CAP.

Introducere n lumea viului

1.1. Structura celular- unitatea de baz a viului

Marea diversitate a formelor de via de pe pmnt presupune totui multe trsturi comune. n mod fundamental toate organismele vii au anumite caracteristici care le difereniaz de lucrurile nevii. Merit evideniate dou: - organismele vii au abilitatea de a se reproduce; - organismele vii au abilitatea de a-i extrage energia necesar din mediul n care triesc. Toate organismele vii utilizeaz acelai principiu organizaional de baz i anume constituirea din uniti de mici dimensiuni. Fiecare unitate de via, care servete ca baz fundamental a viului, este o entitate n sine i poart numele de celul. n forma cea mai simpl, organizarea unei celule const dintr-un nveli exterior numit membran celular ce nconjoar un mediu intern denumit citoplasm. n interiorul celulelor au loc toate reaciile chimice care servesc procurrii energiei din mediul nconjurtor, ca i procesele care asigur creterea organismului, micarea, reproducerea sau alte funcii. Cum biotehnologiile se bazeaz n mod fundamental pe procesele ce au loc in nteriorul celulelor este necesar ca structura i organizarea celular sa fie elemente bine cunoscute. 1.1.1. Organizarea celulelor Sunt astzi cunoscute foarte multe tipuri de organisme constituite din diferite tipuri de celule, dar n ceea ce privete structura celular de baz sunt cunoscute doar dou tipuri diferite de celule: - procariote (fig.1); - eucariote (fig. 2). Singurele organisme ce conin celule procariote sunt bacteriile, organisme unicelulare rspndite n mediile cele mai diferite. Toate celelalte organisme chiar i cele unicelulare, cum sunt levurile sau algele sunt eucariote. Diferena esenial ntre cele dou tipuri de celule, procariote i eucariote, este modul diferit de organizare interioar. Fiecare din cele dou tipuri de celule are la exterior o membran, care ndeplinete diferite roluri, unul din cele mai importante fiind de barier selectiv ntre interior i mediul exterior. Celulele procariote au un singur compartiment intern citoplasm spre deosebire de cele eucariote care prezint mai multe compartimente, fiecare dintre acestea fiind delimitat de o membran proprie. Stocarea informaiilor genetice se face la celulele procariote ntr-o regiune a citoplasmei denumit nucleoid, spre deosebire de cele eucariote care prezint un nucleu bine individualizat de ctre o membran nuclear.

Fig. 1. Celula procariot. Se observ inexistena compartimentrilor interne iar AND-ul ocup o regiune a citoplasmei denumit nucleoid.

Fig. 2. Celula eucariot (celul vegetal tipic)

Celulele eucariote i cele procariote se deosebesc i prin dimensiunile acestora, primele fiind cu mult mai mari, avnd diametre de pn la zece ori mai mari ca cele din urm. De asemenea, celulele eucariote se dezvolt mai ncet, se reproduc cu o frecven mult mai mic fa de cele procariote i au funcii specifice cum ar fi transportul oxigenului, transmiterea impulsurilor nervoase i multe altele. Datorit acestor funcii specifice celulele sunt organizate n organismele vii, n uniti funcionale denumite esuturi.

1.2. Biomolecule
Moleculele reprezint din punct de vedere chimic entiti care n condiii normale nu pot fi divizate n uniti cu dimensiuni inferioare meninnd caracteristicile originale. Moleculele care intr n componena celulelor sunt denumite de literatur biomolecule, iar n prezent datorit studiilor de biochimie, structura i proprietile compuilor moleculari ce intr n componena organismelor vii sunt bine cunoscute. nainte de a detalia trebuie precizat ca biomoleculele au i caracteristici comune dintre care merit reinut structura polimeric (fig.3) preponderent liniar.

Fig. 3. Polimeri biologici (ansamblu format din unitati individuale denumite monomeri)

1.2.1. Lipide

Lipidele, numite i grsimi, constituie rezerva de energie cea mai concentrat a organismelor vegetale i animale. Prezente n toate celulele (n concentraii variabile n limite largi) ele intervin n reglarea permeabilitii membranelor celulare, n absorbia i transportul vitaminelor liposolubile, unii acizi grasi avnd chiar aciune vitaminica (vitamine F).

Lipidele formeaz o clas heterogen de substane, caracterizate n primul rnd prin anumite proprieti comune: insolubilitate n ap, solubilitate n solveni organici (cloroform, tetraclorur de carbon, eter etilic, etc.). Grsimile propriu-zise se clasific n simple i complexe. Grsimile simple sunt substane ternare (C, H, O), esteri ai acizilor grai cu alcooli neazotati (glicerol, alcooli monovalenti superiori etc.). Alcoolul este un alcool monooxidrilat superior n cazul cerurilor; glicerol n cazul gliceridelor (grsimilor neutre); un acid gras hidroxilat n cazul etolidelor i un sterol la steride. n grsimile complexe un ester de acid gras este combinat cu alte substane care conin grupri funcionale variate. Ele sunt substane cvaternare sau mai complexe i conin C, H, O, P, sau C, H, O, P, N etc. Lipidele propriu-zise se pot scinda n componente prin hidroliz: ele sunt saponificabile. Sunt nesaponificabile substanele clasificate n clasa lipide numai pe baza proprietilor lor fizice: sterolii, lipocromii, etc. Lipidele complexe i cele nesaponificabile se mai numesc i lipoide.

1.2.2. Protide
Protidele sunt componente structurale i funcionale de insemnatate primordial ale materiei vii. Stiinta modern a confirmat pe deplin teza lui Engels, care caracterizeaz substanele proteice ca purttoare ale vieii, iar metabolismul ca funciunea lor esential, din care decurg toate celelalte caractere generale ale materiei vii. n compoziia elementar a protidelor sunt nelipsite elementele chimice: C, O, H, N i (cu puine excepii) S, coninute ntre urmtoarele limite procentuale: C= 50,6-54,5 %; O = 21,5-23,5 % ; H = 6,5-7,3 %; N = 15,0-17,6 %; S = 0,32-2,5 %. n protide au mai fost identificate P i elemente minerale, ca: Fe, Cu, Zn, Co, Mg. Protidele se gsesc n proporie mult mai mare n celulele animale dect n cele vegetale. Protidele constituie 45% din masa uscat a corpului omenesc i numai 1,6% din boabele de orez. Protidele sunt produi macromoleculari avnd ca elemente structurale fundamentale aminoacizii. n grupa protidelor intr aminoacizii (monopeptide) precum i toi compuii chimici care prin hidroliz elibereaz aminoacizi (peptide i proteide). Proteidele se mpart in holoproteide (sau proteine) i heteroproteide (dac alturi de aminoacizi mai conin i componente de alt natur).

AMINOACIZI (MONOPEPTIDE) PROTID E PEPTIDE (OLIGO I POLIPEPTIDE) PROTEIDE (MACROPEPTIDE) HOLOPROTEIDE (PROTEINE) HETEROPROTEID E 4

Rolul fiziologic al protidelor este foarte variat i important. n mod concret: - sunt cele mai importante constituente plastice ale materiei vii; - contribuie cu 16 % la acoperirea necesarului energetic al organismului; - extrem de important este rolul lor biocatalitic; ele constituie molecula proteohormonilor si proteoenzimelor i o serie de factori regulatori sau stimulatori ai proceselor metabolice; - formeaz sisteme tampon foarte sensibile i eficace; - au rol de anticorpi n reaciile imunologice; - prin presiunea lor osmotic-oncotic, contribuie la meninerea echilibrului hidric al organismului; - au rol de coloizi protectori, stabiliznd suspensiile i emulsiile substanelor greu solubile; - proteinele plasmatice (n special globulinele) au rol n transportul substanelor cu curentul sangvin; - prin modificrile lor fizico-chimice intervin n exercitarea unor importante funciuni fiziologice: contracia muscular, transportul de oxigen,etc.; - nucleoproteidele au rol important n autoreproducerea materiei vii.

1.2.3. Acizi nucleici

La fel ca protidele, acizii nucleici sunt componente de nsemntate fundamental ale materiei vii. Prezeni n toate celulele vii (animale, vegetale, bacteriene) i n toate virusurile, aceti compui au rol hotrtor n momentele eseniale ale autoreproducerii materiei vii: pstrarea, transmiterea la descendeni i exprimarea caracterelor ereditare. Cercetrile efectuate asupra acestor compui au relevat c cele dou tipuri distincte de acizi nucleici acizi ribonucleici (ARN) i acizi dezoxiribonucleici (ADN) sunt prezeni n orice celul vie: ADN preferenial (dar nu exclusiv) n nucleu (i n cloroplastele plantelor), ARN masiv n citoplasm (dar i n nucleu). Funcia esential a ADN cromozomial este dirijarea genetic a biosintezei proteinelor n citoplasma celulei. Dar aceasta, nu o fac direct, ci conlucrnd cu cele trei tipuri de ARN. Informaia ereditar este transmis de un ARN mesager de la ADN la organele proteosintezei: ribozomii citoplasmatici, la care aminoacizii proteoformatori sunt adui de nite ARN transportori. Constituienii nelipsii ai ribozomilor sunt acizii ribonucleici ribozomali. Componente structurale ale acizilor nucleici. Prin hidroliz, acizii nucleici sunt descompui n nucleotide. Fiecare nucleotid este constituit dintr-o baz azotat, o pentoz (alctuind mpreun un nucleozid) i o molecul de acid fosforic.

Bazele azotate pot fi pirimidinice sau purinice. n afar de cele cinci baze principale, componente normale ale tuturor acizilor nucleici, se cunosc i numeroase baze minore prezente ca elemente structurale rare n molecula unora dintre ei. Caracterul bazic manifestat n soluie apoas de aceste substane, este consecin a faptului, c ele conin n molecul atomi de azot cu electroni neparticipani. Dintre bazele azotate principale, citozina, adenina i guanina fac parte din constituia tuturor acizilor nucleici. Uracilul se gsete numai n ARN, iar timina numai n ADN. Pentoze. Constituente normale ale acizilor nucleici sunt D-riboza (n ARN) i 2-D-dezoxiriboza (n ADN). n mod excepional din hidrolizate au fost izolate i alte pentoze sau substane nrudite cu acestea. Structura acizilor nucleici. Acizii nucleici sunt polimeri ai nucleotidelor. Indiferent de tipul de care aparin (ARN sau ADN), molecula lor este constituit din lungi lanuri polinucleotidice. n aceste lanuri, resturile de acid fosforic formeaz legaturi diesterice cu cte dou molecule de pentoz la atomul de carbon 3 din una si 5 din cealalt. Astfel iau natere catene lungi n care resturile de acid fosforic alterneaz cu resturile pentozice. Acest schelet este comun tuturor acizilor nucleici, cu deosebirea, c n acizii ribonucleici (ARN) pentoza este riboza, iar n cei dezoxiribonucleici (ADN) dezoxiriboza. Ceea ce diferentiaz de la caz la caz structura primar a acizilor nucleici este succesiunea bazelor din nucleotide. Acestea formeaz aa ziii radicali laterali ai lanului polinucleotidic (fig.4).

Fig.4. Constituia acidului dezoxiribonucleic. Structura parial a helixului dublu, dupa Watson i Crick.

1.3.4. Glucide
Glucidele (numite i zaharide sau, cu un termen impropriu, hidrai de carbon) constituie combustibilul principal i substanele de rezerv cele mai uor disponibile ale celulelor. n plus, multe dintre ele sunt constituente ale substanelor plastice cu rol de susinere i de protecie la vegetale i la nevertebrate, respectiv componente ale unor biocatalizatori importani. Sunt substane ternare, formate din C, H, O; unele dintre ele aminozaharurile conin i azot.

Glucidele se clasific n oze i ozide (fig.5). Ozele se numesc i monoglucide, monozaharide sau zaharuri simple. Se mpart n aldoze i cetoze. n funcie de numrul atomilor de carbon din scheletul moleculei (n general neramificat) se disting: bioze (C2), trioze (C3), tetroze (C4), pentoze (C5), hexoze (C6) etc. pn la (C10). Ozidele sunt produi de condensare ai monoglucidelor. Holozidele au molecula constituit numai din resturi monoglucidice, iar heterozidele (glicozidele) sunt compui ai glucidelor cu ali constituieni numii agliconi. La rndul lor holozidele se mpart n: - oligoglucide (oligozaharide), avnd molecula constituit din dou pn la ase resturi monoglucidice condensate; - poliglucide (polizaharide), avnd molecula format dintr-un numr mare de molecule monoglucidice condensate, identice sau diferite.

Glucide Oze Aldoz e Cetoze Holozid e Oligoglucid e Ozide Heterozide

Poliglucide

Homopoliglucid e Heteropoligluci de Fig. 5. Schema de clasificare a glucidelor.

Glucidele prezente n compoziia bacteriilor reprezint 4-25% din masa bacteriilor uscate i pot aprea ca zaharuri simple (mono i dizaharide) i polizaharide (pentoze, hexoze). Bacteriile nu conin celuloz. Unele, cum ar fi cele din specia Acetobacter xylinum formeaz la suprafaa mediului de cultur celuloza bacterian sub form de microfibrile cu aspect de psl. n celulele de drojdii (sau levuri) glucidele au rol structural (ex. glucozamina, chitina, mananul i glucanul din peretele celular) i intr n constituia unor molecule eseniale ca ADN (dezoxiriboza) i ARN (riboza) sau sunt depozitate ca substane de rezerv (glicogen). Din grupa homopoliglucidelor, dextranii sunt sintetizai n cantiti mari (sub forma de filamente) de ctre microorganismul Leuconostoc mesenteroides i ali microbi nrudii, din glucoz sau chiar din zaharoz. Dextranii sunt polizaharide puternic dextrogire, cu mas molecular foarte variabil. n constituia lor predomin legturile 1,6--glicozidice, greu accesibile enzimelor de origine animal. Pentru acest fapt, dextranii, care n concentraii mai mici de 10% dau soluii apoase perfect transparente, se folosesc la nlocuirea proteinelor plasmatice n serul fiziologic administrat bolnavilor cu hemoragii. Din grupa heteropoliglucidelor menionm galactanii care iau natere din galactoz, prin policondensare. Varietile de agar-agar, extrase din algele roii ale Mrilor Indiei i Chinei au molecula format n cea mai mare parte din catene lungi de D-galactopiranoza, legate 1,3-glicozidic. Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultur microbiene. Se folosete i ca laxativ i n industria textil.

1.4. Legturi biomoleculare

chimice

implicate

structurile

Legturile chimice confer biomoleculelor stabilitatea stucturii acestora, determinnd n acelai timp interaciunile inter-moleculare. n marea lor majoritate biomoleculele au n componen atomi de carbon, oxigen, hidrogen, azot, sulf i fosfor a cror proprieti chimice particulare sunt binecunoscute. Acesia pot reaciona n moduri diferite rezultnd uneori forme stabile de interaciune numite legturi. Aceste legturi sunt de mai multe tipuri dar pentru sistemele biologice prezint importan doar trei: legatura ionic, legatura covalent i legatura de hidrogen.

Legatura ionic apare ntre un atom ce are capacitatea de a ceda cu usurin electroni i un altul ce poate accepta aceti electroni. Se produce astfel un transfer de electroni de la elementul puternic electronegativ, cu potenial de ionizare sczut, la elementul puternic electropozitiv, cu afinitate ridicat pentru electroni. Ionii astfel formai nu rmn izolati ci se atrag electrostatic ntre ei, pn la o distan minim permis de repulsiile ntre nveliurile lor electronice. Nu se poate vorbi n cazul combinaiilor ionice, de molecule, ci de reele ionice. Astfel, n reteaua cristalin a clorurii de sodiu fiecare ion atrage i coordineaz n jurul sau la distan minim 6 ioni de semn contrar. Formarea combinaiilor ionice respect regulile stabilite empiric de ctre K. Fajans (1924). Un atom trece n stare ionic cu att mai uor, cu ct: - configuraia electronic realizat este mai stabil; - sarcina ionului este mai mic; - raza atomic este mai mare pentru cation i mai mic pentru anion. Se cunoate c o legatur chimic pentru a fi stabil, trebuie s se formeze cu degajare de energie. Cu ct energia degajata la formarea legturii din atomi liberi este mai mare cu att combinaia rezultat este mai stabil. Toate combinaiile ionice cunoscute sunt combinaii exoterme. Ele nu formeaz molecule propriu-zise, deoarece cmpul electric al ionilor este uniform distribuit n toate direciile. Fiecare ion poate de aceea atrage ioni de semn opus din orice direcie sau altfel spus, legatura ionic (spre deosebire de cea covalent), nu este dirijat. Legatura ionic nefiind dirijat n spaiu i nici rigid permite dizolvarea combinaiei ionice n solveni polari (ex. apa), precum i substituirea uoar a ionilor din reea cu ali ioni. Tria legturilor ionice trebuie considerat n contextul n care acestea se formeaz. Pentru sistemele biologice (la care practic toate componentele se gsesc imersate n ap) legatura ionic poate fi caracterizat ca o legatur relativ slab ce se formeaz ntre atomi ce pot, cu uurin, purta sarcini electrice. Legatura covalent se realizeaz prin punerea n comun a electronilor nemperecheai ai atomilor i conduce la formarea de molecule (agregate de atomi unii prin covalente) sau reele atomice. Covalenta, spre deosebire de legatura ionic, fiind dirijat n spatiu, atomii unei molecule ocupa poziii fixe unii fa de ceilali. Aceste poziii nu se pot schimba nici chiar prin modificarea strii de agregare, lungimea legturii i unghiurile de valen fiind caracteristice moleculelor. n funcie de natura atomilor care particip la formarea legturii moleculei, se deosebesc dou tipuri de covalente: - covalenta nepolar stabilit ntre atomi de acelai fel i caracterizat prin apartenena perechii de electroni de legtura n mod egal la cei doi atomi legai, de exemplu formarea moleculei de hidrogen sau de clor; - covalenta polar stabilit ntre dou specii diferite de atomi, caracterizat prin deplasarea de electroni de legtura, ctre elementul cel mai electronegativ. Astfel, apar sarcini electrice pariale, negativ la atomul mai electronegativ i pozitiv la atomul mai puin electronegativ. Covalenta polar joac un rol foarte important n stabilirea modelului sau a formelor structurale ale moleculelor biologice i chiar a funcionrii acestora. Cei mai muli aminoacizi, de exemplu, prezint catene laterale formate cu legturi polare.
9

n concluzie, legatura covalent are dou caracteristici eseniale care o deosebesc de alte tipuri de legturi i anume: rigiditatea i dirijarea ei n spaiul din jurul atomului. Rigiditatea este caracteristica covalentei de a se menine neschimbat n orice condiii de existen a moleculei respective. Desfacerea covalentei duce la transformarea chimic a substanei, n timp ce desfacerea legturii ionice, de exemplu solubilizarea substanei n ap, nu duce la transformarea chimic a acesteia. Legatura de hidrogen este un tip de legatur intermolecular care se realizeaz ntre protonii unei molecule i un atom puternic electronegativ (F, O, N, Cl, etc.) dintr-o molecul vecina, rezultnd asociaii moleculare, care pot exista n special n stare lichid i solid. Aceast asociere prin legturi de hidrogen determin o cretere a masei moleculare i deci influeneaz unele proprieti ca vscozitate, solubilitate, temperatur de fierbere i de topire, tensiune superficial, etc. Cele mai bune exemple de legturi de hidrogen intermoleculare ne sunt oferite de asociaiile moleculare ale apei n stare lichid (fig. 6) sau de ghea (H2O)n i ale acidului fluorhidric n toate strile de agregare.

Fig. 6 Legturi de hidrogen n ap. (a) Forma i polaritatea unei molecule de ap. (b) Legturi de hidrogen ntre molecule de ap. (c) Cristal de NaCl solvit n ap moleculele polare de ap nconjoara fiecare ion protejnd sarcina electric. Exemplul din fig. 6 (c) este foarte sugestiv pentru interaciunile ce au loc ntre biomoleculele din compoziia celulelor i mediul apos n care acestea exist. Toate biomoleculele sunt practic dizolvate n ap. Un strat foarte subire de ap nconjoar fiecare biomolecul ngreunnd uneori interaciunile posibile ntre acestea. Legturile de hidrogen sunt foarte slabe n comparaie cu legturile covalente dar chiar n aceste condiii ele sunt instrumente foarte importante care asigur meninerea unor structuri i implicit a unor funcii normale.

10

Fore hidrofobe. Natura interaciunilor hidrofobe poate fi uor neleas urmrind urmtorul exemplu: adugnd o molecul nepolar cum ar fi molecula unei lipide n ap, acestea din urm i modific interaciunile normale (puni de hidrogen) pentru a ngloba n sistem molecula hidrofob. Dac n acelai mediu se adaug din ce n ce mai multe molecule hidrofobe, acestea au tendina de coeziune nu datorit unei atracii ntre ele ci pentru ca astfel, puterea de dezbinare a apei este mult mai mic. Coeziunea este asigurat de fore hidrofobe, care de altfel sunt rspunzatoare i de formarea membranelor n interiorul celulelor. Prezena fortelor hidrofobe poate fi evideniat i la alte biomolecule ca de exemplu la proteine. Este cunoscut faptul c proteinele sunt constituite din lanuri de aminoacizi n vecintatea crora se pot gsi numeroase grupri hidrofobe. Aflate ntr-un mediu apos, acestea au tendina de a se aglomera. De multe ori, lanurile proteice se pliaz nglobnd n centrul acestui edificiu gruprile hidrofobe. Pentru o mare parte din proteine, cunoscute sub denumirea de proteine globulare, lanul polipeptidic lung este fragmentat prin cotituri de 1800 n segmente paralele, dispuse pe suprafaa lateral a unui cilindru. De gruprile polare libere NH 2 , -COOH ale acestora se leag peptidic segmente liniare. Structura este stabilizat prin legturi de hidrogen ntre segmentele nvecinate (fig. 7).

1.5. Reacii i procese specifice organismelor vii

11

1.5.1. Reacii de oxido-reducere. Stocarea energiei suplimentare Prin oxido-reducere biologic se nelege pierderea atomilor de hidrogen (respectiv a electronilor) din molecula unei substane care acioneaz ca donor de H sau electroni (D) i transferul lor la molecula unei alte substane care funcioneaz ca acceptor (A). Aceste reacii de oxidoreducere au un caracter reversibil i pot fi exprimate prin ecuaia general: DH2 + A D + AH2

Din ecuaie rezult c oxidarea, care se realizeaz prin captarea a 2 H, este n fond o dehidrogenare. Procesul nu se realizeaz spontan, ci prin intervenia unor catalizatori specifici dehidrazele; reacia invers este cea de hidrogenare. Procesele de oxidare sunt generatoare de energie. Pentru a obine energia necesar, celulele recurg la oxidarea substratelor ce conin atomi de carbon, cel mai adesea a zaharurilor(de la formele simple cum este glucoza pn la celuloz, amidon, etc.). Deoarece oxidarea biologic elibereaz n final o mare cantitate de energie, folosirea acestui mecanism n condiii optime se poate asigura prin eliberarea sub form fracionat a energiei sau prin stocarea excesului de energie n vederea utilizrii ulterioare. Eliberarea sub form fracionat a energiei este posibil ca urmare a faptului c reaciile de oxido-reducere au loc succesiv, sunt catalizate de enzime specifice iar atomii de hidrogen sunt transportai la substratul acceptor, pe calea unui ntreg lan de reacii cuplate. Aceste reacii asigur pe lng degradarea fracionat i ordonat a substanelor organice nutritive i folosirea energiei eliberate prin oxidare pentru biosintez. Stocarea energiei suplimentare. Energia suplimentar, eliberat din reaciile de oxido-reducere nu se pierde, ci este depozitat ntr-un produs special, din care, la nevoie, poate fi eliberat cu usurin. Acest produs este acidul adenozin trifosforic (ATP). Compusul deriv din dou fosforilari consecutive, de la acidul adenozin monofosforic (AMP). Dac n molecula de AMP se introduce prin oxidare o molecul de fosfat anorganic (Pi), aceasta se leag de gruparea fosfat a AMP printr-o legtur macroergic i astfel rezult primul compus macroergic acidul adenozin difosforic (ADP), care, la rndul su se poate transforma printr-o nou fosforilare oxidativ n cel de al doilea compus macroergic acidul adenozin trifosforic (ATP ). Acesta din urm posed dou legturi si, ca atare, nmagazineaz o i mai mare cantitate de energie. Att ATP ct i ADP pot ceda cu uurin fosforul i n acest caz, legtura macroergic se rupe, iar energia sa latent devine accesibil consumului pentru diferite nevoi ale celulei. Utilizarea radicalilor fosforici puternic energetici reprezint o modalitate de obinere a energiei necesare reaciilor de biosintez. ADP i ATP constituie deci inelul de legatur dintre reaciile oxidative productoare de energie i cele de sinteza care necesit energie (fig. 8).

AMP + Pi

ADP
12

ADP

ATP Fosforilare oxidativ +P ADP -P ATP Sinteze care consum energie Consum de P

Oxidri Eliberri de energie Furnizare de P

Fig. 8. Rolul APT n reaciile de oxido reducere Microorganismele chimiosintetizante i obin energia necesar producerii ATP din reaciile de oxido-reducere productoare de energie, care au loc n timpul procesului de respiraie. n procesele metabolice de tipul fermentaiei, n care diferii compui servesc n acelai timp ca donor i ca acceptor de H n reaciile de oxidoreducere productoare de energie, mecanismul obinuit de formare a ATP este cunoscut sub denumirea de fosforilare la nivelul substratului. Are loc adiia prin aciunea enzimatic a P la o substan n curs de oxidare, cu producerea unei legturi n produsul oxidat. n etapa urmtoare grupul P este transferat la ADP cu formare de ATP. Unele bacterii pot produce ATP pe seama ADP prin intervenia acetilCoA, dup reacia: CH3-CO-CoA + ADP + H3PO4 = CH3COOH + CoA + ATP 1.5.2. Cataliza enzimatic. Echipamentul enzimatic. Pentru ca doi atomi sau orice ali compui s reacioneze trebuie s ndeplineasc mai nti o condiie de proximitate adic sa se gseasc la o distan suficient de mic i ntr-o poziie convenabil reaciei. Energia de activare reprezint cantitatea de energie necesar pentru a fi ndeplinite aceste condiii particulare. Accelerarea vitezei unui proces sau reacie determinat de un catalizator, de obicei prezent n cantiti mici i care nu intervine n mersul reaciei poart numele de cataliz. Un catalizator permite reaciei s aib loc mult mai eficient micornd energia de activare (fig. 9).

13

Fig. 9. Energia de activare.(b) Catalizatorul care micoreaz energia de activare. Catalizatorii proceselor biologice sunt denumii enzime. Acei compui catalizeaz orice reacie chimic ce are loc n interiorul celulelor i sunt caracterizai prin specificitatea lor fa de substrat i prin comportarea lor ca acceleratori ai unor reacii care implic formarea sau scindarea de legturi covalente. Din acest punct de vedere enzimele pot fi: 1. oxidoreductaze A- + B 2. transferaze A-B + C 3. hidrolaze A-B + H2O A-H + B-OH A + B-C A + B-

4. liaze catalizeaz separarea unei grupe pentru a forma o legtura dubl sau adiia unei grupe la legatura dubl. A X B Y A=B + X-Y

14

5. izomeraze Y A X B Y A X B

6. ligaze (sintaze) A+B AB

Multe dintre enzime necesit, pentru a-i desfaura activitatea, o serie de molecule mici, numite cofactori. Cofactorii pot fi ioni anorganici simpli, cum ar fi Mg 2+ sau molecule organice complexe, cunoscute sub denumirea de coenzime. Cofactorul se leag strns la o poziie special de pe molecula enzimei. O enzim la care lipsete cofactorul esenial se numeste apoenzim, iar enzima intact, cu cofactorul legat este desemnat ca holoenzim. Dup reacie, enzima se elibereaz de substrat pentru a se adsorbi pe o nou molecul de substrat (enzima poate cataliza circa 10 6 reacii pe minut). n funcie de raportul lor cu celula n care s-au format, enzimele bacteriene se mpart n dou categorii: - enzime extracelulare (exoenzime), n general hidrolaze care de obicei sunt eliberate n mediu; - enzime intracelulare (endoenzime), care rmn n celul. La rndul lor acestea se clasific n enzime solubile, localizate la nivelul structurilor de suprafa, de unde sunt eliberate uor, n urma distrugerii celulei cu ultrasunete sau materiale abrazive i enzime particulate, legate de constituienii imobili ai celulei, care rmn legate de resturile celulare dup dezintegrarea celulei. Capacitatea celulei bacteriene de a-i elabora constituienii echipamentului enzimatic este determinat genetic. Ca urmare, numrul tipurilor de enzime pe care le poate sintetiza o bacterie este limitat de numrul determinanilor genetici inclui n genomul su, care ar fi, n medie, de aproximativ 2000. Dimensiunile mici ale celulei bacteriene limiteaz, la rndul lor, numrul total al moleculelor de enzim. Pentru realizarea adecvat a metabolismului su, celula bacterian dispune de mecanisme de reglare, care ajusteaz n fiecare moment setul de enzime n activitate ca i cantitatea relativ din fiecare enzim, n raport cu nevoile celulei i ca rspuns la variaiile mediului extern. 1.5. 3. Reacii de anabolism i catabolism

15

Totalitatea reaciilor biochimice implicate n activitatea biologic a celulei bacteriene, prin intermediul crora energia i elementele biogene, ca atare sau sub forma de combinaii mai mult sau mai puin complexe, sunt preluate din mediu i utilizate att pentru biosinteza i cretere, ct i pentru alte diferite activiti biologice secundare poart numele de metabolism. Graie acestor reacii, substanele din mediu sunt transformate n constituieni celulari, energie i produi de uzur. Reaciile metabolice sunt de dou tipuri: - reacii prin care se elibereaz energie (exergonice), care corespund catabolismului sau proceselor de dezasimilaie, prin care se elibereaz energie n urma degradrii enzimatice a unor substane nutritive din mediu; - reacii prin care se consum energie (endergonice), care corespund anabolismului, sau proceselor de asimilare, n care energia este folosit pentru sinteza constituienilor celulari. Reaciile metabolismului (fig. 10) sunt interconectate i ndeplinesc urmtoarele funcii pentru viaa celulei: - producerea subunitilor folosite pentru construcia constituienilor celulari; - eliberarea de energie i stocarea acesteia sub forma de ATP; - formarea constituienilor celulari macromoleculari (proteine, acizi nucleici, unele polizaharide) prin polimerizarea monomerilor. Una dintre caracteristicile distinctive ale activitilor metabolice la microorganisme este intensitatea lor excepional comparativ cu a activitilor omoloage ale organismelor superioare (ex. activitatea respiratorie a unui gram raportat la masa uscat - de bacterii aerobe este de cteva sute de ori mai intens dect cea a omului).

16

Intensitatea activitii biologice poate fi explicat prin suprafaa mare a celulelor microbiene n raport cu masa lor, fapt care se reflect n suprafaa de contact cu mediul nconjurtor.

CAP. II biotehnologic

Etapele

elaborrii

unui

proces

Caracteristica fundamental a unui proces biotehnologic este obinerea unui produs sau anumitor produse necesare omului prin cultivarea microorganismelor dotate genetic natural s elaboreze aceste produse. Procesele biotehnologice sunt bazate pe fenomenul de sinergism sau antogonism al diferitelor specii de microorganisme, ceea ce determin caracteristica fundamental a procesului ce poate fi realizat n condiii septice (cnd exist simbioza) sau aseptice (cnd predomin antibioza). n general microorganismele elaboreaz substane ce le asigur condiii de via; aceasta nseamn c elaboreaz enzime ce distrug alte specii de microorganisme din mediu, oferindu-le calea de supraveuire. La elaborarea unui proces biotehnologic trebuie parcurse urmtoarele etape:
17

- izolarea tulpinilor de microorganisme; - selecia microorganismelor cu maxim de eficien; - cultivarea microorganismelor pe un mediu adecvat; - izolarea produsului de biosintez; - stabilirea spectrului de utilizare a produsului obinut, a structurii i eventual a materialelor de sintez n scopul comparrii rentabilitii.

2.1. Tipuri de microorganisme utilizate n biotehnologii

Din punct de vedere chimic, microorganismele sunt foarte asemntoare celulelor animale superioare i ele pot fi gazda multor reacii biochimice de acelai fel. n general, microorganismele exist ca celule individuale sau cel mult colonii multicelulare relativ nespecializate, neavnd capacitatea s regleze temperatura celular. Microorganismele pot fi mprite n: protozoare, alge microscopice, bacterii, mucegaiuri, levuri, actinomicete, virusuri i bacteriofagi. Pentru industria biochimic i alimentar, prezint importan bateriile, levurile i fungii, inclusiv mucegaiurile i actinomicetele (Oniscu, 1978). Pentru procesele biotehnologice din protecia mediului se utilizeaz tipurile de microorganisme enumerate mai sus la care se adaug algele i protozoarele. Bacteriile sunt microorganisme unicelulare sporulate sau nespolurate i care se inmulesc prin diviziune direct. Structura intern a celulei bacteriene, compoziia chimic (tabel 3) i metabolismul bacterian sunt noiuni relativ bine cunoscute i redate suficient de amplu de literatur (Popa si colab. 2001). Metabolismul bacterian este ns condiionat de prezena n mediul de cultur a tuturor substanelor (organice sau anorganice) necesare (att cantitativ, ct i calitativ) speciei date pentru sinteza constituienilor celulari i pentru obinerea de energie. Aceasta impune prezenta n mediul de cultur a unor surse de C, H, O, N, P, S i n cantiti mici surse de K, Mg, Mn, Ca, Fe, Cl, sulfai, fosfai i concentraii infime de oligoelemente (Zn, Cu, Mo) care sunt indispensabile pentru activitatea catalitic a enzimelor. Peretele celular, prin structura sa poroas, favorizeaz ptrunderea substanelor nutritive din mediu, cu excepia celor insolubile sau a celor care exist sub form de particule. Acele substane care nu pot ptrunde ca atare n celul pot fi degradate n mediu extracelular sub aciunea enzimelor microbiene localizate la suprafaa celulei. Levurile sau drojdiile reprezint un grup taxonomic eterogen de microorganisme care se prezint n mod obinuit i dominant n form unicelular i au organizarea intern de tip eucariot. Se nmulesc n mod obinuit prin nmugurire i ocazional prin diviziune simpl sau prin procese sexuale n urma crora se formeaz asce sau ascospori. O caracteristic biochimic i biologic important a levurilor este capacitatea acestora de a produce fermentaia, ntlnit la mediile care conin hidrai de carbon. Drojdia reprezint de fapt masa enorm de celule rezultat din multiplicarea microorganismelor de fermentaie pe seama substratului nutritiv care constituie produsul fermentescibil, de unde denumirea de drojdie, echivalent aceleia de levuri. Echipamantul enzimatic este foarte complex, ceea ce explic activitatea fiziologic intens i variat a celulelor de levuri. Folosesc ca sursa de carbon diferite zaharuri, acizi organici, glicina, intermediari ai
18

metabolismului lipidelor, etc. iar ca sursa de azot produse rezultate din hidroliza proteinelor (peptone, aminoacizi), amoniac, uree. Levurile au nevoie i de factori de cretere ca tiamina, biotina, inositol, piridoxina i acid pantotenic. Temperatura optim de dezvoltare este cuprins ntre 20 i 30 0 C, pH-ul optim este 4,5 5. n anaerobioza levurile realizeaz fermentaia alcoolic a zaharurilor cu producere de CO2 i alcool etilic. Din energia eliberat prin fermentaie numai o parte este folosit pentru asimilare, iar restul este transformat n cldur. n aerobioz levurile oxideaz complet hexozele dup ecuaia: C6H12O6 + 6O2 6 CO2 + 6 H2O + 700 kcal

n aceste condiii o mic parte din glucidele din mediu furnizeaz energie, care este utilizat de celule pentru asimilarea restului de substrat, astfel nct, creterea substanei celulare n aceste condiii este deosebit de intens n raport cu cea realizat n anaerobioz. Aceast comportare metabolic pregnant difereniat n funcie de prezena oxigenului este folosit n industrie unde se creeaz, dupa caz, condiii de anaerobioz atunci cnd produsul dorit este alcoolul etilic sau condiii de aerare puternic, atunci cnd este nevoie de mas celular abundent din care se prelucreaz produsul numit drojdie de bere. Fungii sunt larg rspndii n natur n medii ambiante cu umiditate relativ mai redus dect cea care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor. Metabolismul fungilor este n esen aerob: ei formeaz celule (hife) lungi, filomentoase cuprinznd nuclee mari de 4-20 m, care sunt foarte ramificate i care pot avea sau nu perei despritori. Fungii dispun de capaciti pronunate de degradare i de sintetizare i s-au dovedit a fi surse bogate de acizi organici de importan industrial (ex.: acid citric, acid gluconic), de numeroase antibiotice (penicilina, griseofurina) i de enzime (celuloz, proteoz, amiloz). Ca toate ciupercile, mucegaiurile sunt plante fr clorofil, cu structur celular de tip eucariot (tabelul 1).

Tabelul 1 Caractere difereniale ale bacteriilor i fungiilor Bacterii Tip de organizare celular Volumul celulei Peretele celular Procariot 1-5
3

Fungii Eucariot Levuri de 20-303; la mucegaiuri mult mai mare, greu de definit Glucan, manan,chitin, glucan- i manan- protein

Acid muramic, la care se adaug acizi teichoici i la unele grupe acid

19

Membrana citoplasmatic Nucleu

Citoplasma

Metabolism Sensibilitate la frig Dimorfism Sensibilitate la antibiotice i substane chimioterapice

diaminopimelic Nu conine steroli (cu excepia Mycoplasma, cultivat pe steroli) Nucleoid; absena membranei nucleare Absena mitocondriilor i a reticulului endopalsmatic Autotrofe sau heterotrofe aerobe, obligat i facultativ anaerobe Prezent Absent Sensibile la antibiotice antibacteriene; rezistente la antifungice

Conine steroli Nucleoid; prezena membranei nucleare Prezena mitocondriilor i a reticulului endopalsmatic Heterotrofe; aerobe sau facultativ anaerobe Absena autotrofilor i a anaerobiozei Nedemonstrat fr echivoc Caracteristic pentru unele specii Sensibile la antibiotice de tip special; rezistente la sulfamide i antibiotice antibacteriene

Mucegaiurile sunt organisme vegetale heterotrofe incapabile de fotosintez, care se dezvolt bine n medii bogate n substane organice. De obicei ele utilizeaz ca surs de carbon diferite zaharuri, alcooli i acizi organici, iar ca surs de azot compui organici (peptone, aminoacizi) i uneori sruri de amoniu i nitrai. Mucegaiurile cresc bine n atmosfer umed iar pH-ul optim este 5-6 (variaiile tolerate fiind de pH 2 i pH 9,6). Unele specii cresc n acid acetic 1 N sau acid sulfuric 2 N, hrnindu-se pe seama impuritilor din soluie. Ele au capaciti foarte mari i variate de sintez i pot forma n cursul metabolismului lor polizaharide, lipide, acizi organici, pigmeni, substane antibiotice i substane celulare cu nalt valoare nutritiv, care rmn localizate n miceliu sau sunt eliminate n mediu. Temperatura lor optim de dezvoltare este de 22-320C, cea minim 5-100C i cea maxim de 30-400C. Aproape toi reprezentanii grupului sunt aerobi i ca atare au nevoie de prezena unei concentraii ridicate de oxigen. Actinomicete reprezint o grup de microorganisme cu proprieti intermediare ntre cele ale bacteriilor i fungilor. Formeaz hife lungi, foarte ramificate, lipsite de perei desparitori; sporii nmuguresc din vrful hifelor aeriene. Celulele sunt mai mici, avnd un ordin de marime de numai 0,5 1,4 m semnnd cu bacteriile. Protozoarele sunt larg rspndite n apa dulce i sarat, n sol i chiar in organismele animale, fiind cunoscute pentru rolul lor foarte important n

20

ndeprtarea bacteriilor din apele reziduale, n biofiltre i n instalaiile de nmol activ. Tabelul 2 Constituienti ai celulelor unor microorganisme Constituienti ai celulelor Microorganism e bacterii levuri fungi virusuri Proteine 50 60 % 40 50 % 20 % (cea mai mare parte de natur enzimatic) Acizi nucleici 20 % 10 % 3% 50 %

Microorganismele se mai deosebesc n ceea ce privete necesarul de oxigen. Fungi, algele i cteva bacterii sunt aerobe alte cteva bacteriii sunt strict anaerobe, pe cnd levurile i multe bacterii se pot dezvolta n ambele situaii (facultativ aerobe). Microorganismele anaerobe i facultativ anaerobe pot fi cultivate n vase foarte mari, prevzute cu dispozitive corespunztoare pentru amestecarea substanelor nutritive cu microorganismele. Microorganismele aerobe sau facultativ aerobe, necesit instalaii mult mai complexe.

2.2. Izolarea i selecia microorganismului capabil s produc componenta util necesar elaborrii produsului.
Izolarea microorganismului productor se realizeaz de pe medii foarte diferite cum ar fi fructe, plante, sol, aer, diferite incinte. Microorganismul separat se cultiv pe un mediu minimal ntrit cu agar, gelatin, pectin, CMC sau gel de silice (acesta din urm n cazul microorganismelor autotrofe care sunt inhibate de substanele organice). Tehnica de lucru este cea folosit n microbiologie pentru izolarea microorganismelor n cultura pur. Tot n aceast etap se urmrete evoluia microorganismelor i reaciile ce au avut loc n acest microorganism. Selecia microorganismelor. n selecia microorganismelor, n funcie de natura componentului ce urmeaz a fi transformat se folosesc patru metode de baz: 1. selecia natural a formelor cu importan practic; 2. selecia artificial a formelor care apar prin mutaie natural; 3. selecia artificial a formelor care apar prin mutaie indus cu ajutorul mutagenilor; 4. obinerea de forme folositoare prin hibridare /17/.
21

Selecia natural la microorganisme. Principiul acestei metode const n faptul c se ncearc obinerea unei forme a microorganismului care, n diferite condiii de mediu, este mult mai productiv n comparaie cu forma iniial. n acest caz, trebuie create acele condiii de cultur n care s se limiteze numrul formelor iniiale n populaii. Prin urmare, testarea nsuirii microorganismelor are loc pe cale natural, fr intervenia celui care efectueaz selecia. Aceast metod necesit un volum mai redus de lucru i se folosete cu succes atunci cnd trebuie s se obin diferite variante, care s creasc pe un mediu de cultur nou, obinndu-se astfel tulpini de microorganisme mult mai rezistente fa de factorii nefavorabili, adaptate la schimbarea temperaturii de cultivare etc. Practic, pe un mediu de cultur oarecare i n anumite condiii de temperatur, pH, etc. se dezvolt bine i repede numai un numr mic de microorganisme i anume cele care sunt cel mai bine adaptate la substrat i la parametrii mediului. Prin trecerea microflorei iniiale la intervale scurte de timp pe medii proaspete i sterile, numrul speciilor se reduce i dup un anumit timp se ajunge chiar la culturi care s cuprind microorganisme de aceeai specie. Trecerile de pe un mediu pe altul trebuie s se fac de ndat ce s-a observat o uoara dezvoltare a culturii. Astfel, speciile mai puin adaptate se elimin prin diluare. n faza final de selecie natural se trece la izolarea n cultura pur a speciilor existente. n timpul trecerilor repetate pot s apar mutani i mai bine adaptai condiiilor de mediu, dect specia natural. Dup izolarea n cultura pur urmeaz faza de stabilire a condiiilor fizico-chimice optime de mediu pentru stimularea produciei de enzime i eventual de obinerea de mutani mai productivi. Metoda seleciei naturale este mult utilizat, dar prezint urmtoarele dezavantaje: - nu ntotdeauna microorganismul care se dezvolt cel mai repede este si cel mai productiv; - prin selecie natural se elimin microorganismele care, dei s-ar dezvolta bine pe mediu, sunt impiedicate s se dezvolte de ctre microorganismele care secret substane antagoniste. Selecia artificial fr folosirea factorilor mutageni (adaptarea). Se tie c n funcie de substratul metabolizabil prezent ntr-un mediu de cultur, microorganismele produc enzime ce pot fi clasificai n dou grupe: enzime constitutive i enzime adaptive /18/. Enzimele constitutive se gsesc totdeauna n celule i concentraia lor nu este influenat de prezena sau absena din mediul de cultur a substraturilor pe care ele le metabolizeaz. n ceea ce privete enzimele adaptive se deosebesc: - Enzime net adaptive care nu sunt elaborate de celul dect n prezena substratului. Formarea acestor enzime are loc la scurt timp dup contactul celulelor cu substratul specific. Perioada de inducie este de obicei de ordinul orelor. - Enzime adaptive, care se pot identifica n celul n lipsa substratului specific, ns n concentraie mic fa de cea pe care o au n prezena substratului. n majoritatea cazurilor concentraia acestor enzime crete de cteva zeci de ori n prezena substratului. Prin urmare, aceste
22

enzime ar fi constitutive, biosinteza lor fiind stimulat considirabil de prezena substratului. - Enzime adaptive care se formeaz dup o lung perioad de adaptare a microorganismului la substrat prin treceri repetate pe acelai mediu. Formarea acestor enzime se datorete apariiei de mutani ai microorganismului. Deoarece noiunea de adaptare n microbiologie are un sens diferit de cel folosit n cazul enzimelor adaptive, s-a propus s se utilizeze noiunea de enzime induse pentru biocatalizatorii din primele dou categorii. Enzimile din a treia categorie i datoresc formarea apariiei mutanilor, deci a modificrii eriditii microorganismului datorit unui inductor specific; prin urmare acestea ar putea fi enzime adaptive reale. Selecia artificial prin folosirea factorilor mutageni. Dat fiind c selecia fr folosirea factorilor mutageni nu este de cele mai multe ori eficient, n ultimul timp se apeleaz tot mai des la utilizarea diferiilor factori care s grbeasc i s sporeasc variabilitatea mutaional pe baza creia s se efectueze selecia formelor dorite. Factorii mutageni provoac mutaii, care apar foarte rar n condiii naturale ; mutaiile induse au un caracter de evantai, conducnd la forme cu nsuiri att n plus ct i n minus fa de cele ale microorganismului inial. Mutaiile reprezint modificri spontane, cu caracter nedirecional, care survin la nivel molecular n structura unor determinani genetici ai caracterelor eriditare i care, afectnd astfel o parte din informaia genetic a organismului, duc la construirea unui mutant, diferit de cel normal. n funcie de modul de apariie exist dou feluri de mutaii: 1 - mutaii spontane, care apar n natur datorit unor cauze necunoscute, n condiii obinuite de mediu i fr intervenia vreunui factor decelabil; 2 - mutaii induse care se produc sub aciunea unor factori de mediu ce funcioneaz ca ageni mutageni (de natur fizic sau chimic), n sensul c mresc ritmul sau viteza de apariie a unor mutaii, care oricum s-ar fi produs spontan, dar la intervale mai mari de timp /19/. Folosirea hibridrii pentru separarea formelor de microorganisme utile. Hibridarea se folosete relativ rar n selecia microorganismelor, deoarece obinerea mutaiilor induse este destul de eficient, iar operaia de hibridare este posibil numai la cteva specii cu importan practic /17/. Atunci cnd se folosete, hibridarea are drept scop unirea caracterelor utile de la dou tulpini, sau de a obine hibrizi cu o exprimare mai activ a caracterului util, comparativ cu cel al ambelor forme printeti. Unirea ntr-un microorganism a nsuirilor celor doi prini se poate face pe dou ci: - n primul rnd prin apariia la hibrid a tuturor caracterelor de la cele dou forme, ceea ce este pe deplin posibil, datorit faptului c majoritatea microorganismelor se pot nmuli vegetativ, nmulire care frecvent se poate prelungi timp nedefinit. - n al doilea rnd, mpreunarea caracterelor printeti se poate efectua datorit recombinrii, spre care duce meioza sau segregarea
23

mitotic (separarea cromozomilor la diviziunea nucleului). Recombinatele dup dou caractere se vor evedenia dac acestea sunt determinate de gene care sunt localizate n cromozomi diferii. Astfel, se poate aprecia c n dezvoltarea biotehnologiei un rol deosebit va reveni geneticii care dispune, aa dup cum rezult din sumarele informaii prezentate, de mijloace pentru a influena un microorganism s realizeze predominant o anumit transformare.

2.3. Cultivarea microorganismelor

2.3.1. Medii de cultura. Compoziie i rolul principalelor componente Mediile de cultur sunt soluii sau amestecuri complexe apoase ce conin substanele necesare creterii microorganismului i elaborrii produsului dorit. n funcie de natura componenilor lor, mediile de cultur sunt: - sintetice; - semisintetice; - organice. Indiferent de mediul utilizat, microorganismelor trebuie s li se asigure surse de energie (hidrai de carbon), surse de azot, fosfor, sruri minerale cu diferite coninuturi de microelemente. Hidraii de carbon. Constituie sursa de energie n toate procesele de fermentaie. Prin oxidarea biochimic a glucozei de exemplu, se degaj o mare cantitate de energie, din care, o parte este nmagazinat n legturile macroergice ale adenozintrifosfatului, iar restul este preluat de mediul de cultur. Reaciile chimice de la nivel celular care duc la creterea celulelor si la biosinteza produsului dorit se realizeaz prin utilizarea energiei eliberate de legturile ATP-ului. Restul de energie, preluat de mediul de cultur sub forma de cldur, este transferat agenilor de rcire. Poate cea mai utilizat surs de carbon n mediile de cultur este glucoza. Dac analizm degradarea aerob i cea anaerob a glucozei : 1) Glucoza (C6O6H12) glicoliz proces anaerob respiraie proces anaerob 2 moli acid piruvic + 2 moli ATP

2) Glucoza(C6O6H12)

6 moli CO2 + 6 moli H2O + 38 moli ATP

38 moli ATP = 1112 Kj = 40% se constat c 40% din energia furnizat n procesul de degradare aerob a glucozei este utilizat n proces, restul de 60% fiind preluat de agentul termic. Lactoza este utilizat de microorganisme mult mai lent dect glucoza, furniznd mai puin energie mediului extern. Este de asemenea ntlnit n reetele de obinere a multor medii de cultur.
24

Surse de azot. Azotul, fie de natur oranic, fie mineral din sruri de amoniu este utilizat de microorganisme pentru formarea grupelor aminice i implicit a aminoacizilor, deci a proteinelor, substane de baz pentru procesul de cretere a microorganismelor, deoarece intr n structura peretelui celular. Fosforul. Se ntlnete mai ales sub form de grupri fosfat i intr n structurile macroergice ale metabolismului celular (AMP, ADP, ATP), fiind compus esenial n transferul de energie la nivel celular. Substane minerale (sodiu, potasiu, mangan, magneziu, zinc). Prezena substanelor minerale n compoziia unui mediu de cultur este indespensibil pentru creterea celulei deoarece afecteaz direct permeabilitatea membranei i echilibrul ionic, activeaz unele sisteme enzimatice celulare i intr n compoziia altor sisteme enzimatice. Antispumanii utilizai frecvent n compoziia mediilor de cultur sunt uleuri sau substane tensioactive care pot constitui totodat i surse de lipide. Precursorii sunt substane care conin n structura lor, sau reprezint ele nsele, o poriune cea definitorie a compusului ce se dorete biosintetizat. Altfel spus, prin prezena lor dirijeaz procesul de biosintez ctre produsul dorit. De exemplu, penicilina G are drept precursor fenilacetamida, iar penicilina V acidul fenoxiacetic. Precursorii se adaug n poriuni, astfel nct s nu se depeasc concentraia de 0,1 - 0,2 %, limita peste care pot deveni toxici pentru microorganisme. Factori de cretere. Unele microorganisme au nevoie nu numai de surse de energie, de C, de N, ci i de anumite substane organice oligodinamice eseniale pentru metabolismul lor, numite factori de cretere. Aciunea acestora fiind asemntoare aceleia exercitate de vitamine n metabolismul animalelor superioare, ele au mai fost numite prin analogie i vitamine microbiene. Factorii de cretere ai unui anumit microorganism sunt acele substane pe care microorganismul dat este incapabil s le sintetizeze n cursul metabolismului sau i n absena crora multiplicarea este imposibil. La unele microorganisme factorii de cretere sunt de origine endogen fiind elaborai prin biosinteza n cursul metabolismului celular, astfel nct prezena lor n mediu ca substane preformate nu este necesar. n schimb, microorganismele care nu au capacitatea de a sintetiza aceti metabolii eseniali, nu pot tri dect dac mediul lor este suplimentat cu factori de cretere, pentru a cror sintez facultile lor metabolice sunt deficitare. Aciunea factorilor de cretere se exercit n concentraii extrem de mici: de exemplu 10-4 M n cazul aminoacizilor i 10-6 10-10 n cazul vitaminelor grupului B. Factori stimulatori de cretere sunt substane care, fr a fi eseniale pentru supravieuirea i multiplicarea unor microorganisme, le accelereaz sau amelioreaz dezvoltarea atunci cnd sunt adugate n mediu (de ex. biotina pentru S. cerevisiae). Efectul stimulator al mbogirii mediului de cultur cu aceti factori se datorete faptului ca dei microorganismele i sintetizeaz, biosinteza lor se face ntr-un ritm prea lent
25

i n cantiti care nu pot satisface integral exigenele unei dezvoltri abundente a culturii.

2.3.2. Creterea i multiplicarea bacteriilor 2.3.2.1. Creterea bacteriilor Prin cretere n sens biologic se nelege mrirea coordonat a tuturor componenilor unui organism uni- sau pluricelular, ca rezultat al adugrii de substan nou. Procesul de cretere depinde de natura i concentraia subsantelor nutritive din mediu i de aprovizionarea continu a celulei cu energia necesar reaciilor endotermice de sintez. Creterea bacteriilor este conditionat de trei factori: - existena unor membrane de suprafa cu nalt grad de organizare care prin permeabilitatea lor selectiv menine n celule o concentraie mare a moleculelor necesare n procesele metabolice; - prezena i activitatea enzimelor care catalizeaz transformarea moleculelor aliment n blocuri noi, de construcie celular; - aciunea favorabil a energiei solare, n cazul microorganismelor fotosintetizante, sau aceea a energiei eliberate prin degradarea moleculeloraliment, asupra reaciilor de biosintez (de anabolism). Creterea bacteriilor se realizeaz prin depunerea uni- sau tridimensional de substan nou, ceea ce determin mrirea celulei bacteriene n sensul uneia dintre dimensiunile ei sau n sensul tuturor celor trei dimensiuni lungime, lime, grosime. Mrirea volumului celular se face la bacterii nu numai prin sintez de substan organic, ci i prin sporirea accentuat a coninutului lor n ap. Creterea bacteriilor se ntrerupe cnd se produce diviziunea celular. Se pare c activitatea normal a bacteriilor este condiionat de existena unui anumit raport ntre volumul celulei i suprafaa sa. Acest raport se modific n cursul creterii celulei bacteriene deoarece n timp ce suprafaa bacteriilor crete cu o raie ptratic, volumul ei se mrete cu o raie cubic, ceea ce determin o diminuare relativ a suprafeei celulare. Aportul de substane nutritive devine mai puin adecvat exigentelor metabolice. Pe de alt parte, cu mrirea dimensiunilor celulei, echilibrul ei chimic se altereaz. Ca urmare, atunci cnd disproporia dintre suprafa i volum atinge un punct critic, raportul lor adecvat se restabilete prin diviziunea celulei ajuns la limita ei de cretere. Astfel, diviziunea celular este o form necesar de reglare automat a activitii celulei bacteriene. 2.3.2.2. Multiplicarea bacteriilor. Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la mrirea taliei individului, la bacterii, ca i la alte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creterea numrului de indivizi. Acest proces se realizeaz pe dou ci, dintre care una, diviziunea simpl, direct sau binar, este practic general, iar cealalt, nmugurirea sau ramificarea este excepional, fiind caracteristic numai unui numr relativ foarte mic de specii bacteriene (figura 11).
26

Multiplicarea prin diviziune simpl este tipic pentru majoritatea speciilor bacteriene atunci cnd celulele se afl n condiii optime de via; diviziunea simpl const n scindarea unui individ n dou celule noi, care pot fi aproximativ egale (diviziune izomorf) sau inegale (diviziune heteromorf). Diviziunea bacteriilor se poate face fie prin trangulare, fie prin sept transversal. Diviziunea prin trangulare caracteristic bacteriilor n faza S se realizeaz prin ngustarea median a celulei, determinat de invaginarea membranei ei citoplasmatice, urmat de creterea spre interior, tot prin invaginare a peretelui celular. Astfel, fiecare din celulele fiice are cte un perete celular, ele putndu-se separa la sfritul procesului. Diviziunea prin sept transversal este caracteristic bacteriilor n faza R. La nceputul procesului de diviziune, bacteria matur este deja traversat de regiunea median de un sept derivat din membrana citoplasmatic. Acest sept este apoi scindat n lungul su de un perete despritor care se formeaz pornind de pe faa intern a peretelui celular i care crete centripet, ca o diafragm. Cele dou celule fiice reunite sunt la rndul lor divizate de un sept derivat din membrana citoplasmatic, astfel nct se formeaz un grup de patru celule dispuse n mod caracteristic i ale cror septuri sunt de asemenea scindate ulterior de noi perei celulari transversali. O alt ipotez consider c multiplicarea bacteriilor se face dup un mecansim n trei etape succesive: - Diviziunea citoplasmei prin intermediul unui sept transversal derivat din membrana citoplasmatic i dispus perpendicular sau oblic fa de axul mare al celulei; - trangularea peretelui celular, la nivelul acestui sept care formeaz la rndul su un perete transvers ptrunznd prin cretere centripet n interiorul septului citoplasmatic pe care-l separ n dou straturi subiri; celulele fiice astfel rezultate au nucleu, citoplasm i membrane citoplasmatice; Separarea efectiv a celulelor fiice prin scindarea peretelui lor celular comun, urmat de desprirea lor sub aciunea forelor de traciune din mediu i n funcie de elasticitatea peretelui celular; n unele cazuri peretele celular transvers se formeaz incomplet, astfel nct la sfritul creterii el nu mai apare ca un disc, ci are aspectul unui inel, iar septul membranos citoplasmatic transvers rmas n regiunea sa central alctuiete o plasmodesm prin care cele dou celule rmn n continuare legate. Multiplicarea prin ramificare sau nmugurire. La unele bacterii se formeaz o ramificaie tubular fin, ca o mic umfltur terminal, care crete i devine o nou celul ovoid, dup care n mijlocul tubului de legtur se constituie un sept transversal. Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepional de mare i se datoreaz valorii foarte ridicate a raportului dintre suprafaa i masa lor, valoare care este de 400000 ori mai mare dect n cazul omului. Celula bacterian are o suprafa de adsorbie foarte mare, datorit creia procesele de asimilare i sintez, de cretere i reproducere se desfoar ntr-un timp foarte scurt.

27

Figura 11 Reprezentarea schematic a posibilitilor de multiplicare la bacterii (a) - prin formarea unui sept transversal (b) prin trangulare (c) prin nmugurire lateral (A) i terminal (B) 2.3.3. Evoluia unei culturi bacteriene Dinamica multiplicrii populaiilor bacteriene evolueaz n urmtoarele faze succesive (Fig. 12 ): Faza de laten (lag) sau de cretere zero este cuprins ntre momentul introducerii celulelor n mediu (nsmnare) i momentul cnd ele ncep s se multiplice. n cursul acestei faze, numrul bacteriilor din inocul rmne neschimbat sau chiar scade temporar. Cultura nu este vizibil macroscopic. Aceast prim faz (dou ore) se observ atunci cnd bacteriile nsmnate provin din culturi vechi, deci sunt celule deficitare n enzime sau n produi intermediari de metabolism. Multiplicarea unor asemenea bacterii devine rapid n momentul n care aceste substane s-au acumulat prin sintez n concentraii optime. Dac inoculul este prelevat dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare n aceleai condiii de mediu ca i cele oferite noii culturi iniiate, multiplicarea bacteriilor i menine n continuare ritmul rapid. Atunci cnd bacteriile provin dintr-o cultur exponenial, dar care creteau pe alt mediu dect cel n care sunt transferate prin nsmnare, creterea lor pe noul mediu nu se evideniaz dect dup o perioad de laten necesar induciei unor enzime corespunztoare noului substrat nutritiv. Faza de laten apare ca o period de adaptare la noile condiii de cultur n care bacteriile viabile din inoculum i acumuleaz n celul metaboliii eseniali i sistemele enzimatice
28

necesare creterii n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit condiiilor de via anterioare nsmnrii.

Figura 12 Curba de cretere a unei populaii bacteriene n raport cu timpul, exprimat prin logaritmul numrului de bacterii A-nsmnarea; A-B - faza de lag; B-C - faza de accelerare a ritmului de cretere; C-D faza de multiplicare logaritmic; D-E - faza de ncetinire a ritmului de cretere; E-F - faza iniial de declin; F-G - faza intermediar de declin; G-H - faza final de declin Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este caracterizat prin aceea c dup o scurt perioad (circa dou ore) de accelerare a ritmului de cretere n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit acest ritm devine constant i caracteristic pentru un organism dat n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind minim. Celulele considerate a fi de tip embrionar au dimensiuni mai mari dect cele caracteristice speciei, iar citoplasma lor este omogen, nu conine materiale de rezerv i are o mare afinitate pentru coloranii bazici datorit coninutului ei ridicat de ARN. Celulele aflate n faza exponenial de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie bacterian. n condiii ideale de cretere i multiplicare, cantitatea de materie vie crete n funcie de timp dup o progresie geometric, adic se multiplic print-un factor constant la fiecare unitate de timp. Evoluia unei culturi bacteriene ilustreaz foarte bine progresia geometric sau exponenial a numrului de indivizi n funcie de timp. Primele diviziuni dup nsmnare sunt destul de bine sincronizate i numrul celulelor viabile se dubleaz brusc la intervale regulate; dup un timp relativ scurt de timp, tendina de multiplicare rapid scade progresiv datorit epuizrii substanelor nutritive
29

din mediu i acumulrii produselor de catabolism cu efect inhibitor. Creterea populaiei bacteriene nu se mai face sincron datorit faptului c n aceste condiii de ncetinire a ritmului de cretere apar unele diferene individuale n privina timpului de diviziune celular. Acest fenomen asigur echilibrul organismelor vii n natur. Creterea unei populaii bacteriene se poate aprecia direct prin mai multe metode: determinarea masei uscate a celulelor, dozarea ntr-o cultur a unuia dintre constituenii bacterieni elementari (C sau N), aprecierea cantitativ a unei enzime sau a unui produs metabolic i evaluarea numrului total al celulelor bacteriene (vii i moarte) cu ajutorul celulei microscopice de numrat sau a numrului de celule viabile (capabile de multiplicare) prin nsmnare pe medii de cultur solidificate. Ca metode indirecte se folosesc aprecierea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene ntr-un mediu lichid n raport cu o scar etalon sau la fotocolorimetru, determinarea absorbiei razelor UV cu lungime de 2800 , specific pentru proteine sau 2500 , caracteristic pentru acizii nucleici. Faza staionar maximal urmeaz unei scurte perioade (2 ore) n care multiplicarea nu se mai produce n progresie geometric, ci ntr-un ritm care scade progresiv. n acest faz, numrul celulelor viabile, este maxim i rmne constant o perioad de timp care dureaz de la cteva ore la cteva zile, n funcie de sensiblitatea bacteriilor la condiiile defavorabile de mediu. n cazul n care intrarea culturilor n faz staionar este determinat de epuizarea substanelor nutritive din mediu, celulele nu se mai multiplic, iar numrul total al indivizilor populaiei este constant i egal cu numrul celulelor viabile. Atunci cnd apare o lips parial de substane nutritive sau se acumuleaz compui toxici, multiplicarea persist n ritm ncetinit, dar este contrabalansat de o mortalitate cu ritm echivalent: numrul celulelor viabile rmne constant, n timp ce numrul total al bacteriilor din cultur (vii i moarte) crete. n aceast faz, celulele bateriene sunt considerate mature avnd morfologia descris drept caracteristic pentru fiecare specie: dimensiuni mai mici dect n faza de cretere exponenial, citoplasma mai puin omogen datorit apariiei de incluziuni i acumulrii unor substane de rezerv, afinitate moderat pentru colorani i prezena sporilor la speciile sporogene. Faza de declin corespunde unei scderi progresive a numrului celulelor viabile, pn la sterilizarea bacteriologic a culturii; la un moment dat, numrul bacteriilor viabile scade n progresie geometric n raport cu timpul datorit morii unui numr foarte mare de celule. Celulele din acest faz, celulele btrne, au un polimorfism marcant, determinat de prezena formelor de involuie (celulele mici, sferice, umflate, deformate sau ramificate), se coloreaz foarte slab sau capt afinitate pentru coloranii acizi, iar la speciile sporogene apar n cultur foarte muli spori. n unele cazuri apar fenomeme de liz care determin scderea numrului de celule din mediu. Moartea celulelor dintr-o populaie microbian reprezentat printr-o cultur pur este un proces care evolueaz exponenial sau logaritmic, deoarece indivizii dintr-o asemenea populaie reacioneaz identic fa de factorii letali exogeni. Spre deosebire de organismele superioare, la care abolirea pentru o perioad relativ scurt a funciilor biologice i a capacitii de reproducere a celulelor componente determin fenomene de degradare cu caracter ireversibil care produc moartea, la bacterii procesele biologice pot fi parial sau total suspendate pentru perioade foarte ndelungate, fr
30

ca aceasta s provoace moartea celulelor. Astfel, dei n spori i n celulele congelate sau liofilizate activitatea biologic este practic oprit, capacitatea lor de a se reproduce rmne intact. n acelai timp, la bacterii este posibil i situaia invers, n care pierderea capacitii de reproducere nu este obligatoriu urmat imediat de ncetarea activitilor metabolice. De aceea este mai corect s se aprecieze viabilitatea microorganismelor n raport cu conservarea potenialului lor de reproducere. 2.3.4. Dinamica procesului de cretere la mucegaiuri. Creterea mucegaiurilor poate fi studiat depunnd n zona central a unei plci Petri cu un mediu adecvat, civa spori sau o poriune de miceliu fungic. Creterea este limitat n mod caracteristic la extremitatea liber a hifelor. Ea poate continua prin extinderea hifelor periferice, att timp ct mediul conine substane nutritive. Procesul a fost urmrit la miceliile septate, dei acelai principiu se aplic i celor coenocitice. Dup alungirea celulei terminale i biosinteza peretelui celular, urmeaz procesul de formare a septului terminal avnd ca rezultat delimitarea a dou celule fiice. Cea apical continu ciclul de cretere i diviziune, pe cnd celula subterminal particip facultativ la cretere, numai atunci cnd produce o ramificaie lateral, dotat la rndul ei cu capacitate de cretere apical i diviziune. n unele cazuri, (la unele Basidiomycetes) un singur miceliu poate atinge pn la 15 m. Pe msur ce miceliul crete spre periferie, coninutul citoplasmei poate s dispar n partea central, cea mai veche a coloniei. Creterea unui miceliu pornind de la un inocul de spori sau de la un fragment micelian parcurge mai multe faze: Faza iniial de lag, care dureaz cteva ore, este caracterizat prin procese de germinare a sporilor sau regenerare a hifelor rupte i lezate care au servit ca inocul; Faza de cretere liniar corespunde perioadei n care pe suprafaa mediului apare o colonie circular ce crete liniar n raport cu timpul. Viteza de cretere se menine constant la marginea coloniei, n timp ce n zona central creterea este mai lent sau chiar nceteaz. Creterea coloniei n suprafa nu este corelat cu creterea de mas. n medii srace n substane nutritive colonia se extinde mai repede ns sub forma unei reele fine de hife, n timp ce pe medii bogate creterea ei n diametru este mai lent dar miceliul format este mai gros. Faza de nvechire este echivalent cu ncetinirea vitezei de cretere, pe msur ce colonia se apropie mai mult sau mai puin de bariera mecanic reprezentat de marginea plcii Petri, dar ea este de fapt determinat de efectul duntor al produilor de metabolism eliberai din colonie. La unele specii ea este nsoit de liza miceliului n centrul coloniei. ncetinirea ritmului de cretere apare mai repede cnd cultura se dezvolt n medii bogate n substane nutritive i la temperaturi optime i supraoptimale, acumularea produilor de metabolism fcndu-se mai rapid n aceste condiii. Creterea coloniilor de mucegai pe medii solide evolueaz cu o vitez variabil, n funcie de tulpin, mediul de cultur i factorii de mediu (temperatur, pH, presiune osmotic). La fungii neseptai alungirea miceliului poate ajunge la 3 mm/h la 25 0C, astfel c n 2-3 zile colonia poate acoperi o zon mare. n medii lichide, fungii produc o pnz micelian la suprafaa lichidului, astfel c diferitele pri ale culturii se gsesc n diferite condiii de mediu n special sub raportul gradului de aerobioz. De aceea, n
31

procesele industriale n care se urmrete o dezvoltare abundent i egal a mucegaiului este necesar s se asigure condiii fiziologice omogene de cultivare prin agitare mecanic i aerare controlat a mediului. n acest fel se realizeaz o dispersare a miceliului nsoit de apariia unor colonii sferice.

2.4. Tehnici de nmulire a microorganismelor

Un microorganism se nmulete dac mediul n care se afl cuprinde toate substanele necesare dezvoltrii sale: surs de carbon, azot, sruri nutritive, factori de cretere i dac sunt ndeplinite i anumite condiii fizicochimice de umiditate, pH, temperatur, tensiune de oxigen. Aa cum s-a artat anterior, n dezvoltarea microorganismelor se deosebesc mai multe faze: - faza de inducie n care nu are loc practic nici o nmulire i n care au loc n interiorul celulei transformri metabolice care pregtesc celula pentru nmulire; - faza accelerat, n care microorganismul ncepe s se nmuleasc i viteza de nmulire este n continu cretere; - faza exponenial, n care nmulirea are loc exponenial; populaia microbian crete dup o progresie geometric, aceasta fiind starea normal de cretere a microorganismului; - faza staionar n care nmulirea este n curs de stagnare; numrul celulelor care se formeaz este n echilibru cu numrul celulelor care mor; n practica industrial de nmulire a microorganismelor, faza de nmulire exponenial prezint un interes deosebit deoarece, conducnd bine aceast faz, creterea masei microbiene are loc rapid, cu randamente maxime. Din acest motiv aceast faz va fi discutat mai amnunit. Timpul de generaie sau timpul unei generatii este timpul necesar ca populaia microbian actual n faz de nmulire exponenial s se dubleze; cu alte cuvinte, timpul necesar ca o celul nou format s se nmuleasc, cu formarea unei celule-fiice identice ei. Timpul de generaie este dat de durata nmulirii traportat la numrul generaiilor, n. g = t/n n faza de nmulire exponenial sau logaritmic, nmulirea are loc conform progresiei geometrice: a, 2a, 22a, 23a, 24a, . . . . . 2na n care a este numrul de celule ale microorganismului la timpul zero, n momentul nsmnrii mediului proaspt cu celule n stare de nmulire. Dup n generaii numrul celulelor va fi 2 na. Notnd cu b acest numr rezult: b = 2na Prin logaritmare se obine:

32

n = (log b-log a) / log 2 Deci, g = t x log 2 / (log b-log a). Relaia permite calcularea timpului de generaie pentru faza de nmulire exponenial prin determinarea numrului de celule sau a masei microbiene la nceput i dup timpul t de dezvoltare. Pentru ca faza de nmulire a unui microorganism s fie exponenial este necesar asigurarea unor condiii constante de dezvoltare, care se refer la concentraia substanelor nutritive, condiiile fizico-chimice (temperatur, pH, tensiune de oxigen) i eliminarea metaboliilor rezultai din procesul de nmulire. Dup cantitatea de oxigen necesar dezvoltrii microorganismelor procedeele de nmulire pot fi aerobe i anaerobe. Utilajele folosite pentru nmulirea n condiii aerobe se pot folosi i pentru cele care necesit condiii anaerobe, n condiiile ndeprtrii oxigenului prin barbotare de gaze inerte sau prin folosire de substane tampon de oxidoreducere care s consume oxigenul. De aceea se vor discuta numai procedeele de cultivare a microorganismelor aerobe. 2.4.1. Tehnici de laborator Tendinele recente n cultivarea microorganismelor sunt orientate spre experimente care s simuleze ct mai mult condiiiile din natur. De aceea, alturi de utilizarea diferitelor specii de microorganisme este necesar folosirea amestecurilor de substane nutritive i modificarea parametrilor de cultivare (durat, temperatur, pH, agitare etc.). Aceast situaie este determinat de faptul c microorganismele care se cultiv n laborator pot folosi alte ci metabolice, comparativ cu cele care cresc n mediile naturale pentru a consuma substratul. n acest din urm caz microorganismele care se dezvolt n condiii de competiie vor recurge la ci metabolice variate pentru a metaboliza diferite substraturi. Astfel, caracteristicile unui microorganism pentru supravieuire n mediu natural contrasteaz cu cele ale celui selecionat i cultivat n laborator, ceea ce explic unele rezultate contradictorii. De aceea, suplimentarea continu a mediului de cultur cu concentraii mari ntr-un anumit substrat poate furniza dezvoltarea unui microorganism care poate utiliza mai bine acel substrat. Metoda culturilor de suprafa. Dezvoltarea microorganismelor se realizeaz n condiii sterile, pe medii i n vase sterilizate i utiliznd pentru procesele aerobe aer tehnologic sterilizat. Sterilizarea se poate realiza prin diferite metode, n funcie de materialul folosit (tabelul 3). Sterilizarea pe cale termic se realizeaz timp de dou ore la 160o 180 C. Aceste condiii sunt necesare pentru a distruge microorganismele, inclusiv formele vegetative i sporii. Pentru a degrada endotoxinele produse de bacteriile gram-negative, se recomand efectuarea sterilizrii pentru durate mai lungi (cel puin 4 ore). Sterilizarea n autoclav se conduce (T aprox. 120 0C) folosind abur sub presiune (15 psi). Tabelul 3
33

Metode de sterilizare Material Metal Sticl Policarbonat Polietilen Polipropilen Polistiren Medii de cultur Soluii de sruri H * * A * * * * * * Metod R * * * * * * * * G * * * * F * *

H termic uscat; A- termic n autoclav; R- radiaii; G-gaze; F filtrare; - nerecomandat; * -se poate utiliza Sterilizarea cu radiaii recomand folosirea radiaiilor UV (2 ore, 250270nm) sau iradierea cu radiaii . Acestea din urm se utilizeaz pe scar larg pentru a steriliza materiale plastice i reactivii liofilizai (doza 2-3 GyGray). Sterilizarea cu gaze toxice se folosete pentru materiale plastice. n acest scop se utilizeaz oxidul de etilen. Ca durat, aceasta variaz de la 12 zile pn la 1 sptmn. Sterilizarea prin filtrare reprezint o tehnic accesibil, recomandat n cazul n care componenii unei soluii sunt sensibili la tratarea termic sau cu radiaii. Pentru filtrare se impune folosirea unor membrane cu poroziti ale cror dimensiuni s exclud trecerea virusurilor (1nm-0,1 m) i microorganismelor (0,45 -10m). Aerisirea este asigurat n mod natural printr-un dop de vat care acoper vasul (eprubete, vase Erlenmayer, baloane cu fund plat, cutii Petri, vase Roux etc.), caz n care schimbul de gaze se realizeaz destul de lent. n cazul acestor microorganisme (bacterii acetice, mucegaiuri) se folsesc vase de sticl cu baza mare i cu un strat subire de mediu (vase conice de 500 mL care conin cte 50-100 mL mediu). Mediile pe care are loc dezvoltarea microorganismelor aerobe pot fi lichide sau solide. Dezvoltarea pe medii lichide poate avea loc la suprafaa mediului lichid sau n interiorul su. Microorganismele care se pot dezvolta la suprafaa mediilor lichide formeaz de obicei o pelicul fin sau mai groas care cade la fund. n locul vechii pelicule se formeaz o pelicul nou care cade i ea, .a.m.d. Cu timpul se acumuleaz la fundul vasului un sediment format din celulele microorganismului. Mucegaiurile, pe medii lichide, se dezvolt la suprafa formnd un miceliu mai subire sau mai gros, dup specia de mucegai i cantitatea de substane nutritive din mediu. n interiorul mediilor de cultur se dezvolt de obicei microorganismele facultativ anaerobe (drojdiile, care formeaz de la nceput un sediment pe fundul vasului). Oxigenul necesar acestor microorganisme difuzeaz n interiorul mediului prin dizolvare. Producia microbian a culturilor aerobe pe medii lichide este influenat de raportul volum:suprafa.
34

Dezvoltarea microorganismelor aerobe pe medii solide n vasele de laborator menionate se realizeaz pe suprafaa acestora, n condiiile unui bun contact cu oxigenul. Ca medii de cultur solide se pot folosi medii de cultur lichide ntrite cu diferii ageni (agar, gelatin, pectin, CMC, gel de silice) sau medii solide prin natura lor, boabe de cereale, tre, pine, rdcini (morcov), cartofi etc. Metoda culturilor submerse. Microorganismele se pot dezvolta la fel de bine i n interiorul mediilor de cultur, ca i la suprafaa lor, n condiiile asigurrii oxigenului necesar; acesta este alimentat prin agitare, ceea ce previne asocierea celulelor de drojdii i bacterii, care rmn izolate. Metoda vaselor agitate. n vederea obinerii unei mase miceliale uniforme s-a propus folosirea unui sistem de agitare n timpul procesului de cultivare a microorganismelor care se nmulesc prin spori. Metoda se aplic la cultivarea n laborator a tuturor microorganismelor aerobe care produc antibiotice, enzime, vitamine. Agitarea vaselor se realizeaz cu agitatoare care acioneaz pe orizontal cu micare du-te - vino sau cu sisteme rotative. Acestea din urm sunt mai eficace i prezint avantajul posibilitii de modificare a turaiei i a amplitudinii de agitare. Metoda culturilor agitate prin barbotare de aer. Bacteriile i drojdiile se pot nmuli submers i prin barbotare de aer prin mediu. Aerul barbotat asigur aerarea i agitarea mediului de cultur. 2.4.2. Procedee pilot Studiul nmulirii microorganismelor prin metode de laborator este util pentru stabilirea condiiilor optime de dezvoltare (sursa de carbon, azot, sruri nutritive, factori de cretere, microelemente, pH, temperatur) i a condiiilor optime de producie care se ofera microorganismului. Aceste date se obin n laborator dup un mare numr de experimente i nu se poate trece direct la producia de microorganisme la nivel industrial deoarece condiiile de nmulire din instalaiile industriale difer de cele de laborator. Fa de factorii care influeneaz dezvoltarea microorganismelor n laborator prezint importan i tensiunea optim de oxigen din mediu, agitarea (n strns legatur cu primul factor) i gradul de spumare a mediului. Primii factori afecteaz durata proceselor metabolice, precum i randamentul n mas microbian i metabolii. Aceste elemente determin studierea nmulirii microorganismelor n instalaii pilot, n condiii de lucru foarte apropiate sau identice cu cele industriale. Pe lng influena tensiunii de oxigen (microaerobioz, aerobioz la presinue atmosferic, suprapresiune) i a agitrii asupra nmulirii, n instalaia pilot se mai stabilete sensibilitatea microorganismelor la infecii. Datele obinute privind nmulirea i dezvoltarea microorganismelor n instalaia pilot permit aplicarea condiiilor optime necesare la nivel industrial. Metoda culturilor de suprafa. Pentru dezvoltarea microorganismelor dup aceast metod se folosesc tvi de diferite dimensiuni construite din aluminiu, oel inoxidabil, tabl de oel lcuit etc. Mediul de cultur poate fi lichid sau solid; el se aeaz pe tvi n strat de grosime convenabil (1-10 cm). Tvile se aeaz pe rafturi ntr-un dulap care se poate nchide ermetic. Instalaiile pilot de acest gen se construiesc astfel nct s se poat lucra att n condiii de sterilitate, ct i de semisterilitate, deoarece primele sunt greu de realizat la nivel industrial i, n acelai timp, n asemenea instalaii nu se pot dezvolta microorganisme sensibile la infecii.
35

Sterilizarea instalaiei se face cu abur, mediul fiind pus pe tvi, sau fr mediu, cu introducerea ulterioar a mediului sterilizat separat. n acest din urm caz, sterilizarea tvilor i a dulapului se poate face cu antiseptice. nsmnarea se efectueaz prin tuuri speciale prin pulverizarea pe mediu a unei suspensii de microorganisme n stare vegetativ sau de spori. nsmnarea cu spori se poate realiza i prin pomparea sporilor cu ajutorul unui curent de aer steril: sporii se depun ncetul cu ncetul pe mediu i ncep s se dezvolte. Dac mediul de cultur i microorganismul nu sunt prea sensibile la infecii, nsmnarea se poate face fr prea mari precauii de meninere a sterilitii. Aerarea culturii n timpul nmulirii se realizeaz cu aer sterilizat i condionat (temperatur i umiditate) care se sufl ncet deasupra tvilor. Aceast metod se folosete la studiul cultivrii microorganismelor pe medii solide i pentru dezvoltarea acestora la suprafaa mediilor lichide n industriile fermentative (de ex. cultivarea bacteriei Acetobacter xylinum pentru obinerea celulozei bacteriale). Metode submerse. Pentru nmulirea submers a microorganismelor n condiii pilot se folosesc instalaii care s semene mult ca mod de funcionare cu instalaiile industriale. Tambure rotative. Dezvoltarea submers a microorganismelor n tambure rotative are loc prin rostogolirea mediului o dat cu rotirea tamburului. Aceste aparate permit folosirea mediilor lichide i a mediilor solide mrunite care nu se aglomereaz. Tamburul are forma de cilindru aezat orizontal i terminat cu capete semisferice. n interior are sudate de-a lungul generatoarei palete care antreneaz mediul n timpul nvrtirii i asigur o bun aerisire. Aerul steril necesar aerisirii se introduce prin ax. Aparatul se sterilizeaz cu abur i poate lucra sub presiune. Se folosete pentru studiul fermentaiei oxidative submerse i pentru cel al producerii enzimelor pe medii solide. Fermentatoare pilot. Instalaiile pilot pentru nmulirea submers a microorganismelor prin barbotare de aer i agitare s-au perfecionat foarte mult n ultimul timp, existnd posibilitatea efecturii unor experimente identice cu cele din instalaiile industriale. Ele au caracter general, putnd fi folosite la orice fermentaie submers. Sterilizarea aerului tehnologic necesar n procesele aerobe, constitue una din problemele de importan major n biotehnologii, de rezolvarea creia depinde buna desfaurare a procesului de biosintez. Pentru sterilizarea aerului se cunosc urmatoarele metode bazate pe distrugerea microorganismelor: - sterilizarea termica; - sterilizarea cu raze ionizate sau ultra-violete; - sterilizarea cu ageni chimici; - sterilizarea prin filtrare. La sterilizarea aerului prin utilizarea procedeului termic, se cer temperaturi ridicate deoarece microorganismele au rezisten mare la temperaturi uscate. Astfel, dup Decker [25], sporii din aer sunt distrui n 24 secunde la 218-220C. Aceast temperatur poate fi obinut fie prin nclzirea aerului ntr-un schimbtor de cldur, fie prin comprimarea aerului n compresor adiabatic [26]. Metodele de sterilizare prin utilizarea radiaiilor catodice, gama, U.V.,cu lungime de unda cuprinse ntre 2,265 i 3,287 [27] i a agenilor
36

chimici, printre care fenol, etilen-oxid, derivai orgalo-mercurici, nu au depit sfera de laborator. Sterilizarea aerului prin metoda filtrrii, se realizeaz pe filtre mecanice prevzute cu un strat de material fibros. La nceput s-au folosit fibre din bumbac dar, odat cu dezvoltarea produciei industriale de antibiotice, fibrele de bumbac au fost nlocuite cu fibre de sticl. Bazele teoretice a filtrrii aerosolilor stabilite de Chen [31] i analiza matematic a acestui proces, efectuat de Aiba [32], permit estimarea distribuiei longitudinale a bacteriilor n filtre i proiectarea filtrelor [5,33]. n prezent, cea mai larg utilizare n procesele boitehnologice o are procesul de sterilizare a aerului bazat pe principiul filtrrii combinat cu efectul termic. Dup acest procedeu, aerul tehnologic supus procesului de sterilizare trece prin filtru cu saci pentru separarea particulelor solide, apoi este nclzit, in schimbtor de cldur sau n compresor, la 150-160C. Aerul nclzit este trecut n continuare printr-un rcitor de aer, separator de picturi, filtru principal cu material fibros (prima treapt de purificare), filtru individual cu material fibros (treapta a doua de purificare) dup care ptrunde n fermentator. Schema de principiu a liniei de purificare i sterilizare a aerului tehnologic este redat n figura 13.

bioreactor

Figura 13. Procedeu pentru sterilizarea aerului tehnologic n care: 1 - filtru cu saci; 2 - compresor (sau prenclzitor);
37

3 4 5 6

rcitor; separator de picturi; filtru principal; filtru ndividual;

La nclzirea aerului prin comprimare adiabatic creterea temperaturii se determin cu ecuaia:

p T2 = T1 2 p1

k1 k

n care: T1= t iniial a aerului n K; T2 = t final a aerului n K;

k=

cp cv

Coeficient adiabatic al aerului

Dac nclzirea aerului se face n schimbtor de cldur eav n eav, temperatura final se determin din bilanul termic. Filtrul de aer este format dintr-un strat de material filtrant plasat ntre dou plci perforate. Stratul de material filtrant, din fibra de sticl cu = 6-9 are grosimea cuprins ntre 7 10 cm. Pentru a evita antrenarea fibrelor filtrante, se monteaz ntre stratul filtrant i plci plas de srm. n general filtrele de aer au diametrul de 360 mm. Grosimea stratului filtrant se stabilete prin calcul, iar pentru siguran n exploatare valoarea obinut se majoreaz cu 10 15 %. 1 tu ieire aer 2 plac perforat 3 plas de srm 4 garnitur din cauciuc spongios 5 strat fibros 6 rama filtrului 7 tu intrare aer. 2.4.2.2. Influena strii termodinamice a aerului asupra gradului de sterilizare. Materialul filtrant asigur gradul de sterilizare dorit numai dac se evit umezirea acestuia prin ptrunderea umiditii din aer sau a uleiului din compresor. Sub acest aspect este necesar a se determina corect condiiile climatice iniiale - presiunea, umeditatea relativ, temperatura medie
38

- iar funcie de ele s se stabileasc regimul de exploatare al instalaiilor de sterilizare a aerului. Pentru a nu favoriza ptrunderea umiditi n filtrul principal i n cel individual aerul comprimat se rcete sub valoarea temperaturii punctului de rou, se ndeprteaz umiditatea separat i se nclzete pentru a depi temperatura critic. Acest procedeu, de rcire a aerului i ndeprtarea parial a umiditii este utilizat n perioada de var cnd aerul are temperatur i umeditate relativ mare. Dac aerul are un coninut sczut n umiditate, cum este n perioada de iarn, rcirea se face pn la o temperatur superioar punctului de rou, dup care se trece prin cele dou filtre. n industria de biosintez, presiunea aerului la ieirea din compresor este cuprins ntre 1,5 - 2,5 at., iar dup filtrul individual ntre 1-2 at. Deoarece scderea presiunii aerului determin scderea temperaturii punctului de rou, valoarea acestuia se va stabili n funcie de presiune i umeditate. Astfel pentru aerul cu o umiditate d g/kg aer uscat i presiune P cunoscute, se poate determina cu relaia (3), presiunea parial a vaporilor de ap saturai, iar funcie de aceasta se scoate din tabel temperatura punctului de rou, care se va compara cu temperatura aerului dup filtru individual.
p= p 622 + 1 d

Parametrii principali ai procesului de sterializare a aerului sunt: temperatura punctului de rou a aerului comprimat , temperatura aerului dup filtrul individual i temperatura aerului dup destinderea adiabatic la ieirea din barbotor. Valorile acestor parametri se pot stabili cu diagrame ce dau dependena dintre coninutul de umiditate i temperatura punctului de rou precum i dependena dintre temperatura aerului dup scderea presiunii i temperatura iniial. 2.4.3. Procedee industriale Elementele principale ale acestor instalaii sunt vasele de fermentaie numite i fermentatoare (figura 14). De obicei, nmulirea microorganismelor se face n mai multe etape cu un raport de nsmnare de 10%. Pentru aceasta se construiesc grupuri de fermentatoare formate din dou sau trei vase cu capaciti de 50, 500 i 5000 L. Fermentatoarele sunt prevzute cu instalaii de insuflare a aerului i agitare, cu posibilitatea modificrii att a sistemului de aerare, ct i a turaiei agitatorului. Sterilizarea mediului se face n fermentatoare prin manta cu vapori indireci sau chiar cu vapori direci prin barbotare n mediu. Rcirea i termostatarea se efectueaz prin manta, prin circulaia apei de termostatare.

39

Fig. 14. Fermentator pentru dezvoltarea microorganismelor n culturi submerse; 1-aparat de inregistrat presiunea; 2-filru de aer; 3- debitmetru de aer;
4- conducta de aer; 5- agitator; 6-robinet de luat probe; 7-evacuare la canal; 8robinet de evacuare; 9-barbotor; 10-termometru; 11-serpentina; 12-sicane; 13-gura de vizitare; 14-dispozitiv pentru spargerea spumei.

Pentru controlul temperaturii i al debitului de aer exist aparate de nregistrare a acestor parametri. Aerul este furnizat de compresoare cu piston sau turbosuflante de capaciti corespunztoare. Sterilizarea aerului se face prin filtre generale cu crbune, vat de sticl i azbest sau chiar vat de bumbac montate pe coloana de aer, apoi prin filtrele individuale ale fiecrui fermentator. Adugarea de precursori, substane nutritive sau antispumani se realizeaz din vase speciale care permit introducerea lor n condiii sterile. nsmnarea dintr-un vas n altul se efectueaz n condiii sterile prin conducte de legtur cu ajutorul aerului comprimat steril. Instalaiile moderne sunt prevzute cu dispozitive de nregistrare i reglare automat a pH-ului, rH-ului, precum i de monitorizare asistata de calculator. nmulirea microorganismelor n instalaii industriale se poate face periodic sau continuu. Cnd se lucreaz periodic se pot urma dou ci: microorganismul se nmulete n ntreaga mas de mediu introdus n fermentator integral de la nceput, fie se realizeaz nmulirea pe o cantitate mic de mediu cu alimentarea continu pe parcurs, pn la umplerea fermentatorului. Viteza de alimentare poate fi constant sau logaritmic; n acest din urm caz se ine cont de nevoile crescnde n substane nutritive ale masei microbiene care se multiplic n condiii favorabile de mediu dup o lege exponenial. Este evident intensificarea aerrii odat cu creterea masei microbiene. La nmulirea continu a microorganismelor, viteza de alimentare cu mediu este constant, de asemenea i viteza de evacuare
40

a mediului pentru separarea masei de microorganism. nmulirea cu alimentare continu de mediu se aplic n industria drojdiei de panificaie i drojdiei furajere. Pentru primele stadii de inmultire se folosesc utilaje cu capacitate de laborator i pilot (fig.15).

Fig.15. Schema tehnologica pentru dezvoltarea microorganismelor. 1- cultura stoc; 2- cretere n vase conice; 3- vas de transfer; 4- cultura stoc; 5- cultura de spori sau suspensie de spori; 6- vas de transfer.

41

CAP. III Producerea de energie cu ajutorul microorganismelor pe baz de biomasa. Biocombustibili.

3.1. Rezerve de biomas vegetal accesibile. Posibilitile de generare a energiei i produselor chimice din biomasa vegetal au orientat preocuprile tiinifice n direcia valorificrii complexe a deeurilor de exploatare ct i a culturilor energetice. Este din ce n ce mai evident opiunea bioenergetic a mediilor tiinifice a cror preocupri vizeaz trei direcii importante de aciune: - identificarea surselor de biomas vegetal disponibile sau identificarea unor derivai ai acestora; - identificarea modului n care aceast mas trebuie procesat pentru a obine combustibili, substane chimice cu potenial industrial valoros, etc.; - identificarea celor mai adecvate domenii de utilizare. n prezent sunt considerate ca surse de biomas urmtoarele elemente: lemnul, reziduurile culturilor agricole (paie), culturi de plante cu potenial energetic deosebit, reziduuri organice. Totodat sunt cunoscute cteva posibiliti de cretere a rezervelor de mas vegetal, care sunt prezentate n fig. 16. Biomasa vegetal, utilizat ca materie prima prezint avantajul unei regenerri continue n cantiti mari, cu un coninut energetic ridicat. Astfel, se apreciaz c plantele terestre asimileaz 3,3 x 10 4 kg CO2 / an din care 6 % se regsesc n celuloz ceea ce nseamn la nivel mondial 24 tone celuloza/an/locuitor. Prin urmare, n condiiile n care se dispune, n mod controlat, de un fond de biomas vegetal accesibil valorificrii complexe se poate realiza i o larg varietate de produse competitive cu cele obinute prin tehnologii clasice. Al doilea avantaj l constituie faptul c materiile prime de origine vegetal se caracterizeaz printr-o compoziie chimic de baz (tab. 4), care constituie sursa de carbon i energie pentru procesele metabolice ale microorganismelor. Tabelul 4 Compoziia chimic de baz a unor materiale de origine vegetal Celuloza 40-50 94 45 30 50 85-99 Component % Hemiceluloze 20-30 2 35 50 20 Lignina 25-35 15 15 30 0-15

Lemn de conifere Bumbac Coceni de porimb Paie de grau Hrtie de ziar Hrtie

42

Utilizarea direct a biomasei vegetale prezint i o serie de dezavantaje: - n general biomasa vegetal conine o cantitate mare de ap. Din acest motiv, o cantitate mare de energie termic, ce ar rezulta la utilizarea acesteia drept combustibil, s-ar pierde sub form de caldur latent de vaporizare a apei. Pe de alt parte, biomasa vegetal fiind biodegradabil n prezena apei, este imposibil pstrarea acesteia pe timp ndelungat. - biomasa vegetal se caracterizeaz prin densitate volumic mic astfel nct necesit spaii mari de depozitare bine echipate cu aparatur pentru meninerea temperaturii constante i a unor condiii de aerare corespunztoare. Combustibili extrai din biomasa vegetal. Criza energetic, declanat n 1973-1974, a fost cauzat de creterea preului petrolului (prima scumpire a avut loc n ianuarie 1974). Criza a redus sau a frnat ritmurile de cretere economic i a deteriorat viaa lumii n ansamblul ei, practic n toate rile. Noua situaie a determinat iniierea unor cercetri n vederea lrgirii surselor i rezervelor energetice, pentru dezvoltarea unor tehnologii menite s exploateze competitiv noi forme de energie i alte materii prime dect cele fosile. Se acord atenie mai ales unor energii neconvenionale: hidraulic, solar, eolian, a valurilor, utilizarea hidrogenului, precum i a biomasei i folosirea deeurilor urbane i menajere. Formele noi adiionale, de energie pot aduce un aport nsemnat n bilanul energetic i economic. n doar civa ani limbajul s-a mbogit prin reactivarea sau crearea de noi termeni sau noiuni: biotransformare, sau bioconversie, biomas energetic, agrienergie, energie verde sau petrol verde, petrol accelerat, biotehnologie, plante energetice, plante petrolifere, plante alcoligene. Disponibilitatea resurselor energetice este vital pentru dezvoltarea i promovarea unor tehnologii care s asigure creteri economice semnificative. n acest context se impune gsirea unei soluii pentru depirea cercului vicios: lipsa resurselor financiare pentru energie duce la dezvoltarea limitat, constrns a tehnologiilor, iar lipsa unor tehnologii moderne duce la imposibilitatea acumulrii unor resurse financiare. Tendina, semnalat din ce n ce mai frecvent n rile dezvoltate, de a gsi surse alternative de energie poate fi o cale de depire a acestui paradox. Biomasa vegetal poate constitui o surs de combustibili. Sunt cunoscute astzi cteva directii de lucru i anume: obinerea uleiurilor din seminele diferitelor plante, extinderea unor culturi cu coninut energetic ridicat, cultivarea plantelor alcooligene, obinerea de hidrocarburi cu ajutorul unor culturi de alge, obinerea de biogaz. Obinerea de uleiuri din seminele diferitelor plante - accentul este pus pe obinerea uleiurilor din seminele de in, rapi, floarea soarelui, arahide, palmier. Aceste uleiuri n afar de utilizrile n industria alimentar sau cosmetic, datorit coninutului energetic ridicat, pot fi utilizate fie ca surs de energie, fie drept combustibil pentru motoarele cu ardere intern. Floarea-soarelui (43-53% ulei n substan uscat din smn i 5868% n miez), soia (17-29%), inul de ulei (42-47%), ricinul (47-58%), rapi colza (37-49%), smn de bumbac (21-30%), arahidele (55%), sintetizeaz uleiuri pe care le stocheaz n smn. n general aceste specii, cultivate n
43

zonele cu clim temperat dau la hectar producii mici de ulei, chiar i atunci cnd sunt cultivate doar pentru producia de ulei. Plantele uleioase cultivate n Romania i n alte ri cu climat temperat (chiar n cazul unor producii duble) nu sunt rentabile ca plante bioenergetice. Cultivarea n condiii de mediu optime, a unor genotipuri cu capacitate biosintetizant sporit i un potenial productiv ridicat, poate contribui la adecvarea acestor specii i n zona temperat la producia de carburani. Potrivit unor cercetri efectuate n Africa de Sud uleiul de floareasoarelui poate fi utilizat drept carburant n motoare diesel. Se apreciaz c dac cultivatorii de porumb nsmneaz 1/10 din suprafa cu floareasoarelui ei vor dispune de ntreaga cantitate de carburant necesar pentru tractoarele lor. Plantele uleioase din zonele cu climat tropical, de exemplu, palmierul de ulei, produc 5-6 tone de ulei la hectar. Aceasta nseamn 4,55,4 tEP/ha, ceea ce reprezint o producie rentabil. Principalul dezavantaj legat de utilizarea acestor uleiuri drept combustibil l reprezint vscozitatea lor ridicat. Acest inconvenient poate fi ndeprtat prin esterificarea uleiurilor, operaie care duce implicit la creterea costurilor produselor. n momentul de fa, n lume, Malaezia este ara care a dezvoltat i dezvolt n continuare o adevarat industrie de obinere a uleiurilor din semine de palmier. Utilizarea materialelor provenite din culturi cu un coninut energetic ridicat Culturi de plante dirijate doar spre producerea energiei reprezint un obiectiv realizabil i rentabil cnd vor fi puse la punct prin cercetri tiinifice dou cerine: - detectarea unor specii i crearea genetic a unor varieti cu un randament energetic ridicat; - perfecionare i asigurarea tehnicilor de recoltare, transport, depozitare i transformare a biomasei energetice. Alaturi de deeurile rezultate din exploatarea pdurilor i din industria lemnului i alimentar, din activitatea menajer i din creterea animalelor, a tulpinilor, a paielor i a altor subproduse agricole, culturile energetice pot furniza o nsemnat cantitate de biocombustibili. Unele plante pot constitui surse pretioase de combustibili direct utilizabili. Asfel, diverse specii pot realiza o bioproducie de hidrogen, de hidrocarburi i de uleiuri. PLANTAII DE PETROL. Specii vegetale cum sunt Euphorbia tiriculli, E. lathyris, E. characias, E. abyssinica, din familia Euphorbiaceae, din care fac parte circa 280 de genuri i circa 7000 de specii, printre care arborele de cauciuc - Hevea brasiliensis, ricinul (pentru ulei) - Ricinus communis, tapiocul (pentru amidon) -Manihot esculenta sunt nzestrate cu celule (i vase dup dezvoltarea pereilor celulari) lacticifere n a caror vacuole se acumuleaz latex. Compoziia chimic a latexului, care constitue sucul celular, const dintr-o emulsie n ap de molecule de hidrocarburi, de poliisoprene. Cercetrile desfurate de Melvin Calvin (laureatul Premiului Nobel pentru descoperiri n domeniul fotosintezei), au evideniat faptul c aceste molecule, dup izolare, pot fi direct utilizabile n rafinriile de petrol existente. n acestea, printr-un proces de cracare catalitic utilizat la petrolul brut, se poate obine benzina i o gam larg de produse chimice (care sunt materii prime cu mult mai scumpe dect benzina).

44

Pentru chimizare, uzinele verzi cum sunt numite speciile de Euphorbia de M. Calvin, dup recoltare i uscare, sunt puse n contact cu un solvent chimic, pentru dizolvarea tuturor hidrocarburilor. Apoi prin tratarea reziduurilor cu un alt solvent se obin diverse zaharuri fermentescibile. Reziduul lemnos (tip melas) rezultat n urma acestui ultim proces ar putea fi utilizat drept combustibil (din care o parte poate servi la recuperarea solvenilor prin distilare) sau este folosit ca materie prima celulozo-chimic. Potrivit aprecierilor lui Calvin, prin aplicarea acestor tehnologii, din 1000 tone de substan uscat vegetal, ar fi posibil obinerea a 80 tone de hidrocarburi i a 260 tone de zaharuri (care prin fermentare produc, 100 tone de alcool). Chiar dup recuperarea solventului mai rmn nc 200 tone de reziduuri tip melas. Totalul de energie obinut n acest mod ar fi de peste 9000 milioane BTU (British Thermal Unit) din 1000 tone s.u. Avantajul plantaiilor de petrol este enorm dac se apreciaz c plantele euphorbiacee se pot cultiva pe soluri deertice i aride. Astfel, suprafee intinse din diverse ri ale lumii situate mai ales n spaiul cuprins ntre Ecuator i paralelele 30-45 nord i sud, pot fi amenajate cu plantaii de Euphorbia. Se apreciaz c alturi de speciile de Euphorbia a cror capacitate petrolifer este cunoscut, n flora lumii exist sute de specii bogate n compui energetici. Urmeaz ca acestea s fie detectate, studiate, cultivate i supuse unui program de ameliorare n vederea ridicrii randamentului produciei de hidrocarburi. Pentru rile Europei, n programele de ameliorare, un obiectiv de prim ordin trebuie s fie obinerea unor genotipuri adaptate condiiilor climatului temperat. Specia Euphorbia characias, care crete spontan n zona mediteranean, poate prezenta un interes aparte, dat fiind faptul ca latexul sau poate conine 25 % cauciuc. Pentru condiiile Romniei, specia E. lathris, va da, probabil, bune rezultate. Culturi cu un coninut energetic ridicat sunt i cele de Copaifera (Brazilia). Copaifera este o plant leguminoas care triete n inuturi umede atingnd 30 m nlime i avnd capacitatea de a ngloba n frunze cantiti apreciabile de lichid. Acest lichid conine un amestec de hidrocarburi cu o compoziie asemntoare cu a uleiurilor Diesel. 3.2. Producerea de hidrocarburi n culturi de Botryococcus braunii Botryococcus braunii este o specie de alg unicelular n care hidrocarburile constitiue 15-75 % din substana uscat. Aceast alg de ap dulce sau srat, poate fi ntalnit att n regiunile cu clim temperat ct i tropical, unde nmulirea ei pe suprafaa apelor poate fi de-a dreptul spectaculoas. Se prezint sub dou forme care se deosebesc prin pigmentatie i prin structura hidrocarburilor sintetizate: - forma verde conine hidrocarburi liniare cu numr impar de atomi de carbon (25 31) i srace n duble legturi. - forma roie conine hidrocarburi cu 32 38 atomi de carbon i bogate n duble legturi. Hidrocarburile se acumuleaz n peretele celulelor i sinteza lor este rezultatul activitii metabolice a algei n faza de cretere. Exist posibilitatea extragerii hidrocarburilor prin centrifugare, fr ca celulele s fie distruse. n legatur cu utilizarea algelor Botryococcus braunii mai rmn de elucidat unele probleme i anume:
45

rolul bacteriilor care triesc n asociaie cu alga i dintre care unele favorizeaz producerea hidrocarburilor; - lupta mpotriva speciilor concurente i mpotriva paraziilor; - controlul factorilor care determin producia optim. n sud-estul Franei aceast tehnologie este aplicat ntr-o unitate pilot de cultur, unde algele sunt cultivate n tuburi din materiale plastice, transparente, coninnd mediu nutritiv i care au i rol de captatori de energie solar. Cercetrile efectuate la nivel de pilot industrial au condus pn la performan dublrii biomasei de alge n dou zile, fapt care mrete considerabil eficiena culturii. 3.3. Culturi acvatice petrolifere Zambila de ap, Eichhornia crassipes, probabil cea mai prolific plant acvatic n zona tropical, n condiii climatice i de nutriie optime, poate s produc la hectar, pe zi, o ton de substan uscat, circa 300 tone s.u. la un hectar pe an. Aceasta reprezint echivalentul energetic a 120 tone petrol. n zone tropicale (este originar din America tropical) zambila de ap este o calamitate. Proliferindu-se rapid blocheaz staiile de pompare, canalele de irigaie, mpiedic navigaia i favorizeaz propagarea unor maladii caracteristice. n zonele temperate aceste inconveniente sunt reduse simitor. n schimb zambila de ap poate realiza creteri mari pe suprafee ocupate cu ape inutilizabile. Ea are o capacitate remarcabil pentru epurarea apelor industriale poluate cu metale periculoase (plumb, cadmiu, nichel sau mercur). Suprafeele acvatice, n majoritatea rilor, sunt mari (pe glob mai mult dect dublul suprafeei uscatului). n aceste condiii colonizarea unor suprafee cu plante acvatice energetice, care nu manifest cerine nutritive i nu concureaz suprafaa ocupat de plantele alimentare, apare ca o surs foarte valoroas de biomas. Valoarea culturilor de plante acvatice (inclusiv de alge) este cu att mai mare cu ct ele sunt susceptibile de a valorifica mediile poluate de efluenii urbani sau agro-industriali. Cercetrile au stabilit ca depoluare este realizat cu succes de ctre alge n lacurile de epurare a apelor, iar de ctre zambila de ap n bazinele de ape calde i poluate ale unor industrii sau centrale electrogene. Biomasa sintetizat n aceste ape uzate, foarte bogate n ap (peste 95%), reprezint o surs nsemnat pentru biogaz (metan). Astfel, acvacultura bioenergetic este asociat, cu succes, cu procesul depolurii mediului nconjurtor. 3.4. Producerea de etanol 3.4.1. Modaliti i condiii de producere. Sinteza chimic a etanolului se face pornind de la etilena (provenind din petrol sau gaz natural), care este convertit la temperatur nalt n prezena apei i a catalizatorilor. La nceputul secolului XX, etanolul era produs pe scar larg prin fermentare, n timp ce, n cursul ultimilor ani, 70% din etanolul produs, de exemplu n Statele Unite, era rezultatul sintezei chimice, deoarece preurile zahrului i amidonului erau mult prea ridicate; cretera preurilor produselor petroliere red ansele n favoarea fermantaiei alcoolice. Printre plantele alcooligene intrate n exploatare, sau care pot fi cultivate n scopul producerii de etanol, se numr maniocul, cerealele (mai ales porumbul), cartoful i napul ale cror glucide de rezerv sunt amidonul
46

i inulina (numai n cazul napilor) precum i trestia de zahr, ananasul, sfecla de zahr i sorgul zaharat, la care zaharoza este carbohidratul principal. Trestia i sfecla de zahar, porumbul, cartoful, sorgul, grul, via de vie, pot fi numite alcooligene. Acestea sunt nzestrate cu unele organe (tulpini, rdcini, boabe, frunze) a cror celule depoziteaz nsemnate cantiti de glucide uor hidrolizabile, care, prin fementare, sunt transformate n etanol. Amidonul, zaharoza i insulina sunt glucide uor fermentescibile, dupa reacia: C2H12O6 (Glucoza) 2CH3CH2OH + CO2 (etanol) + (gaz carbonic)

Fermentaia anaerob este realizat de levurile Saccharomyces cerevisiae care convertesc hexozele sau glucidele de rezerv (glucoza, fructoza), n etanol. Randamentul fermentaiei alcoolice este redus, fiind cuprins doar ntre 8-15%. Dup cum s-a precizat, levurile tranform doar glucidele de rezerv (fructoza i glucoza din fructe i struguri, zaharoza din sfecl i trestia de zahr, amidonul din tuberculii de cartof i boabele de cereale, inulina din tuberculii de topinambur) i glucidele de structur (celuloza tuturor plantelor dup o hidroliz prealabil cu ajutorul unor acizi puternici). Fermentaia este supus unor factori limitativi: activitatea levurilor este inhibat de substratul n fermentare (glucoz) i de ctre alcoolul produs. Pentru fermentarea inulinei (format din D-fructoza), prezent n topinambur, Helianthus tuberosus i dalie, Dahlia variabilis, se urmrete gsirea unor levuri mutante cu o ridicat activitate enzimatic pentru hidroliza i fermentarea concomitent a substratului. Cele mai productive plante alcooligene sunt topinamburul, sfecla furajer i sorgul zaharat, urmat de trestia de zahr, sfecla de zahr i cartof. Cerealele produc o cantitate de etanol la hectar sensibil mai mic. Etanolul este folosit ca materie prim n industria chimic. Deoarece trestia de zahr ocup intinse suprafee de teren fertil, potrivit pentru cultivarea unor specii alimentare, se preconizeaz ca n viitor s se extind cultura maniocului, care are avantajul ca produce recolte bune pe terenuri srace, recolte ce pot fi uor stocate pn la prelucrare. Astfel masa produciei de manioc la hectar este de 3 ori mai mic comparativ cu aceea de trestie de zahr, n timp ce producia de alcool este doar de 1,5 ori mai mic. Aceste trsturi fac din manioc, pentru condiiile de clim favorabile cum sunt cele din Brazilia, o excelent plant alcooligen. Utilizarea unor soiuri ameliorate de manioc, cultivate pe terenuri neexploatate pn n prezent, permite Africii de Sud s produc 500 de milioane litri de alcool pe an. Speciile zaharigene necerealiere, care cresc n climat temperat, deci i n Romnia, corespund att ca numr ct i ca variabilitate genetica a obiectivului de a fi cultivate ca materie prima pentru fabricarea etanolului. Printre acestea n afar de via de vie, primul loc l ocupa topinamburul. Planta poate realiza producii duble de etanol comparativ cu cartoful. Planta nu este pretenioas, cultura este complet mecanizat, tuberculii pot fi manipulai i pstrai cu usurin (mai uor dect sfecla furajer, sfecla de zahr i cartofii). Subprodusele rezultate din cultura topinamburului (tulpini i tiei) pot fi folosite fie ca ngrmnt sau n furajarea animalelor, fie pentru producerea metanului. Topinamburul ca i tulpinele i cocenii de
47

porumb, paiele ca i materialele lemnoase, dup degradarea biologic (hidroliza enzimatic) produc zaharuri cu 5 i 6 atomi de carbon. Ele sunt transformate de bacteriile Clostridium acetonobtylicum, care produc fermentaia acetonobutilic. Dupa fermentare rezult o soluie apoas cu 2% MBAE (amestec de butanol-aceton-etanol) care dup distilare poate fi folosit drept carburol. Avantajul fermentaiei acetonobutilice const n faptul c ea transform toate zaharurile naturale hexozice: amidon, inulina, celuloza si pentizice: hemicelulozele. C. acetonobutylicum, transform cu un randament de 30%. S-a stabilit c unele sue mutante, aparinnd ciupercii Trichoderma reesei, produc enzime care hidrolizeaz celuloza i hemicelulozele din paie cu un randament de 85%. Concentraia n solutie a 2% MBAE inhib fermentarea, fapt care impune distilarea unor soluii foarte diluate. Se sper ca unele sue mutante vor activa i la concentraii mai mari a soluiilor. Se poate aprecia ca n viitor, dat fiind necesitatea utilizrii etanolului agricol n scopuri mai nobile (industrie alimentar, cosmetic, farmaceutic) i a materiilor prime mai ieftine pentru metanol i MBAE, opiunile se vor ndrepta mai ales spre aceti doi alcooli. La nivelul anului 1990, utilizarea ca biomas energetic doar a unei pri din sporul produciei de cartof i sfecl de zahr (1,1+1,2=2,3 milioane tone recoltate de pe 44000 ha, respectiv de pe 30000 ha ) ar asigura obinerea n plus a peste 200000 tone etanol-carburant. O suprafa egal cu 75000 ha, cultivat cu topinambur, la potenialul genetic actual al acestei plante, ar produce 340000 tone etanol. n general se poate estima, c n Romnia, prin asigurarea condiiilor tehnico-materiale i organizatorice, biomasa va putea asigura 10-15% din consumul de energie. Etanolul este utilizat ca solvent, ca agent de extracie i agent antigel; servete de asemenea la sinteza a numeroi ali solveni, tincturi, substane farmaceutice, lubrifiani, adezivi, detergeni, pesticide, plastifiani, explozivi i rini pentru fabricarea fibrelor sintetice. Utilizarea etanolului drept carburant n motoarele cu combustie intern se poate face fie sub form de etanol anhidru (99,8 %), amestecat cu benzin n proporie de maxim 20 %, fie sub form de etanol hidratat (94 %) neamestecat cu benzin. n primul caz, etanolul modific substanial indicele octanic i alte caracteristici de funcionare ale motoarelor, ca demarajul, carburaia i emisiile de gaz. Valoarea economic a alcoolului amestecat cu benzin este cu 15 - 20 % mai ridicat dect cea a alcoolului utilizat ca substituient al benzinei. n uzinele care prelucreaz trestia de zahr, care sunt i cele mai simple, trestia este splat, mcinat i celuloza este separat din sucurile dulci (fig. ). Resturile lemnoase sunt uscate, apoi arse pentru a furniza energia necesar. Sucurile dulci sunt concentrate, sterilizate i apoi fermentate. Etanolul este separat de reziduurile solide ale fermentaiei i din soluia alcoolic de 8 10 % prin distilare. Lichidele reziduale sunt foarte poluante dar tratate corespunztor pot fi utilizate ca elemente fertilizante. n uzinele prelucrtoare de plante bogate n amidon , este nevoie de o etap suplimentar, cea legat de hidroliza amidonului n zaharuri fermentescibile; n plus n absena resturilor lemnoase, este nevoie de o surs de energie exterioar. Materie prim splare
48

mcinare sucuri dulci Concentrare

celuloz

etap suplimentar de hidroliz a amidonului (pentru plante bogate n amidon)

sterilizare

fermentaie Concentrare prin distilare Fig. 16 Succesiunea operaiilor unitare n tehnologia de obinere a etanolului Eforturile de ameliorare a produciei de etanol au avut ca obiect: - dezvoltarea unei tehnologii de fermentare continu pentru a obine o concentraie n alcool ct mai ridicat (12 % n loc de 8-10 %); - sporirea randamentului energetic printr-o distilare mai eficace i o mai bun recuperare a cldurii; - randamente mai bune de separare. Fermentaia alcoolic Fermentarea este definit ca un proces de degradare biochimic, sub aciunea enzimelor, a unor produse naturale cu structuri complexe, n produse cu structur mai simpl. Prin acest proces se degaj ntotdeauna energie, n majoritatea ei sub form de energie caloric. Fermentaia alcoolic este tot un proces biochimic, spontan sau provocat, prin care glucidele sunt transformate n alcool etilic i bioxid de carbon ca produi principali, nsoii de o serie de produi secundari. Procesul, de asemenea, este exoergic. Descompunerea glucidelor n alcool i CO 2 se produce n interiorul celulelor de levuri. Soluia de zaharuri ptrunde prin membrana celular, iar produsele fermentaiei difuzeaz n mediu. Numai distrugnd membranele celulare i eliminnd coninutul lor prin presare devine posibil de realizat fermentaia n afara celulelor. n ambele cazuri ns procesul este determinat de activitatea levurilor pentru c acestea sunt microorganismele necesare desfurrii procesului. Aceste enzime intervin n reaciile de transformare a glucidelor dupa mecanismul general de aciune al biocatalizatorilor. n principiu, enzima se leag de molecula reactant denumit generic substrat i formeaz un intermediar enzim-substrat. La rndul su acest compus intermediar se poate combina cu alt molecul reactant formnd produi de reacie i regenernd enzima.

49

Procesul de fermentaie alcoolic este un proces anaerob. n acest proces, levurile i procur energia necesar indeplinirii funciior vitale din degradarea glucidelor fr intervenia oxigenului. Mecanismul biochimic al fermentaiei alcoolice Ecuaia global a fermentaiei alcoolice, stabilit de Gay-Lussac, 1815 se prezint astfel: C6H12O6 2 CH3 CH2OH + 2 CO2

Prin aceast ecuaie se red substana care se degradeaz i produsele principale la care se ajunge. Ea nu cuprinde complexitatea fenomenelor care au loc n timpul fermentaiei i nici produii secundari care apar alturi de etanol i bioxid de carbon. Ulterior au aparut numeroase scheme prin care s-a incercat sa se explice mecanismul biochimic al procesului de fermentaie alcoolic. n prezent este unanim recunoscut schema Embeden-Meyerhof-Parnas, numit i glicoliz. Conform acestei scheme, hexozele, respectiv glucoza i fructoza, sunt transformate n acid piruvic, iar acesta, printr-o serie de reacii, este transformat apoi n CO2 i etanol. Glicoliza cuprinde trei etape: - fosforilarea hexozelor i degradarea lor n cte dou molecule de trioze; - oxidarea, prin dehidrogenare, a triozelor cu formarea de acid fosfogliceric; - transformarea acidului fosfogliceric n acid piruvic. Transformarea acidului piruvic n bioxid de carbon i etanol are loc n alte dou etape: - decarboxilarea acidului piruvic; - reducerea acetaldehidei la etanol. Fosforilarea hexozelor si degradarea lor n cte dou molecule de trioze ncepe cu formarea esterilor fosforici ai glucozei i fructozei. Prin transferul acidului fosforic de la ATP la hexoze are loc i un transfer de energie. Esterii fosforici rezultai, mai bogai n energie dect hexozele corespunztoare, sunt mai reactivi dect acestea i ca atare particip cu mai mult usurin n reacii. Se menioneaz c glucoza-6-fosfat se izomerizeaz n fructoza-6-fosfat. Indiferent c se pleac de la glucoz sau de la fructoz procesul de fosforilare din aceast etap conduce la formarea de fructoza1,6-difosfat. Acest ester, prin scindare formeaz dou molecule de trioze care se gsesc sub form de esteri fosforici. Oxidarea, prin dehidrogenare este catalizat de enzima triozfosfat dehidrogenaza. Inial, prin participarea unei molecule de ATP rezult acidul 1,3-difosfogliceric. Prin formarea moleculei de ATP, aceast reacie reprezint, din punct de vedere energetic, stadiul cel mai nalt al procesului de glicoliz. Transformarea acidului fosfogliceric n acid piruvic ncepe prin formarea acidului 2-fosfogliceric cu participarea enzimei fosfoglicerat mutazei. Acidul 2-fosfogliceric, printr-o oxidare intern, se transform n acid fosfoenolpiruvic n care se nmagazineaz macroenergia eliberat la oxidarea intern ce a avut loc. Acesta, printr-o reacie cu ADP, se transform n acid enolpiruvic. Odat cu transferul acidului fosforic se transfer i macroenergia
50

de la acidul fosfoenolpiruvic la ADP. Acidul enolpiruvic, n urma unei reacii, considerat spontan, trece n acid cetopiruvic. Acidul piruvic format n ultima reacie, este decarboxilat formndu-se bioxid de carbon i acetaldehid. Prin aceast reacie ireversibil se formeaz unul din produii principali ai fermentaiei alcoolice i anume bioxidul de carbon. Reducerea acetaldehidei la etanol este numit i etapa formrii celui de al doilea produs principal al fermentaiei alcoolice. 3.5. Producerea de biogaz 3.5.1. Definiie i procedee de recuperare a energiei din reziduuri organice Rezidurile organice din agricultur reprezint resurse importante de energie. n prezent exist ase procedee principale de recuperare a energiei din rezidurile organice agricole: - fermentarea aerob la temperatura mediului ambiant - fermentarea anaerob la temperatur ridicat - descompunerea aerob termofil - distilarea destructiv (piroliza, hidrogenarea) - compostarea - incinerarea i transferul de cldur. Dintre aceste procedee, fermentarea anaerob prezint potenialul cel mai ridicat de recuperare a energiei i constituie procedeul cel mai eficient de a genera energie neconvenional (Jewell i Loehr, 1977). Prin fermentare anaerob, microorganismele descompun materiile organice, elibernd o serie de metabolii printre care CO 2 i CH4. Amestecul dintre aceti doi metabolii cu predominarea CH4, care include n cantiti mici pn la urme i ali metabolii gazoi, constituie biogazul. n cursul fermentrii anaerobe a amestecurilor de materiale organice reziduale se descompune, de regul, pn la 60% din materia organic iniial. Dintre componentele chimice ale materiei organice, grade mai ridicate de conversie n biogaz, au celulozele, hemicelulozele i grsimile, n timp ce proteinele prezint grade mai sczute i variabile de conversie (tabel 5). Tabelul 5 Cantitatea teoretic de biogaz care poate rezulta prin conversia energetic a unor substane organice pure Natura substanei Hidrai de carbon Grsimi Proteine Biogaz ( l /kg mat. Org.) 886 1535 587 Coninut n CH4 ( %) 50 70 84

51

Lignina nu contribuie la formarea biogazului sau contribuie foarte puin (proces neelucidat nc). Reziduul fermentat rmne cu cantiti apreciabile de materie organic i aproape neschimbate de N i S. Acestea se gsesc n componente nedescompuse sau n diferii compui sintetizai de microflor microbian, care este activ n fermentarea anaerob. O proporie important de azot se gsete n form amoniacal (NH 3). Reziduul conine cantiti apreciabile de aminoacizi, enzime i vitamine din complexul B (de la 2 la 5 miligrame vitamina B12 / kg reziduu). P i K i microelementele (Ca, Mn, Zn, Fe) se menin n aceleai cantiti, dar au grade de mobilitate mai ridicate dect n materialul iniial. Datorit acestei compoziii, reziduul fermentat poate fi folosit ca ngramnt organic pentru sol, pentru ridicarea fertilitii i chiar ca adaos vitamino-proteic, n cazul unor furaje, suport pentru culturi de alge sau hran de peti. Este evident c fermentarea anaerob reprezint un procedeu complex de recirculare a energiei i a elementelor minerale stocate n resturile organice lipsite altfel de valoare de ntrebuinare, dar caracterizate printr-un potenial ridicat de depreciere a calitii mediului ambiant. 3.5. 2. Fermentaia metanogene anaerob. Fazele procesului. Bacterii

Fermentarea anaerob folosit pentru producerea i captarea biogazului este un proces dirijat de descompunere a materiei organice umede, care se desfoar n incinte nchise, n condiii controlate de mediu, n lipsa oxigenului molecular i a luminii. Spre deosebire de alte procese microbiologice dirijate de ctre om, fermentarea anaerob pentru obinerea biogazului nu folosete culturi pure sau condiii sterile. n sistemele naturale n care se gsete, materia organic decompozabil este purttoarea unei microflore foarte variate i active; bacteriile metanogene nu cresc niciodat n culturi pure, ci numai n asociaie cu o microflor bogat, foarte divers. Aceast microflora mixt, n anaerobioz, asigur compuii metabolici specifici dezvoltrii metanobacteriilor. Materiale organice n curs de descompunere, folosite pentru alimentarea fermentatoarelor anaerobe, furnizeaz permanent o microflor activ n procesul de metanogeneza i reprezint principalele surse de sue pentru obinerea inoculului de metanobacterii. De aceea, principalul obiectiv urmrit n procesul de metanogenez l constituie optimizarea factorilor de mediu i tehnologici implicai n activitatea comunitii de microorganisme responsabile de transformrile materiei organice, cu accent deosebit asupra metanobacteriilor. Pe baza cercetrilor microbiologice i biochimice efectuate asupra animalelor erbivore rumegtoare ca i n cazul fermentatoarelor anaerobe, sa constatat c transformarea materiei organice n metan are loc n mai multe faze, dup unii autori dou, dup alii trei. n fiecare dintre ele acioneaz n mod predominant sau aproape exclusiv comuniti distincte de microorganisme (Jewell i colab. 1976; Sursey 1979). n cele ce urmeaz se vor accentua n deosebi aspectele de interes practic privind microbiologia procesului de fermentare anaerob i producere a biogazului. Sinteze valoroase asupra aspectelor fundamentale ale
52

metanogenezei bacteriene au fost Hobson (1983).

efectuate de Topala i Kiss (1982) i

Fazele procesului de fermentaie anaerob Faza acidogen (lichefierea) n aceast faz acioneaz microorganisme fermentative nespecializate, cu capacitate de hidroliz a materiei organice i de producere a acizilor organici. Ele sunt microaerofile i facultativ anaerobe: bacterii celulozolitice, coliforme, propionice, lactice, butirice, acetice, lipolitice, proteolitice, precum i numeroase specii de ciuperci i unele drojdii. n aceast faz, ca i n cea de metanogenez, mai acioneaz bacterii sulfat reductoare i denitrificatoare. Lichefierea reziduurilor organice se produce prin hidroliz enzimatic a substanelor macromoleculare care trec n substane cu greutate molecular mic. n rezidurile din zootehnie, hidraii de carbon se gsesc sub form de compui polimerizai, avnd celuloza ca o component principal, precum i hemiceluloze i alte polizaharide vegetale care nu au fost descompuse n procesul de digestie al animalelor. Datorit coninutului ridicat de lignin acestea sunt relativ greu hidrolizabile, viteza lor de hidroliz constituind, n unele situatii, un factor limitativ pentru desfurarea ntr-un timp optim a fermentaiei anaerobe. Din hidraii de carbon hidrolizai rezult zaharuri uor fermentescibile de tipul arabinoz, xiloz, glucoz i manoz. Aceste zaharuri servesc ca surs energetic pentru nmulirea microorganismelor implicate n transformarea celorlalte componente ale materiei organice. Hobson (1983) subliniaz c nc nu a fost clarificat pe deplin microbiologia descompunerii hidrailor de carbon polimerizai din fermentatoarele anaerobe. Numeroase tipuri de bacterii celulozolitice implicate n acest proces au fost izolate din fermentatoare acionnd n zona de temperaturi mezofile. Activitatea lor specific este potentat, prin efecte necunoscute nc, de o serie de interaciuni cu alte microorganisme din fermentator. Pn n prezent a fost izolat o singur bacterie celulozolitica care acioneaz n zona termofil Clostridium thermocellum. Hobson i Shaw (1974) au identificat n dejeciile de porc supuse fermentaiei anaerobe dou tipuri de bacterii care degradeaz hemicelulozele, tipul principal fiind identificat cu Bacteroides ruminicola. Lipidele sunt hidrolizate de microorganismele lipolitice, cu formare de glicerol i acizi grai cu caten lung. Azotul, necesar pentru proliferarea microorganismelor din fermentator, se gsete n rezidurile organice provenite din zootehnie, n constituieni ai bacteriilor intestinale, ai secreiilor i celulelor epitiliale intestinale, ai resturilor de furaje, sub forma de uree si alti compusi cu azot neproteic, precum i ca azot amoniacal. Sub aciunea microorganismelor proteolitice se produce descompunerea proteinelor cu formarea de amoniac (NH3) care reprezint principala surs de azot pentru toate microorganismele din fermentator (Hobson i Shaw, 1984). Hobson (1983) menioneaz c majoritatea activitii proteolitice din fermentatoarele anaerobe este desfurat de bacterii butirice din genul
53

Clostridium, mai fiind implicate, n mai mic msura Bacteroides rumicola i alte bacterii. n urma descompunerii aminoacizilor cu sulf, bacteriile sulfat reductoare ca i unele bacterii fermentative formeaz sulfuri. De asemenea, H2S intr ca impuritate n compoziia biogazului depreciindu-i calitatea. Peste anumite limite, el este toxic i pentru populaia microbian din fermentator, ceea ce poate conduce la inhibarea procesului de metanizare. Datorit coninutului apreciabil de metale grele din dejeciile de animale crescute industrial, se formeaz ns sulfuri insolubile, care n urma precipitrii nu mai influeneaz n mod nefavorabil activitatea microflorei din fermentator. Efectul metalelor grele n formarea de sulfuri insolubile explic lipsa lor de toxicitate i chiar o influen pozitiv asupra proceselor fermentative din instalaiile de biogaz. n partea final a acidogenezei, mono i dizaharidele sunt fermentate cu producerea n deosebi de acid acetic, hidrogen i bioxid de carbon, iar acizii cu caten lung i acizii grai volatili, cu mai muli atomi de carbon dect acidul acetic, sunt degradai pn la acid acetic i gaze. La ncheierea acestei faze, predomin printre acizii organici volatili acidul acetic, alturi de care se mai afl substane organice i gaze, precum i vitamine i enzime, care vor fi folosite de microorganismele metanogene n procesele lor metabolice. Faza metanogen (gazeificarea) n aceast faz acioneaz bacteriile metanogene, obligatoriu anaerobe, care sunt specializate n producerea de metan. Hidrogenul i bioxidul de carbon reprezint un substrat caracteristic pentru metanogenez. Majoritatea metanobacteriilor, studiate i caracterizate pn n prezent, folosesc ca substrat numai hidrogenul i bioxidul de carbon. Metanul se formeaz prin reducerea bioxidului de carbon i oxidarea hidrogenului gazos. Methanobacterium thermoautotrophicum reprezint, pn n prezent singura metanobacterie, care utilizeaz hidrogenul, avnd activitate n zona temperaturii ridicate. CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O + energie

Bacteriile metanogene, n afara speciilor Methanobacterium bryantii Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanobrevibacter i Methanosarcina barkeri pot folosi i acid formic ca donator de H+.
4 H COOH CH 4 + 3CO2 + 2 H 2O + energie

Dei mai multe cercetri sugereaz c metanobacteriile care pot folosi acetai ar reprezenta o pondere mai mare n cadrul microflorei anaerobe, pn n prezent a fost stabilit aceast nsuire numai pentru Methanosarcina barkeri: :
CH 3 COOH CH 4 + CO2 + energie

54

Aceeai bacterie mai poate folosi metanolul i metilamina ca donori de H :

+

4CH 3 OH 3CH 4 + CO2 + 2 H 2O + energie

Folosirea rapid a H2 de ctre metanobacterii menine o presiune scazut a acestui gaz n mediu, ceea ce constituie o condiie esenial pentru producerea lui n continuare. Metanobacteriile ce folosesc acetaii au un ritm de dezvoltare mai lent. De aceea, conversia acetatului n metan constituie un alt factor pentru desfurarea ntr-un timp optim a fermentrii anaerobe. Energia produs n reaciile menionate mai sus este folosit de bacteriile metanogene pentru meninerea funciilor vitale i pentru asimilarea carbonului, azotului, fosforului, sulfului i microelementelor, cu care sintetizeaz substanele necesare multiplicrii celulare. Principalele surse de carbon sunt bioxidul de carbon i acidul acetic: CO2 + energie acidul acetic + energie substane celulare substane celulare

Bacteriile metanogene nu au capacitatea de a folosi n procesele de nutriie acizii propionic, lactic, butiric, alcoolii superiori metanolului, proteinele sau aminoacizii. Pentru sinteza proteinei celulare, acestea utilizeaz formele reduse ale azotului (forma amoniacal) i sulfului (hidrogen sulfurat). Faza de metanogenez se ncheie prin obinerea biogazului. Acesta este un amestec gazos, de metan n proporie de maxim 80% i CO 2 20%, alturi de care se gsesc cantiti mici de H2, H2S, mercaptani, vapori de ap, urme de amoniac, de azot elementar, indol etc. Bacteriile metanogene sunt foarte variate n privina nsuirilor morfologice, dar unitare din punct de vedere biochimic i fiziologic; sunt singurele microorganisme care au o respiraie strict anaerob i capacitatea de a produce metan prin procese metabolice. Ca forme de via dintre cele mai vechi pe Terra, bacteriile metanogene au fost incluse la nivel taxonomic superior n regnul Archaebacteria (Woese i colab.,1978). Ele se deosebesc de toate celelalte bacterii prin trsturi caracteristici: 1. extrema sensibilitate fa de aciditatea mediului; 2. lipsa mureinei din peretele celular; 3. predominarea lipidelor poliizoprenice n compoziia lipidelor celulare; 4. structuri caracteristice secvenelor nucleolitice din ARN. Speciile de bacterii metanogene se deosebesc ntre ele, printre altele, i dup structura i compoziia peretelui celular, ceea ce le confer o rezisten diferit fa de substanele bactericide i bacteriosatice (Topala i Kiss, 1982). Bacteriile metanogene, fiind microorganisme strict anaerobe, necesit tehnici de cultur speciale pentru a fi obinute n culturi pure de laborator. Aceste tehnici costisitoare, descrise de Hungate i Wolfe (citai de Hobson,
55

1983) implic ndeprtarea total a aerului din mediu n timpul preparrii culturilor. 3.4.3. Factorii care influeneaz fermentarea anaerob Factorii care influeneaz fermentaia anaerob sunt factori de mediu i factori tehnologici. De optimizarea acestor factori depinde obinerea unor randamente ridicate n bioconversia energetic a reziduurilor organice. Factorii de mediu cu influene semnificative asupra fermentaiei anaerobe sunt: - temperatura - pH-ul - elementele nutritive - substanele toxice. Dintre factorii tehnologici trebuie retinui: - compoziia substratului organic - mrimea ncrcturii organice timp de retenie coninut de substan uscatdin substrat - omogenizarea - nclzire, izolare - inoculare cu microorganisme metanogene 1. Temperatura Viteza de cretere a metanobacteriilor i, prin urmare, producerea biogazului depinde de temperatura din fermentator. Dei obinerea de biogaz este posibil n domeniul de temperatur de la 0 la 60 grade Celsius, creterea metanobacteriilor este mult ncetinit sub 20 grade i peste 55 grade Celsius. Au fost delimitate 3 domenii de temperatur n care se produce fermentaia metanic: - zona termofil (peste 45 grade) - zona mezofil (ntre 20 si 45 grade) - zona psihrofil (criofila sub 20 grade) n practica curent, fermentarea anaerob a nmolurilor de la staiile de epurare oreneti se face n zona de temperaturi mezofile, temperatura optim fiind cuprins n limitele 30 35o C (fig. ). Alegerea temperaturii de funcionare a fermentatorului depinde att de criterii biotehnologice ct i economice. Fermentatoarele care funcioneaz n zona termofil produc biogaz cu o vitez mai mare dect cele care funcioneaz n zona mezofil. Viteza mai mare de producere a biogazului scurteaz timpul de retenie al substratului organic n fermentator. Ca urmare, volumul fermentatorului este mai mic i instalaia cost mai puin. Acest tip de instalaie este indicat n zone climatice calde.

56

Fig. 17 Producia relativ de gaz / zi n funcie de temperatura la care are loc procesul Fermentatoarele anaerobe din zona temperat funcioneaz n zona mezofil la temperaturi de 22-38C. Principalul dezavantaj al acestei temperaturi de funcionare este acela ca determinnd viteze mai lente de producere a biogazului, necesit perioade de retenie mai ndelungate a materialului organic n fermentator. Variaiile bruste de temperatur influeneaz negativ activitatea microbiologic din fermentator. Dac aceste variaii sunt prea mari sau prelungite, producerea de biogaz poate s se opreasc complet. Aceasta este determinat de ruperea echilibrului dintre faza de acidogenez i metanogenez, ntruct metanobacteriile sunt mult mai sensibile la variaiile bruste de temperatur dect celelalte microorganisme. Astfel de situaii se ntlnesc n instalaiile de capacitate mic, n timp ce n instalaiile de capacitate mijlocie i mare, procesul poate suporta scderi de temperatur de pn la 5C, dar nu mai mult de 48 ore. 2. PH - ul Stabilitatea procesului de producere a biogazului ca i calitatea acestuia depinde de pH-ul materialului supus fermentaiei. Metanobacteriile sunt foarte sensibile la pH-ul mediului. Ele se dezvolt cel mai bine dac reacia este neutr, respectiv la pH de 6.8 7.2, dar pot tolera un domeniu mai larg de pH cuprins ntre 6.7 8.0. Aceste microorganisme sunt sensibile i la variaiile bruste de pH. n condiii normale, dejeciile de animale, mai ales cele proaspete, dein suficient alcalinitate pentru a menine pH-ul din fermentator n domeniul 7.0 8.0. Apar i situaii cnd, datorit proiectrii improprii sau exploatrii defectuoase a instalaiei, echilibrul ntre activitatea microorganismelor productoare de acizi i cea a metanobacteriilor este rupt i pH-ul scade. ntr-o prim etap va crete n biogaz proporia de CO 2 fa de CH4; dac pHul continu s scad va nceta total producerea de biogaz. Pentru meninerea pH-ului n domeniul optim fermentrii metanice prin prevenirea acidifierii excesive, este indicat introducerea de substane alcalinizante, stabilizatoare de pH: apa de var, var pasta, carbonat de calciu, fosfat de calciu, ap amoniacala, hidroxid de sodiu soluie 40 %. 3. Elemente nutritive Produsele organice reziduale din agricultura conin cantiti suficiente i n raporturi echilibrate din toate elementele eseniale pentru nutriia microorganismelor. 4. Substane toxice Orice substan care inhib activitatea microorganismelor metanogene sau care este letal pentru acestea prezint un pericol potenial pentru procesul de fermentare anaerob. Ex: produse antimicrobiene (antibiotice), prezena unor cantiti excesive de NH3.

57

Cap. IV Conversia deeurilor i subproduselor industriale cu ajutorul microorganismelor

4.1. Natura i cantitile de subproduse i deeuri Biomasa vegetal destinat conversiei pe cale biologic este constituit din componentele de baz (celuloz, hemiceluloz, lignine) ale membranelor celulare de la plantele vii sau moarte supuse transformrilor. Aceste mase lignocelulozice, formate din poliglucide fermentescibile au fost, fiind n prezent, prea puin valorificate, dei natura pune la dispoziie cantiti enorme de materii prime (tulpini ale plantelor lemnoase, paie de cereale, coceni de porumb, furaje, reziduuri de fructe i legume din industria alimentar). Din diverse specii de cereale, cultivate n lume, rezult anual peste 1,7 miliarde tone de paie, din care cea mai mare parte se pierde prin mineralizare. De la cultura trestiei de zahr i din industria zaharului rmn anual 50 de milioane de tone de reziduuri i 67 milioane tone de trestie mcinat. Acestea sunt insuficient folosite, cu toate c ar putea servi ca fertilizani pe ogoarele agricole sau ca furaj pentru animale. Cantiti mari de deeuri rmn i de la fabricile de conserve de ananas unde se folosesc mai puin de 20% din fructele ntregi. n aceste condiii, valorificarea complet a acestor biomase, n deosebi prin hidroliza enzimatic a poliglucidelor componente i trecerea lor n forme mai simple cu multiple utilizri reprezint un deziderat. Compoziia principalelor surse de biomas lignocelulozic este diferit n funcie de provenien (tabel 6). Tabelul 6 Coninutul biomasei lignocelulozice din diferite specii vegetale Sursa vegetal Celuloz (%) Tulpini de pin 42,0 Tulpini de mesteacn 38,8 Paie de gru 34,0 Coceni de porumb 38,0 Hemiceluloz (%) 23,5 37,3 27,6 26,0 Lignin (%) 27,8 19,5 18,0 11,0

Celuloza este un polimer liniar, insolubil format din cca 10.000 molecule de glucoz, cuplate prin legturi glicozidice de tip C 1-C4. Straturile celulozice din membranele celulare sunt protejate de o structur ligninic i hemicelulozic, ceea ce frneaz procesul de degradare sub influena diferiilor factori.
58

Hemicelulozele sunt heteropoliglucide ramificate, mai uor degradabile dect celuloza. Conin, n amestec, molecule de xiloz (60-70%), arabinoz (10-15%) i glucoz (15-30%), asociate cu celuloza n membrana primar i secundar a celulelor vegetale.

Fig. 18 Sructura celulozei Lignina reprezint o component esenial a lemnului, a doua n importan dup celuloz. Separarea de celuloz, cu care este intim legat se bazeaz pe hidroliza acesteia cu acizii tari, urmat de obicei de dizolvarea celulozei degradate. Aceste operaii brutale, produc probabil i modificri n structura ligninei. Lignina se formeaz prin copolimerizarea dehidrogenat a alcoolului phidroxicinamilic cu alcoolul coniferilic si cu alcoolul sinapic. Aceast reacie poate fi realizat i " n vitro " n prezena fenol-oxidazei, obinndu-se lignine deosebit de pure. Lignina este deci un compus cu structur polifenolic n care elementele C, H, O se afl n proporii ce variaz cu specia vegetal i vrsta plantei. Este o combinaie aromatic, macromolecular, amorf, care umple toate spaiile din jurul fibrelor de celuloz, unindu-le ntr-un agregat rigid. Lignina reprezint cca 70% din componena lamelei mediane care separ celulele vegetale ntre ele i constituie un strat greu permeabil pentru accesul agenilor hidrolizani n interiorul celulelor. Produsele de degradare enzimatic a ligninelor din membrane nu sunt fermentescibile, ceea ce le asigur o rezisten mare fa de aciunea unor factori degradabili . Celuloza, hemicelulozele i ligninele sunt compui insolubili n ap iar, prin poziia lor n structura membranelor celulare, constituie bariere de acces pentru diferite substane, inclusiv pentru enzime. Rolul de barier este exercitat, n deosebi, de membrana secundar format, n principal, din lignin i hemiceluloz care sunt asociate strns, att ntre ele ct i cu fibrele de celuloz, prin diferite tipuri de legturi (fore Van der Waals, puni de hidrogen). Organizarea fibrilar i pluristratificat a foielor membranare ale celulelor precum i prezena unor particule de ncrustaie, determin o slab degradare enzimatic, pe cale natural, a componenilor pereilor celulari. De aceea pentru a mri gradul de hidroliz este necesar aplicarea unor pretratamente fizico-chimice care s realizeze distrugerea matrielor de lignin i hemiceluloze precum i mrirea suprafeelor substratului accesibil pentru enzime . 4.2. Biodegradarea ligninei, celulozei i hemicelulozelor 4.2.1. Pretratamentele i hidroliza biomasei
59

Pretratamentele se bazeaz pe solubilitatea ligninei i a hemicelulozelor n medii alcaline, calde i pe solubilizarea hemicelulozei i n medii acide si calde. Pe aceste principii se aplic tratamente alcaline cu NaOH (8-12% n raport cu substana uscat a substratului lignocelulozic), cu meninerea la temperatura de 80-120 C, pe o durat de 30-60 min . Pentru hidroliza complet a hemicelulozelor se recomand i un pretratament cu acid sulfuric (1-3%), pe o durat de 30 min., la temperatura de 120-130C, folosind un reactor de percolare. Mai recent, s-a propus tehnica de pretratament cu vapori de ap prin injectare sub presiune la temperaturi foarte ridicate (180-240C) . Mai eficiente s-au dovedit pretratamentele combinate (acide+vapori sub presiune), mecanice, chimice (cu solveni n prezen de catalizatori) precum i tratamente biologice folosind ciuperca bazidiomicet Phanerochaete Chrysosporium , care degradeaz rapid lignina. Dup pretratament, urmeaz hidrolizarea biomasei lignocelulozice prin acionarea enzimelor celulolitice specifice (celulaze , hemicelulaze , pectinaze) . Aceste enzime sunt produse de ciuperca Trichoderma reasii, fie n form mutant, realizat printr-un program de ameliorare genetic, fie extras din pasta de molid . 4.2.2. Biodegradarea celulozei Acest proces, care se bazeaz pe aciunea enzimelor celulazice asupra celulozei, prezint ca avantaj obinerea unor produse mai omogene, lipsite de compui aldehidici sau cetonici care rezult din transformarea glucozei n hidroliza acid. Problema este de importan major dac produsele reaciei enzimatice se utilizeaz n alimentaie sau fermentaie. De asemenea, degradarea celulozei cu enzime celulazice este convenabil din punct de vedere energetic (temperaturi i presiuni sczute) i al polurii mediului nconjurtor (nu rezult deeuri acide ). Dezavantajele proceselor de hidroliz enzimatic constau n aceea c este necesar o instalaie complex pentru producerea enzimei, iar scindarea celulozei este relativ lent comparativ cu hidroliza acid. Materialele celulozice trebuiesc supuse unor tratamente (fizice si chimice) pentru a obine eficiena industrial scontat. De fapt, lipsa unui procedeu de pretratare standard, cu efecte cunoscute i economice, reprezint principala cauz pentru care hidroliza enzimatic ntrzie s fie industrializat pe scar larg. Microorganisme i enzime Microorganismele care produc enzime ce hidrolizeaz legturile glucozidice din lanurile de celuloz, sunt larg distribuite n diferite grupuri taxonomice. Astfel, abilitatea de a utiliza celuloza este caracteristic: bacteriilor, actinomicetelor, fungiilor superioare. Cu toate acestea numai cteva dintre acestea se caracterizeaz prin producerea unei activiti enzimatice ridicate, necesar pentru a realiza "n vitro" degradarea celulozei insolubile pn la zaharuri solubile : - bacterii: Clostridium thermocellum,Thermomonospora sp.; Cellulomonas sp., Streptomyces flavogriseus.

60

- fungii: Trichoderma reasei, Sporotricum pulverulentum, Penicillium funiculosum, Aspergillus wentii , Schizophyllum commune etc Dei natura multicomponent a sistemului celulazic variaz considerabil printre organisme, mecanismul de aciune asupra substratului este similar. Bazat pe faptul c multe organisme capabile de a utiliza forme modificate chimic ale celulozei au o slab activitate fa de celuloza nativ, s-a presupus c microorganismul celulolitic produce cel puin dou celulaze: una denumit "C1" care provoac hidroliza celulozei native n catene polizaharidice mai scurte si alta ,"Cx" responsabil pentru scindarea acestora n molecule mici solubile, capabile de difuzie n celul. Aceast ipotez a fost modificat ulterior prin adugarea altei enzime, clasificat ca celobioz, care hidrolizeaz produsul final de degradare a celulozei, celobioza, n glucoz . Mai trziu, cercetrile efectuate asupra aciunii enzimelor fa de substraturile iniiale i intermediare i cele referitoare la activitatea componenilor celulazici individual au condus la concluzia c , complexul enzimatic este alctuit din patru componente : - endo -1,4-glucanaza - exo -1,4-glucanaza - -1,4-glucan-celubiozil hidrolaza - -glucozidaza Endo -1,4-glucanaza - n aceast grup se include Cx cu activitate fa de carboximetilceluloz. Rolul enzimei este de a scinda statistic catenele de celuloz i se presupune c acioneaz n principal asupra regiunilor amorfe din fibra de celuloz . Exo -1,4-glucanaza - aceast categorie de enzime separ o singur unitate de glucoz de la captul nereductor al catenei de celuloz. Enzimele produc o cretere rapid a cantitii de zaharuri reductoare i o scdere lent a gradului de polimerizare . -1,4-glucan-celubiozil hidrolaza - enzimele de acest tip separ o unitate de celobioz de la captul nereductor al catenei de celuloz . Ele acioneaz asupra regiunilor cristaline din fibra de celuloz i pot fi considerate de tip C1. -glucozidaza i celobiazele sunt enzime de baz care catalizeaz hidroliza celobiozei la produsul final glucoz, n biodegradarea materialelor celulozice. 4.2.3. Biodegradarea hemicelulozelor. Microorganisme i enzime Hemicelulozele constituie componenta polizaharidic care se degradeaz cel mai uor sub aciunea microorganismelor. n general, enzimele incluse n procesul de hidroliz a hemicelulozelor sunt produse de aceleai microorganisme care sintetizeaz i celulaze. Astfel, sunt citate fungiile: Myrothecium verrucaria, Aspergillus cryzae, Aspergillus niger, Aspergillus wenti, Trichoderma reasei, Pennicillium janthinellum, etc. Experimentele privind coninutul de enzime care degradeaz hemicelulozele, efectuate pentru fungiile Aspergillus niger i Trichoderma, au evideniat c toate preparatele enzimatice obinute au n compoziie alturi de celulaze, glicozidaze i enzime hemicelulazice. Dintre microorganismele considerate, A.niger se distinge printr-un potenial mai ridicat de producere a hemicelulazelor .
61

Relaia ntre structura hemicelulozelor i enzime; mecanismul hidrolizei enzimatice. Enzimele care acioneaz asupra hemicelulozelor fac parte din categoria hidrolazelor i sunt denumite enzime hemicelulolitice sau hemicelulaze. Aceste glican-hidrolaze degradeaz catenele principale ale poliozelor. Prin urmare hemicelulazele tipice sunt : --D-galactanaz; --D-mananaz; --D-xilanaz. Aceste enzime sunt capabile s hidrolizeze nu numai glicozidele cu masa sczut ci i catenele scurte i s elibereze monozaharidele care reprezint ramificaii ale catenei principale hemicelulozice. Aciunea glicozidazelor este necesar pentru a realiza hidroliza total a hemicelulozelor pn la monozaharide, deoarece enzimele menionate acioneaz sinergic cu hemicelulazele . Asemntor majoritii enzimelor care degradeaz polizaharidele, hemicelulazele acioneaz asupra substratului n dou moduri : exo i endohidrolitic. -o exo-enzim degradeaz poliozele prin separarea succesiv a unitilor mono sau oligozaharidice, iar scindarea avanseaz n trepte, n mod obinuit de la captul nereductor al catenei polizaharidice . -endo enzimele acioneaz ntr-o manier statistic, provocnd o hidroliz multipl care este nsoit de o scdere marcant a gradului de polimerizare a substratului. Polimerul este astfel degradat progresiv n fragmente mai scurte pn la produse ce nu mai pot fi scindate (n mod obinuit mono i di-zaharide). 4.2.4. Biodegradarea ligninei n ultimii ani s-au amplificat n mod deosebit studiile referitoare la degradarea microbiologic a ligninei deoarece realizarea practic a biolignificrii ofer o serie de avantaje fa de procedeele clasice utilizate n prezent (tabelul 7): Tabelul 7 Comparaii privind procedeele clasice de delignificare i cele biologice Dezavantajele procedeelor actuale Energointensive Incompatibilitate cu mediul ambiant Utilizarea moderat a resurselor (randament de conversie) Consum mare de ageni chimici
62

Avantajele delignificrii biologice (enzimatice) Necesar sczut de energie convenional Compatibilitate cu mediul ambiant nalt selectivitate i activitate a enzimelor Catalizatori regenerabili

Produse ligninice care conin sulf

Produse ligninice lipsite de sulf

Pentru a putea controla procesul de biodelignificare se impune rezolvarea urmtoarelor probleme : - selecionarea de microorganisme cu agresivitate ridicat fa de lignin; - determinarea condiiilor optime de cultur; - realizarea de mutaii; - controlul sintezei enzimelor; - optimizarea treptelor catalitice care limiteaz viteza.

Microorganisme cu activitate lignolitic Principalele grupe de microorganisme care degradeaz lignina sunt prezentate n tabelul: Tabelul 8 Microorganisme cu capacitate de degradare a ligninei Microorganism Actinomycetes Nocordia Streptomyces Fungi imperfeci Ascomycetes Basidiomycetes Fusarium Paulospora Paecilomyces Chaetomium Coriolus, Phanerochaete Lantinus, Pleurotus Gloeophyllus Poria, Coniophora Substrat Lignin sintetic, tulpini de porumb, esut floemic de conifere Lignin sintetic, blocuri de lemn Blocuri de lemn, lignin sintetic, tulpini de porumb Lemn Lignin sintetic

n prezent se consider c aplicarea practic a biodelignificrii este limitat datorit pe de o parte a lipsei de specificitate a microorganismelor fa de lignin, iar pe de alt parte datorit vitezelor reduse ale proceselor de biodegradare.

63

Prin urmare o prim etap important a realizrii unui proces biotehnologic de biodegradare a ligninei o constituie obinerea unei tulpini cu aptitudini imbuntte de biodegradare, care ulterior s fie dezvoltat prin mutaii i adaptare. O a doua etap este optimizarea parametrilor de cultur care includ nutriia microorganismului, factorii de mediu, introducerea diferiilor aditivi i volumul culturii. n a treia etap se poate apela la ingineria genetic pentru a introduce genele care codific genele dorite n tulpina productoare. Primele dou etape au fost mai intens studiate n ultimii ani pentru o serie de microorganisme dintre care: Phanerochaete chrisosporium. n general pentru a putea caracteriza un microorganism pentru capacitatea sa lignolitic se poate aplica urmtoarea metod: un mediu care conine lignin i alte elemente nutritive este inoculat cu un organism test. Dup incubare n plci Petri se efectueaz un tratament cu o soluie de clorur feric/fericianur de potasiu. Zonele clare din jurul coloniilor indic degradarea ligninei. Factori care influeneaz biodegradarea ligninei Studiile efectuate au evideniat c lignina nu reprezint o surs de carbon pentru microorganisme n etapa de cretere primar i c pentru degradarea i metabolizarea sa este necesar prezena hidrailor de carbon. Astfel, fungiile Phanerochaete chrisosporium i Coriolus necesit pentru cretere i metabolizarea ligninei un cosubstrat de tipul celulozei sau glucozei. S-a mai constatat de asemenea c pentru a realiza un metabolism biologic maxim, cu o degradare minim a hidrailor de carbon, azotul din mediu trebuie limitat iar concentraiile ionilor sulfat i fosfat i ale celorlalte elemente nutritive s fie meninute la nivele adecvate. Un alt factor care influeneaz degradarea ligninei este concentraia oxigenului n mediul de cultur , deoarece mecanismul de degradare a ligninei este oxidativ i deci prezena oxigenului molecular ntr-o concentraie ct mai ridicat n mediu este benefic. 4.3. Obinerea de biomas din deseuri celulozice Microorganismele utilizate pentru acest proces sunt Candida utilis, Candida torulopsis, Candida robusta. Pentru a deveni substrat ce poate fi utilizat de drojdii pentru producerea de biomas, deeurile celulozice trebuie hidrolizate acid sau enzimatic. Acest din urm procedeu este preferat din motive economice si de calitate a substratului obinut. Pentru a creste susceptibilitatea deseurilor celulozice, la hidroliza enzimatic este recomandat pretratamentul acestora cu alcalii (NaOH), tratament tip viscoz sau cuproamoniacal. Hidrolizatul de celuloz se separ de fraciunea netransformat i constituie substratul pentru bioconversie. Procesul de bioconversie este aerob i se realizeaz ntr-un fermentator de tip air-lift la 35380 C si la pH = 4,8-5,5, n fermentator fiind adus i soluia de sruri minerale pentru sursa de azot i fosfor. Cantitatea de aer pentru o bun biosintez este de 8 12 m3 aer /
64

m3 mediu de cultur. Meninerea pH-ului n timpul biosintezei se face cu amoniac. Dup obinerea biomasei, aceasta se concentreaz prin filtrare si centrifugare n dou trepte cu splare dup treapta ntia de centrifugare. n final materialul organic obinut la separarea centrifugal se concentreaz n evaporatoare i se usuc prin pulverizare pn la un coninut de 8 10 % umiditate.

4.4. Biosolubilizarea accelerat a metalelor grele din steril

Ca rezultat al activitii miniere desfurate de zeci de ani n diferite zone, s-au acumulat uriae depozite (halde) de steril, coninnd concentraii crescute de ioni metalici sau elemente radioactive. Asemenea sedimente reprezint severe surse de poluare a mediului, fenomen agravat i de lipsa nveliului vegetal de pe suprafaa unor astfel de halde. n Romnia sunt prezente dou astfel de zone cu deeuri miniere, cantonate la Baia judeul Tulcea i Valea Sebei judeul Alba unde se prelucreaz minereuri sulfurice cuprifere extrase de la Altn Tepe i respectiv Roia-Poieni. n ambele areale exist condiii pentru o biosolubilizare natural a ionilor metalici coninui n steril, sporind astfel riscul polurii mediului. Dintre multiplele aspecte care fac obiectul biotehnologiilor, recuperarea metalelor din deeuri i depuneri rezultate n urma exploatrilor miniere reprezint un domeniu extrem de actual. Prin aceste procese se urmresc dou aspecte: -concentrarea ionilor metalici din soluii prin activiti de biosolubilizare i biosorbie; -reducerea gradului de poluare a terenurilor contaminate cu depuneri de materiale reziduale coninnd ioni metalici. Biosorbia Sorbia unor specii anorganice pe biomas, cu rol de sorbent, este denumit biosorbie. Biosorbia asigur o alternativ pentru tehnologiile de depoluare. Biosorbia ionilor metalici pe biomas implic legturi extracelulare i intracelulare, interacii complexe, dependente de natura ionului metalic i de structura biosorbentului. Biosorbia decurge prin mecanisme de adsorbie, complexare sau legare chimic. Iniial are loc adsorbia rapid a ionului metalic, datorit interaciei dintre acesta i pereii celulei, urmat de adsorbia activ, lent, produs de transportul prin membran a ionului n interiorul celulei. La contactul cu o soluie apoas care conine un ion metalic, biomasa poate reine, n mai puin de 10 minute, 90% din cantitatea de cationi. n continuare se desfoar etapa de adsorbie lent a metalului, care poate dura cteva ore, pn la atingerea strii de echilibru. Adsorbia lent sau activ a metalelor pe biomas este influenat de: activitatea metabolic a biomasei, pH-ul i compoziia mediului apos, concentraia metalului n soluia de analizat, temperatura i prezena unor ioni competitivi. Unii factori determinani pentru adsorbia metalelor pe biomas sunt prezentai n figura de mai jos:
65

Fig. 19 Rspunsul microorganismului n funcie de concentraia elementelor urm Majoritatea microorganismelor vii manifest mecanisme de dezintoxicare, care implic excluziunea metalului din celul sau segregarea metalului n peretele celulei, complexarea cu polimeri extracelulari sau transformarea metalului prin reacii redox. Biomasa microbian conine un numr mare de centri activi, care pot lega ionii metalici. Acetia sunt reprezentai de grupele carboxil, carbonil, hidroxil, fosfat i tiol, coninute de pereii celulelor. Mecanismul de legare a ionilor metalici implic interacii ionice ntre celulele ncrcate negativ i cationi, care se soldeaz cu flocularea microorganismelor, ca n cazul tratrii apelor reziduale cu nmol activ. Studiul izotermelor de adsorbie a evideniat c n cazul biomasei de Aspergillus niger este posibil un proces de schimb ionic, ntre cationii uranil, care nlocuiesc reversibil cationii, fixai de aminoacizii constitutivi ai proteinei din pereii celulei. Peptidoglicanul este agentul principal care determin depunerea metalului n pereii celulelor de Bacillus subtilis, acionnd prin intermediul grupelor carboxil din acidul glutamic. Metalotioneinele constituie un grup de proteine (enzime i pigmeni) care fixeaz specific cationii, prin complexare, recuperndu-i din eflueni apoi. Este de perspectiv modificarea genetic a microorganismelor, n vederea obinerii de ageni complexani ai metalelor. n acest context, se remarc producerea metalotioneinelor prin clonarea genelor de metalotionein uman i exprimarea lor ntr-o bacterie. Complexarea metalelor cu polimeri din pereii celulelor permite microorganismelor s supraveuiasc n medii apoase, care conin metale la concentraii la care ar fi letale dac ar fi prezente n citoplasma celulei. Recuperarea metalelor acumulate n biosorbeni prin biosorbie prezint o serie de avantaje: Posibilitatea recirculrii deeurilor industriale, eliminnd necesitatea depozitrii metalelor; Posibilitatea reutilizrii biosorbentului, ceea ce contribuie la reducerea costurilor implicate n generarea acestuia.

66

Eluarea metalelor din biosorbeni poate fie efectuat cu soluii alcaline (Na2CO3), acid etilen diamino tetraacetic sau cu soluii diluate de acizi minerali (HCl, HNO3, H2SO4). La utilizarea unor biomase ieftine (nmoluri) i reinerea metalelor preioase sau rare (aur, argint, uraniu) se practic recuperarea cationilor prin incinerarea biosorbentului. Pentru evaluarea factorilor de risc ai poluanilor asupra mediului nconjurtor i elaborarea unor strategii eficiente de control al calitii mediului se impune descrierea interaciilor ntre contaminani i mediu, sau materialul sorbtiv, apelnd la modele, precum: Modelul distribuiei hidrofobe; Modelul complexrii de suprafa (al complexrii superficiale). Modelarea procesului de biosorbie pentru poluani organici Modelul distribuiei hidrofobe. Datorit persistenei n mediul nconjurtor, 2,4,6-triclorfenolul este un poluant periculos, investigat n scopul reinerii din soluii apoase pe suprafee bacteriene de Bacillus subtilis, constatndu-se c procesul depinde de pH-ul mediului, durata sorbiei i raportul solid-soluie. Modelul distribuiei hidrofobe presupune c sorbia este controlat de poluant i de concentraia bacteriei, descriind corect procesul de reinere numai pentru valori ale pH-ului mai mici de 8. 2,4,6 Triclorfenolul este o specie organic ionizabil, fiind prezent n dou forme: neutr (HTCPO) i ncrcat negativ (TCP). Conform acestui model, biosorbia este descris printr-un set de coeficieni de distribuie (D) care coreleaz activitile HTCP O i/sau TCP n faz apoas (a, moli/kg de soluie) cu concentraiile lor sorbite (reprezentate prin paranteze ptrate, moli/kg soluie) i masa sorbentului (, g/kg de soluie).
TCPaq TCPadsorbit TCPadsorbit = DTCP aTCP O O HTCPaq HTCPadsorbit O HTCPadsorbit = DHTCP O aHTCP O

Mrimea D se coreleaz cu printr-o izoterm liniar. Dup normalizarea lor, n raport cu , valorile D pot fi utilizate pentru modelarea sorbiei ntr-un domeniu, n care rapoartele solid/soluie sunt descrise de izoterma respectiv. Modelul complexrii de suprafa. Biosorbia 2,4,6 triclorfenolului (TCP) poate fi descris prin modelul complexrii de suprafa, conform cruia att forma negativ, ct i cea neutr a TCP formeaz compleci 1:1, grupele funcionale hidroxil neutre ale bacteriei.
R OH O + TCP R OH TCP R OH + HTCP R OH HTCP
O O O

(log K = 3,01 0,5) (log K = 3,77 0,5)

Procesele de adsorbie din grupele funcionale de pe suprafaa bacterian i speciile din soluie pot fi caracterizate prin: stoechiometrie, legea aciunii maselor i constanta de stabilitate.
67

Protonarea grupelor funcionale carboxil, fosfat i hidroxil implic reaciile (3,55-3,57) n care R reprezint bacteria la care sunt ataate grupele funcionale.
R COOH O R COO + H + R PO4 H
O

log K = 4,82 log K = 6,9 log K = 9,4

R PO + H

Bacillus subtilis are o suprafa specific de 140 m 2/g, respectiv 1,210-4 moli de centri carboxil, 4,410 -5 moli de centri fosfat i 6,210 -5 moli de centri hidroxil/g. Pentru a descrie sorbia triclorfenolului pe bacteria Bacillus subtilis a fost luat n considerare i adsorbia HTCP O pe centri superficiali carboxilici protonai, care poate fi reprezentat prin reacia de mai jos i caracterizat prin constanta de stabilitate, K unde modulele reprezint concentraiile speciilor capsulate pe suprafa, n moli/kg soluie.
R COOH O + HTCP O R COOH HTCP O K = R COOH HTCP O R COOH O aHTCP O

R OH O R O + H +

Relaii similare pot fi obinute i pentru reacii de adsorbie n care sunt implicate HTCPO sau TCP- i centri superficiali carboxil, fosfat i hidroxil protonai sau deprotonai. Suprafaa bacterian dezvolt un potenial electric negativ datorit deprotonrii grupelor sale funcionale superficiale, care influeneaz caracterul hidrofob al suprafeei i interaciile dintre centri superficiali i speciile ncrcate din soluie. Din aceste motive, constantele de stabilitate determinate experimental, Kexp, trebuie ajustate pe baza relaiei.
K = K exp . exp( zF/ RT )

unde K este constanta de stabilitate, cnd sarcina suprafeei este zero. Variabilele z, F, , R i T reprezint: sarcina ionului care se adsoarbe, constanta Faraday, potenialul electric al suprafeei, constanta gazelor i temperatura absolut. Potenialul electric al suprafeei () poate fi corelat cu sarcina suprafeei () prin modelul capacitii electrice (C) constante a stratului dublu:
C=

Pentru Bacillus subtilis capacitatea electric a suprafeei este de 8 F/m2. Se pare c biosorbia 2,4,6 triclorfenolului pe Bacillus subtilis poate fi descris pe modelul complexrii superficiale, cu toate c numeroase date de literatur atest c biosorbia speciilor organice pe suprafee biologice este guvernat de interacii hidrofobe. Modelul complexrii pe suprafa prezint trei avantaje fa de modelul distribuiei hidrofobe: Valorile K sunt constante i independente de compoziia soluiei i de raportul solid/soluie; Constantele de stabilitate din modelul complexrii superficiale pot fi comparate cu alte constante de stabilitate determinate anterior; Posibilitatea estimrii constantelor de stabilitate care descriu adsorbia pe diferite suprafee bacteriene dintr-un set limitat de date experimentale.
68

Deoarece exist mai multe specii de bacterii n soluii, iar caracteristicile celulelor sunt dependente de condiiile de cretere, o fraciune semnificativ a celulelor poate fi prezent sub form de spori. Din aceste motive descrierea sorbiei pe bacterii prin modelul complexrii de suprafa implic investigaii suplimentare. Modelarea procesului de biosorbie pentru poluanii anorganici Modelul complexrii de suprafa (sau superficial) a fost aplicat i pentru descrierea adsorbiei metalelor grele pe suprafee minerale, n special pe suprafeele solide ale oxizilor hidratai, obinndu-se rezultate promitoare. Aceasta constituie o abordare superioar a procesului, prin renunare la metode empirice, respectiv la determinarea izotermelor de adsorbie i a parametrilor de distribuie corespunztori, care s-au dovedit a implica restricii. Modelul echilibrului chimic a fost aplicat i pentru descrierea cantitativ a adsorbiei metalelor grele pe nmoluri din ruri. n cazul unei dependene direct proporionale ntre constantele de adsorbie a metalelor i constantele iniiale de hidroliz, modelul echilibrului chimic poate fi utilizat pentru determinarea concentraiei de Cu, Ni, Pb i Zn n apa rurilor. Sedimentul are o grup funcional superficial medie, exprimat prin SOH. Protonarea i deprotonarea suprafeei sedimentului este exprimat prin reaciile de mai jos: int + Ka SOH 2 SOH + H + 1
SOH SO + H +
int Ka 2

Adsorbia metalelor grele (M2+) pe suprafaa sedimentului poate fi reprezentat prin reaciile de mai jos:
2+ SOH + M S SO M 2 + + HS + 2+ + SOH + M S + H 2O SO MOH + + 2 H S

Adsorbia din sistemele naturale este descris prin considerarea principiilor a trei modele de complexare superficial: modelul capacitii electrice constante, modelul stratului difuz i modelul stratului triplu. Modelul capacitii electrice constante, presupune un simplu plan, pe a crui suprafa sunt adsorbii specific ionii. Straturile dublu electric sunt de tip Helmholtz, cu caracteristici de condensator electric, cu o pereche de plci n parallel i capacitate electric fix (C) pentru fiecare dintre combinaiile ntre temperatur, trie ionic i proprietile de electrolit. Modelul are trei parametric specifici (C, pk inta1, pkinta2). Modelul stratului difuz implic prezena n regiunea interfacial a dou planuri: o suprafa pentru adsorbia H +, HO- i a speciilor adsorbite specific i un plan al stratului difuz, spre care converg contraionii. Distribuia ionilor, sarcina i potenialul n stratul difuz sunt descrise prin ecuaiile Poisson Boltzmann. Pentru caracterizarea suprafeei la diferite trii ionice se utilizeaz dou constante: pkinta1 i pkinta2. Modelul stratului triplu admite c n regiunea interfacial exist trei planuri: o suprafa pentru adsorbia H +, HO- i a ionilor puternic adsorbii, o suprafa aproape plan pentru ionii slab adsorbii i un strat difuz,
69

reprezentnd cea mai scurt distan de acces spre sarcina disociat. Acest model este caracterizat prin ase parametri (C1, C2, pKinta1, pKinta2, pK-intNO3, pKint Na) i s-a dovedit eficient ntr-un interval larg de trii ionice. Aplicarea acestui model este dificil, fiind implicat pentru adsorbia metalelor pe un sediment oxidic. Modelele comlexrii superficiale pot simula rezultatele experimentale, n anticiparea comportrii la adsorbie a sedimentelor acvatice naturale (tabelul de mai jos). Tabel 9 Modelele complexrii superficiale n sorbia Cu(II) i Cd(II) pe sedimente naturale Ioni sorbii Cu (II) Cd(II) Constant Modelul a e int -0,766 log K M
2+

Modelul b -1,247 -2,585

int log K MOH

Modelul c 0,058 -4,599 -0,455 -6,385 1,60 0,20

int log K M 2+

-1,960 1,66

( ) C (F / m )
C1 F / m 2
2 2

int log K MOH

Tabelul 10 Tipuri de microorganisme utilizate n procesele de biosorbie

Nr. Denumire Specie Identificar e taxonomic [38] 644 5061 Metal biosolubiliz at

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Aeromonas hidrophilia Aspergillus terres Aspergillus niger Aspergillus arysae Aspergillus foetidus, Aspergillus carbonaris Aureobasidium pullulans Azolla filiculoides Bacillus subtilis, Cyanadium caldarium Cladosporium resinae Chlorella salina Chlorella vulgaris

Bacteria/ species Fungi/species Fungi/ species Fungi/ species Fungi/ species Fungi/ species Fungi/ species Eukaryota, ,Viridiplantae/ species Bacteria/ species Eukaryota, algae/ species

Ag

63131 40993 5580 84609 1423 2771

Cu, Cr Pb Zn Cu Cu, Al Cu

Agae/spieces Eukaryota, ,Viridiplantae/ species 70

3077

Co, Zn, Mn Cu, Al

14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50.

Citrobacter sp. Cladophora crispata Datura innoxia Durvillaea potatorum Desulfovibrio vulgaris Echerichia coli * Ecklonia radiata Eichhornia crassipes Eterobacter cloacae Galdieria sulphuraria Ganoderma sp. Kluyveromyces marxianus Lemna minor Leptospirillum ferrooxidans Mucor rouxii Mucor miehei Myrothecium verrucaria Phanerochaete chrysosporium Pseudomona aeruginosa Penicillium ochrochlorom Penicillium funiculosum Penicillium chrysogenum Penicillium italicum Pseudomonas cepacia * Rhizopus arrhizus * Rhizopus nigricans* Sargassum fluitans Sulfobacillus thermosufidooxidans Sulfolobus Sargassum Sacharomyces cerevisiae* Sphaerotilus natans* Streptomyces longwoodensis* Streptoverticillium cinnamoneu Streptococcus faecalis* Talaromyces ernersonii Thiothrix sp

Zn, Pb Fe+2, Cr+4) Eukaryota, ,Viridiplantae/ species Eukaryota/ species Basteria / species Basteria / species Eukaryota, Viridiplantae/ species Eukaryota/ species Fungi/species Fungi/species Viridiplantae/ species Bacteria/ species Fungi/species Fungi/species Fungi/species Fungi/species Bacteria/ species Fungi/species Fungi/species Fungi/species Fungi/species Bacteria/ species Fungi/species Fungi/species Eukaryota/ species Bacteria/species Archae/ spieces Eukaryota/ genus Levuri/species Bacteria/ species Bacteria/ species 2288 3015 4932 34103 68231 Cd, Zn, Cu, Ag, Cr), U , Fe Zn, Pb Bacteria/ species Bacteria/ genus 71 1351 1030 U Cu, Ni, Zn, Mo, Cu, Fe Pb, Cd, Cu,, Zn, U, Cr 28572 5074 40296 292 64495 4846 143163 Pb, Zn 4075 91052 881 562 44947 Cu+2, Cd+2 U+6 toU+4 Cr+6to Cr+3 Fe As, Cd, Hg, Pb Cr 130081 4911 4472 180 29923 4839 5532 5306 Cu (U)
204+

Tl, Cu, Mn, Hg, Na)

Pb+2Ni+2 U, Cu+2

Sr+2>Mn+2>Z n+2>Cd+2>Cu +2 >Pb+2 Fe Pb+2> Cd+2 +2 > >Cu Ni+2 > +2 Zn

51. 52.

Thiobacillus ferrooxidans* Zoogloea ramigera*

Bacteria/ species Bacteria/ species

920 350

Zn

Tipuri de inocul bacterian utilizate pentru biosorbie Se pot utiliza 3 categorii de bacterii, sub form de cultur mixt, i anume: - bacterii chemolitotrofe acidofile (de tip Thiobacillus) - bacterii heterotrofe acidofile; -amestec de bacterii heterotrofe acidofile i bacterii chemolitotrofe acidofile. n tabelul 11 sunt prezentate detalii referitoare la metodologia de izolare i cultivare a acestor microorganisme. Tabelul 11 Grupele fiziologice de bacterii acidofile folosite n experimente de biosolubilizare Grupe fiziologice de Medii selective pH-ul bacterii folosite pentru lichidelor de izolare i cultivare cultur ale bacteriilor Bacterii heterotrofe Mediul Golovacheva 1,0 acidofile (pH =2,5) Mediul Brierley (pH= 1,0 2,0) Mediul Manning 2,5 (pH=2,8) Bacterii chemolitotrofe acidofile: Crescute pe Fe Crescute pe S Mediul 9K (pH=2,5) Mediul Waksman (pH=4,0) Crescute pe S2O3 Mediul Postgate (pH=5,0) Alte bacterii fier si sulf Mediul March (pH=2,5) oxidante 1,5 1,0 2,5 1,5

Procesul de biosolubilizare accelerat este posibil ntr-un interval de timp de aproximativ 7 zile. Ca inocul bacterian se prefer utilizarea unor culturi mixte (consorii) de bacterii , scurtndu-se astfel activitatea sinergic de colaborare ntre componentele inoculului. Procentele de biosolubilizare a diferiilor ioni metalici pot oscila ntre 6 58%, n mod preferenial fiind solubilizai cu randamente superioare urmtorii ioni metalici: Zn, Pb, Ca, Mg, Cu, Mn.

72

Procesul de biosolubilizare poate avea loc i n absena adaosului de inocul bacterian, dar n acest caz este necesar, pentru stimularea bacteriilor indigene prezente n sediment, administrarea de medii nutritive adecvate.

4.5. Asociaii de microorganisme biodegradare a hidrocarburilor

cu

potenial

de

n ultimii ani a sporit mult interesul n dezvoltarea in situ a unor tehnici pentru remedierea solurilor contaminate cu produse petroliere. Bioremedierea este una din tehnicile preferate, datorit costurilor sczute pe care le implic i condiiilor de lucru relativ sigure pentru mediul nconjurtor. n principiu metoda const n biodegradarea de ctre asociaii de microorganisme (consorii) a produselor petroliere ce au contaminat diferite situs-uri. Microorganismele degradeaz aceti poluani organici utilizand propriile mecanisme enzimatice; produsele finale ale acestor procese de mineralizare aerob a hidrocarburilor sunt biomas microbial, bioxid de carbon i ap. Studiile microbiologice dezvoltate n ultimii cinci ani au fost conduse astfel nct s stabileasc rolul i compoziia asociaiilor de microorganisme n timpul bioremedierii unor soluri contaminate cu deeuri petroliere, ntr-un perimetru pilot, n condiii aerobe (Czechowice Oil Refinery Polonia). Comunitatea microbial izolat din perimetrul unor rafinrii const n cateva tipuri de microorganisme cum sunt levuri, fungi filamentoi i cateva bacterii care sunt capabile s degradeze att hidrocarburile liniare ct i cele aromatice, la valori de pH foarte mici (2,5 sau chiar mai coborate). Tabelul 12 Specii de microorganisme izolate din soluri contaminate cu reziduuri petroliere Specia Chryseomonas chlororaphis Chryseomonas luteola Pseudomonas aureofaciens Pseudomonas cepacia Pseudomonas fluorescens Pseudomonas mendocina Pseudomonas sp. Sphingomonas paucimobilis Stenotrophomonas maltophilia Aphanoascus reticulisporus Aphanoascus keratinophilum Candida famata Exophiala sp. Fusarium sp. Geomyces pannorum Geotrichum candidum Microsporum gypseum
73

Grup taxonomic Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Bacterii Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi

Penicillium sp. Phialophora sp. Phoma sp. Pseudallescheria boydii Scopulariopsis brevicaulis Trichophyton ajelloi Trichophyton terrestre Total: 25 specii cu 141 tulpini

Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi Fungi

4.5.1. Obinerea de biomas microbian din petrol Procedeele de obinere a biomasei din petrol sunt de dou tipuri: cele care folosesc ca substrat n-parafinele (alcani) i cele care folosesc ca substrat motorina. Microorganismele utilizate n proces sunt levuri de tipul Candida lipolitica i Candida tropicalis. Procedee ce folosesc ca substrat n-parafine : din aceast categorie reprezentative sunt urmtoarele procedee: - British Petroleum Grangeemontas Scoia; - Esso-Nestle S.U.A. si Elveia; - Kanegafuchi Chemical Industry Co Osaka Japonia; - Regional Research Laboratory India; - Inst. Francais du Petrol Frana; - Inst. Of Organo Element Comp., Academy of Science Rusia. Procedeele difer ntre ele, n special prin tipul de fermentator utilizat n linia tehnologic (Vogelbuch, Scholler-Seidfel, air-lift, fermentatoare cilindrice cu agitare, fermentatoare tubulare), gradul de purificare al biomasei, nivelul de automatizare al procesului tehnologic. Procesul tehnologic decurge aseptic. Schema tehnologic de obinere a biomasei din n-parafine este prezentat n figura :

74

Aer sterilizat

n-parafine

Ap

Substane nutritive

Sterilizare

Bioconversie

Gaz rezidual

Separare biomas
Supernatant

Crem de drojdie

Purificare

Concentrare plasmoliz uscare

Produs finit

Fig. 19 Schema tehnologic de obinere a biomasei din n-parafine. Procedee ce folosesc ca substrat motorina - din aceast categorie mai reprezentative sunt procedeele British Petroleum Lavera Frana i procedeul rusesc. n aceste procedee nu se realizeaz sterilizarea substratului i aerului, dar exist o secie de purificare a biomasei. Se folosesc de asemenea debite foarte mari de aer (oxigenul necesar amestecrii i creterii masei levuriene), iar barbotarea se face la viteze mari ale aerului. Schema tehnologic este prezentat n fig. :
75

Aer

Motorin

Ap

Substane nutritive

Amestecare

Bioconversie

Gaz rezidual

Separare
Motorin i ap

Crem de drojdie

Purificare

Concentrare plasmoliz uscare

Extracie cu solveni

Produs finit

Fig. 20 Schema tehnologic de obinere a biomasei din motorin Analiza comparativ a celor dou tipuri de procedee arat c producia de biomas se face cu costuri apropiate, diferenele rezultnd din ponderea componentelor n costurile respective (costurile materiilor prime este mai mare la procedeele cu substrat de n-parafine, n schimb costul srurilor nutritive, al utilitilor, salariile si amortizrile sunt mai mari la procedeele care folosesc ca substrat motorinele). Exist diferene nete ntre transportul hidrocarburilor din celula de levuri i cea al glucidelor, precum i metabolizarea celor dou categorii de substraturi. Metabolizarea hidrocarburilor liniare are loc prin intermediul alcoolilor i aldehidelor, pn la acizi grai, care sunt degradai prin -oxidare la acizi
76

dicarboxilici (fig. ). Mai complicat este metabolizarea hidrocarburilor aromatice pan la -cetoadipat, care este untat n ciclul acizilor tricarboxilici via acetil-CoA i succinat (fig. ).

Fig. 21 Oxidarea parafinelor prin mecanismul reaciilor nlnuite

77

Fig. 22 Mecanismul de scindare a nucleului aromatic. Cooxidarea joac un rol important n transformarea hidrocarburilor aromatice n produi oxidai ce pot fi utilizai de microorganisme (fig. ).

Fig. 23 Oxidarea n-parafinelor de ctre microorganisme.

78

Trebuie de subliniat faptul c drojdiile dezvoltate pe hidrocarburi au o morfologie diferit de cea a celor dezvoltate pe substrat glucidic.

Fig. 24 Structura levurilor dezvoltate pe substrat de n-parafine. n orice caz, la folosirea ca substrat a n-parafinelor i a motorinei trebuie s se aib n vedere urmtoarele: - o bun emulsionare a hidrocarburilor n faz apoas pentru a asigura un transfer optim de substrat la celulele de levuri, ceea ce presupune adaosul de ageni tensioactivi i sisteme de amestecare eficiente n fermentatoare; - o aerare corespunztoare, deoarece consumul de oxigen este de aproximativ 3 ori mai mare la transformarea hidrocarburilor decat la transformarea glucidelor. Acest lucru se explic prin solubilitatea diferit a oxigenului n faza hidrocarbur (mai mare) i n faza apoas (mai mic) i deoarece condiiile de interfaa ntre aer i ap sunt modificate n prezena parafinelor, transferul de oxigen la celulele de levuri fiind dificil; - o meninere a pH-ului n limitele 4 6 cu amoniac i a temperaturii n limitele 28.310 C; - o eliminare eficient a cldurii din sistem (procesul este exotermic); - o bun purificare a biomasei, chiar dac aceasta este destinat furajrii animalelor. 4.5.2. Obinerea de biomas microbian din metan Pentru metabolizarea metanului se utilizeaz bacteriile Pseudomonas methanica, Methanomonas methanooxidans i Metylocioccus capsulatis. Metanul poate fi metabolizat fie prin intermediul glucidelor fie prin intermediul serinei.

CH4

CH3 OH

CH2 O
79

Ribozo 5 P

Fructoz 6-P Ciclul Krebs Glicoliz

Glicocol

Serin

Piruvat

Oxalacetat

Ciclul Krebs

Se utilizeaz un fermentator cu agitare puternic pentru favorizarea dizolvrii metanului i a oxigenului. Raportul molar oxigen / metan utilizat este 0,8 / 1,8. Procesul tehnologic care se desfoar aseptic conduce la un randament de biomas de pn la 50 % fa de masa metanului.

80

Cap. V

Alternative pentru reducerea cantitii de atmosferic

fertilizani chimici. Fixarea biologic a azotului

Dei utilizarea intensiv a fertilizanilor este esenial pentru hrana populaiei aflata in continua crestere, lipsa discernamantului in exploatarea acestora se poate repercuta foarte negativ asupra mediului nconjurator, anulnd contribuia lor pozitiv la creterea productivitii agricole. Utilizarea excesiv a fertilizatorilor cu azot duce la: contaminarea cu nitrai a solului i apelor de suprafa; acidifierea solului arabil; modificarea echilibrului microbian din sol; degradarea grav a suprafeelor cultivabile. Aceast situaie impune gsirea unei alternative viabile pentru reducerea cantitilor de fertilizatori chimici din agricultura intensiv a viitorului. S-a estimat c la nivel global azotul provenit din fixarea biologica reprezint o cantitate dubl fa de azotul furnizat solului de fertilizatori. Fixarea biologic a azotului atmosferic i administrarea de ngraminte cu azot nu se exclud reciproc ci se completeaz cu rezultate benefice pentru sntatea plantelor i produciilor. Cererea global de fertilizatori cu azot se poate reduce prin ameliorarea cantitilor de azot fixat biologic i utilizarea preparatelor bacteriene fixatoare de azot. Din punct de vedere chimic procesul de fixare biologic a azotului atmosferic const n reducerea formei biatomice a acestuia la amoniac asimilabil de ctre plante. Reacia de trecere este catalizat de enzimele nitrogenazice care sunt specifice doar microorganismelor procariote (tabelul ). ntruct forma biatomic este foarte stabil, reacia de reducere a azotului atmosferic necesit un consum energetic foarte mare i s-a estimat c aceast energie este mai mare dect n cazul asimilarii azotailor. Amoniacul (NH3) rezultat din fixarea biologic este fie asimilat direct de ctre plante, fie transformat n amide sau ureide i apoi transferat prin intermediul xilemului n diferite zone ale plantelor unde se transform n proteine. n cazul asocierilor simbionte, plantele gazd asigur prin fotosinteza carbon microorganismelor fixatoare de azot care, la rndul lor, aprovizioneaz planta cu forma asimilabil de azot. Fixarea azotului atmosferic (diazotrofia) este o proprietate a microorganismelor procariote. Cercetrile de natur taxonomic i fiziologic au artat ca proprietatea de fixare i asimilare a azotului atmosferic sau diazotrofia este arareori universal n interiorul unor genuri microbiene i adesea chiar n interiorul unui gen sau al unei specii determinate.

81

Tabelul 13 Principalele microorganisme fixatoare de azot Raportul cu plantele Liber fixatoare Anaerobe Microaerofile Aerobe Asociative Microaerofile Simbionte Liber fixatoare Microaerofile Aerobe Simbionte microorganismului Heterotrofe Clostridium Azospirillum Azotobacter Azospirillum Frankia, Rhizobium Autotrofe Rhodosperillum Cyanobacteria Photorhizobium Genul

5.1. Aspecte biochimice ale diazotrofiei Enzima ce determin azotrofia se numete nitrogenaza. Activitatea nitrogenazei este exprimat n nanomoli de acetilena redus sau de etilen produs pe or i pe gram de materie uscat; ea poate fi apoi transformat n kg de azot fixat la hectar i pe an. Aceasta deoarece complexul enzimatic (sau nitrogenaza) care reduce azotul gazos la amoniac, poate s reduc i acetilena la etilena. S-a demonstrat de asemenea ca nitrogenaza poate s reduc mai multe substraturi, dar reducerea acetilenei este o operaie care se realizeaz rapid i d rezultate bune. Reducerea ciclopropenei este tot o reacie specific care permite s fie confirmat capacitatea de a fixa azotul sau, dimpotriv, s fie respins un caz ndoielnic, n care acetilena era redus la etilen pe cale chimic i nu cu ajutorul nitrogenazei. Nitrogenaza este capabil s reduc i alte substane n locul azotului, inclusiv ionii de hidrogen i s degaje hidrogen n acest caz. N2 C2H2 HCN NH3 C2H4 CH4 + NH3 + CH3NH2

82

CH3CN N2O H3O+

CH4 + CH3NH2 + produi cu doi atomi de carbon N2 + H2O H2

Nitrogenaza a fost izolat n 1981 din aproximativ 30 de microorganisme sub forma unui preparat brut i a fost apoi purificat. Proprietile acestui complex enzimatic sunt aproape identice la diverse microorganisme fixatoare de azot. Cele dou proteine care constituie nitrogenaza formeaz n general o enzim activ, chiar atunci cnd ele provin din dou genuri microbiene diferite. Nitrogenaza este deci o enzim binar , constituit din dou metaloproteine brune, a cror activitate conjugat este indispensabil reducerii azotului la amoniac (NH3). Molibdenoferoproteina (MoFeproteina) are masa molecular aproximativ 105, conine molibden (2 atomi per molecula), fier (32 atomi per molecula) i sulf (30 de atomi per molecul); se prezint sub forma unui tetramer. Feroproteina (Feproteina) are masa molar de ordin de mrime 4 10 , conine Fe (4 atomi per molecula) i sulf (4 atomi per molecul) i este tot un tetramer. Se consider c azotul se fixeaz pe molibdenoferoproteina, care mai este numit i dinitrogenaza. Unirea azotului se face probabil la nivelul molibdenului, ntr-un fragment separat de protein. Cele dou proteine constitutive ale nitrogenazei sunt distruse de oxigen n mod rapid i ireversibil. De aceea, dificultatea fiziologic esenial a fixrii azotului este protecia obligatorie a nitrogenazei mpotriva daunelor cauzate de oxigen. 5.2. Factori care influeneaz azotocaptarea biologic Fixarea biologic a azotului atmosferic este supus influenelor mai multor factori: - biotici - de mediu - de sol - de management n msura n care aceti factori pot influena i celelalte plante sau microorganisme nefixatoare de azot. Din multitudinea acestor factori se consider a avea o influen deosebit urmtorii: - densitatea microorganismelor - nutritia - aciditatea solului - concentraia azotului din sol. Densitatea microorganismelor. Fixarea simbiont a azotului atmosferic, depinde de realizarea asociatiei dintre speciile de plante gazd i microorganismele fixatoare. Atunci cnd se cultiv o plant cu caracteristici de gazd, bacteriile fixatoare de azot trebuie s existe n sol sau s fie
83

introduse, iar solul trebuie s asigure condiiile necesare dezvoltrii asociaiilor plant bacterii. Cele mai comune asociaii sunt cele de tipul plante leguminoase Rhizobium. Atunci cnd se introduc semintele, n sol exist posibilitatea ca nodulii radiculari s nu se dezvolte ca urmare a densitii slabe i a ineficienei tulpinilor de Rhizobium existente. n acest caz se impune inocularea solului cu tulpini de Rhizobium cu infectivitate corespunztoare. Procesul de inoculare nseamn: fie introducerea n sol a preparatelor bacteriene specifice; fie tratarea seminelor nainte de nsmnare. Nodularea rapid i eficiena impune prezena n jurul rdcinilor n formare a unui numr mare de microorganisme. n cazul culturilor de soia irigate de exemplu, creterea prin inoculare a numrului de bacterii de 100 de ori duce la diminuarea efectului inhibitor al solului i al coninutului ridicat de azot asupra nodulrii. n solurile care n mod natural conin bacterii din genul Rhizobium, este dificil de a le nlocui pe acestea cu alte tulpini iar cercetrile actuale sunt direcionate spre obinerea de soiuri de plante cu mare specificitate n privina caracterului de gazd sau soiuri de plante cu mare capacitate de a forma nodoziti cu bacteriile existente n mod natural n sol. S-au identificat soiuri de soia care reduc capacitatea de nodulare i competitivitate bacteriilor slbatice favoriznd astfel preparatele cu bacterii selectionate. Nutriia. Deficitul de fosfor din sol afecteaz att fixarea biologic a azotului ct i dezvoltarea plantelor. Unele elemente nutritive sunt necesare mai mult pentru nodulare i fixarea azotului dect pentru dezvoltarea plantelor gazd. Astfel, cobaltul inhib iniierea nodulrii prin aciunea sa direct asupra bacteriilor. Borul este cel mai important element pentru dezvoltarea nodozitilor, el intervenind direct asupra creterii plantelor gazd. Molibdenul este constituentul cheie al enzimei Mo nitrogenaza implicat direct n fixarea azotului. Dezvoltarea nodozitilor este influenat i de fier iar buna funcionare a acestor surse de azot se afl sub influena ionilor de calciu i de fier. Aciditatea solului. Solurile devin acide n principal ca urmare a aplicrii necontrolate a fertilizatorilor chimici. Aciditatea solului afecteaz drastic fixarea biologic a azotului. Att plantele ct i bacteriile fixatoare de azot manifest o toleran diferit fa de aciditatea solului. Reacia acid se traduce printr-o toxicitate evident mediat de ionii de aluminiu i/sau mangan. Plantele care sunt dependente de fixarea biologic a azotului sunt mai supuse unei astfel de toxiciti dect plantele care depind de azotul furnizat de sol. Cercetarea de specialitate vizeaz contracararea acestor efecte fie prin ameliorarea reaciei solurilor, fie prin obinerea de soiuri de plante cu toleran la reacia acid a solului. Concentraia azotului din sol. Concentraiile de azot din sol iniferent dac i au originea n azotul organic mineralizat sau n fertilizatorii cu azot pot inhiba procesul de infectare a periorilor absorbani, creterea nodulilor i fixarea azotului atmosferic. Nodulii ntrzie s apar sau pur i simplu nu apar la plantele cultivate pe soluri cu coninut ridicat de azot n timp ce pe solurile cu coninut sczut
84

de azot aplicarea unor cantiti reduse de fertilizatori cu azot stimuleaz nodularea. Este consecina procesului cunoscut sub numele de efect de starter. Azotatul este principala form de azot mineral existent n solurile arabile. i n acest caz se urmrete obinerea de soiuri de plante leguminoase tolerante la concentraii ridicate de azotai i cu capacitate mare de nodulare. 5.3. Bacterii care compun unele preparate comerciale Dupa 1990 se nregisreaz o adevarat explozie de informaii referitoare la izolarea din sol, selecia de laborator i obinerea de biopreparate pe baz de bacterii fixatoare de azot cu denumirea comercial Rizofil i Azotobacterin. Toate eforturile depuse vizeaz reducerea consumului de fertilizatori cu azot i cu fosfor i implicit a impactului acestora asupra mediului nconjurtor. Izolarea bacteriilor fixatoare de azot se face de regul de pe sau din rdcinile plantelor iar la nivel de laborator prin tehnici genetice i biochimice e amplificat potenialul de azotocaptare. Majoritatea bacteriilor fixatoare de azot libere, asociative sau simbionte pot fi cultivate n profunzime la nivel de laborator, pilot sau industrial pe instalaii clasice de biosintez. Multiplicarea este urmat de condiionarea i stabilizarea biopreparatelor pe diferite suporturi solide inerte. Azotobacter chroococcum este folosit pe scar larg n Ungaria i Slovacia ca biofertilizator, separat sau n combinaie cu Rhizobium leguminosaurum. Drept consecin, se reduc cantitile de ngrminte cu azot, se amelioreaz reacia solului i se obin importante sporuri de producie n culturile de floarea soarelui (plus de 530 kg/ha) i lupin. Aceeai specie de Azotobacter se afl la baza biopreparatului Rizofil cu mare capacitate de adezivitate la rdcinile de orz i tomate i cu efecte stimulatoare asupra produciei. Azotobacterinul este un alt produs comercial pe baza de Azotobacter care introdus n sol stimuleaz dezvoltarea produselor agricole pe ntreg ciclul vegetal, n special a tomatelor. Unele tulpini de Azotobacter sunt considerate a avea i capaciti de simbioz asociativ cu rdcinile de tomate, determinnd sporuri de producie de circa 29%, iar alte tulpini dau rezultate foarte bune n cultura orzului. n afar de bacteriile fixatoare de azot simbionte, din categoria celor liber fixatoare cele mai utilizate n calitate de biofertilizatori sunt tulpinile Azotobacter i Azospirillum. Tulpinile de Azotobacter sunt utilizate ca biofertilizator pentru culturile de gru, porumb, tutun, tomate i alte specii, bacteriile avnd capacitatea de a sintetiza fitohormoni din categoria auxinelor, giberelinelor i citochininelor. Inocularea culturilor de porumb cu preparate de Azotobacter nseamn un aport de circa 40 de kilograme azot fixat pe hectar, iar dac se aplic un astfel de tratament combinat cu preparate de Azospirillum rezultatele sunt i mai spectaculoase. n cazul culturilor de sfecl de zahr tratate cu biofertilizator pe baz de Azotobacter sporul de recolt a fost de pn la 25%. Culturile de orz inoculate cu bacterii din specia Azospirillum lipoferum i carora li s-a administrat doar 50% din necesarul de uree au dat rezultate similare cu acelea la care s-a administrat o cantitate normal de uree.
85

Dac odat cu bacteriile fixatoare de azot se introduc n sol i bacterii solubilizatoare de fosfor Bacillus megaterium sau Bacillus polymixa se obin rezultate deosebite n privina nlimii plantelor, diametrului rizosferei i coninutului de substan uscat. Inocularea seminelor de gru cu Azospirillum lipoferum a dus la creteri de producie cu 64% n teren fra fertilizatori minerali, cu 31% n teren cu 40 kg de fertilizator mineral la hectar i cu 40% n teren cu 80 kg de fertilizator mineral la hectar. Efectul favorabil al inoculrii culturilor agricole cu celule de Azotobacter i Azospirillum const printre altele i n contracararea microflorei patogene, mobilizarea fosfatilor, asimilarea exudatelor radiculare i sinteza de fitohormoni.

Cap. VI Bioremedierea solului

6.1. Surse de poluare a solului Principalele surse de poluare a solului sunt: - reziduurile industriale i urbane; - poluarea solului cu produse fitosanitare. A. Reziduurile industriale constituie o surs important de pouare a mediului ncojurto. Materiile prime minerale sau organice, care dup exploatare i prelucrare produc reziduuri, sunt: crbuni, turba, isturi petrolifere, minereurile de fier, mangan, plumb, zinc, apatit, sulful, calcarul i dolomita, argila refractar, argila bentonitic, nisip. n categoria poluanilor solului sunt incluse i: - materialele de decopertare, rmase dup construcia conductelor magistrale de titei i gaz metan; - soluri rmase dupa ndeprtarea stratului lor superior, folosit n zone urbane pentru mbuntiri peisagistice; - soluri folosite pentru copertarea haldelor de moloz i a rambleurilor de gunoi municipal; - nmoluri portuare; - nmoluri din staiile de epurare a apei (care conin att deeuri industriale ct i menajere); - deeuri radioactive: - reactoarele de cercetare L.F.I.N. Mgurele; - reactoare de testare a materialelor I.C.N. Piteti; - Centrala nuclear Cernavod; - Depozitul Naional de ngropare pentru deeuri radioactive, cu activitate joas (Bia, Oravia); - sterilul rezultat la procesarea uraniului (Feldioara).

86

B.Poluarea solului se poate datora utilizrii neraionale a substanelor fitosanitare: erbicide, insecticide, fungicide, rodenticide i nematocide. Pesticidele utilizate n exces determin att fenomene de fitotoxicitate, ct i de micorare a fertilitii solului, datorit distrugerii unor microorganisme. Dintre pesticide, prezint un grad mare de toxicitate insecticidele de contact care cuprind dou subgrupe: - compui clorurai; - compusi organofosforici. 6.2. Microorganismele din sol ca participani depoluare n procesele de

Microorganismele ndeplinesc o serie de funcii importante n transformarea substanelor i energiei n procesul de formare a solului, cum ar fi: - transformarea substanelor organice, - formarea diferitelor sruri simple din combinaiile minerale i organice, - particip la descompunerea mineralelor din sol, la migrarea i acumularea produilor de pedogenez. De aciunea microorganismelor sunt strns legate desfurarea i natura proceselor biochimice, nutritive, oxidoreducatoare, de aeraie a solului, condiiile de reactie alcalino-acid etc. Microorganismele au un rol important n descompunereea substanelor organice complexe din sol pn la compui simpli finali: gaze (CO 2, amoniac etc.), ap i combinaii minerale simple. Fiecrui tip de sol i este proprie o distribuie specific de profil a microorganismelor i compoziia lor pe specii reflect nsuirile mai importante ale solului, cum ar fi: rezerva de substan organic, cantitatea i calitatea humusului, coninutul de elemente nutritive, reacia solului, asigurarea cu ap, gradul de aeraie. Biomasa ciupercilor i bacteriilor n stratul arabil al solului reprezint pn la 5t/ha; numrul de bacterii ajunge la miliarde de celule la 1g de sol, iar lungimea hifelor de ciuperci este de pn la 1000 m la 1g de sol [I. P. Babiova, G. M. Zenova, 1983 citat]. Rdcinile plantelor, prin mas, lungimea i procesele la care particip, exercit o mare influen asupra micropopulaiilor din sol. Ele absorb substanele nutritive din sol, iar n anumite situaii pot elibera n soluia solului cationi sau anioni. De exemplu, s-a stabilit c cerealele pioase i tutunul la sfritul perioadei de vegetaie elibereaz potasiu n sol, iar soia, cnd solul nu conine calciu, elibereaz anioni fosfat. Rdcinile plantelor pot secreta diferite substane care influeneaz fertilitatea solului. Astfel elimin CO2 care favorizeaz transformarea substanelor nutritive din fosfai, sulfai i silicai, n forme accesibile plantelor. Acizii organici activi, de asemenea sporesc accesibilitatea pentru plant a compuilor minerali din sol. Secreiile radiculare pot conine ioni de potasiu, mangan, fier i alte elemente, care influeneaz n mare msur activitatea microflorei din sol. Rdcinile pot secreta, mai ales n faza de ncolire a seminei i substane toxice care sunt vtmtoare pentru unele plante, aceasta fiind
87

una din cauzele pentru care rdcinile plantelor vecine nu se ntreptrund aa de mult. Chimismul eliberrii de substane toxice este puin studiat. Se consider c inul secret acidul cianhidric care protejeaz plantele de atacul ciupercilor patogene, iar bobul i mazrea secret substane care omoar viermii srm. Densitatea i distribuia rdcinilor influeneaz eficacitatea explorrii solului de ctre plante. Contactul strns ntre sol i rdcini se datorete faptului c suprafaa perilor radiculari este acoperit cu mucilagii de care se lipesc particule mici de sol. Perii radiculari i o parte din rdcinile fine funcioneaz o perioad scurt de timp dup care mor i se desprind de rdcinile vii. Ca urmare, microorganismele sunt aprovizionate n continuu cu substrat energetic uor accesibil. Influena reciproc dintre plante i microorganisme este prezentat schematic n figura 26.

Substane eliberate de plantele superioare

Influeneaz plantele

Substane eliberate de microorganisme

Influeneaz microorganismele din sol

Figura 26. Interaciunile dintre plante i microorganisme determinate de substanele fiziologic active elaborate 6.2.1. Bacteriile din sol. Factori care condiioneaz activitatea bacteriilor din sol Bacteriile sunt printre cele mai mici i mai numeroase microorganisme care triesc liber n sol. Astfel, particip la descompunerea substanelor organice, la circuitul azotului, carbonului i a altor elemente i
88

favorizeaz o parte din reaciile chimice (organice i anorganice) care au efecte importante asupra creterii plantelor. Numrul bacteriilor n sol variaz foarte mult deoarece, pe de o parte, ele se pot nmuli foarte repede. Cea mai mic populaie se gsete n solurile nisipoase, pietroase, podzoluri, iar cea mai numeroas n solurile fertile cum sunt cernoziomurile .a. la care, pentru perioade scurte se pot afla chiar pn la 10 miliarde de indivizi la 1g de sol. n mod normal populaia bacterian se afla n peliculele de ap din sol. Dup modul cum i procur energia necesar proceselor vitale, bacteriile se clasific n dou grupe: heterotrofe i autotrofe. Bacteriile heterotrofe i obin energia din descompunerea substanelor organice complexe. Aici se ncadreaz majoritatea bacteriilor din sol. Unele dintre ele sunt fixatoare de azot, ca de exemplu, Rhizobium sp.(bacterie simbiotica), Azotobacter chorococcum (bacterie aerob), Clostridium pasteurianum (bacterie anaerob) .a.. Cea mai mare parte din bacteriile heterotrofe ns, pentru nutriie folosesc azotul fixat n ali compui. Ele sunt responsabile pentru descompunerea materiei organice. Bacteriile autotrofe i obin energia din oxidarea compuilor minerali simpli cu carbon sau a altor compui anorganici. Ele asimileaz carbonul din dioxidul de carbon din aer, iar azotul i alte elemente, din compuii anorganici. n aceast grup se ncadreaz bacteriile care oxideaz amoniacul (Nitrosomonas), nitrii (Nitrobacter), sulful (Thiobacillus thiooxidans), fierul i compuii acestuia. Cea mai important grup o reprezint aceea care oxideaz amoniacul i nitriii i este cunoscut ca grup de bacterii nitrificatoare. Acestea sunt autotrofe chimiosintetizante. Exist n numr relativ redus i bacterii pigmentate care au o nutriie autotrofa fotosintetizanta. Frecvena bacteriilor difer foarte mult att pe profil ct i n acelai orizont de sol. Cu puine excepii, numrul lor descrete cu adncimea solului (tabelul ) i reflect distribuia materiei organice. Tabelul 14 Frecvena bacteriilor pe profil i orizont de sol Variant Adncime Bacterii a a totale, stratului mil/g de sol, sol cm Sol O 10 13.6 nelucr 20 30 1.6 at 40 50 0.4 Sol lucrat 0 10 20 30 40 50 14.1 8.2 1.0 Bacterii sporulat e, mil/g sol 2.8 1.6 0.1 4.1 1.8 0.7 Ciuperci , mil/g sol 10.0 1.0 1.0 14.0 23.0 1.8 Actinomicete, mil/g sol 3.0 0.5 0.2 9.1 5.5 1.5 Microorganisme celulolitic e, mil/g sol 3.0 0.0 0.0 8.0 4.0 1.0

Distribuia bacteriilor este influenat mult i de prezena rdcinilor plantelor. Acestea, prin secreiile plantelor lor sau prin prile desprinse de
89

pe nveliul scoartei, ca urmare a rennoirii permanente a acesteia, servesc ca material energetic pentru microorganisme i determin nmulirea bacteriilor n apropiere (rizosfera). Principalii factori care condiioneaz activitatea bacteriilor sunt: sursa accesibil pentru energie; umiditatea solului; aerul; temperatura; reacia solului; factorii biotici. Lipsa de hran sau de surs accesibil pentru energie este factorul limitativ principal. De aceea orice adaos de material energetic determin intensificarea activitii bacteriilor. Activitataea bacteriilor poate fi limitat de insuficiena unuia sau mai multora elemente nutritive eseniale. Acest fenomen se constat mai ales n procesul de descompunere a hidrailor de carbon sau a resturilor organice cu un raport mare C / N. De aceea, adaosul de elemente nutritive minerale n procesul descompunerii (azot, fosfor, sulf .a.) stimuleaz activitatea microbiologic. n procesul descompunerii substanelor srace n azot, cum sunt paiele, cocenii etc. (care conin ~0.5%N) bacteriile i procur azotul din sol lipsind plantele de cultur n sezonul respectiv de acest element. Activitatea bacteriilor se reduce odat cu scderea umiditii, astfel ca la evaluarea corespunztoare a coeficientului de ofilire, activitatea lor este slab perceptibil. Majoritatea sunt rezistente la uscciune astfel, dup umezire, fenomene ca nitrificarea, amonificarea, fixarea azotului pe cale nesimbiotic, oxidarea sulfului etc., se reiau rapid. Bacteriile mai sensibile la uscciune sunt cele simbiotice, mai ales n cazul solurilor cu capacitate de tamponare redus. Pentru activitatea bacteriilor, sunt importante concentraiile n oxigen, CO2 i azot din aer. Oxigenul este necesar pentru procesele de oxidare, CO2 ca surs de carbon pentru organismele autotrofe i azotul pentru organismele fixatoare de azot. Bacteriile aerobe cum sunt cele nitrificatoare, i desfoar activitatea aproape cu aceeai intensitate cnd aerul din sol conine oxigen n proporii de 10-20% (la volum). Activitatea lor se reduce considerabil la concentraii de oxigen mai mici de 10%. n ceea ce privete CO 2, nitrificarea decurge rapid cnd acest gaz reprezint 0.5-5% din volumul aerului. Compoziia aerului din sol este foarte variabil i ca urmare determin mari variaii n dinamica microflorei solului. Deseori exist o combinaie complex ntre microzone cu aerobioza i anaerobioza. Acest fapt este demonstrat de prezena simultan a bacteriilor aerobe i anaerobe n stratul de sol. Explicaiile acestui fenomen pot fi multiple: de exemplu, bacteriile anaerobe prolifereaz n zonele n care cele aerobe au consumat oxigenul, sau n microzone izolate temporar (de ctre barierele de ap aprute n cazul precipitaiilor excesive) etc. Activitatea bacterian se micoreaz treptat cu scderea temperaturii, nct aproape de 00C ea este foarte redus. n condiii obinuite, bacteriile i desfoar activitatea n intervalul de pH = 4 10, optimum fiind neutru-uor alcalin. Dar cerinele bacteriilor
90

difer. Astfel, pentru unele apare ca factor limitativ aciditatea, pentru altele alcalinitatea. Aciditatea mare mpiedic activitatea bacteriilor simbiotice i a celor nitrificatoare. Majoritatea organismelor din sol exercit unele asupra altora un efect pronunat. n unele situatii, relaiile biotice pot fi favorabile, dar deseori activitatea unora stopeaz dezvoltarea altora sau le oblig s treac n stare de via latent. Alteori activitile lor se succed. Una din cauzele coexistenei mai multor specii de microorganisme n sol, poate fi specializarea pentru hran. n acelai habitat pot coexista un numr mare de nie ecologice. De exemplu, n rizosfer, unde abund substanele energetice (secreii, exfolieri de pe scoarta rdcinilor etc.), mai multe specii de microorganisme acioneaz simultan pe materiale diferite, ele nefiind deci n raporturi de concuren. Un microhabitat este supus la schimbri n serie datorit fie fluctuaiilor de condiii fizice ale mediului, fie activitii microorganismelor i ca urmare prezint o succesiune de nie ecologice. Un exemplu evident de astfel de succesiune este ciclul de nitrificare: amoniacul este oxidat la nitrii de ctre bacterii aparinnd genului Nitrosomonas, iar mai departe nitriii sunt oxidai la nitrai de ctre bacterii aparinnd genului Nitrobacter. Acesta este un exemlu tipic de interrelaie, de asociaie, de metabioz. Succesiuni mult mai complexe apar n procesul de descompunere a substanelor organice ajunse n sol. 6.2.2. Actinomicetele i ciupercile din sol Actinomicetele, din punct de vedere morfologic, ocup o poziie ntre bacterii i ciuperci. Se aseaman cu ciupercile deoarece au miceliu ramificat, dar mai mult cu bacteriile: ca i acestea sunt unicelulare, de mrimi apropiate, posed nucleoizi, n compoziia pereilor celulari nu intr chitina sau celuloza etc. Actinomicetele se ntlnesc n diferite medii (ap, atmosfer, esuturile vii ale omului i animalelor), dar n general sunt organisme care triesc n sol. Unele actinomicete, cum sunt cele din familia streptomicete, produc substane aromatizante ca: acid acetic, acetaldehida, isobutanol i izobutilacetat etc. care imprim solului proaspt arat un miros caracteristic. Majoritatea actinomicetelor sunt aerobe, cu excepia speciilor din genul Actinomyccs, care sunt anaerobe sau microaerofile i care constituie cauza actinomicozelor la om i animale. Numrul actinomicetelor din sol variaz ntre 10 i 70% din numrul total de microorganisme, ele se gsesc n colonii sub form de mas de filamente. Aceste microorganisme sunt importante nu att prin numrul lor, ct ndeosebi prin proprietile fiziologice deosebite. Ele sunt organisme heterotrofe i desfoar o activitate nsemnat n descompunerea celor mai variate substane organice din sol. Acioneaz asupra substanelor organice prin intermediul enzimelor pe care le produc: xilanaza pentru descompunerea hemicelulozelor, pectinaza pentru pectina, keratinaza pentru keratina, chitinaza pentru chitina s.a. n procesul de descompunere de ctre microorganisme, deci i de ctre actinomicete, compuii cu carbon sunt parial transformai n acizi
91

humici. Primele procese n formarea acizilor humici sunt condiionate de activitatea microorganismelor. Unele actinomicete cum sunt streptomicetele, dar mai ales Nocardia, folosesc acidul oxalic din resturile de plante ca surs de carbon, ndeplinind astfel un rol important n detoxificarea solului. Actinomicetele produc foarte multe vitamine, pigmenti i antibiotice. Astfel, vitamina B12 este produs de Streptomyces griseus; S. Olivaceus i S. Aurefaciens. Vitamine din complexul B ca thiamina i riboflavina sunt biosintetizate de asemenea de unele actinomicete. Cantitatea de antibiotice format n sol este mic i foarte greu poate fi pus n eviden. Cu toate acestea, antibioticele produse exercit un efect inhibitor local pentru multe ciuperci, precum i asupra unor nematozi care sunt atrai n jurul actinomicetelor de ctre produsele lor metabolice. Ciupercile reprezint microflora solului cu cele mai mari dimensiuni. Ele sunt organisme heterotrofe, fiind lipsite de clorofil i obligate s-i obin energia i carbonul din substanele organice complexe. Ciupercile din sol sunt de diverse genuri, mai rspndite fiind: Penicillium, Fusarium, Mucor, Aspergillus, Achyla, Martierella, Pythium, Chaetomium, Saprolegnia, Monosporium .a. Numrul de ciuperci variaz de la cteva mii pn la circa 1 milion/g sol, ceea ce echivaleaz cu aproximativ 800-1400 kg/ha, pe stratul arabil de 18 cm. Dei mai puin numeroase dect bacteriile, ciupercile formeaz o mas mai mare datorit faptului c miceliul lor este mult mai mai mare dect celula bacterian. Ciupercile din sol particip la descompunerea materiei organice de la substanele uor degradabile (de exemplu: zaharurile, amidonul, proteinele etc.) pn la cele mai rezistente (de exemplu: celuloza, lignina, rini). n procesul descompunerii, pe msura modificrii straturilor energetice i deci a microhabitatelor, se succed i grupele de ciuperci (ca de altfel i celelalte microorganisme). Astfel, la nceput sporesc numeric ficomicetele (incluznd Mucor i Rhisopus) care descompun mai ales amidonul i zaharurile. Se inmulesc apoi n ordinul Penicillium i Aspergillus, Cytofaga, Celvibrio, Cellfociculla, concomitent cu pierderi de celuloza i hemiceluloza, iar in final sporesc Bazidiomicetele care particip la descompunerea ligninei. Ciupercile din sol pot fi saprofite sau simbiotice. Ciupercile saprofite i procur energia din materia organic aflat n descompunere. Ciupercile simbiotice triesc pe rdcinele unor plante, arbori de pdure, pomi roditori. Aceast asociere ciuperc rdcini este numit micoriz i de pe urma ei beneficiaz att plantele ct i ciupercile. Fenomenul de convieuire este foarte complex. n principal, ciuperca folosete hidrai de carbon asimilai de planta superioar, iar planta se aprovizioneaz cu azot n urma digerrii miceliului ciupercii bogat n azot. Multe dintre microorganisme produc substane antibiotice active asupra unor bacterii, ciuperci, plante superioare, iar altele produc substane toxice pentru diverse animale. Ciupercile sunt microorganisme strict aerobe. Cea mai bun dezvoltare a ciupercilor are loc n medii cu reacie neutr, dar suport mai uor dect alte microorganisme valorile sczute de pH i de aceea, n lipsa de concuren, se dezvolt mai bine n solurile acide. 6.3. Fitoremedierea solurilor
92

Fitoremedierea reprezint o tehnic ce folosete plantele pentru a remedia mediul contaminat cu poluani organici i anorganici prin nlturarea, nmagazinarea sau descompunerea chimic a poluanilor. Microorganismele ce se gsesc n zona rdcinilor plantelor pot crete capacitatea de a fi adsorbit al poluantului, de ctre sistemul radicular al plantei. Din punct de vedere al fitoremedierii planta poate fi considerat ca fiind un sistem de pompare i tratare care poate preveni rspandirea contaminarii solurilor. Eficienta plantelor ca decontaminani sau filtre a fost dovedit n decontaminarea solurilor poluate cu petrol brut, explozivi, metale, pesticide, hidrocarburi policiclice aromatice. Plantele cu potenial de fitoremediere mare pot fi alese dintre speciile din flora spontan ce cresc n locuri poluate sau dintre plantele cultivate care au trsturi specifice, determinate de mediul poluant. Pentru suprafee ntinse sau medii, unde contaminarea este superficial sau moderat, fitoremedierea este o alternativ viabil, preferat metodelor mecanice i chimice tradiionale. Comparat cu tehnologiile tradiionale, fitoremedierea are dou avantaje majore: este relativ ieftin i are impact redus asupra mediul. De asemenea metoda are o larg acceptare din partea oamenilor. Pe de alt parte tehnica de fitoremediere are i unele dezavantaje: este un proces care se desfoar n timp (de obicei mai multe cicluri de vegetaie), este limitat doar la grosime solului (att ct ptrund rdcinile), necesit naintea aplicrii o lung perioad de cercetare i exist riscul ca elementul contaminant s ajung n lanul trofic prin consumul plantei de ctre animale. Sunt cunoscute urmtoarele metode de fitoremediere: Fitoextracia (fitoacumulare) - absorbia i translocarea poluanilor din sol sau ap de ctre rdcini n partea de sus a plantei; Fitotransformarea (fitedegradarea) poluanii sunt transformai n zona radcinii sau n esuturile plantei prin reacii chimice sub influena enzimelor produse de plante. Acest proces poate transforma poluantul anorganic ntr-un derivat insolubil, mpiedicnd astfel ptrunderea sa n lanul trofic. Fitovolatilizarea poluanii sunt preluai de sistemul radicular al plantei, transmii frunzelor n forma nemodificat sau dup transformri chimice i volatilizai n atmosfer. Rizotransformarea poluanii din sol sunt transformai de ctre microorganismele care triesc n rizosfer. Rizofiltrarea apa contaminat este purificat folosind capacitatea sistemului radicular al plantei de a fixa elementele contaminante. 6.3.1. Consideraii teoretice Sistemul plant-sol-poluant este determinat de o combinaie complicat de factori chimici, biochimici, fizici i biofizici care pot juca un rol important n determinarea soluiei ce vizeaz o anumit problem de fitoremediere. Exist o diferen semnificativ ntre capacitatea speciilor de plante de a prelua i tolera poluanii. Doar plantele cu anumite caractere biochimice pot fi avute n vedere n aplicarea unei soluii de fitoremediere. n prezent sunt ns dezvoltate numeroase studii de baz n domeniul
93

fiziologiei, biochimiei i biologiei moleculare a plantelor care au pregtit drumul pentru dezvoltarea tehnicilor de fitoremediere. A. Fitoextracia - Absorbia i deplasarea poluanilor n plante Biodisponibilitatea poluanilor din sol este deseori un factor limitativ n ceea ce privete eficacitatea fitoremedierii(..). Eficacitatea fitoremedierii solurilor poluate depinde de proprietile fizico-chimice ale poluantului dar i ale solului : poluanii pot fi fixai de particulele solului sau preluai de microorganisme, plante si animale. In procesul de fitoremediere, disponibilitatea poluantului de a fi preluat de microorganismele din rizosfera i de sistemul radicular este de mare importan. Absorbia poluanilor organici i anorganici dizolvai n ap i transportul acestora n esuturile plantelor poate fi mediat de sistemele de transport ale membranelor celulare sau, n mod alternativ, poate fi un proces pasiv reglementat de transportul apei prin intermediul celulelor. Ptrunderea prin membrana celulei i transportul n interiorul plantei este puternic influenat de solubilitatea n ap a poluantului ca i de mrimea i forma moleculelor sale sau de distribuia sarcinilor electrice( ). Recent s-a demonstrat c esuturile mamiferelor manifest rezisten puternic fa de proteina MDR ceea ce confer celulelor rezisten fa de elementele chimice organice citotoxice i chiar eliminarea elementului toxic din celul. A fost descris de asemenea existena unor sisteme asemntoare n plante( ). Unii compui chimici de sintez pot avea rolul de amendamente a proceselor de fitoremediere. Acetia ar putea fi folosii pentru a favoriza desorbia poluanilor din sol, mbuntind astfel biodisponibilitatea acestora din urm de a fi preluai de plantele i microorganismele din rizosfera ( ). B. Biotransformarea plantelor i stocarea poluanilor n esuturile

n esuturile plantelor vii, poluanii sunt transformai printr-o mare varietate de reacii metabolice, biochimice i chimice. Biotransformarea xenobioticelor are loc dup o succesiune de reacii ce pot fi grupate n dou faze: faza I reprezentat de reacii de oxidare i faza II n care au loc transformri ale produilor rezultai n prima faz. n plante, metabolismul oxidativ caracteristic fazei I este mediat de enzime din grupa oxigenazelor (citocrom P 450). n faza II xenobioticele hidrofobe activate sunt convertite n forme cu proprieti hidrofile mult mai mari prin conjugarea cu zaharuri sau grupri sulfhidrice (-SH) (..). Gruprile SH din structura tripeptidelor de la nivel celular ofer protecie mpotriva toxicitii ionilor metalici dar i a compuilor organici alchilai. 1. Biotransformarea Informaii detaliate asupra mecanismelor chimice de transformare a poluanilor organici i anorganici n plantele care au capacitatea de a metaboliza sau reine aceti compui sunt greu de obinut. Sunt ns formulate cteva ipoteze. Prima dintre acestea afirm c aa numitele plante tolerante (plante ce manifest capacitate de fitoremediere) detoxific ionii metalelor grele pe calea unor reacii chimice prin care acetia sunt transformai n forme insolubile sau chelatai cu acizi carboxilici sau tioli i apoi nmagazinai n vacuolele unor celule.
94

O alt ipotez, care vizeaz mai ales transformrile din faza II postuleaz c metabolizarea poluanilor n plante este condiionat de conjugarea cu GHS (-L-glutamil-L-cisteinil-glicin) sau homoglutation (-Lglutamil-L-cisteinil--alanin) reacie care reprezint unul dintre cei mai importani pai n reducerea sau eliminarea total a toxicitii unui compus organic. Este de altfel cunoscut c enzima GSH transferaza (GST) mediaz conjugarea GSH cu numeroi compui chimici cu proprieti ierbicide dup o schem general de reacie de forma: GSH + X-R
GST

GS-R + H-X

X-R=poluant GS-R = GSH conjugatul poluantului Enzimele de tipul GSH transaminaz reprezint o clas de enzime cu o specificitate mare pentru diferite tipuri de substrat, care faciliteaz reacii de tipul celei prezentate anterior, mai ales pentru substraturi cu caracteristici hidrofobe electrofile. Cele mai multe informaii asupra enzimelor de tip GST din plante le prezint ca fiind implicate n procese de detoxifiere pentru un mare numr de ierbicide, dar n mod evident, aceste enzime joac un rol mult mai nsemnat, putnd fi implicate n fenomene generale de stress la plante. Compuii conjugai cu GSH obinui nu sunt total lipsii de activitate biologic. Acumularea acestor metabolii n celule poate duce la o reducere activitii de detoxifiere din faza II, printr-o inhibare a activitii GSH transferazei. 2. Compartimentarea n plante, produii rezultai n urma metabolismului i implicit poluanii ajuni n esuturile acestora sunt stocai n vacuolele celulare. Acest proces de stocare poate fi privit ca faza III a procesului i este dependent de energia stocat n legturile macroergice de ATP la nivelul membranei celulare. Prezena acestei energii poate face ca membrana s acioneze ca o pomp ce trage spre interiorul vacuolelor compuii cu caracter poluant stocndu-i. C. Reducerea toxicitii sau detoxifierea speciilor oxigen active generate de ctre poluani Radicalii oxigenai sunt produi n urma unor transferuri de electroni sau prin diferite reacii de oxido-reducere n esuturile plantelor. n condiii de stress chimic producerea unor astfel de radicali este mult accentuat. De exemplu: concentraiile micromolare de ioni de Hg (II) duc la reacia de peroxidare lipidic n esutul frunzelor de porumb. Plantele au posibiliti de aprare mpotriva efectelor radicalilor oxigenai produsi. Este cunoscut faptul c exist un echilibru fragil ntre factorii care genereaz oxiradicalii i sistemul de aprare a celulei mpotriva efectelor nocive ale acestora.

95

Protecia antioxidant este asigurat de trei categorii generale de compui care includ: 1 compui cu caracter reductor solubili n ap cum ar fi compuii ce conin grupri tiol: cisteina, GSH); ascorbai; catehine; 2 compui lipo-solubili: -tocoferol i caroten; 3antioxidani enzimatici: GSH peroxidaza, ascorbat peroxidaz, catalaza i superoxid dismutaza. 6.3.2. Poluani anorganici A. Absorbia i translocarea caracter poluant n plant) (deplasarea compuilor cu

Ionii metalelor sunt fixai prin legturi puternice de particulele de sol. Pentru a depi energia acestor legturi, plantele i-au dezvoltat de-a lungul evoluiei lor mecanisme prin care s mbunteasc biodisponibilitatea microelementelor care sunt indispensabile n nutriie. Unul dintre aceste mecanisme const n producerea i secretarea unor compui naturali cu caracter chelatant pentru ionii metalelor, care pot imobiliza Fe, Cu, Zn punnd n libertate protonii care modific pH-ul solului aflat n vecintatea rdcinilor. Modificarea de pH determin solubilizarea ionilor metalelor. Un mecanism analog de solubilizare a ionilor metalelor este declanat i de bacteriile din rizosfer avnd o aciune sinergic cu procesul de fitoremediere a solurilor poluate cu poluani anorganici. O bun toleran la ionii metalici, dar mai ales la Zn o au plantele din familia Arabidopsis, Triticum aestivum , Nicotina tabacum etc. Dup solubilizarea din sol a ionii metalici sunt transportai prin xilem. Mobilitatea ionilor metalici n zona radicular poate fi mult ntrziat din cauza capacitii de schimb ionic a celulelor ce delimiteaz xilemul. De aceea complecii metal-chelat ar putea fi transportai cu mai mult uurin prin transpiraie. B. Rolul amendamentelor Anumii ageni cu proprieti chelatante, naturali sau sintetici au capacitatea de a facilita n mod semnificativ absorbia ionilor metalici din sol de ctre rdcinile plantelor i de a favoriza chiar transportul acestora spre prile aeriene ale plantelor. De aceea n practica de fitoremediere, pentru a mbunti absorbia ionilor metalici se administreaz, pe suprafaa solului contaminat, chelatori naturali sau sintetici. Pentru decontaminarea unui sol contaminat cu Pb se poate folosi cu bune rezultate o cultur de Brassica juncea n condiiile administrrii de amendamente sintetice de tipul acidului etilen diamino tetraacetic (EDTA). Concentraiile de Pb n esuturile plantelor sunt direct proporionale cu concentraiile de Pb din sol, dar i cu concentraia de EDTA administrat. EDTA poate de asemenea s mbunteasc acumularea de Cd, Cu, Ni i Zi. Pentru decontaminarea solurilor contaminate cu Pb se mai pot folosi culturi de mazre (Pisum sativum) i porumb (Zea mays). In interiorul plantelor, atomii de Pb snt transportai sub forma de chelat- EDTA ceea ce indic faptul c EDTA-ul mbuntete i translocarea (migrarea ionilor n
96

esuturile plantei). Pentru ndeprtarea uraniului din solurile contaminate se pot utiliza ca amendamente acizi organici de tipul acid citric, acid acetic, acid malic. Dintre acetia, acidul citric are capacitatea cea mai bun de a mobiliza uraniul din sol i de a determina absorbia acestuia n esuturile plantelor de Brassica juncea i Brassica chinensis. Concentraia de uraniu n esuturile plantelor este de circa zeci de ori mai mare n prezena acidului citric. C. Biotransformarea n condiii normale, plantele sunt vulnerabile la toxicitatea ionilor metalici aflai la nivelul rizosferei. Aflate n perimetre contaminate, plantele au capacitatea de a dezvolta mecanisme prin care s poat tolera concentraii relativ ridicate de ioni metalici n esuturile lor. Unul din mecanismele posibile implic formarea complecilor metalchelat cu compui de tipul oligopeptidelor, ce au n structur grupri tiol (fitochelatani), proteine i ali produi naturali cu mas molecular mic, cum sunt aminoacizii i acizii carboxilici. Prin acest tip de mecanism sunt adsorbii ioni de tipul Cu, Cd, Pb. Toxicitatea acestor metale, manifestat asupra plantelor, ca i a cromului, seleniului i arsenicului, poate fi redus prin reacii chimice de reducere i/sau prin ncorporarea elementelor menionate n structura unui compus organic. D. Stocarea compartimentarea) elementelor toxice (ncorporarea i

Acumularea metalelor n frunzele plantelor nu este un proces ce se desfoar n mod omogen. De exemplu, concentraia de Ni n plantele de Thlaspi montanum este variabil n funcie de tipul de esut n care se acumuleaz. n aceast specie, acumularea nichelului se desfoar de preferin n celulele epidermei frunzelor. Un studiu asupra acumulrii zincului n frunzele de Thlaspi caerulescens a dovedit c acest metal este acumulat n celulele epidermale n concentraii de 5-6 ori mai mari dect n celulele mezofile. Mai precis, poluanii anorganici se acumuleaz n vacuolele celulelor epidermei, iar procesul este de obicei dirijat de un proton. 6.3.3. Poluanti organici Posibilitile de ndeprtare a poluanilor organici (de tip cloroacetanilid sulfonilureat, tiolcarbamai i altele) prin tehnici de fitoremediere constituie o prioritate datorit mai ales a efectelor fitotoxice selective ale ierbicidelor ce au n compoziie structuri chimice de felul celor mai sus menionate. Poluanii organici sunt prezeni n concentraii mari n sol i n apele subterane. Poluarea poate aprea din cauza unor produse secundare rezultate n urma unor procese industriale sau agricole, produse petroliere, utilizarea unor ierbicide, pesticide sau a altor substane de combatere. De cele mai multe ori contaminarea solurilor din cauzele mai sus menionate are loc pe suprafee foarte ntinse astfel nct tehnicile clasice de remediere sunt fie foarte scumpe, fie n unele cazuri impracticabile. Fitoremedierea poate constitui n aceste cazuri o alternativ.
97

A. Absorbia i transportul poluanilor organici Absorbia i transportul poluanilor organici din sol de ctre rdcinile plantelor poate fi corelat cu proprietile fizico-chimice i structurale ale acestor substane. De multe ori n aceste estimri se ia n considerare aa numitul factor de absorbie al rdcinilor, parametru definit ca raportul dintre concentraia poluantului organic n rdcin i concentraia acestuia n sol. B. Rolul amendamentelor O problem major pentru tehnicile de fitoremediere n cazul contaminrii solurilor cu poluani organici o constituie slab biodisponibilitate a poluanilor. n scopul creterii biodisponibilitii compuilor organici rspndii pe soluri cu scop ierbicid, companiile productoare de chimicale au lansat pe pia produse ce au n compoziie surfactani care mbuntesc pe ct posibil solubilitatea n ap a ierbicidelor (ce au caracter lipofil) micornd tensiunea superficial la interfaa compus chimic/ap. Odat solubilizate cu ajutorul surfactanilor, ierbicidele devin biodisponibile pentru a fi preluate de ctre specii de plante. Solurile poluate cu compui aromatici de tip benzen sau alchil derivai ai acestuia (toluen, etilbenzen i xilen) pot fi de asemenea decontaminai prin tehnici de fitoremediere. Aceti contaminani au caracter lipofil slab, iar extracia lor din sol se poate realiza relativ uor, mrind solubilitatea aparent n ap a acestora. Se pare c ciclodextrinele au capacitatea de a crete eluia compuilor organici din sol, avnd att rol de surfactani, ct i de ageni de complexare, care pot forma incluziuni cu compui hidrofobi. Studii efectuate asupra ciclodextrinelor naturale i a hidroxipropil ciclodextrinelor au relevant faptul c solubilitatea aparent a benzenului, toluenului i xilenului este mult mbuntit n cazul n care n mediu au fost prezeni i aceti compui( ). C. Biotransformarea Majoritatea informatiilor asupra reaciilor de biotransformare a compuilor chimici organici n plante se refer la reaciile de descompunere a pesticidelor. Literatura prezint ns i studii asupra reaciilor de biotransformare a poluanilor organici comuni (solveni aromatici, compui clorurati alifataci, explozivi). Compuii organici alifatici halogenai cum ar fi tetraclorura de carbon, cloroformul i tricloretilena (TCE)

98

sunt folosii pe scar larg ca solveni i se gsesc printre cele mai obinuite substane toxice ce pot contamina diferite perimetre. Plantele pot juca un rol important n remedierea solului i a apei freatice contaminate cu aceti compui. Plante din familia Populus au capacitatea de a transforma tricloretena n tricloretanol, acid tricloracetic, acid dicloracetic i o mic cantitate de CO2. La nivelul ntregii plante tricloretena nu manifest efecte toxice, chiar dac, concentraia acesteia n esuturi este cu mult mai mare fa de cea raportat n perimetrele contaminate. Rezultate asemntoare au fost obinute n cazul tetraclorurii de carbon. n esuturile arborilor de plop poluanii de tip hidrocarburi alifatice halogenate sufer procese de oxidare i dehalogenare pentru c n final s fie supuse unor mineralizri complete pn la CO2. Solurile i apele freatice contaminate cu explozibili cum ar fi trinitroglicerina (GTN), trinitrotoluenul (TNT) sau hexahidroxi-1,3,5-trinitro1,3,5-triazin (RDX) reprezint o problem ceva mai greu de rezolvat. ndeprtarea acestor tipuri de poluani din apele freatice a fost evaluat utiliznd specii de plante acvatice. S-a demonstrat c TNT-ul este ndeprtat complet din apele de adncime incubate cu plante acvatice, n timp ce concentraia de RDX rmne constant. Mineralizarea celor dou substane, pn la CO2, cu ajutorul plantelor, este foarte slab iar transformarea acestora n compui organici volatili este neglijabil. Pentru ndeprtarea TNT-ului din soluri contaminate au fost testate patru specii de plante superioare: dou dicotiledonate i dou monocotiledonate. Experimentrile au dovedit c o cultur de Avena sativa are o mare toleran la TNT (1600 mg /kg) i prezint un bun potenial de decontaminare. Pentru ndeprtarea trinitroglicerinei se poate utiliza o cultur de sfecl de zahr (Beta vulgaris). n esuturile plantei, trinitroglicerina este transformat rapid n dinitroglicerin i mai apoi n glicerol monohidrat. Cultura de tutun este de asemenea capabil s supravieuiasc n prezen de trinitroglicerin sau TNT. O alt problem de mediu major o reprezint contaminarea solurilor cu ierbicide. Ierbicidele de tipul cloroacetanilid (n special acetoclor) sunt contaminanii cel mai frecvent ntlnii. Pentru decontaminarea acestor compui s-a utilizat un sistem integrat de fitoremediere, utiliznd o cultur de porumb tratat cu benoxacor, iar la nivelul rizosferei plantelor a fost inoculat o tulpin de Pseudomonas capabil s catabolizeze acest ierbicid. Aceast combinaie de tratament chimic i biologic reprezint o nou
99

abordare n scopul creterii toleranei fitoremediere (Ch. Brunold, 1991).

plantelor

i a

capacitii

de

Cunotinele asupra factorilor ce determin eficacitatea tehnicilor de fitoremediere s-au amplificat considerabil n ultimii ani. A devenit evident faptul c aceste procese sunt determinate de o succesiune de evenimente ale cror elemente pot juca un rol important n contracararea daunelor din esuturile plantelor. Eficiena tehnicilor de fitoremediere pare s fie puternic influenat de capacitatea plantei de a evita concentraiile prea mari ale formei toxice a poluantului i a speciilor oxigen active, care ar putea fi generate n esuturile n care poluanii sunt stocai. Rolul important al -Lglutamil-L-cisteinil-glicin (GSH) n biotransformarea poluanilor electrofili n unele plante tolerante precum i importana sistemelor antioxidante de a contracara efectele nocive ale activitii peroxidative a fost clar stabilit. Totui mai rmn multe aspecte de studiat mai ales n ceea ce privete specificul i mecanismul de inducie i transformare a poluanilor. Progresele n biologia molecular a plantelor, studiile n vivo i n vitro de urmrire a transformrilor poluantului, folosirea plantelor transgenice n practica de zi cu zi pot face din tehnicile de fitoremediere o important alternativ n protecia mediului.

100

Cap. VII Biotehnologie i societate

1. Dou atitudini Nu toat lumea este de acord asupra a ceea ce reprezint biotehnologiile pentru domeniul tiielor agronomice. De exemplu, unii consider c procesele biotehnologice s-au nscut acum 10.000 de ani aproximativ n epoca cunoscut sub denumirea ,,Croissant Fertile, n timpurile cnd omul se desprindea de dependena sa de vntoare i de cules, inventa cultura pmntului i creterea animalelor domestice. Acetia nu vd nici o ruptur n etapele succesive de ameliorare ale tehnologiei agricole, care a culminat fr ndoial n anii 60 cu aa numita revoluie verde. Ei consider c noile biotehnologii, care folosesc fabuloasele cunotine ale mecanismelor celulare i ale structurii AND ului nu sunt dect o etap suplimentar, fr trecerea unui prag. Aceasta este de exemplu, atitudinea lui Joseph Schell i a lui Marc von Montagne de la PGS, mari furnizori de produse vegetale genetic modificate. Cei doi declarau recent, cu o mare convingere (la o reuniune consacrat Biotehnologiei n Societatea European), c ameliorarea genetic a produselor vegetale va contribui la rezolvarea enormelor probleme pe care omenirea le va avea de surmontat n deceniile viitoare i anume cum s hrnim 10 miliarde de oameni? Pentru a depi aceste probleme trebuie s fie folosite cele mai bune tehnici cunoscute, incluznd aici pe cele care produc organisme modificate genetic (OGM). Pentru Schell (1994) organismele modificate genetic nu difer de vegetalele ameliorate obinute prin metodele clasice, cum sunt selecia i hibridarea. De cealalt parte, Philip Dale de la Institutul John Innes din Marea Britanie, exprim cele mai puternice rezerve privind folosirea la scar mare a produselor vegetale transgenice, subliniind ignorarea total a domeniului ecologiei. Si ali cercettori, cum sunt cei de la Union for Concerned Screntist (SUA) estimeaz c aceste noi tehnologii prezint enorme
101

pericole poteniale i cer cu vehemena ca ageniile de protecie a mediului s fac totul pentru a modifica radical reglementrile ce guverneaz obinerea i utilizarea organismelor modificate genetic. Aceste atitudini se regsesc n mod asemntor n unele medii medicale. Considernd c idealul medical este de a vindeca, de a eradica boli sau anomalii transmisibile, unii cercettori estimeaz c utilizarea interveniilor la nivelul genomului nu este dect prelungirea progresului tehnologic din ultimele cteva decenii. Medicina ar trebui s funcioneze, dup aceti cercettori, urmnd ideea implicit a ceea ce omul ar trebui s fie. Se pot refuza oare astfel de intervenii la nivelul genomului? se ntreab Tagnieff (1993) n articolul: Genele defectuoase sunt sacre?. Trebuie respectat transmiterea fatal a flagelului ereditar? Dar oare aceasta nu nseamn c omenirea s se fac complice la repetarea nedefinit a suferinelor umane chiar dac ar fi posibil remedierea parial a acestora?. Charles Susanne(1990), genetician la Universitatea Liber din Bruxelles adaug c Biologul n-ar devenii mai bun dect Dumnezeu pentru c i-ar permite s vindece aceste boli congenitale care, spontan apar la fiecare generaie. Jean Hamburger(1990) este de aceeai prere pentru c afirma: Frica neraional a oricrei aplicri pe om a progreselor genetice nu este fr un inconvenient grav. Ea risc s devin obstacol n vindecarea posibil a bolilor ereditare. La polul opus se gsete Hans Jonas (1992) pentru care intervenia pe genomul uman constituie crima esenial pentru care autotransformarea omului este vzut ca o atingere a ideii de divinitate. Susintorii ecologiei profunde nu sunt deloc departe de acest neofundamentalism genomic care proclam c genele ce prezint deficiene fac parte din valoarea patrimonial a genomului uman. Jean Dausset (1992), deintorul premiului Nobel i preedintele Micrii universale pentru responsabilitate tiintific, este puin mai nuantat: Omul scrie el trebuie s urmreasc fr ncetare cutarea cunotinelor care l-au fcut ceea ce este: homo sapiens . Descoperirile tiinifice nu trebuie s fie folosite dect n beneficiul omului i nu n detrimentul acestuia. Genetica molecular, ramur mai nou a tiinelor, trebuie din acest punct de vedere s fie exemplar i s ridice bariere ntre acceptabil i neacceptabil. Dar supremaia vieii nu trebuie s conduc, cel puin n faza actual a cunotinelor noastre, la modificarea patrimoniului genetic al umanitii. Unii consider biotehnologia c semnul de start a viitorului ciclu economic n care intr acum societiile occidentale (Thompson 1986) sau cel puin ca o unealt puternic a rennoirii fundamentelor economice ale societii contemporane. Dar ce au realizat biotehnologiile? Ce putem spera de la aceast ramur a tiinei? 2. Ce au realizat biotehnologiile? Chiar i cei mai entuziati partizani ai tiinelor biotehnologice (Tait 1991) admit c s-au realizat relativ puine lucruri, fa de potenialul uria al domeniului. Astfel, n tiinele agronomice, pentru cultura plantelor s-au pus la punct tehnici de micropropagare, s-a mbuntit rezistena la ger sau la stress, s-a reuit ameliorarea creterii. Pentru sectorul animalier au fost aduse importante contribuii n controlul bolilor i reproducerii, n
102

ameliorarea conversiei alimentare n domeniul alimentelor pentru vite, creterea produciei de lapte sau carne prin folosirea hormonilor. Dobndirea unei rezistene la insecte sau ierbicide prin transfer de AND manipulat sau nu, a unui organism oarecare spre un vegetal este biotehnologie. Pioner n acest domeniu alunecos a fost P. B. Male Van Montagn fondator al PGS Sistemul genetic al plantei (1987) care a transferat gene modificate a Bacillus thuringiensis B thuringiensis produs de proteinele toxice pentru un mare numr de specii de insecte n plantele de tutun. Acest tutun transgenic este protejat vis-avis de larvele de Manduca Sexta. Aceast soluie este fr o stare de suflet i fr a putea meniona potenialele pericole la introducerea n natur a organismelor modificate genetic, astfel nct echipa de la PGS concluzioneaz afirmnd c transferul diferitelor gene ntr-o varietate de plante (culturi) furnizeaz o nou metod mai sigur al controlului insecticidelor distructive. Obinerea animalelor transgenice este o alt aplicaie a biotehnologiei. O premier a fost anunat la sfritul anului 1982. oarecii gigani au fost obtinui prin injectarea genei hormonului de cretere a obolanului n ovulele de oareci imediat dup fecundare. Aceti soareci transgenici, de dou ori mai grei dect cei normali, transmiteau descendenilor gena strin pe care o integraser n patrimoniul lor genetic (Palmiter i al. 1982). Aceste animale din fericire sau nefericire aveau o cretere, o psihologie i o morfologie puternic putin echilibrat. Se pare c acest rezultat mai curnd negativ, a rcit, civa ani analiza unor cercettori. Totui n aceti doi sau trei ultimi ani, noi etape au strbtut cu mare vitez. Astfel transferul genelor umane n capre, scroafe sau oi, permit strngerea n laptele acestor animale a unei ntregi serii de proteine umane, ca de exemplul, proteinele de cuagulare folositoare n tratamentul hemoglobinei care este produs cu aproximativ 10% n sngele porcului. Cazul taurului olandez Herman este exemplar. Lactoferina este o protein bactericid prezena n laptele uman dar absena in laptele bovinelor. S-a transferat din gena uman de lactgerina ntr-un anumit numr de zigoii bovini. S-a nscut un taur botezat Herman; el a provocat n rile de Jos n parlament vii dezbateri. n cele din urma Herman a fost autorizat s se reproduc, el a avut o viic, care a avut un viel, i a produs n lapte lactoferin. 3. Sperane ! Temeri ! Ceea ce se poate spera sau de ceea ce ne-am putea teme! Se pare caz de fapt starea de bine a produselor vegetale poate fi uor ameliorat. Se poate spera astfel n mod rezonabil s se modifice coninutul n acizi aminici a anumitor proteine, compoziia n acizii grai saturati sau nesaturatii, se poate spera s se diminueze coninutul n toxine endogene, s se diminueze sau s creasc coninutul n amidon, s se modifice gustul sau culoarea. Nu este fr ndoial utopie de a se folosi vegetale ca gaz pentru producia de proteine strine. n stadiul experimental, o plant de tutun poate s produc interferoni, albumina uman, amilaza bacterian i chiar poliesteri. Fr ndoiala mult mai ndeprtat n timp va fi o realizare care acum 20 de ani se credea uor realizabil: fixarea azotului de ctre esuturile plantei neleguminoase, ca grul, porumbul sau orezul. ncreztor sau mai bine spun biologii (moleculari) necesit s fim rbdtori, argumentnd c nu
103

se cunosc dect aproximativ 5% din genomul vegetalelor , de 10 15 ori mai puin dect se cunoate la mamifere. Dup toate scrie Boutry 1992 ce nseamn 20 de ani comparativ cu 3 miliarde de ani?. Dup Departamentul de Agricultur a Statelor Unite erau n mai 1993, 18 specii vegetale modificate prin tehnica ANDului recombinat. La fel n Europa celor 15 erau la 10 februarie 1995, 19 specii vegetale modificate, primele trei locuri fiind obinute de rapi, porumb i sfecl de zahr (Comisia European 1995). n SUA vegetalul cel mai modificat este cartoful, devenit rezistent la anumite erbicide, n general foarte specifice, la unii virui i la anumite insecte. A crescut deasemeni cantitatea de amidon. Mai curios a fost creat o varietate care produce o larg gam de molecule neavnd nici o legatur cu cartoful sau cu lizomi de pasre. A doua plant deja bine aranjat este porumbul; rezistena la erbicidele specifice, anumii viruii i unele insecte, producie de aglufinina de gru. n privina roiei, ea rezist la civa virui, cteva erbicide, cteva insecte i a fost micorat viteza sa de coacere i deci de putrezire. Aceast ultim roie produs de Compania Calgene i denumit FlavourSavoir a fost introdus pe piaa american n mai 1994. Pentru celelalte 15 vegetale este vorba aproape exclusiv de rezistena la un erbicid, la un virus sau o insect. La sfritul anului 1994 mai mult de 2000 de ncercri n cmp fuseser realizate n lume, pe suprafee mici i n condiii de medii destul de strict definite i controlate. 1031 din aceste ncercari au fost n SUA, 496 n Europa, n sensul larg al termenului. Nici una din aceste noi plante nu par s devin un flagel (Anonymos, 1994). Ziarul oficial al Comunitii Europene a publicat pe 8 mai 1990 dou directive: 90/219 i 90/220 una relativ la folosirea specializat a microorganismelor modificate genetic, cealalt la desemnarea voluntar a a organismelor modificate genetic (OGM) n mediul nconjurtor. Aceste dou directive spun c n toi trei anii i pentru prima dat la 1 sept. 1992, statele membre trimit comisiei un raport despre msurile luate pentru aplicarea directivelor. De asemenea n trei ani i pentru prima dat n 1993, comisia public o sintez care se bazeaz pe rapoartele statelor membre. Aceast sintez demonstreaza nc o dat ca orice s-ar spune sau gndesc unii, Europa este departe de a fi fcut tot, a fost publicat n februarie 1995. Este vag i arat c directivele sunt subiecte pentru interpretrii multiple. Diseminarea voit a organismelor modificate genetic Pentru a obine o autorizaie a diseminrii voluntare a OGM, firma candidat trebuie s furnizeze autoritilor sale naionale rspunsuri la multiple ntrebri, inspirate de direcia 90/220 a CEE. Aparent, responsabilii acestei directive nu au ntotdeauna o idee clar a ce este o fiin vie i mai ales interaciunile ei cu mediul nconjurtor. Mai mult ei nu tiu fr indoial enorma sum a ignoranei noastre n ecologie. Se cunosc cteva exemple! Care este probabilitatea, dup desemnarea unei selecii conducnd spre exprimarea trasturilor neateptate i sau n interaciunile biologice sau n gama gazelor? Crezi c visezi? n Frana, n mai 1994 o cerere de comercializare a unei rapie transgenetice fusese introdus pe lng Comisia Geniului biomolecular (CGB). O situaie picant. n timpul unei mese rotunde organizat in cadrul conveniei Disiminarea organismelor modificate genetic, prudena este
104

posibil? care a avut loc la Ministerul Mediului nconjurator la Paris la 25/27 mai 1994 un reprezentant al lumii agricole declar c n starea agriculturii franceze actual, ranul francez nu are nevoie deloc de acest vegetal transgenetic. Nu este indispensabil preciza el! Semnalm de asemenea ca dc cererea de ncercare sau de disiminare voluntar era refuzat de unul din Statele membre ale Comnunitii Europene, de SUA, de Japonia i un grup de alte rii, rmne totui posibilitatea de ncercare sau de disiminare n multe alte ri: China, unde n 1994 au fost semnalate mai mult de 800 hectare semnate cu tutun transgenetic (Fang 1994) care va fi comercializat n 1995 fostei URSS i Americii de Sud. Totui OGM urile, trebuie s reamintim, c nu cunosc frontiere naionale. Va trebui, ntr-o zi s vorbim de ingenerana ecologic cum se vorbete astzi de ingerina umanitar? Ceea ce este caracteristic numeroaselor ncercri realizate n lume n timpul ultimilor 5 sau 6 ani este c exist preocupri numai de performanele agronomice i c nici un efort nu a fost consimit cu scopul de a ti dac vegetalele modificate genetic ar putea sau nu s devin un flagel (Kareiva 1993). Singura excepie de remarcat este un studiu remarcabil al rapiei Brassica napus subspecia oleifera, n Anglia, timp de trei ani succesiv i 12 locuri diferite (Crawley i al. 1993). Colaboratorii lui Crawley au fost ecologiti, matematicieni, biologi ai populaiilor i ecologisti ai comunitatilor. A fost sustinut de un consortiu de industriasi si de agentii guvernamentale. Principala caracteristic msurat a fost potenialul de invadare a unei rapie transgenetice. n cele 12 medii testate au fost observai un numr mare de factori ecologici: - prezena sau absena mamiferelor i/sau insectelor erbivore; - prezena sau absena ciupercilor patogene; - prezena sau absena vegetaiei ntmpltoare cultivat sau nu. Posibilitatea invadrii a fost msurat comparndu-se creterile populaiei vegetale de rapi nemodificate, de rapi modificat de gena de hanamicin i de gene de rezisten la erbicidul Basta. Rezultatele acestui studiu frumos sunt perfect clare: n toate cazurile creterea rapiei modificate genetic este riguros asemntoare cu cea a rapiei originale. Bineneles, cu o floare nu se face primavara. i nu trebuie s credem c frumoasa experien a lui Crawley d rspunsuri definitive i exhaustive problemelor puse de OGM uri. De fapt, este bine cunoscut c un invadator vegetal sau animal poate prin a ncepe a supravieui mizerabil, timp de decenii ca s izbucneasc cu o violen apoi. n Belgia, cazul cufundacului mare motat este exemplificator, disprut n anii 60 nu rmseser dect cteva perechi se gsesc astzi pe cea mai mic balt. n Europa, turtureaua turceasc altdat specie proprie Turciei a invadat n 40 de ani toat Europa, practic pn la cercul polar i a trecut recent n cellalt sens al Mediteranei. La noi a fcut s dispar turtureaua noastr din pduri. De ce? Pe de alt parte, invazia nu este singura problem. Se poate ntmpla ca gene noi transmise de polen s nu reueasc bine dect n buruieni i s dea acestora o vigoare a hibrizilor catastrofal. n final, rapia este o plant din regiuni de mari culturi, bine udate i cu climat temperat. Ce se va ntmpla cu puterea de invadare a vegetalelor modificate ca s reziste la diferii factori de stres ca de pild seceta, salinitatea solurilor sau atacurile insectelor?
105

n final, exist nc dou pericole mai puin evidente legate de folosirea vegetalelor transgenice. Primul se adapteaz faptului c cultura fiind recoltat, rmn n sol semine care, anul viitor vor deveni buruieni pentru cultura urmtoare, aa se ntmpl, de exemplul cu cartoful i sfecla. Dac sfecla i cartoful au fost genetic manipulate ca s reziste la un erbicid specific, un alt erbicid va trebui folosit pentru a scpa de vegetalul buruian. Un alt pericol, mai subtil este legat de faptul c plantele cultivate pot transmite genele lor speciilor nvecinate care sunt adesea buruieni. Se vorbete de fluxul genetic. Din acest moment ne putem imagina c o buruian devine rezistent la o ntreag serie de ierbicide sau virui. Aciunile ameliatorilor i a aprtorilor din mediul nconjurtor sunt puternic opuse. Unele animale i vegetale transgenice conin virui genetic modificai. Ori, cunotiinele noastre referitoare la capacitatea unui virus la infeciile unei gazde sunt slabe. Nu tim nimic din ceea ce determin gama gazdelor unui virus. i netiina noastr privitoare la aptitudinea pentru un virus de a se recombina cu o alt specie de virui i de a produce o nou matc virala cu proprieti eventual patogene aceast ignoran (necunoatere) este astral. Exist, la ora actual, n SUA, creteri de pete, pisic i crapi transgenici n care sau introdus gena hormonului de cretere al pstravului curcubeu, n China, creteri de crapi transgenici, crora li se adaug gena hormonului de cretere uman. Scopul acestor transgerri este de a obine peti de talie sporit, cu o cretere mai rapid i capabil de a suporta temperaturi mai joase, aceasta cu scopul de a se putea crete n regiuni mai nordice. Aceste creteri se aseamn, dar este clar ca peti manipulai vor scpa mai devreme sau mai trziu, invadnd din acel moment biotopii vechi unde ei nu au fost niciodat prezeni (Anonymous 1994) cu ce rezultate? Diminuarea biodiversitii? Eliminarea speciilor? Plante i animale exotice Ce ne nva trecutul? Introducerea voluntar a plantelor i animalelor n ri n care ele nu provin este considerat ca un model aplicabil dimensionrii voluntare a OGM urilor. Dac aceast aseriune este adevarat, acest fapt poate cauza cteva griji (Pimentel 1989) au examinat n SUA soarta diferitelor animale i vegetale exotice introduse din raiuni agricole, horticole sau ornamentale, pentru vntoare, sport sau ca animale de companie. 5800 de specii vegetale au fost introduse: 128 au devenit calamitate. Toat lumea i va aminti de oribila poveste cu zambila de ap! Zece din 20 de mamifere i psri de companie sunt sursa unor mari necazuri. La fel pentru 9 din 20 de mamifere i psri introduse pentru vntoare. Din contra 5 numai din 2000 de peti introdui au devenit duntori. n Africa, introducerea n regiunea Marilor Lacuri (Nile pereh) a provocat dispariia a sute de specii de cyclide aproape mereu endemice. n Australia, proliferarea iepurelui adus de primi emigrani care contau pe iepure ca s-i asigure subsistena este un exemplu clasic i dezvoltarea contemporan a acestui adevrat dezastru este puin cunoscut. Iepurii nmulindu-se s-ar fi putut crede c un alt mamifer, introdus n acelai timp, vulpea, ar fi acionat i ar fi limitat pagubele. Ce pcat! Vulpea i ddu
106

repede seama c micile marsupiale alergau mult mai ncet dect iepurii i c puteau astfel c din acel moment s profite cu mai puin cheltuial. Rezultatul: astzi 20 de specii de marsupiale au disprut definitiv. Iepurele nmulindu-se, australieni au introdus myxomatoza, boala specific i mortal transmis de un virus. 99% din iepuri fur rapid eliminai. Procentul rmas rezistnd la myxomatoza pornete bine i este deajuns astzi la mase de iepuri i de vulpi. Este adevrat c niciodat nu se nva nimic. Astzi australienii vor s recurg la genetic, la noile biotehnologii. Ei vor s lucreze din nou cu virusul myxomatozei pentru iepuri i virusul vaccinului pentru vulpi, introducnd n aceasta o gen codnd o protein de suprafa a spermatozoizilor. Dup injectare iepurii i vulpile ar trebui s provoace anticorpi anti-spermatozoizi care ar trebui s joace un rol contraceptiv (Morell 1993). i dac cinele dingo sau cinele domestic ar fi sensibil la virusul manipulat inoculat vulpilor? i dac virusul ar iei din Australia? i dac un procent dintre iepuri cei ce au puterea de reproducere cea mai ridicat ar trebui cruta? Acrobatii biotehnologice! Cu toate aceste situaiile colportate cumplite de cei care nu vor s aud de biotehnologii noi sunt toate exemple negative. Nu este sigur c introducerea n sistem a unei specii noi s fie analoag cu diseminarea voluntar a unui OGM. Aceste organisme sunt n general cultivate de zeci dac nu de sute de ani i nu sunt modificate dect pentru una sau dou gene. Ceea ce nu constituie totui o garanie de bun conduit pentru c la fel de bine nimeni nu are idee de ceea ce determin faptul c o plant sau un animal s prolifereze n exces. n SUA, Pimentel i colaboratorii si sunt disiminarea voit a OGM urilor va provoca accidente i bazndu-se pe observaiile trecutului privind introducerea speciilor exotice ei estimeaz c de fapt consecinele unora dintre aceste accidente, cauzate de o eroare uman, nu vor putea fi niciodat eliminate (Pimentel 1989). Lumea celui de al treilea val Lumea n care intrm lumea celui de al treilea val este o lume periculoas. Cuvintele cheie ale aceste lumi n pericol, produc excese a ceea ce Toffler (1980) a numit al doilea val care a dominat aceste ultimile trei secole, cuvintele cheie sunt penurie de resurse, poluare, distrugerea pdurilor, ploi acide, efect de ser, gaura n stratul de ozon, modificarea climei, muni de deeuri, explozie demografic, somaj, mase neguvernabile, datorii internaionale, naionalism distrugtor, srcirea lumii a treia, supranarmarea, moartea atomic. Societatea noastr occidental care a mizat att pe progres, este clar ameninat de autodistrugere. Aa cum spune Hans Kung n 1991, lumea occidental a adus tiina dar nu nelepciunea care ar mpiedica abuzurile cercetrii tiinifice iat-ne revenii la biotehnologie; - ea a adus tehnologia dar nu energia spiritual care ar permite controlul riscurilor imprevizibile a tehnologiilor eficiente - iat-ne mereu referitor la biotehnologii; - ea ne-a adus industria dar nu ecologia; ne-a adus democraia dar nu morala care ar putea contrabalansa voina puterii nemsurate a oamenilor i grupurilor la putere noi nu ne indeprtm de biotehnologii. Am vzut c un entuziasm aproape delirant a nsoit primii pai ai biotehnologiilor. Multe rezultatele ntrevzute sunt foarte departe de a fi
107

atinse. Mai mult ncepem s ntrevedem efectele negative poteniale ale folosirii vegetalelor i ale animalelor modificate genetic. Din nefericire dezbaterile centrate pe aceste chestiuni au fost ntunecate de absena unei distincii clare ntre aspectele etice, sociologice i politice, n care poporul ar fi trebuit s aib un cuvnt de spus ntr-o mare dezbatere democratic i aspectul risc ecologic, n care pare c specialitii ar trebui, n cunostiin de cauz s-i spun parerea. Vaucheret i Tepfer (1993) estimeaz c aspectele etice i morale, care se exprim n legtur cu acceptarea sau respingerea de ctre public a noilor vegetale, a noilor animale sau a noilor tehnologii, vor condiiona viitorul organismelor modificate genetic. Este bine ceea ce apare c se petrece n SUA cu hormonul creterii la bovine sau somatropina (STB). Aceasta, indiscutabil sporete ntr-un mod substanial de lapte al bovinelor. Nelinitit privind calitatea laptelui, dar mai mult critici de ordin sociologic, folosirea hormonului va duce la dispariia unui numr mare de agricultori mai mult sau mai putin marginali i de ordin etic se epuizeaz animalele n trei, patru ani a adus un numr mare de oameni i chiar de lanuri de magazine s boicoteze laptele provenit de la laptele tratate. Dimpotriv, tot n SUA, roia ElavourSavour, recent pus pe pia de Societatea Calgene ntmpina un succes clar n ciuda faptului c a fost genetic modificat prin adugarea de gene bacteriene i gene virale. Este de altfel unul dintre motivele pentru care Europa nu a autorizat nc comercializarea sa. De ce, de atunci, marile transnaionale ale chimiei nu cumpr sistematic, de mai bine de 10 ani, casele de ameliorare i de selecie vegetal? Este voina puterilor care i mpinge la aceasta! Avnd, de o parte un erbicid total de calitate i de cealalt, gruntele de gru sau de porumb sau de orez ameliorate este uor s introduci n aceste semine gena de rezisten la erbicidul total. Hegemonie complet! Transnaionalul vinde smna i erbicidul care trebuie s-o nsoeasc n mod necesar. S reacionm? Cum s-ar putea reaciona? i dac ar fi o reacie, ar fi util? Care ar trebui s fie atitudinea oamenilor de tiin ce suntem? Pentru un numr mare de cercettori dou atitudini par posibile: - una este acceptarea oarb orbire voit sau inconstient a dinamicii n care trim. Este atitudinea cea mai curent pentru o mie i unul mai muli sau mai puin bune motive. - cealalt este respingerea parial sau total a practicrii unei tehnologii noi. Este atitudinea biologului Jacqnes Testart (1992) n Frana, a tehnologului Hans Jonas (1992) n Germania. Testart este acel biolog francez care, de dou ori, demisiona din postul su. Prima dat la INRA, Institutul Naional al Cercetrii Agronomice, unde lucra la un program de ameliorare a produciei laptelui la bovine, cnd i ddu seama c, crescnd producia de lapte, el i osndea pe civa mici agricultori la pieire. A doua oar, la INSERM (Institutul Naional al Sntii i al Cercetrii Medicale), unde a pus la punct tehnicile de fecundare n vitro el a fost fr ndoial tatl Amandinei, primul bebelu eprubet francez cnd i ddu seama de derivele pe care le trim astzi zilnic, pe care ducea aceast nou biotehnologie. Gilbert Hottois (1990), din contr, estimeaz c exist trei ci posibile privitoare la dezvoltarea tiinelor i biotehnologiilor. Prima este alegerea
108

ncercrii din ntregul posibil tehnotiinific. Teller, unul dintre taii bombei atomice este cel care spunea omul tehnologic trebuie sa produca tot ce este posibil si trebuie sa aplice cunostinta dobandita fr limite (citat de Lenk 1984). A doua cale este alegerea renunrii globale i a conservrii omului natura. Cum spunea Francois Gros i colaboratorii si : noi suntem gestionari i nu proprietarii biosferei noastre (citat de Hottois 1990). Este clar c poruncitorul tehnician conduce n afara eticii, aa cum semnele de neintervenie i de pur conservare duc n afara tehnotiinei. Nu rmne, dup Hottois, dect o a treia cale, cale de mijloc a ncercrii unor posibiliti tehnotiinifice n funcie de criteri de determinat (subliniat de FAL). n funcie de criterii de determinare! Aici rezid toate greutle i de asemenea imposibilitatea. Ce vor fi determinantii acestor criteri? Cine va fi responsabil? Cine va fi maiestrul? Cum vor fi aplicai. Exist mai multe posibiliti. O prim posibilitate este o zvorare definitiv, o ntoarcere n trecut fr ntrerupere. Aceasta este, ntre altele atitudinea lui Veritatis Splendor, recenta enciclic a lui Jean Paul II publicat pe 6 august 1993. Modul de a se comporta n faa tehnologiilor noi este acela spus prin cele 10 cuvinte, decalogul, poruncile din Sinai, doctrina sntoas, legea natural. Se concluzioneaz totul plecnd de la un text destinat poporului evreu care dateaza aproximativ de 2350 B.P., dar care nu a fost dect de mic importan n tradiia crestin naintea A. D. 1246 cnd a aprut prima dat ntr-un manual destinat celor care veneau la confesare (Mendenhall 1965). Aceast introducere friguroas la nisipurile din desert, din Sinai, i care vrea s ignore totul privitor la cercetrile tiintifice contemporane se nsoesc de o nencredere vie fa de un ansamblu de discipline regrupate sub numele tiintelor umane care au tras pe drept atenia asupra condiionrilor de ordin psihologic i social care apas asupra exercitrii libertii umane. Dar unii, depind concluziile pe care putem s le tragem legitim din aceste observaii au ajuns s pun la indoial sau s nege realitatea chiar libertatea uman Nencredere nc: trebuie de asemenea s amintim unele nterpretri abuzive ale cercetrii tiinifice n domeniul antropologiei. Tragem un argument din varietatea de obiceiuri, de obinuinte i de instituii prezente n lume sfrim dac nu totdeauna prin a nega valorile umane universale, cel puin prin a concepe morala ntr-un fel relativist. i totui ultimul mijloc de secol ne-a deschis perspective cu adevrat noi. Societile occidentale ajunseser s cunoasc c lumea ntreag nu tria ca ele ncepnd cu 1492, cu Cristophe Columb apoi ntr-un mod mai sistematic cu marile expediii exploratoare ale secolului XVIII i cu colonizarea din secolul XVIII i XIX. Dar continuar s gndeasc c lumea ntreag trebuie s gndeasc ca ele. Se cunoate anecdota referitoare la manualele de istorie a micilor africani din Congo belgian care ncepe cu: Strmoii notri galezii . Doar n cele din urm, de mai puin de jumtate de secol lumea occidental, foarte timid, admite c sunt i alte valori dect cele ale sale i c a vrut att de mult timp s-i impun prin for. O sintez a acestui ansamblul de valori este absolut necesar. n acest sens scrie Hans Kung n recenta scriere proiect de etica planetar (1981). Nu este supravieuire fr ethos planetar. Nu exist pace mondial fr pace religioas. Nu exist pace religioas fr dialog ntre religii. i mai departe criteriul etic fundamental va fi de atunci: omul nu trebuie s triasc inuman, ntr-un mod instinctual ( animalic) dar uman i rezonabil, ntr-un mod autentic uman! Va fi bun din punct de vedere moral ceea ce contribuie
109

durabil la reuita vieii umane n dimensiunea sa individual i social, ceea ce permite o dezvoltare optim a omului la toate nivelele (a impulsurilor, a sentimentelor) i n toate dimensiunile (ntelegndu-se raporturile sale cu natura i societatea). Kung, binenteles i n ciuda urgenei, i d seama c efortul va fi imens i c rezultatul nu va fi garantat. Suntem nc destul de departe de aceast vrst, de aceast gndire postmetafizica (Heberman, 1988) de la care plecnd am putea ajunge la o etic raional fondat. Ce vedem n jurul nostru? Comitetele de etic esenialmente biomedicale apar, nfloresc n toate colurile Europei (a celor 15) i n fiecare ar aproape, la fiecare col de strad. Consiliul Minitrilor Comunitii Europene a creat n 1990 un grup de lucru compus din 12 persoane cte unul din fiecare ar a Comunitii privind embrionul uman. Un prim raport publicat n martie 1992 relev nu n totalitate practicile autorizate sau tolerate n Europa celor 12. Diferenele dintre ri sunt enorme. Astfel la o extrem se gsete Irlanda, ara obedientei (supunerii) catolice riguroase singura ar a Europei celor 12 n care avortul este interzis. Irlanda rspunde grupului de lucru, pe scurt i sec: n prezent, n Irlanda nu exist cercetarea embrionului uman. Cercetarea embrionului se limiteaz doar la domeniul agriculturii i al zootehniei. La partea opus Irlandei se gsete Italia, Marea Britanie i ntr-o mai mic msur Spania unde se observ cea mai mare fantezie. Ne vom aminti mamele de 59 i 63 de ani, de mama neagr cu un bebelu alb, de cererea Dr. Roger Gosden, de la Universitatea din Edimburg care dorete s aplice femeii un procedeu de fecundare n vitro deja folosit la oarece. Acest procedeu const n a scoate ovarele n maturizare ale unui fetus, obinut n urma unui avort i s astepi ca aceste ovare s devin fertile pentru a le implanta ntr-o femeie devenitp steril n urma unei boli a propriei sale ovare. Cum afirma ziarul Libertation din 4 ianuarie 1994 Ultima sptmn din 1993 a fost o explozie de acrobaii obstreticale. Planul global Marshall O ultim atitudine, poate cea mai bun pe termen mediu, n legtur cu aceste noi certitudini care ne conduc la incertitudini precum i ceea ce spune Edgar Morin i Anne Brigitte Kern (1993) n foarte frumoasa lor carte "Pmnt Patrie, este aceea a lui Al Gore, actualul vicepreedinte al SUA, care public n 1992 cu puin de a se prezenta cu Bill Clinton la alegerile prezideniale, o foarte bun carte Earth in the Balance. Forging a new common Purpose. Dup un proces verbal de constatare i de o foarte frumoasa analiz a pericolelor care amenin umanitatea n acest sfrit de mileniu el propune ceea ce el numete Planul Marshall Global, care ar trebui s fie finanat de SUA, Japonia, Europa celor 12 i rile petroliere. Acest nou Plan Marshall ar trebui s-i propun 5 probleme inperative. Primul ar trebui s fie stabilizarea populaiei mondiale, printr-o politica a creri condiiilor necesare tranziiei demografice, legat de o mortalitate infantil slab i un nalt nivel de educaie. Al doilea imperativ i aici ne situam n plin domeniu al biotehnologiilor legate de agricultur i de mediul nconjurtor, ar fi crearea i dezvoltarea tehnologiilor care respect mediul nconjurtor, singurul mijloc de a asigura o dezvoltare durabil cu o dezvoltare substanial n domeniile energiei, transporturilor, agriculturii,

110

construciilor i fabricaiilor. Aceste noi tehnologii ar trebui sa fie puse la dispozitia tuturor natiunilor. Al treilea imperativ strategic ar trebui s fie modificarea mondial a regulilor economice prin care msuram impactul tehnologiilor asupra mediului nconjurtor i ecologiei. Trebuie s atribuim valori consecinelor ecologice ale alegerilor fcute att de indivizi precum i de marile societi precum i de alegerile macroeconomice realizate de naiuni. Al patrulea imperativ - fr indoial fiind cel mai greu de realizat va fi de a negocia o larg serie de tratate internaionale viznd crearea cadrelor organizatorice a interzicerilor specifice, a mecanismelor de ntrire, a greutii i a amenzilor. Al cincilea i ultimul imperativ vizeaz stabilirea unui plan mondial de educaie n legtura cu mediul nconjurtor. Ultimul scop al unui asemenea plan ar fi ca oamenii lumi s constientizeze relaiile complexe dintre mediul nconjurtor i civilizaie, adic societile, tiinele i noile tehnologii. Efortul ar trebui s fie imens. Pe msura imensei nedrepti care divizeaz lumea n 650 milioane de naii i 5 miliarde a altora. Cum spune Morin i Kern (1993) contientizarea destinului terestru de ctre comunitate trebuie s fie evenimentul cheie al sfritului de mileniu. Noi suntem solidari n, i pentru planeta noastr. Este Pmntul Patrie, al nostru. Risc i Moral Din punct de vedere moral, biotehnologia este o preocupare important din cauza urmatoarelor trei motive: - Imagini de ansamblul a riscului i slippery slope risc - Riscul asociat cu impactul social i economic - Riscul pentru sntatea animalelor i oamenilor precum i a mediului nconjurtor. n ceea ce privete o perspectiv a riscului, este bine s amintim tendina omului de a-i creea o puternic rezisten pentru propria lui protecie. Temeri despre slipper slope sunt mereu alimentate de preocupri cum ar fi schimbri n gndirea noastr dar i cu lucrul cu motenirea genetic a speciilor ntr-un mod ireversibil alunecnd spre o modificare necunoscut a animalelor i n final a manipulrii genetice umane. Uneori, n loc de slipery slop imaginea unei bariere ce poate fi depit, este invocat. Manipulrile genetice asupra viruilor, bacteriilor, plantelor, animalelor, petilor i psrilor au avut un impact important n agricultur, n prepararea chimicalelor i a medicamentelor, au fost folosite n scopuri de cercetare i terapie medical. Contrar impactului social i economic s-au introdus rezultatele modificrilor genetice a animalelor i plantelor n agricultur, pentru a putea obine o mai bun concentrare a eforturilor companiilor chimice i farmaceutice i pentru a stabili o mai bun relaie ntre universiti, cercetri academice i companii. Riscul asupra sntii animalelor i oamenilor, precum i a mediului nconjurtor este real i a produs i mai multe complicaii; n ceea ce privete, societatea din SUA este optimist n privina tehnoloigiei i a tiinei dar cu rezervele de rigoare asupra riscurilor pe care le presupun acestea asupra sntii. Relaia dintre starea de sntate i biotehnologii este
111

puternic i ntr-o continu dezvoltare. Civa critici au adresat ntrebri ngrijortoare asupra sntii oamenilor i asupra biotehnologiei. Mai nti se ofer ajutor medical oricrui individ care merit. Unii ar sugera c orice descoperire medical este bun i merit a fi urmat pentru c fiecare via are o valoare infinit. Unii spun c dac ajui i doar civa oameni, mergi nainte i perseverezi, chiar dac sunt i cteva probleme financiare. Totui uni ar putea spune c beneficiile sociale ar fi suficiente pentru a putea persevera. Cum gndim noi despre costul controlului i este justificat intervenia alocaiilor pentru resurse financiare? Unii nu ar vrea s includem tehnologiile n sntatea noastr doar dac nu s-a dovedit nainte beneficiile financiare. Unii ar vrea s ducem tehnologiile n afar unde putem s le evalum. O mai conservatoare prere ar fi c noi am avea nevoie de mai mult receptori deoarece este dificil s instaleze i s exploreze o nou tehnologie, s o testeze i n final s hotrti dac o poi folosi. Oamenii care au aceast prere argumenteaz c intoarcerea n timp este posibil. Al treilea, credem noi c natura, incluznd natura uman, tie ea ce este mai bun? Bioeticele medicale par s promoveze natura i nu o vede ca un ghid propriu. Noi am putea ntreba natura, ar trebui s intervenim n toate ce privete tehnologia? A patra, ar trebui s ne gndim doar de a aduce individul membru al populaiei noastre la un anumit nivel de normalitate ori ar trebui s dorim o eradicare a bolilor, durerilor i suferinelor pentru toi? n final, n materie de incertitudini i mai multe biotehnologii recent clasific incertitudini ar trebui s procedam agresiv? Uni oameni vor spune s mergem nainte i s profitm de aceste posibiliti. Alii ne vor sftui s procedm n mod atent. n materii de incertitudini, ei nu vor fi de acord, dar noi mergem mai departe foarte uor, pas cu pas. Noi, sincer nu tim n orice caz ce va merge mai bine sau nu. Fiecare din aceste ntrebri sunt foarte greu de adresat, dar pe msura ce vor aprea vor trebui s fie puse. Dac suntem optimiti n ceea ce privete progresul tiinific, vom lua acest grup de valori i vom merge cu biotehnologiile mai departe. Pe fundalul acestor valori, perspective i nclinaii, luarea deciziilor concrete prezint o diferen important n ceea ce privete eticul acestor surse. Ne-am putea atepta s gsim un ir de activiti acceptabile i un ir de activiti inacceptabile i n final s lsam ca experiena s ne ating. Totui biotehnologia poate fi considerat un experiment dinamic. Noi nu tim cu exactitate ce poate face pentru noi sau nou nine, deci trebuie s nvm i sa mergem mai departe. Figura urmtoare ne arat multiplele aplicaii care se regsesc n biotehnologii, unele realizate mai devreme, altele vor fi pentru viitor:

112

1. Risc i noi tehnologii Nu este de dorit, dar riscul este un component necesar n dezvoltarea biotehnologiei. Riscul se prezint sub mai multe forme: de la riscuri capitale la riscuri personale asumate de indivizi care sunt voluntari la programele de testare a noilor medicamente. Corporaiile i asum foarte mari riscuri prin investiiile n productie i procedeuri specifice, spernd s gseasc eventual drumul spre pia i s devin folositori n prealabil. Municipalitile i asigur riscurile prin acordarea de finane pentru cercetare n sperana de a preveni rul n respectiva regiune. Pe scurt, dezvoltarea biotehnologiilor a fost vzut i continu s fie vzuta de aventurile riscurilor. Asta nseamn c aceast tehnologie nu ar trebui s fie urmat? La o astfel de ntrebare este dificil s raspunzi i rspunsul probabil depinde de perspective. O temere care apare chiar frecvent n discuiile despre risc, este ca riscul individual este diferit de cel al unei societi ca un ntreg. Ceea ce ar crede unii oameni c este benefic pentru societate este perceput ca un risc de unii indivizi sau invers. ntruct a tri n societate nseamn a face compromisuri din partea tuturor indivizilor implicai, acest aparent conflict pare rezonabil. n orice caz, nu este totdeauna simplu s decizi, fiecare personalitate sau o parte a societii i asum riscul. n fiecare zi, noi suntem subiectul a mai multor riscuri pe care le putem evita. n SUA foarte muli oameni conduc cu viteze mari n mod frecvent chiar dac nu este necesar asumndu-i diferite grade de risc. Muli aleg s locuiasc la mare altitudine, expunndu-se la nivele ridicate de radiaii cu ultraviolete. Muli oameni locuiesc n orae sau n apropiere, unde aerul adesea conine substane nocive. Totui folosim toate aceste riscuri ele sunt lucruri normale din viaa noastr. Nu ntotdeauna conteaz dac toi sunt contieni de riscurile fumatului i de riscurile pe care le conine sexul neprotejat numeroi indivizi aleg s se implice n aceste comportamente de nalte riscuri. Ali fac tot ce le st n putin s evite aceste riscuri necesare. Cum ar trebui societatea s manevreze aceste riscuri cnd sunt att de diferii indivizi responsabili?

113