de proteínas se basan en la tecnología desarrollada para la fabricación de los microarrays de ADN. En este caso, en vez de ácidos nucléicos, las moléculas que se inmovilizan sobre el soporte son de naturaleza proteica, como anticuerpos 24 , enzimas o proteínas de otro tipo 25 .

Los microarrays de proteínas consisten en un soporte sólido sobre el que se inmovilizan proteínas específicas en posiciones concretas. Los microarrays de proteínas y anticuerpos permiten el análisis a

gran escala de los perfiles de expresión de proteínas

y el estudio de las interacciones entre las mismas 26 .

Por medio del empleo de muestras procedentes de tejidos sanos y enfermos, los microarrays de proteínas permiten estudiar la expresión diferencial de proteínas en tejidos enfermos y relacionar las diferencias en el perfil de expresión proteica con el

fenotipo de la enfermedad, lo que permite identificar

y validar dianas potenciales de una enfermedad.

Existen tres tipos de microarrays de proteínas en función de las moléculas que interaccionan entre sí. De esta forma, nos encontramos con microarrays de interacciones proteína-proteína, ADN-proteína, y

enzima-sustrato 27 .

Las principales limitaciones técnicas de los microarrays de proteínas se refieren a la dificultad para detectar e identificar proteínas de modo específico en comparación con los microarrays de ácidos nucléicos, que no poseen esta limitación 28 .

nucléicos, que no poseen esta limitación 2 8 . Interacción prot-prot Interacción ADN-prot Interacción

Interacción

prot-prot

Interacción

ADN-prot

Interacción

prot-molécula

Interacción

antic-prot

Interacción

enzima-sustrato

Figura 6. Interacciones de proteínas en validación de dianas. Fuente: Smith, M. G. & Snyder, M. (2005). Global analysis of protein function using protein microarrays. Mech. Ageing Dev. 126(1):171-5.

23 Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery today. 8 (23):

1067-1077.

Pillutla, R. C., et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opin. Ther. Targets, 6(4): 517-531

24 Los anticuerpos son proteínas especializadas producidas por el sistema inmunológico que se unen a partículas extrañas denominadas antígenos.

25 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.

26 Kumble, K. D. (2003). Protein microarrays: new tools for pharmaceutical development. Anal Bioanal Chem. 377: 812-819.

27 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.

28 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.

2.2.2. Sistema doble híbrido El sistema doble híbrido es una herramienta molecular que permite el
2.2.2. Sistema doble híbrido El sistema doble híbrido es una herramienta molecular que permite el

2.2.2. Sistema doble híbrido

El sistema doble híbrido es una herramienta

molecular que permite el estudio a gran escala de

las interacciones proteína-proteína a través de las

proteínas que regulan la expresión génica,

denominadas factores de transcripción 29 . Estas

proteínas son las encargadas de regular la

expresión de los genes mediante su activación o

represión. La mayoría de los factores de

transcripción presentan dos regiones o dominios,

un dominio de unión al ADN y un dominio

responsable de la activación del gen. Ambos

dominios son esenciales para que tenga lugar la

expresión génica, aunque no tienen porqué

formar parte de una misma proteína 30 .

La identificación de dianas terapéuticas mediante el sistema doble híbrido analiza las interacciones entre dos proteínas diferentes, que se unen a los dominios de unión de ADN y activación de un gen que se utiliza como indicador respectivamente. La unión de los dos dominios a través de las proteínas fusionadas permite la activación de la expresión del gen indicador, por lo que su presencia pondrá de manifiesto la existencia de una interacción entre las dos proteínas 31 . El sistema doble híbrido aprovecha la maquinaria celular de la levadura S. cerevisiae, que se utiliza como sistema de expresión de ambas proteínas de fusión. Por otro lado, esta técnica permite estudiar la interacción entre proteínas y construir redes de interacciones de todo el proteoma, proporcionando una visión global de la maquinaria molecular 32 .

Dom. Activ.
Dom.
Activ.
Dom. Activ. Proteína 2
Dom.
Activ.
Proteína
2
Proteína 1
Proteína
1
Proteína 2
Proteína
2
Proteína 3
Proteína
3
Dom. unión ADN
Dom.
unión
ADN
 
Dom. unión ADN   Expresión del Dom. unión ADN Sin expresión del gen indicador

Expresión del

Dom. unión ADN
Dom.
unión
ADN

Sin expresión del gen indicador

 

gen indicador

Promotor

Gen indicador

 

Promotor

Gen indicador

Figura 7. Funcionamiento del sistema doble híbrido. Fuente: Elaboración propia.

La principal limitación de esta técnica radica en que no permite analizar las interacciones entre proteínas localizadas en compartimentos diferentes de la célula, limitando por tanto su aplicación. Por otra parte, es habitual la presencia de falsos

positivos provocados por la activación del gen indicador por parte de otras proteínas de la levadura, además de falsos negativos debido a problemas en la unión de las dos proteínas 33 .

29 Factor de transcripción: proteínas que regulan la expresión de determinados genes, mediante la activación o represión de su expresión.

30 Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9.

31 Pillutla, R. C. et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Target Validation and Drug Discovery. 6 (4): 517-531.

32 Parsons, A. B. et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell Cycle Research. Vol 5. 159-166.

33 Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

3. Técnicas de validación de dianas

A pesar de que las técnicas anteriormente

mencionadas arrojan información relevante sobre

la función de las dianas, su objetivo principal

radica en la identificación a gran escala de nuevas dianas terapéuticas y no en la validación de las mismas. A continuación se describen aquellas técnicas empleadas en etapas posteriores del proceso de I+D, en las cuales es necesaria la validación de la función de las dianas moleculares ya identificadas. Las principales estrategias están encaminadas a la modulación de la expresión génica, la inactivación de la función de las dianas proteicas, y el análisis de la expresión génica a gran escala. Por último, se describen las técnicas de desarrollo de modelos vivos de enfermedad.

3.1. Modulación de la expresión génica

La técnicas de modulación de la expresión génica

persiguen bloquear o activar de forma específica la expresión de genes mediante diferentes estrategias

a nivel del ARN mensajero, a través del empleo de

oligonucleótidos modificados 34 . Estas modificaciones les permiten conseguir una serie de

propiedades entre las que se encuentran la entrada

al interior de las células, la resistencia a la

degradación y el aumento en la afinidad por la molécula de ARN. Las tecnologías antisentido se emplean en validación de dianas sobre cultivos de tejidos o células, así como en modelos animales 35 .

Las técnicas de modulación de la expresión génica más habituales consisten en el bloqueo de la expresión génica a nivel del ARN impidiendo que un gen concreto se exprese y por tanto consiguiendo que la proteína no se sintetice. Esta

estrategia de validación permite comprobar la existencia de modificaciones en el fenotipo de organismos o células en ausencia de expresión del gen. De este modo, se consigue reproducir el efecto que produciría la ausencia o inactivación de la proteína, lo que resulta de suma utilidad para validar dianas al permitir relacionar el fenotipo asociado a la enfermedad con un gen en concreto. Otras técnicas de validación de dianas basadas en la modulación de la expresión permiten activar la expresión de genes específicos provocando la transcripción de ARN a partir del ADN.

3.1.1. Oligonucleótidos antisentido

Los oligonucleótidos antisentido son pequeños fragmentos de nucleótidos de unos 15 o 20 pares de bases de ADN o ARN de cadena sencilla, que son complementarios a un fragmento del ARN diana. Esta complementariedad permite su unión al ARN de forma específica, bloqueando su expresión e impidiendo la producción de la proteína diana.

Los oligonucleótidos antisentido inhiben la expresión proteica mediante dos mecanismos diferentes. En algunos casos el ARN emparejado con el oligonucleótido es fragmentado por acción de una enzima que reconoce el ARN emparejado con ADN. Tras este corte, el ARN queda dañado y el oligonucleótido antisentido en cambio no sufre alteración alguna de modo que puede seguir uniéndose al ARN. En otros casos no se produce un corte en el ARN, pero el emparejamiento con el oligonucleótido puede impedir procesos esenciales para la producción de proteínas a partir del ARN 36 .

34 Los oligonucleótidos son moléculas de ácido nucléico de longitud reducida que se pueden emplear para bloquear el ARN mensajero e impedir su función.

35 Ilag, LL, et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7(18

Suppl):S136-42.

36 Stone, L. S. et Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for functional genomics in pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1081-1112.

Ribosomas ARNm Oligo antisentido Comienzo de la síntesis de proteínas Unión de un oligonucleótido antisentido
Ribosomas ARNm Oligo antisentido Comienzo de la síntesis de proteínas Unión de un oligonucleótido antisentido
Ribosomas ARNm Oligo antisentido
Ribosomas
ARNm
Oligo antisentido

Comienzo de la síntesis de proteínas

Unión de un oligonucleótido antisentido

Corte del ARNm por la enzima Ribonucleasa H

Inhibición de la expresión de la proteína

Figura 8. Tecnologías de oligonucleótidos antisentido en validación de dianas. Fuente: Silencing code. Chemsoc, Royal Society of Chemistry (http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1997/dna.htm).

En general, el empleo de oligonucléotidos antisentido es una herramienta de validación de dianas que proporciona una elevada especifidad. Sin embargo, esta selectividad requiere como contrapartida el diseño detallado de oligonucleótidos ya que existen numerosas variables que afectan a la especificidad de los oligos 37 . Otra desventaja que plantea el uso de los oligonucleótidos antisentido es que son muy inestables y se degradan rápidamente en células y tejidos. Esta limitación puede ser atenuada mediante modificaciones químicas que mejoren su estabilidad. Asímismo, la administración y distribución de oligonucleótidos a los cultivos celulares constituye un paso limitante y habitualmente es necesario combinarlos con compuestos que facilitan la entrada de los oligonucleótidos a las células, como los liposomas 38 .

La inhibición de la expresión génica mediante oligonucleótidos antisentido es un proceso que tiene lugar de manera transitoria, lo que supone una limitación en el silenciamiento de la expresión de proteínas con una vida media de larga

duración. Este problema se ha solucionado mediante el empleo de estructuras de ADN denominadas vectores de expresión, las cuales contienen la información necesaria para dirigir la síntesis de oligonucleótidos antisentido en el interior de la célula. Estos vectores ofrecen la ventaja de ser más estables que los oligonucleótidos antisentido desnudos, por lo que se consigue una inhibición de la expresión génica más prolongada 39 .

3.1.2. ARN de interferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnología que se basa en el empleo de moléculas de ARN de doble cadena para bloquear la expresión de genes específicos. El mecanismo del ARNi está presente en la naturaleza y es una respuesta celular innata que permite combatir las infecciones virales regulando la expresión del ARN.

37 Hall, J. (2004). Unravelling the general properties of siRNAs: strength in numbers and lessons form the past. Nature Reviews. Genetics 5: 552-557.

38 Lee, L. K. et Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511.

39 Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457–467.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

En los ensayos de validación de dianas, el ARNi de doble cadena se introduce en el interior de las células mediante distintos métodos. Posteriormente, este ARNi de doble cadena es procesado enzimáticamente dando lugar a moléculas de ARN más pequeñas denominadas pequeños ARNs de interferencia o ARNsi (“small interfering RNAs”). Estos ARNsi son de doble cadena y están por tanto formados por dos hebras complementarias y emparejadas. Los

ARNsi son reconocidos por el complejo RISC

(“RNA-induced silencing complex”), el cual se une

a moléculas de ARNm complementarias,

facilitando la degradación de éstas. Asimismo, es posible administrar directamente el ARNsi a la célula, en cuyo caso no sería necesaria ninguna de las etapas anteriores. De este modo, tanto el ARNi como el ARNsi son herramientas útiles para la inactivación específica de la expresión de genes 40 .

ARN de doble cadena

ARNi de doble cadena Activación del complejo RISC por ARNi de cadena sencilla Rotura del
ARNi de
doble cadena
Activación del complejo
RISC por ARNi de
cadena sencilla
Rotura del ARNm

ARNm

Reconocimiento de la diana

Figura 9. Tecnologías de ARNi en validación de dianas. Fuente: Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. Vol. 4,457-467.

Las principales ventajas de los ARNi radican en su bajo coste y alta especificidad, por lo que constituyen una herramienta molecular que está sustituyendo a los oligonucleótidos antisentido como método de modulación de la expresión génica 41 . Por otro lado, el ARNi puede emplearse como herramienta para el estudio de la biología de organismos completos a escala genómica mediante microarrays de células transfectadas con ARNi. Esta estrategia ha sido empleada con éxito en líneas celulares procedentes de modelos animales, siendo inminente su aplicación en células humanas 42 .

El empleo de ARNi presenta básicamente los mismos problemas que las tecnologías antisentido

y se refieren principalmente a las dificultades de

administración y distribución en cultivos celulares

y tejidos, viéndose agravada la situación en

estudios in vivo. Estos problemas se han solucionado en parte mediante el empleo de vehículos de administración como liposomas, o vectores de expresión como plásmidos y virus 43 . Por otra parte, las técnicas de ARN interferente pueden dar lugar a efectos inespecíficos debidos a la unión de alguna de las dos hebras del ARNsi a moléculas de ARNm distintas del ARN diana 44 .

40 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.

41 Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.

42 Gunsalus, K. C. & Piano, F. (2005). RNAi as a tool to study cell biology: building the genome-phenome bridge. Curr. Op. in Cell Biology 17:3-8.

43 Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4):165-171.

44 Lee, L. K. & Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511.

Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadas
Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadas

Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadas químicamente que evitan la aparición de efectos no específicos 45 . Por otra parte, mientras que la tecnología de ARNi ha sido aplicada con éxito in vitro en numerosas ocasiones en la validación de dianas terapéuticas, su empleo in vivo todavía no ha alcanzado el mismo grado de desarrollo.

Otro tipo de mejoras que se están desarrollando en tecnologías de ARN interferente incluyen la administración directa de ARNsi de cadena sencilla en células, que ha demostrado ser efectivo en muchos tipos celulares aunque de forma transitoria. Para solucionar este problema se ha recurrido a los ARNsh (“short hairpin”), moléculas de ARN con secuencias repetidas invertidas que forman estructuras en forma de horquilla, y que dan lugar a una inhibición mucho más estable de la expresión génica 46 .

Similitudes y diferencias entre Oligonucleótidos antisentido y ARNsi 47 Similitudes Diferencias • Fragmentos
Similitudes
y
diferencias
entre
Oligonucleótidos
antisentido
y
ARNsi 47
Similitudes
Diferencias
Fragmentos
cortos
de
ácidos
nucleicos
Dos
hebras
para
el
ARNsi,
una
hebra
para
(aprox.
20
bases).
oligos
antisentido.
Metodología
común
para
la
administración
a
ARN
de
doble
hebra
es
más
estable
que
cultivos
celulares.
ácidos
nucleicos
de
una
sola
hebra.
Inducen
el
silenciamiento
de
la
expresión
Las
modificaciones
químicas
no
son
tan
génica
mediante
su
unión
al
ARNm.
necesarias
para
su
administración
en
cultivos
celulares
en
el
caso
de
los
ARNi.
Los
ARNsi
y
ciertos
oligos
antisentido
provocan
la
ruptura
del
ARNm.
Mediación
del
complejo
RISC
en
el
ARNi.
Sus
propiedades
pueden
alterarse
mediante
Activación
de
la
enzima
ARNasa
en
oligos
modificación
de
las
bases.
antisentido.
Perfiles
de
biodistribución
similares.
Aplicación
más
extendida
de
la
técnica
de
ARNi.

3.1.3. Ribozimas

Las ribozimas son pequeñas moléculas de ARN que actúan como enzimas y que pueden cortar otras moléculas de ARN en sitios específicos. La unión entre el ribozima y el ARN diana se produce por complementariedad y apareamiento entre ambas moléculas. De este modo, se pueden diseñar ribozimas que reconozcan cualquier ARN diana simplemente variando la región de reconocimiento del ribozima.

variando la región de reconocimiento del ribozima. ARNm Ribozima Figura 10. Ribozimas en la validación de

ARNm

variando la región de reconocimiento del ribozima. ARNm Ribozima Figura 10. Ribozimas en la validación de
variando la región de reconocimiento del ribozima. ARNm Ribozima Figura 10. Ribozimas en la validación de

Ribozima

Figura 10. Ribozimas en la validación de dianas. Fuente: Chattterton, J. E. et al. (2004). Ribozymes in gene identification, target validation and drug discovery. DDT: Targets, Vol. 3(1):10-17.

45 Samarsk, D. & Datta, M. (2003). Expediting target identification and validation through RNAi. Expert Rev. Mol. Diagn.

4(1):11-14.

46 Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85.

47 Paroo, Z. & Corey, D. R. (2004). Challenges for RNAi in vivo. Trends in Biotechnology. Vol. 22, No. 8: 390-394.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Las principales limitaciones de los ribozimas se deben a su inestabilidad y sensibilidad a la degradación, menor especificidad y restricciones en el diseño. Los ribozimas pueden ser modificados químicamente para incrementar su estabilidad. Por otro lado, es posible introducir en la célula vectores que dirigen la síntesis de ribozimas de tal modo que dicha síntesis ocurra directamente en el interior de las mismas. En este caso, el nivel de producción de ribozima en la célula será de suma importancia para que se produzca una reducción significativa en el nivel de ARN diana 48 .

3.1.4. Proteínas de dedos de zinc

Una alternativa a las anteriores técnicas de modulación de la expresión génica es el diseño de proteínas de dedos de zinc como agentes de

bloqueo o activación de la expresión génica en cultivos celulares. Los dedos de zinc son regiones presentes en proteínas tales como los factores de transcripción que participan en la iniciación de la transcripción, es decir, el paso de ADN a ARN previo a la síntesis de proteínas. Estos factores de transcripción poseen unas estructuras características en forma de dedos unidos por un ión de zinc, los cuales reconocen secuencias específicas del ADN. Esta particularidad es de gran utilidad en la validación de dianas ya que se pueden diseñar proteínas con dedos de zinc que reconozcan específicamente la secuencia de ADN que se desea bloquear o activar. La activación o represión de la expresión génica se consigue mediante la unión de dominios activadores o represores respectivamente a las proteínas de dedos de zinc. La asociación entre la modulación de la expresión génica de la diana con el fenotipo o estado patógico, será la que determine finalmente la validación de la diana 49 .

Activación de la expresión génica ADN Bloqueo de la expresión génica Proteína de 3 dedos
Activación de la expresión génica
ADN
Bloqueo de la expresión génica
Proteína de 3 dedos de Zinc
ADN

Figura 11. Modulación de la expresión génica mediante proteínas de dedos de Zinc. Fuente: Jamieson, A.C. et al. (2003). Drug discovery with engineered zinc-finger proteins. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 361-368.

48 Chatterton, J. E., et al. (2004). Ribozymes in gene identification and drug discovery. Drug Discovery Today: Targets, vol. 3, No. 1, 10-17. 49 Jamieson, A. C., et al. (2004). Drug Discovery with Engineered Zinc-finger Proteins. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2, 361-368. Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.

La principal ventaja de esta técnica frente al resto de técnicas de modulación de la
La principal ventaja de esta técnica frente al resto de técnicas de modulación de la

La principal ventaja de esta técnica frente al resto de técnicas de modulación de la expresión génica consiste en que es más estable que las estrategias que emplean ácidos nucleicos. Por otro lado, el diseño de estas proteínas requiere la identificación previa de las secuencias de ADN susceptibles de ser reconocidas por los dedos de zinc, que se corresponden con regiones del genoma de baja condensación. Este mapeado se realiza mediante enzimas ADNasas, que reconocen regiones del ADN con baja condensación y por tanto más accesibles a los factores de transcripción 50 . Otra limitación a tener en cuenta es la dificultad en la administración de proteínas de dedos de zinc, que afecta por igual a todas las tecnologías de modulación de la expresión génica mencionadas en el presente informe. Este problema se puede solucionar por medio del empleo de vehículos moleculares llamados vectores que permitan introducir genes en las células 51 .

3.2. Inactivación de proteínas

Debido a que la mayoría de los fármacos que actualmente se encuentran en el mercado actúan sobre proteínas, parece lógico pensar que la validación de dianas proteicas ha de ser una estrategia fundamental en el proceso de desarrollo de un fármaco 52 . La validación de dianas mediante técnicas de modulación de la expresión génica no siempre está relacionada de forma directa con la expresión de la proteína. En numerosas ocasiones, se ponen en marcha una serie de mecanismos moleculares que modifican la proteína hasta dar lugar a la molécula responsable del fenotipo final, y que por tanto serían imposibles de identificar únicamente mediante tecnologías de modulación de la expresión génica 53 . Así mismo, algunas proteínas están formadas por varios dominios multifuncionales, por lo que la inhibición de la expresión de uno de los genes que codifica un único dominio no proporciona datos extrapolables

a la función de la proteína completa. Por este

motivo, las técnicas basadas en la inactivación de proteínas son esenciales en la validación de numerosas dianas terapéuticas 54 .

En el presente apartado se agrupan técnicas que permiten el bloqueo o inactivación de proteínas específicas de modo que éstas dejan de ejercer su función. El efecto observado tras la inactivación de la proteína diana permite relacionar dicha proteína con su función concreta, y de esta forma resulta posible asociar un fenotipo determinado a una proteína concreta.

3.2.1. Química genética

La estrategia clásica de validación de dianas o química genética consiste en el empleo de pequeñas moléculas que se unen a las dianas de modo específico provocando su inactivación. De esta forma, se consigue inactivar la función de una proteína específica, lo que permite establecer una relación entre la actividad de la misma y los efectos que se manifiesten en los cultivos de células, tejidos o animales 55 . A diferencia de las estrategias genéticas, la química genética permite

la alteración del fenotipo de forma directa y

ocurre en tiempo real. Esta modificación en la función proteica no es permanente, ya que su efecto es reversible si se eliminan los restos de estas moléculas del medio. Este enfoque resulta muy útil a la hora de validar dianas mediante el empleo de pequeñas moléculas, ya que permite asociar un fenotipo de interés con la acción de una determinada molécula sobre una diana concreta 56 .

Además de permitir analizar la función celular y validar dianas moleculares, estas pequeñas moléculas pueden emplearse como base para obtener potenciales fármacos. A partir del conocimiento de la estructura química del compuesto activo, es posible diseñar nuevas moléculas de cara a su potencial aplicación

50 Liu, P-G., et al. (2001). Regulation of an endogenous locus using a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 276:11323-11334.

51 Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets 2 (4): 125-127.

52 Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.

53 Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85.

54 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. DDT Vol. 7. Nº 18 (Suppl.) S136-142.

55 Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.

56 Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8, No. 4: 168-174.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

farmacéutica. Una de las principales limitaciones de esta estrategia consiste en que requiere la disposición de pequeñas moléculas que sean capaces de interaccionar de modo selectivo con proteínas, lo que no es posible en todas las ocasiones 57 .

Las estrategias de química genética son de gran utilidad en aquellos casos en los cuales los genes de interés son esenciales para la supervivencia del organismo, y su alteración es inviable para el funcionamiento de la célula. La principal limitación de esta técnica consiste en que no siempre se dispone de pequeñas moléculas que actúen de modo específico sobre la proteína celular de interés.

3.2.2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos son proteínas desarrolladas por el organismo con el fin de combatir infecciones mediante el bloqueo de agentes infecciosos de forma específica. Esta selección y acción inhibitoria es de gran utilidad en la validación de dianas proteicas, por lo que se han desarrollado diferentes técnicas de fabricación de anticuerpos monoclonales 58 a gran escala como el “phage-display” y el doble híbrido 59 . En el caso de que las dianas se encuentren en el interior de la célula, es necesaria la administración de anticuerpos mediante microinyección, o bien la expresión de los mismos en el interior de la célula mediante vectores de expresión, denominándose en este caso intracuerpos.

Anticuerpo intracelular

Proteína diana
Proteína diana

Interacción de la Proteína diana y el anticuerpo monocional

Figura 12. Inactivación de proteínas mediante anticuerpos, aplicación en la validación de dianas. Fuente: Iclectus Ltd. (http://www.iclectus.com/technology/intrabodies.htm#figure1).

Una de las limitaciones de los anticuerpos es su inestabilidad en el interior de las células, por lo que las estrategias que se están desarrollando en la actualidad van encaminadas al diseño de anticuerpos más estables y eficientes.

El principal problema que presentan los anticuerpos como agentes de validación de dianas es el bajo número de estas moléculas que dan lugar a una inactivación efectiva de sus dianas proteicas 60 .

57 Williams, M. (2003). Target validation. Curr Opin Pharmacol. 3(5): 571-7.

58 Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos específicos que pueden ser producidos en grandes cantidades por células que se originan a partir de una línea celular (hibridoma). Todos los anticuerpos monoclonales producidos por una célula híbrida son idénticos.

59 Pillutla, R. C., et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517.531.

60 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):

136-142.

3.2.3. Aptómeros Los aptómeros son nucleótidos artificiales capaces de reconocer y unirse a moléculas específicas
3.2.3. Aptómeros Los aptómeros son nucleótidos artificiales capaces de reconocer y unirse a moléculas específicas

3.2.3. Aptómeros

Los aptómeros son nucleótidos artificiales capaces de reconocer y unirse a moléculas específicas debido a su particular estructura terciaria. Es posible diseñar y construir aptómeros que unan e inhiban prácticamente cualquier proteína diana.

Aptómero
Aptómero

Proteína diana

Interacción de la Proteína diana y aptómero

Figura 13. Inactivación de proteínas mediante Aptómeros, aplicación en la validación de dianas. Fuente: Archemix Corp. (http://www.archemix.com/tech_aptapp.html).

Los aptómeros presentan problemas de inestabilidad que se han solucionado mediante modificaciones químicas que incrementan su estabilidad. Al igual que en el caso de los anticuerpos, una solución al problema de administración consiste en el empleo de vectores de expresión que permiten la síntesis de aptómeros en el interior de la célula 61 . Otra de sus principales limitaciones reside en la preferencia de unión de los aptómeros hacia formas determinadas de la superficie de las proteínas, lo que implica una limitación a la hora de validar dianas proteicas. Por otro lado, la naturaleza negativa de las moléculas de ácidos nucleicos que conforman los aptómeros supone un impedimento a la hora de bloquear proteínas con dominios cargados negativamente 62 .

Los aptómeros también pueden ser inmovilizados sobre microarrays de manera similar a los microarrays de ADN, con el objeto de ser empleados en la validación de dianas proteicas. Las ventajas de esta técnica radican en su alta especificidad y sensibilidad. La detección de los

aptómeros se consigue mediante la construcción de aptozimas, aptómeros conjugados con dominios de ribozimas, o bien pares de aptómeros que reconocen simultáneamente a la proteína diana. En el primer caso, la unión de la aptozima a la diana provoca un cambio conformacional que altera la actividad de la ribozima. En el segundo caso, la unión de aptómeros adyacentes a la diana crea un puente de oligonucleótidos que provoca el ligamiento del nucleótido conector, que posteriormente es amplificado y detectado por PCR. Esta última estrategia ofrece una sensibilidad potencialmente superior al ELISA hasta 1.000 veces 63 .

3.2.4. Péptidos

Los péptidos son fragmentos de proteínas que pueden ser diseñados como agentes de unión a dianas proteicas bloqueando su función o bien inhibendo su interacción con proteínas intracelulares 64 .

61 Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.

62 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):

136-142.

63 Walgren, J. L. & Thomson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicology Letters 149: 377-385.

64 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):

136-142.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Los péptidos presentan ciertas ventajas como agentes de validación de dianas principalmente debido a su fácil producción. Por otro lado, existen diversos sistemas que permiten identificar los péptidos que inhiben dianas concretas, entre las que cabe destacar la técnica del doble híbrido y el phage display 65 . La principal limitación de los péptidos consiste en que presentan problemas de afinidad y selectividad, por lo que no es una técnica que por sí sola permita la validación de una diana terapéutica 66 .

3.2.5. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos

La técnica CALI 67 o inactivación por láser mediante cromóforos, consiste en el empleo de cromóforos, moléculas que absorben la luz de una determinada longitud de onda, unidos a un anticuerpo, péptido o aptómero.

Al exponer estas moléculas a luz láser, se inducen daños fotoquímicos en la proteína diana de modo irreversible en las zonas de unión al anticuerpo, péptido o aptómero, inactivando la proteína de modo específico 68 . Esta técnica de validación de dianas ha demostrado ser eficaz en el caso de su empleo con anticuerpos, ya que se aprovecha de la selectividad de los anticuerpos y mejora sensiblemente su poder de inhibición de la función de la proteína diana 69 .

Una alternativa a esta técnica consiste en la utilización de fluoróforos que reaccionan ante luz difusa y que por tanto no requieren fuentes de luz especiales. Esta técnica se denomina FALI 70 o inactivación por láser mediante fluoróforos 71 . La principal ventaja de esta ténica radica en que permite modificar un área más amplia de la proteína, asegurando una inactivación más efectiva de la proteína diana. Tras la inactivación de la diana es necesario purificar el complejo formado por el anticuerpo unido al cromóforo o fluorocromo junto con la proteína diana, y posteriormente identificar esta última 72 .

diana, y posteriormente identificar esta última 7 2 . Proteína diana Unión proteína-ligando (anticuerpo,

Proteína

diana

Unión proteína-ligando

(anticuerpo, péptido

o aptómero)

Emisión de luz láser

Inactivación del dominio funcional de la proteína diana

Figura 14. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos aplicado a la validación de dianas. Fuente: Hanash, S. (2003) Disease proteomics. Nature 422, 226-232.

3.3. Análisis de la expresión génica in situ

Las técnicas de análisis de la expresión génica como los microarrays de ADN permiten la identificación de genes implicados en procesos patológicos. Sin embargo, la mayoría de los patrones de expresión obtenidos requieren de pasos posteriores de validación que posibiliten realizar una asociación entre la expresión de un gen y su fenotipo. Las técnicas de análisis de la expresión génica mediante microarrays de tejidos y células son dos técnicas empleadas en la validación clínica y funcional de dianas respectivamente.

65 Caponigro, G., et al. (2003). Functional analisis of expressed peptides that bind yeast STE proteins. Journal of Biotechnology 103: 213-225.

66 Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.

67 CALI: Chromophore assisted lasser inactivation.

68 Peet, N.P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.

69 Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.

70 FALI: Fluorophore assisted lasser inactivation.

71 Beck, S., et al. (2202). Fluorophore-assisted light inactivation: A high-throughput tool for direct target validation of proteins. Proteomics 2: 247-255.

72 Ilag, LL. (2003). Direct methods for modulating protein function. Current Opinion in Drug Discovery & Development 6(2):

262-268.

3.3.1. Microarrays de tejidos Los microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue Microarrays) consisten en colecciones
3.3.1. Microarrays de tejidos Los microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue Microarrays) consisten en colecciones

3.3.1. Microarrays de tejidos

Los microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue

Microarrays) consisten en colecciones

miniaturizadas de hasta 1.000 muestras de

tejidos inmovilizadas sobre un soporte, que

permiten el análisis in situ de dianas moleculares

simultáneamente (ADN, ARN o proteínas).

Prácticamente la mayoría de los artículos

publicados sobre microarrays de tejidos están

relacionados con el análisis de tumores, aunque

se ha demostrado su valor en otro tipo de

patologías relacionadas en el sistema nervioso 73 .

Las principales ventajas que ofrecen los

microarrays de tejidos frente a otras técnicas de

validación se basan en la naturaleza in vivo del

ensayo, que posibilita observar cambios

fenotípicos que no son obvios mediante técnicas

moleculares. En la actualidad, los principales

desarrollos encaminados a mejorar esta técnica

se centran en la mejora de la instrumentación

dedicada a la inmovilización de los tejidos en el

array, automatización de la obtención de

imágenes digitalizadas, así como almacenamiento,

análisis y estandarización de la información

obtenida 74 .

Características de los Microarrays de Tejidos en la validación de dianas: • Determinación de la
Características
de
los
Microarrays
de
Tejidos
en
la
validación
de
dianas:
Determinación
de
la
distribución
celular
y
subcelular
de
las
dianas.
Integración
de
la
información
procedente
del
análisis
de
las
dianas
a
nivel
del
ADN,
ARN
y
proteínas.
Confirmación
de
los
resultados
obtenidos
mediante
técnicas
de
validación
in
vivo
basadas
en
modelos
animales
y
microarrays
de
ADNc.
Análisis
de
la
prevalencia
de
dianas
en
diferentes
etapas
de
progresión
de
la
patología
(ej.:
progresión
tumoral).
Correlación
de
los
datos
moleculares
con
los
datos
clínicos.

3.3.2. Microarrays de células

Hasta la fecha, el análisis in vivo de la expresión

génica se realizaba únicamente gen a gen, por

medio de la introducción de un gen en una célula, y

la posterior observación de su efecto fisiológico o

fenotipo. Los microarrays de células permiten el

análisis de la expresión génica in vivo a gran escala

en células humanas, y por tanto son una

herramienta valiosa a la hora de validar dianas

terapéuticas 75 . La estrategia empleada para su

diseño consiste en el cultivo de células sobre

fragmentos de ADN inmovilizados en un microarray.

Estos fragmentos de ADN se transfectan o

introducen en las células, que posteriormente

expresan las proteínas codificadas por su secuencia.

Los cambios fenotípicos que se observen en las

células serán empleados para valorar la implicación

de las dianas terapéuticas de interés 76 .

Una estrategia alternativa consiste en transfectar

las células inmovilizadas en el array con ARN

interferente, de modo que en vez de activarse la

expresión de un gen, se produzca el

silenciamiento del mismo. Este bloqueo de la

expresión génica define un conjunto de puntos en

el array que se corresponderán con la expresión

del fenotipo esperado 77 .

73 Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972.

74 Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101.

75 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.

76 Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101. Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411:107-110.

77 Silva, J. M., et al. (2004). RNA interference microarrays: High-throughput loss-of-function genetics in mammalian cells. PNAS 101, nº 17: 548-6552.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Microarrays de Tejidos Microarrays de Células b c a a b Inmovilización de Transfección de
Microarrays de Tejidos
Microarrays de Células
b
c
a
a
b
Inmovilización de
Transfección de las
d
células en un
Microarray de ADNc
células con múltiples
genes de interés
c
Inmovilización de secciones
de tejidos en un array
e
Visualización de la expresión de los
genes en las células in vivo

Figura 15. Esquema de funcionamiento de un microarray de tejidos aplicado a la validación de dianas. Fuente: Sauter, G., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews. Drug discovery 2: 962-972; Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411: 107-110.

3.4. Modelos vivos de la enfermedad

El avance en el conocimiento del genoma de diferentes organismos que se ha producido a lo largo de los últimos años ha puesto de manifiesto la existencia de un alto grado de conservación de la secuencia del ADN y proteínas, así como una similitud en la función de los genes y rutas de señalización en diferentes organismos. Este elevado grado de conservación permite el empleo de otros organismos diferentes del ser humano como sistemas modelo en el proceso de desarrollo de fármacos. De hecho, se ha descubierto que existe un elevado grado de similitud con las rutas moleculares implicadas en enfermedades humanas, lo que hace que el valor de los organismos modelo en la validación de dianas sea mayor 78 .

Vertebrados Invertebrados
Vertebrados
Invertebrados
Unicelulares
Unicelulares
Ratón Pez cebra Mosca de la fruta

Ratón

Ratón Pez cebra Mosca de la fruta

Pez cebra

Mosca de la fruta
Mosca de la fruta
C. elegans

C. elegans

Levadura

Levadura

Figura 16. Principales sistemas modelo en validación de dianas. Fuente: Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.

78 Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, Nº 5: 191-197.

En lo concerniente a la validación de dianas, la obtención de un modelo animal que
En lo concerniente a la validación de dianas, la obtención de un modelo animal que

En lo concerniente a la validación de dianas, la obtención de un modelo animal que reproduzca la enfermedad humana constituye de por sí un proceso de validación de la diana. Al tratarse de un organismo completo, se puede así demostrar la implicación de la diana en la enfermedad in vivo, y

proporciona un grado elevado de evidencia de que un gen en concreto está implicado en el proceso de interés. Por otro lado, el modelo animal obtenido es de gran valor para estudios posteriores necesarios para el desarrollo del fármaco, como son los estudios farmacológicos y toxicológicos 79 .

Características de un modelo animal ideal 80 • Facilidad de cría en cautividad. • Tiempos
Características
de
un
modelo
animal
ideal 80
Facilidad
de
cría
en
cautividad.
Tiempos
de
reproducción
cortos.
Descendencia
numerosa.
Disponibilidad
de
métodos
de
manipulación
genética
y
experimental.
Elevado
número
de
genes
conservados
respecto
al
ser
humano.

3.4.1. Ratones knock-out y knock-in

Los ratones knock-out son ratones a los que se les ha inactivado uno o varios genes mediante técnicas de ingeniería genética 81 , por lo que carecen de una determinada función génica. Los ratones knock-out permiten estudiar la función fisiológica de genes de mamíferos y son sistemas modelo valiosos sobre los que estudiar la eficacia de los fármacos. Se ha demostrado que el fenotipo de los ratones knock-out para una determinada diana se corresponde con los efectos de los fármacos que actúan sobre la diana y la bloquean 82 . Los ratones knock-in, en cambio, son ratones que sobreexpresan el gen de interés mediante la introducción de varias copias del gen durante el desarrollo embrionario del ratón.

Una estrategia alternativa consiste en el desarrollo de ratones knock-out y knock-in específicos de tejido o inducibles. Los primeros consisten en ratones en los que la expresión de un gen determinado se encuentra inhibida en un

tejido concreto. Los knock-out inducibles permiten interrumpir la expresión de interés en el momento deseado administrando una sustancia determinada. En este caso, el gen se expresa con normalidad hasta que se administra el compuesto concreto 83 .

Los ratones knock-out suelen presentar problemas de letalidad de los embriones para determinados genes. En ocasiones se ponen en marcha mecanismos de compensación en el embrión que hacen que la ausencia del gen no de lugar a los efectos esperables ya que otros genes compensan al gen inactivado. Los knock-out inducibles permiten inactivar el gen cuando el ratón ya se ha desarrollado y por tanto evitan que se den estos mecanismos de compensación y letalidad embrionaria.

La principal limitación de los ratones knock-out y knock-in se refiere al tiempo y coste que requiere la manipulación genética de estos organismos, lo que dificulta la manipulación de ratones a gran escala 84 .

79/80 Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional Genomics to new Drug Targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 3: 965-972. Abuin, A., et al. (2002). Full-speed mammalian genetics: in vivo target validation in the drug discovery process. Trends in Biotechnology. Vol. 20, Nº 1: 36-42.

81 La ingeniería genética es una tecnología que permite introducir cambios en el genotipo de un organismo.

82 Zambrowicz, B. P., et al. (2003). Predicting drug efficacy: knockouts model pipeline drugs of the pharmaceutical industry. Current Opinion in Pharmacology. 3: 563-570.

83 Törnell, J. & Snaith, M. (2002). Transgenic systems in drug discovery: from target identification to humanized mice. Drug Discovery Today. Vol. 7 No. 8: 461-470. Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets. Drug Discovery Today. 9(3): 117-26.

84 Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, Nº 4: 147-148.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

3.4.2. Ratones transgénicos

Los ratones transgénicos son ratones a los que se

les ha introducido un gen procedente de otro

organismo diferente durante el desarrollo

embrionario. De este modo, se puede introducir

en el animal transgénico un gen que codifique

para la diana terapéutica que se desee validar,

sobreexpresando dicha diana en el modelo

animal.

Los ratones transgénicos más fáciles de obtener

son aquellos en los que el transgén se expresa de

modo continuo en todos los tejidos del organismo,

aunque también es posible obtener ratones que

expresen el transgén en un tejido determinado al

igual que ocurre con los ratones knock-out y

knock-in. Asimismo, se pueden emplear ratones

transgénicos inducibles, y en este caso el

transgén sólo se expresa al inducir la expresión

mediante la administración de un compuesto

concreto 85 . Las tecnologías de transgénesis

permiten introducir genes humanos en ratones

transgénicos de modo que se puede estudiar la

función de proteínas humanas en ratones

transgénicos. De este modo se obtienen ratones

humanizados que expresan dianas humanas que

permiten estudiar los efectos debidos a la

expresión de la diana humana en el modelo

animal. La principal limitación de los ratones

transgénicos se refiere al tiempo y coste que

requiere la manipulación genética de los ratones,

haciendo imposible el empleo de esta técnica a

gran escala.

El clonaje de expresión en cultivos celulares es

una alternativa al empleo de modelos animales

transgénicos. Esta técnica se basa en introducir

genes en células con objeto de que los genes se

expresen en su interior y den lugar a las

proteínas. Posteriormente se estudian las

alteraciones en el fenotipo de las células de modo

que se puede asociar una alteración concreta a la

expresión de un gen determinado. Sin embargo,

esta técnica no ofrece las ventajas de los modelos

animales transgénicos, los cuales proporcionan

información sobre la función desempeñada por un

gen in vivo 86 .

Tecnología knock-out/transgénica vs. Tecnología Antisentido 87 • Bloqueo total de la expresión del gen.
Tecnología
knock-out/transgénica
vs.
Tecnología
Antisentido 87
Bloqueo
total
de
la
expresión
del
gen.
Modulación
de
la
expresión
del
gen.
Aplicable
a
numerosas
especies
incluyendo
a
Limitado
a
un
número
de
especies.
humanos.
Efectos
generalmente
irreversibles.
Efectos
reversibles.
Elevado
precio.
Precio
moderado.
Proceso
lento.
Proceso
rápido.
Instalaciones
adecuadas
para
animales.
No
requiere
instalaciones
especiales.
Requiere
el
control
de
efectos
Requiere
el
control
de
efectos
debidos
a
la
compensatorios
y
de
desarrollo.
inespecifidad
del
ADN.
Laborioso
si
se
desea
modificar
varias
dianas.
Posibilidad
de
modificar
múltiples
dianas.
Fenotipos
letales
para
algunos
genes.
Toxicidad
de
altas
dosis
de
oligos
antisentido.
Es
posible
generar
modelos
animales
que
No
es
posible
sobreexpresar
el
gen.
sobreexpresen
el
gen.

85 Törnell, J. & Snaith, M. (2002). Transgenic systems in drug discovery: from target identification to humanized mice. Drug Discovery Today. Vol. 7 No. 8: 461-470. Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets.Drug Discov Today. 9(3): 117-26.

86 Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8, No. 4: 168-174.

87 Stone, L. S. & Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for functional genomics in pain and analgesia. Advances Drug Delivery Reviews 55: 1081-1112.

3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar Las mutaciones consisten en cambios en la secuencia del
3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar Las mutaciones consisten en cambios en la secuencia del

3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar

Las mutaciones consisten en cambios en la secuencia del ADN debidas a la sustitución de una base nucleotídica o unidad estructural por otra. Mediante agentes mutagénicos químicos es posible crear mutaciones al azar. La línea germinal masculina que dará lugar a espermatozoides puede ser sometida a mutagénesis y los ratones macho que producen espermatozoides mutados se cruzan con hembras dando lugar a una generación de ratones mutada. A partir de esta descendencia se pueden seleccionar los ratones que presentan el fenotipo de interés, es decir una sintomatología similar a la de la enfermedad de interés. Mediante el estudio de las mutaciones

ocurridas en estos ratones, se pueden identificar los genes mutados, que por tanto estarán asociados a la aparición de la enfermedad. Existen otras técnicas capaces de obtener ratones mutados al azar sin necesidad de emplear agentes químicos. La captura de genes

o Gene trapping es un método que permite la

mutación al azar mediante inserción de un elemento de ADN en el gen que interrumpe la transcripción del mismo.

Sin embargo, estas técnicas no permiten crear mutaciones precisas ya que éstas ocurren al azar. Las mutaciones no siempre dan lugar a la inactivación del gen, y por tanto pueden no detectarse mutaciones en genes de interés. En el caso de la mutagénesis química, la identificación

del gen mutado resulta muy difícil ya que requiere

la búsqueda de cambios a lo largo de toda la

secuencia del genoma debido a que no existe información previa acerca del gen que se ha mutado. La captura de genes, en cambio, facilita la localización del gen mutado a partir del fragmento

de ADN que se inserta en el genoma ya que éste es de secuencia conocida y puede ser localizado 88 .

3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad

La levadura Saccharomyces cerevisiae 89 es un organismo ampliamente estudiado y de fácil crecimiento en condiciones de laboratorio. A pesar de la distancia evolutiva que separa al ser humano de las levaduras, éstas poseen miles de proteínas de secuencia similar a las proteínas humanas. De hecho, muchas de las mutaciones que se observan en tumores humanos pueden ser modelizadas en levaduras, y los fármacos que actúan sobre proteínas humanas ejercen una acción similar en sus equivalentes en las levaduras.

Es posible obtener mutantes de S. cerevisiae a los que se les haya eliminado un gen concreto, lo que permite crear un modelo del efecto biológico debido a la inactivación del gen. De este modo, se puede reproducir el efecto de un fármaco que actúe inhibiendo esa diana en concreto. Por otro lado, también es posible sobreexpresar genes concretos y observar su efecto en el fenotipo celular, lo que resulta de utilidad a la hora de establecer relaciones entre genes y enfermedades.

La principal desventaja de la levadura como modelo se debe a que se trata de organismos simples formados por una sola célula, por lo que no permiten el estudio de procesos más complejos característicos de mamíferos como el ser humano. Resulta imposible por tanto el estudio de fenotipos complejos, limitando su utilización a la validación de dianas de determinados tipos de enfermedades siendo una de las principales el cáncer 90 .

88 Abuin, A., et al. (2002). Full-speed mammalian genetics: in vivo target validation in the drug discovery process. Trends in Biotechnology 20 ( 1): 36-42.

89 Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org).

90 Parsons, A. B., et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell Cycle Research Vol. 5, 159-166. Carroll, P. M. & Fitzgerald, K. (2003). Model Organisms in Drug Discovery. Edited by John Wiley & Sons, Ltd.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

3.4.5. Otros organismos modelo

Existen otros organismos modelo de origen animal diferentes del ratón que se pueden emplear en validación de dianas. Los más importantes son la mosca de la fruta o Drosophila melanogaster, el nemátodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra o Danio rerio.

La mosca de la fruta (D. melanogaster), es una mosca de pequeño tamaño que se ha empleado durante el último siglo en investigación genética y genómica, debido a que se han descrito un gran número de mutantes que permiten estudiar la herencia de los genes y las características controladas por los mismos. Mediante la introducción de genes procedentes de otros organismos es posible conseguir que la expresión de los genes introducidos varíe en función de los tejidos o estadíos del desarrollo. Por tanto, la mosca de la fruta se puede emplear para identificar nuevos componentes de rutas asociadas a enfermedades concretas.

La validación de dianas en la mosca de la fruta puede realizarse empleando tecnologías antisentido como el ARNi y el ARNsi, por medio de modificaciones que permiten introducir un transgen que codifique para el ARN de interferencia. De este modo se consigue silenciar la expresión de un gen en un organismo completo de modo estable, sin necesidad de añadir ARN de interferencia de manera constante.

La mosca de la fruta se ha empleado para validar dianas implicadas en la diabetes y en la enfermedad de Alzheimer mediante la búsqueda de modificadores genéticos. Esta estrategia consiste en crear fenotipos de enfermedad ya conocidos mutando dianas ya descritas y estudiadas, para posteriormente buscar mutaciones que modifiquen el fenotipo. Las

mutaciones pueden ser creadas por mutagénesis química al azar o empleando mutaciones ya conocidas. De este modo, se pueden identificar rutas nuevas que están relacionadas con enfermedades conocidas, lo que permite relacionar nuevas dianas y rutas con enfermedades 91 .

El nematodo intestinal (C. elegans) fue el primer organismo multicelular cuyo genoma fue secuenciado 92 y consiste en un buen modelo para estudiar la función de genes asociados a la enfermedad, y por tanto para validar dianas. Esto se debe a que existe una elevada similitud entre su secuencia y los genes humanos (65%), y sus proteínas son responsables de funciones y rutas metabólicas similares 93 .

El ARN de interferencia fue descubierto en este

organismo como un mecanismo regulador de la transcripción, responsable del silenciamiento de genes de forma específica de secuencia. El silenciamiento de genes concretos mediante tecnologías de ARN de interferencia da lugar a cambios fenotípicos que permiten asociar rutas y dianas a enfermedades concretas 94 . Por otro lado, las técnicas de transgénesis descritas para otros sistemas modelo también pueden ser empleadas en C. elegans como método de validación de dianas.

Como modelo animal, C. elegans ha sido empleado con frecuencia para el estudio de enfermedades humanas como el cáncer, la

depresión, la enfermedad de Alzheimer y la muerte celular 95 . La ruta que controla la apoptosis

o muerte celular fue dilucidada en C. elegans y

esta ruta tiene implicaciones importantes para el estudio del cáncer. En el caso del Alzheimer, C. elegans posee equivalentes a los genes humanos implicados en esta patología, lo que permite estudiar su función en este modelo 96 .

91 Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 965-972.

93 Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, Nº 4: 147-148.

94 Jain, K. K. (2004). RNAi and siRNA in target validation. Drug Discovery Today. 9 (7): 307-309.

95 Carroll, P. M. & Fitzgerald, K. (2003). Model Organisms in Drug Discovery. Edited by John Wiley & Sons, Ltd.

96 Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, Nº 4: 147-148.

El pez cebra ( Danio rerio ) es un organismo modelo que se ha comenzado
El pez cebra ( Danio rerio ) es un organismo modelo que se ha comenzado

El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo que se ha comenzado a usar recientemente en validación de dianas. Sin embargo, este organismo es un modelo ampliamente conocido debido a que sus embriones son transparentes y permiten estudiar el desarrollo embrionario con facilidad, son fáciles de criar, tienen un ciclo de vida corto y su desarrollo es rápido. Debido a que el pez cebra es un organismo vertebrado, posee numerosas similitudes con los mamíferos, lo que ha permitido desarrollar modelos representativos de enfermedades humanas 97 .

En este sentido, han sido desarrolladas varias técnicas que permiten modular la expresión

génica en el pez cebra por medio de mutaciones, la sobreexpresión de genes del pez cebra, y la introducción de genes procedentes de otros organismos. Por otra parte, existen tecnologías basadas en el empleo de oligonucleótidos antisentido sintéticos especialmente adecuados para su empleo en pez cebra, siendo las más empleadas los oligonucleótidos tipo morfolino y los péptidos nucleicos o PNAs 98 . Los oligos tipo morfolino son oligonucleótidos antisentido modificados que presentan un esqueleto con una estructura química determinada que se denomina morfolino, mientras que los PNAs son oligonucleótidos antisentido modificados con un esqueleto peptídico de carga negativa.

Tecnología

Naturaleza

antisentido

Oligonucleótidos

Ácido nucleico sintético con un esqueleto de morfolino

tipo morfolino

Peptidos nucleicos (PNAs)

Ácido nucléico con un esqueleto peptídico de carga negativa.

Funcionamiento

Ventajas

Unión al ARNm específico y bloqueo de la síntesis de la proteína

Mayor estabilidad

Unión de alta afinidad al ARNm de la proteína

Mayor especificidad

Menor toxicidad

Tabla 1. Comparativa de las dos principales tecnologías antisentido empleadas para validar dianas en pez cebra. Fuente: Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3(5): 191-197.

Actualmente, el pez cebra se emplea como modelo para enfermedades humanas y procesos biológicos de interés como la angiogénesis o creación de vasos sanguíneos, procesos inflamatorios, metabolismo de lípidos, regulación de la insulina y mecanismos implicados en la adicción a las drogas 99 .

3.4.6. Células madre embrionarias

Las células madre de origen embrionario no constituyen una técnica de validación por sí mismo sino que son un sistema sobre el que aplicar las diferentes técnicas de validación que se han tratado en apartados anteriores. Debido a su

interés creciente se ha considerado necesario

dedicarles un apartado en el que se expone su

aplicación en la validación de dianas, junto con

sus ventajas respecto a la validación mediante

otros cultivos celulares.

Las células madre embrionarias son células

procedentes del embrión en su fase temprana que

conservan la capacidad de convertirse en toda

clase de células del organismo. Al cultivarlas en

laboratorio, estas células pueden ser mantenidas

en un estado no diferenciado o pueden

diferenciarse a algún tipo celular en condiciones

adecuadas. En la validación de dianas se emplean

tanto células madre no diferenciadas, como

células diferenciadas procedentes de ratón debido

97 Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, Nº 5:

191-197.

98 PNA: Peptide Nucleic Acid.

99 Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Aplication of proteomic technologies in the drug development process. Toxicology Letters 149: 277-385. Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 965-972.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

a los problemas legales que hay en torno a las

células embrionarias humanas. Recientemente, la

Comisión de Donación y Utilización de Células y

Tejidos Humanos ha autorizado los cuatro

primeros proyectos de investigación con células

madre embrionarias en España a partir de

embriones sobrantes de los procesos de

fertilización 100 .

Las células madre no diferenciadas pueden ser

manipuladas para eliminar la expresión de un gen

con el objeto de evaluar la función del mismo en la

célula dando lugar a células madre knock-out, o

bien a células madre knock-in que sobreexpresen

el gen de interés. Por otro lado, se pueden diseñar

células madre transgénicas modificadas

genéticamente mediante la introducción del gen

que codifique para la diana potencial que se desea

validar, de modo que ésta se exprese en la célula.

Entre las últimas aplicaciones de las células madre

para la validación de dianas se encuentra la

tranfección de RNA interferente a cultivos de estas

células, provocando el silenciamiento de la expresión génica 101 .

Las células madre pueden diferenciarse posteriormente mediante su cultivo en condiciones controladas, dando lugar a células adultas con una fisiología similar a las células diferenciadas del organismo. De este modo se pueden diferenciar células madre a las que se les ha eliminado la expresión de un gen concreto y obtener células de un tipo celular determinado en las que estudiar la función de los genes concretos.

Otro tipo de estrategia de validación de dianas consiste en la implantación de células madre no diferenciadas en ratones, que dan lugar a teratomas o tumores formados por células de origen embrionario. Estos teratomas son de utilidad para evaluar el papel de genes concretos en la proliferación celular y la diferenciación, de modo que pueden resultar de interés como dianas terapéuticas frente al cáncer.

Tipo celular

Tumoral o

transformada

Células

primarias

Células

madre

embrionarias

Estabilidad

genética

Alteraciones

cromosómicas

Normal

Normal

Crecimiento

Disponibilidad

Anormal

Ilimitada

No proliferan

Limitada

Normal

Ilimitada

Variabilidad

celular

Cambian a lo largo del cultivo

Dependiente

del donante

Uniforme

Manipulación

genética

Muy limitada

No

Si

Tabla 2. Características de tipos celulares empleados habitualmente en validación de dianas. Fuente: McNeish, J. (2004). Embriogenic stem cells in drug discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 70-80.

Las células madre embrionarias presentan ciertas ventajas en comparación con los demás tipos de cultivos celulares que se emplean en validación de dianas. Las células madre embrionarias son genéticamente estables, uniformes en cultivo celular, y presentan un crecimiento normal aunque se dividen sin límite, lo que permite mantenerlas en cultivo indefinidamente y disponer de ellas en cantidades ilimitadas. Por otra parte,

estas células son las únicas que pueden ser manipuladas genéticamente con facilidad debido a su habilidad para sufrir recombinación homóloga con una frecuencia mayor que el resto de tipos celulares. Todas estas características confieren ventajas a las células madre embrionarias sobre las células primarias o las líneas celulares procedentes de tumores, ya que combinan las características deseadas de ambos 102 .

100 ”La Comisión de Donación y Utilización de Células y Tejidos Humanos da luz verde a los primeros proyectos de investigación con células madre embrionarias en nuestro país”. Nota de prensa: 23 de febrero 2005, Ministerio de Sanidad y Consumo (http://www.msc.es/gabinetePrensa/notaPrensa/desarrolloNotaPrensa.jsp?id=268).

101 Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4): 165-171.

102 McNeish, J. (2004). Embriogenic stem cells in drug discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 70-80.

3.5. Técnicas bioinformáticas La bioinformática consiste en el uso de las matemáticas y de las
3.5. Técnicas bioinformáticas La bioinformática consiste en el uso de las matemáticas y de las

3.5. Técnicas bioinformáticas

La bioinformática consiste en el uso de las matemáticas y de las técnicas informáticas para

resolver problemas biológicos por medio de programas informáticos y modelos matemáticos.

Las herramientas bioinformáticas más relevantes son las bases de datos, las cuales permiten el almacenamiento y manejo de la información

biológica, y los algoritmos, que permiten elaborar relaciones de asociación entre datos contenidos en las bases de datos. La bioinformática permite

por tanto el estudio de una elevada complejidad de datos mediante el uso de herramientas con

gran capacidad de almacenamiento y poder de cálculo.

Los principales objetivos de la bioinformática

durante las fases iniciales de desarrollo de un fármaco se centran en desentrañar la información

contenida en las secuencias de ADN, ARN y

proteínas. Las técnicas bioinformáticas presentan

tres aplicaciones fundamentales para la validación

de dianas, la identificación de genes

homólogos 103 , el análisis de mapas de proteínas y

el análisis a gran escala de perfiles de expresión.

El primero es de utilidad a la hora de asociar

fármacos potenciales a las dianas, ya que

permiten la predicción de la estructura de las

proteínas a partir de su secuencia. El

conocimiento de la estructura tridimensional de

las proteínas sirve para comprender mejor sus

funciones e identificar compuestos de bajo peso

molecular que inhiban la proteína de modo

selectivo. La identificación de genes homólogos en

otras especies puede resultar de utilidad a la hora

de asignar nuevas funciones a genes humanos, o

bien confirmar la utilidad de modelos animales

para experimentos in vivo. Asimismo, la

identificación de genes homólogos con funciones

divergentes en el genoma humano puede ser útil

para valorar problemas de especificidad de

dianas. Por otro lado, la identificación de

proteínas con funciones similares mediante la

construcción de mapas de interacciones de

proteínas es posible mediante herramientas

bioinformáticas de análisis. Respecto al análisis de

perfiles de expresión, existe una amplia variedad

de software que permite almacenar y analizar los

diferentes patrones derivados de experimentos

por medio de microarrays de ADN

fundamentalmente 104 .

La bioinformática en la identificación y validación de dianas • Métodos comparativos basados en
La
bioinformática
en
la
identificación
y
validación
de
dianas
• Métodos
comparativos
basados
en
homología
(identificación
de
genes
homólogos
que
poseen
similitud
entre
en
la
misma
especie
o
en
distintas
especies):
La
comparación
de
la
diana
a
nivel
de
secuencia
de
ADN
o
estructura
de
la
proteína
con
familias
de
proteínas
humanas
u
otros
organismos
arroja
información
relevante
sobre
la
función
de
la
diana.
La
identificación
de
genes
homólogos
con
funciones
divergentes
en
el
genoma
humano
puede
ser
útil
para
valorar
problemas
de
especificidad
de
dianas.
• El
análisis
de
mapas
de
proteínas
se
emplea
para
asignar
funciones
a
proteínas.
• El
análisis
de
los
perfiles
génicos
obtenidos
con
microarrays
puede
servir
para
asignar
función
biológica
a
determinados
genes.

103 Genes homólogos: genes que poseen similitud entre sí, tanto en la misma especie como entre distintas especies. Esta similitud puede derivarse de una ascendencia común (genes ortólogos) asumiéndose que tienen la misma función, o bien surgir a partir de la duplicación de un gen dentro de un mismo genoma (genes parálogos), que en este caso tendrían diferente función o especialización. 104 Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8), 434-439.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Técnicas de validación de dianas

génica

la

Análisis de

expresión

proteína-proteína

Interacciones

Modulación de la expresión

Inactivación de proteínas

Técnica

Análisis Serial de la Expresión Génica (SAGE).

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE).

Microarrays de ADN.

Microarrays de proteínas.

Sistema doble híbrido.

Oligos antisentido.

ARN de interferencia.

Ribozimas

Proteínas de dedos de zinc.

Genómica química.

Anticuerpos

Aptómeros

Péptidos

CALI/FALI

Ventajas

Análisis simultáneo de niveles de expresión. No requiere conocer la secuencia del ARNm.

Bajo coste.

Multiplexado.

Alto rendimiento.

Requieren cantidades reducidas de muestra. Automatizable. Alto rendimiento.

Detecta interacciones entre proteínas a gran escala. Permite construir mapas de interacción de proteínas.

Facilidad de obtención. Resistentes a las nucleasas. Actúan en el núcleo de la célula.

Facilidad de obtención. Requiere bajas concentraciones. Mayor estabilidad. Baja toxicidad. Puede expresarse intracelularmente.

Facilidad de obtención. Requiere bajas concentraciones. Evita el bloqueo no específico de la síntesis proteica.

Mayor estabilidad. Permiten activar o reprimir genes.

Las moléculas pueden emplearse como base para obtener potenciales fármacos. No requieren la alteración genética de la célula.

Elevada especificidad.

Posibilidad de diseño frente a cualquier diana. Se unen a los sitios activos de las proteínas.

Facilidad de producción.

Alto poder de inhibición y especificidad en conjunción con anticuerpos monoclonales.

Desventajas

Elevado coste. Un segmento corto no siempre se corresponde con un único gen, y viceversa.

Requiere cantidades elevadas de muestra. Bajo rendimiento.

Coste elevado.

Baja especificidad en la unión de proteínas. Elevado coste.

Falsos positivos y negativos. No permite analizar proteínas de membrana y factores de transcripción.

Problemas de administración. Toxicidad. Inestabilidad. No puede expresarse intracelularmente.

Problemas de administración. Efectos no específicos. No actúa en el núcleo de la célula. Inestabilidad in vivo.

Problemas de administración. Inestabilidad. Especificidad. Falta de experiencia in vivo.

Problemas de administración. Incapacidad de reconocer sitios no activos del genoma.

Uniones no específicas. Requiere disponer de moléculas de inhibición.

Baja eficacia de bloqueo de la proteína. Inestabilidad.

Inestabilidad. Problemas de administración. Baja afinidad por proteínas cargadas negativamente.

Baja afinidad.

Baja selectividad.

La inactivación depende de la distancia entre el sitio activo y el sitio de unión.

(Continúa en página siguiente)

Técnicas de validación de dianas Técnica A n á l i s i s i
Técnicas de validación de dianas Técnica A n á l i s i s i

Técnicas de validación de dianas

Técnica

Análisis in de vivo expresión

Sistemas modelo

Bioinformática

Microarrays de tejidos.

Microarrays de células.

Ratones knock-out y knock-in

Ratones transgénicos.

Mutagénesis de ratones al azar.

Levaduras.

Mosca de la fruta.

C. elegans.

Pez cebra.

Células madre

embrionarias.

Herramientas

bioinformáticas.

Ventajas

Ensayos in vivo. Correlación de los datos moleculares con los datos clínicos.

Ensayos in vivo.

Visualización in vivo de los cambios fenotípicos. Modelos animales similares al ser humano.

Visualización in vivo de los cambios fenotípicos. Modelos animales similares al ser humano.

No requiere conocer la función de genes modificados. Alto rendimiento.

Genoma secuenciado. Facilidad de crecimiento.

Numerosos mutantes desarrollados.

Genoma secuenciado. Validación de dianas mediante tecnologías antisentido.

Modelo vertebrado con un ciclo de vida corto. Validación de dianas mediante tecnologías antisentido.

Estabilidad genética, disponibilidad ilimitada y facilidad de manipulación genética. Permiten estudiar genes que causan mortalidad en fetos de ratones knock-out.

Gran capacidad de almacenamiento y poder de cálculo.

Desventajas

Requieren de la disponibilidad de muestras de tejidos.

Requiere la transfección de ADN a las células.

Laborioso y costoso. Letalidad de embriones. Bajo rendimiento.

Laborioso y costoso. Bajo rendimiento.

Mutaciones no dirigidas. Dificultad de identificar genes mutados.

Organismo simple que no permite el estudio de procesos complejos. Su uso se limita a ciertas enfermedades.

Modelo invertebrado.

Modelo invertebrado.

No existen knock-outs.

Disponibilidad de células madre.

Requiere de datos experimentales o bases de datos.

Tabla 3. Comparación de las principales técnicas empleadas en validación de dianas. Fuente: elaboración propia.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

4. Estrategias de validación de dianas

El objetivo de la validación de dianas consiste en demostrar la implicación de una determinada diana en un proceso patológico. En función de las técnicas empleadas para validar una diana, el grado de validación alcanzado será diferente. El nivel más alto de validación de dianas se consigue mediante la demostración de que la modificación de una diana revierte la sintomatología asociada a la patología en cuestión, lo que sólo ocurre cuando el fármaco ya se encuentra en el mercado. Por este motivo, se ha desarrollado un amplio abanico de técnicas de validación de

dianas, fundamentales para la obtención de fármacos eficaces en el menor tiempo posible 105 .

Existen varias estrategias que se pueden emplear a la hora de desarrollar nuevos fármacos frente a enfermedades. El optar por una u otra estrategia dependerá del conocimiento previo que se posea acerca de las potenciales dianas, de la disponibilidad de muestras biológicas procedentes de individuos tanto enfermos como sanos, y del dominio y disponibilidad de las técnicas de validación de dianas.

Estrategia inversa

Estrategia directa

validación de dianas. Estrategia inversa Estrategia directa Gen Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación

Gen

de dianas. Estrategia inversa Estrategia directa Gen Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación dirigida

Proteína

dianas. Estrategia inversa Estrategia directa Gen Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación dirigida

ARN

Estrategia inversa Estrategia directa Gen Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación dirigida Modificación
Estrategia inversa Estrategia directa Gen Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación dirigida Modificación
Genes ARNs Proteínas
Genes
ARNs
Proteínas
Modificación dirigida

Modificación dirigida

Modificación dirigida
Modificación dirigida
Proteína ARN Genes ARNs Proteínas Modificación dirigida Modificación al azar Fenotipo alterado Fenotipo alterado
Modificación al azar

Modificación al azar

Modificación al azar
Modificación al azar
Proteínas Modificación dirigida Modificación al azar Fenotipo alterado Fenotipo alterado Búsqueda de la diana
Fenotipo alterado

Fenotipo alterado

Fenotipo alterado
Fenotipo alterado
Fenotipo alterado
Fenotipo alterado
Fenotipo alterado

Fenotipo alterado

Fenotipo alterado
Fenotipo alterado
Modificación al azar Fenotipo alterado Fenotipo alterado Búsqueda de la diana de interés Asociación de una
Búsqueda de la diana de interés
Búsqueda de la diana de interés

Búsqueda de la diana de interés

Búsqueda de la diana de interés
Búsqueda de la diana de interés
Búsqueda de la diana de interés

Asociación de una diana con el fenotipo

Figura 17. Estrategias de validación de dianas. Fuente: Doan T. N., et al. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. 3 (5):

191-197.

105 Drews, J. (2000). Drug Discovery: A Historical Perspective. Science, 287: 1960-1964 .

• En aquellas ocasiones en las que existe información previa acerca de las dianas potencialmente
• En aquellas ocasiones en las que existe información previa acerca de las dianas potencialmente

• En aquellas ocasiones en las que existe información previa acerca de las dianas potencialmente implicadas en una enfermedad concreta, es posible proponer su implicación en el proceso patológico. En estas ocasiones, se opta por una estrategia inversa o dirigida de validación de dianas, en la cual se altera la expresión de un gen o proteína conocida para

demostrar su implicación en el desarrollo de la enfermedad. Por tanto, para esta estrategia son de utilidad aquellas técnicas que permiten alterar selectivamente la función de una diana concreta y observar los cambios debidos a estas alteraciones. Las técnicas de modulación de la expresión génica como la tecnología antisentido

y las técnicas de inactivación de proteínas como los anticuerpos monoclonales, permiten

establecer la relacion entre el fenotipo y una diana concreta.

• En los casos en los que no se dispone de

información acerca de las dianas implicadas en

la enfermedad de interés, o bien se desea

descubrir dianas novedosas para una enfermedad concreta, la estrategia ha de ser

necesariamente diferente y se puede optar por

el empleo de estrategias al azar también

denominadas estrategias directas. Estas estrategias consisten en el estudio de los cambios en el fenotipo debidos a la modificación de genes o proteínas que se realiza al azar, de modo que se desconoce la función del gen o proteína sobre la que se está actuando y se pretende validar. Como resultado, se obtienen células u organismos con alteraciones que dan

lugar a fenotipos diversos, entre los que alguno puede estar relacionado con enfermedades interesantes. Una vez detectado el fenotipo de interés y dado que la modificación que ha dado lugar al mismo es desconocida, se ha de buscar

el gen o la proteína diana, es decir el gen

responsable del fenotipo de interés. De este modo se establece la relación entre la diana y el fenotipo relacionado con la enfermedad. Existe una gran diversidad de técnicas que permiten modificar genes o proteínas al azar, siendo habitual el empleo de técnicas como las tecnologías antisentido, las técnicas de bloqueo de proteínas y la mutagénesis al azar en organismos modelo. La principal desventaja de las estrategias directas o al azar consiste en que

en ocasiones resulta difícil identificar la diana sobre la que se ha actuado 106 .

Las técnicas moleculares que se emplean para validar dianas son muy diversas en cuanto a su naturaleza. De hecho, cualquier técnica que permita asociar una proteína o un gen a una característica o a un fenotipo, es susceptible de ser aplicada en la validación de dianas. Por otra parte, las técnicas que se emplean en la validación de dianas pueden ser de utilidad en otras etapas de la investigación farmacológica, como los ensayos preclínicos mediante cultivos celulares y modelos vivos de la enfermedad, los cuales se emplean prácticamente a lo largo de todo el proceso de investigación farmacéutica previo a los ensayos clínicos en humanos. Las diferentes técnicas descritas en el presente informe se pueden aplicar en diversos momentos de los programas de I+D en función de los recursos de los que se disponga y del grado de validación que se desee alcanzar.

El desarrollo de nuevos fármacos por parte de la industria farmacéutica se aborda habitualmente mediante una primera identificación de un elevado número de dianas potencialmente asociadas a la enfermedad. Las técnicas de validación que se suelen aplicar en primer lugar han de ser rápidas, de alto rendimiento, coste reducido y capaces de eliminar las dianas no válidas, en las cuales no merece la pena invertir mayores esfuerzos. Las tecnologías de análisis de la expresión génica, interacciones proteína- proteína y el cribado virtual son las técnicas que se realizan en las etapas iniciales ya que a pesar de que no permiten establecer una asociación robusta entre la enfermedad y la diana, permiten identificar y descartar parte de las dianas con rapidez. Posteriormente, se aplican otras técnicas que si bien requieren más tiempo y presentan un rendimiento inferior, permiten establecer una asociación más concluyente entre la diana y la enfermedad. Éste es el caso de las técnicas de modulación de la expresión y bloqueo de proteínas diana, que se suelen aplicar sobre cultivos celulares o modelos animales. Los modelos vivos de la enfermedad constituyen el nivel superior de validación de dianas y aunque su coste es muy elevado, se emplean tanto en validación de dianas como en la investigación preclínica previa a los ensayos en humanos.

106 Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, Nº 5:

191-197.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS

Identificación Identificación Validación Investigación y optimización de dianas de dianas preclínica del
Identificación
Identificación
Validación
Investigación
y optimización
de
dianas
de
dianas
preclínica
del compuesto
Análisis
de
la
expresión
Interacción
proteína-proteína
Ensayos en animales
Cribado
virtual
Modulación
de
la
expresión
Inactivación
de
proteínas
Modelos
vivos
de
enfermedad
Ensayos clínicos
Ensayos
clínicos

Ensayos en humanos

• Fase I

• Fase II

• Fase III

• Fase IV

Fig. 18. Aplicación de las técnicas de validación de dianas a lo largo de la investigación farmacéutica. Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 24. Nº8: 434-439.

Por tanto, la validación de una diana terapéutica es un proceso en el cual están implicadas más de una única técnica, permitiendo establecer con la suficiente robustez la asociación de la diana con una enfermedad concreta. Una adecuada validación de dianas requerirá entonces la combinación de varias técnicas entre sí, de modo que se pueda asociar con un grado de certidumbre suficiente una diana y su enfermedad, y de este modo validar o descartar las potenciales dianas terapéuticas identificadas. La elección de las tecnologías más adecuadas vendrá determinada por distintos factores. En el caso de que hubiese que adoptar tan solo dos técnicas, sería recomendable emplear tecnologías que actúen a nivel génico y a nivel de proteína respectivamente, ya que ofrecería una visión de conjunto más completa acerca de la función de la diana. No obstante, las técnicas elegidas vendrán determinadas en gran medida por el coste previsto del ensayo, el tiempo disponible, y los resultados obtenidos a partir de los ensayos de validación previos 107 .

La aproximación que hemos tenido en cuenta hasta el momento se basa en la presunción de que un fármaco ejerce su acción únicamente sobre una diana, lo cual es bastante improbable debido a la complejidad biológica de los procesos patológicos. Un escenario más parecido a la realidad sería aquel en el cual un fármaco interaccionara con múltiples dianas que estuvieran implicadas directamente en ciertas patologías. El fármaco ideal consistiría en un compuesto dirigido frente a múltiples dianas, todas ellas relacionadas con el proceso patológico de interés, de forma que el efecto terapéutico se viera potenciado. El ejemplo más característico es el imanitib, comercializado por Novartis con el nombre Glivec ® como fármaco frente a la Leucemia Mieloide Crónica y tumores de ciertas células del estroma gastrointestinal. Este medicamento es capaz de frenar la expresión de determinadas proteínas anormales características de estas patologías, pero también posee la capacidad de bloquear otras vías aberrantes de señalización celular relacionadas con la aparición de tumores, confiriéndole al producto un extraordinario valor añadido 108 .

107 Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets. Drug Discovery Today. 9(3): 117-26. 108 Glivec ® (imatinib mesylate, USA Gleevec ® ), Novartis Pharmaceuticals Corp. (http://www.glivec.com/espanol/content/site_disclaimer.jsp)

5. Aplicaciones de las técnicas de validación de dianas El presente apartado pretende incidir en
5. Aplicaciones de las técnicas de validación de dianas El presente apartado pretende incidir en

5. Aplicaciones de las técnicas de validación de dianas

El presente apartado pretende incidir en aquellas enfermedades para las cuales es esencial la identificación de nuevas dianas terapéuticas, así como la validación de algunas dianas ya conocidas que forman parte de procesos biológicos implicados en las patologías de interés. Por otra parte, se ha realizado una revisión de los principales tipos de dianas terapéuticas descritas, junto con las estrategias tecnológicas empleadas en su validación.

5.1. Enfermedades que requieren nuevas dianas

Numerosas enfermedades de alta incidencia en la población conllevan necesidades médicas que no han sido resueltas por la medicina actual. Algunas enfermedades no poseen tratamientos eficaces para el paciente, mientras que para otras patologías tan sólo existen tratamientos paliativos que poseen una eficacia limitada o bien dan lugar a efectos secundarios que limitan su uso generalizado. Gran parte de estos problemas se solucionarían mediante la identificación y validación de las dianas terapéuticas implicadas en estas enfermedades. Por este motivo, la identificación y validación de nuevas dianas terapéuticas es una necesidad a la hora de desarrollar nuevos y mejores fármacos.

Enfermedades para las que es necesario identificar y validar nuevas dianas 109 • Enfermedades
Enfermedades
para
las
que
es
necesario
identificar
y
validar
nuevas