Biomedicina y Ciencias de la Salud

INFLAMACIN E HIPOXIA: MECANISMOS IMPLICADOS EN PROTECCIN O DAO TISULAR

INFLAMACIN-CM

http://www.inflamacion.net

PROGRAMAS DE ACTIVIDADES DE I+D DE LA COMUNIDAD DE MADRID

| RESUMEN|
La inflamacin es un proceso fisiolgico crtico durante el desarrollo de infecciones. Adems, tambin se producen procesos inflamatorios en numerosas patologas, que abarcan desde enfermedades cardiovasculares a tumores. El microentorno de los focos inflamatorios presenta bajos niveles de oxgeno as como bajos niveles de citoquinas inflamatorias. El factor de trascripcin inducible por Hipoxia (HIF) se regula en respuesta a hipoxia as como en respuesta a mediadodores inflamatorios. A su vez la induccin de este factor resulta crtico para la adecuada funcin de las clulas implicadas en la respuesta inflamatoria en entornos hipxicos. Los distintos grupos de investigacin que formamos el Programa INFLAMACION tenemos un inters comn en el Papel de la Hipoxia en el Contexto de la Inflamacin. Nuestros objetivos se centran en investigar los mecanismos que correlacionan la induccin de HIF en hipoxia y otras seales activadas durante la inflamacin para garantizar la adecuada respuesta en los procesos inflamatorios. Investigamos por otro lado como la induccin sostenida de HIF-1 en condiciones inflamatorias puede contribuir al desarrollo de tumores.

| L N E A S D E T R A BA J O D E S TAC A DA S |
1. Hipoxia en Procesos Inflamatorios (M.Ortz de Landzuri).
HIF 1

miRNA

Step 2.: Stem-loop RT

7 6 miRNA rno-miR-101a rno-miR-127 rno-miR-129* rno-miR-154 rno-miR-28 rno-miR-376b rno-miR-223 control vs hipoxia 1 1,16 1 1 1,27 1,33 1 hipoxia vs reoxigenacin 2,63 2,46 2,13 8,03 1,90 6,70 -1,91 5 4 3 2 1 0 1 PR CC HYP R3H R6H

mR-101a mR-127 mr-376b

HIF 1

Oxigen

Oxigen
Step 2.: Real=time PCR

HIF 1

HIF 1

VHL Ubiquitin/Proteosome Degradation ARNT

VHL

Ubiquitin/Proteosome Degradation
Angiogenesis RCB Increase Anaerobib metab.

F1

VEGF EPO LDH

Figura 5. Identificacin de miRNAs. Mediante arrays de expresin se han identificado miRNAs que estn inducidos diferencialmente en condiciones de isquemia/reperfusin mimetizadas in vitro. Adems, mediante ensayos de stem-loop PCR se confirm la expresin de algunos de los miRNAs identificados mediante los arrays.

HIF response element

Figura 1. Papel de HIF en Normoxia e Hipoxia.

HIF response element

La respuesta celular a la hipoxia que se presenta en muchas situaciones (procesos tumorales, inflamacin, isquemias, etc) es regulada por un gen maestro el cual codifica para el factor de transcripcin denominado HIF (hypoxia inducible factor). Este factor de transcripcin en condiciones de normoxia es hidroxilado (por una familia de enzimas llamadas prolil hidroxilasas) y degradado por va proteosoma, por tanto sus niveles de expresin son inexistentes. Sin embargo en condiciones de hipoxia, las prolil hidroxilasas no son funcionales (por ello han sido consideradas los sensores celulares de oxgeno) y por tanto no son capaces de hidroxilar a HIF, el cual escapa a la va de degradacin y se acumula, induciendo un programa gnico de angiognesis, cambios metablicos, etc.

HI

| SOCIOS|
Coordinador general

2. Desarrollo de una estrategia teraputica basada en la interferencia con la angiognesis y la estabilizacin de HIF (Luis del Peso y Benilde Jimnez).

3. Sealizacin por lpidos. (I.Mrida).

NT

5. Modulacin de las respuestas inflamatorias y fibrticas renales por retinoides y prostaglandinas: papel del factor inducible por hipoxia (HIF) (J. Lucio).

MANUEL ORTZ DE LANDZURI (Hospital Universitario de la Princesa) Tcnico de gestin CAROLINA EGEA MILLET Socios Grupo HP (Hospital Universitario La Princesa) Seccin de Inmunologa Coordinador: MANUEL ORTZ DE LANDZURI Grupo UAMa (Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Medicina) Departamento de Bioqumica Coordinador: LUIS DEL PESO OVALLE Grupo UAMb (Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Medicina) Departamento de Bioqumica Coordinador: BENILDE JIMNEZ CUENCA Grupo HRC (Hospital Ramn y Cajal) Coordinador: LAURA GARCA BERMEJO

Figura 6. Expresin de HIF-1 en biopsias humanas post-transplante. Inmunohistoqumica de HIF-1 sobre tejido renal humano procedente de biopsias a pacientes trasplantados embebido en parafina. Obsrvese que HIF-1a se localiza en ncleo de clulas proximales tubulares que no manifiestan signos de dao y/o muestran signos de reparacin tras dao isqumico, confirmando que HIF-1 participa en la supervivencia y/o reparacin de dao tubular tras I/R y que puede constituirse como una diana de actuacin teraputica para la mejora de evolucin del injerto renal tras el transplante.

| INFRAESTRUCTURA CIENTIFICO-TECNOLGICA Y SERVICIOS|

Figura 2. Terapia Antiangiognica El objetivo de esta lnea es el desarrollo de una estrategia teraputica en la que se combina la accin de estrategias antiangiognicas (pptido antiangiognico ABT510 y terapias anti-VEGF) y de adenovirus replicativos condicionales cuyo ciclo ltico es estrictamente dependiente de la estabilizacin de HIF en respuesta a la hipoxia tumoral (AdE1A9xHRE). Figura 3. Generacin de diacilglicerol en la sinapsis inmunolgica. Clulas T transfectadas con una construccin que codifica el dominio de interaccin con diacilglicerol de la PKC fusionado a la protena verde fluorescente GFPC1bPKC se ponen en contacto con clulas B cargadas con superantgeno. La redistribucin del sensor para diacilglicerol en la zona de contacto permite determinar la acumulacin de este lpido en la sinapsis inmunolgica.

Grupo HP- Manuel Ortiz de Landzuri Gran Cabina de Hipoxia. Sistemas de Nucleofeccin de Clulas primarias. Sistema de separacin y aislamiento celular de tejidos.

zacin de microciruga, laparoscopia quirrgica o electrofisologa en roedores, conejos y cerdos. Microscopio confocal Leica TCS-SL (3 lseres y 5 lneas). Cmara de Perfusin para realizar experimentos semi-in vivo. Grupo HRC- Laura Garca DNA Microarray Scanner (Agilent) y Agilents Feature Extraction Software v9.5. PCR cuantitativa con sistema Stem loop (Applied Biosystems) Cmara de hibridacin.

www.madrimasd.org

Grupo UAH (Universidad Alcal de HenaresFacultad de Medicina) Departamento de Fisiologa Coordinador: JAVIER DE LUCIO CAZAA Grupo CNB (Centro Nacional de Biotecnologa (CNB - CSIC)) Departamento de Inmunologa y Oncologa (DIO) Coordinador: ISABEL MRIDA SAN ROMN Pharmamar Coordinador: LUS FRANCISCO GARCA Abbott Coordinador: JACK HENKIN Pfizer Coordinador: ANTONIO MARTN CENTENO (Jefe Dep. Oncologa)

4. Estudio del papel de HIF-1 en el desarrollo del dao tubular tras la isquemia renal y su reparacin: nuevas aproximaciones teraputicas para el FRA y el transplante renal. (L. Garca Bermejo)

Grupo UAMa- Luis del Peso Equipo IVIS-lumina (Caliper-Xenogen): monitorizacin no invasiva del crecimiento tumoral y la respuesta teraputica en modelos de ratn. Grupo UAMb- Benilde Jimnez

Ratas: Machos Sprague Dawley 180-200g

Sangre

Ratones: Machos C57/BL6 180-200g

PROCEDIMIENTO QUIRRGICO

Sham

R-24 h

champaje: rata 45 mn. ratn 30 mn. Isquemia quirgica

Reperfusin Orina 24h

1. Preparacin ligadura del pedculo cascular

Determinacin de dao tubular tras I/R en rata por tincin con cido perydico de shift (PAS). Obsrvese desaparicin de microvellosidades apicales y aparicin de cilindros taponando los tbulos. Su correlacin con el aumento de urea y creatinina en suero como parmetros de dao funcional (panel inferior).

Grupo CNB- Isabel Mrida Animalario de nivel de bioseguridad 2 para experimentacin con ratones inmunodeprimidos y el uso de estrategias teraputicas basadas en adenovirus replicativos condicionales. Grupo UAH- Javier de Lucio Servicio de Inmunomarcaje. Sombreado de DNA y complejos DNA-protena. Criomicroscopa de liposomas.

2. Champaje bilateral

Sacrificio

0 h. a 7-14 das de reperfusin

3. Reperfusin

Figura 4. Determinacin de dao tubular tras isquemia/reperfusin en rata.

Sistemas de alojamiento bajo barrera biosanitaria (SPF-Specific Pathogen Free), equipamiento necesario para la reali-

Diseo de estrategias de inmunizacin, preparacin de inmungenos y anlisis de respuesta inmune de animales de experimentacin.

| P U B L I C AC I O N E S Y PAT E N T E S R E L E VA N T E S |
Publicaciones
Nuria Isabel Fernndez-Garca, Olga Volpert and Benilde Jimnez. Pigment epithelium-derived factor as a multifunctional anti-tumor factor. Journal of Molecular Medicine 85(1):15-22 (2007). Villar D, Vara-Vega A, Landzuri MO, Del Peso L. Identification of a region on hypoxia-inducible-factor prolyl 4hydroxylases that determines their specificity for the oxygen degradation domains. Biochem J. 2007 Dec 1;408(2):23140. Alonso R, Mazzeo C, Merida I, Izquierdo M. A new role of diacylglycerol kinase alpha on the secretion of lethal exosomes bearing Fas ligand during activation-induced cell death of T lymphocytes:Biochimie. (2007) Feb;89(2):21321. Merida I. and Carrasco S. Diacylglycerol, when simplicity necomes complex. Trends in Biochemical Science (2007) Jan;32(1):27-36 Rincn E, Santos T, Avila-Flores A, Albar JP, Lalioti V, Lei C, Hong W and Mrida I.Proteomic identification of sorting gnexin 27 as a diacylglcyerol kinase zeta-associated protein: new diacylglcyerol kinase roles in endocytic recycling. Mol Cell Proteomics.(2007) Jun;6(6):1073-87 Fernandez-Ulibarri I, Vilella M, Lazaro-Dieguez F, Sarri E, Martinez SE, Jimenez. N, Claro E, Merida I, Burger KN, Egea G. Diacylglycerol Is Required for the Formation of COPI Vesicles in the Golgi-to-ER Transport Pathway.Mol Biol Cell. (2007 ) Sep;18(9):3250-3263. Matilde Alique, Francisco Javier Lucio-Cazaa, Victoria Moreno, Qihe Xu, Tsuneo Konta Kenji Nakayama, Akira Furusu Juan C Sepulveda, Masanori Kitamura. Pharmacology. Up-regulation of cyclooxygenases by retinoic acid in rat mesangial cells. Vol: 79. Pginas: 57-64. 2007 Patricia Reyes-Martina, Matilde Aliquea, Trinidad Parrab, Jaime Perez de Hornedob, and Javier Lucio-Cazana,*.Cyclooxygenase-independent inhibition of h2o2-induced cell death by s-ketoprofen in renal cells. Pharmacol Res. Vol: 55.Pginasl: 295-302.2007 Matilde Alique, Juan F Herrero, Francisco J de Lucio-Cazana. All-trans retinoic acid induces COX2 and prostaglandin E2 synthesis in SH-SY5Y human neuroblastoma cells: involvement of retinoic acid receptors and extracellular-regulated kinase 1/2. Journal of Neuroinflammation.Volumen:4:I doi:10.1186/1742-2094-4-1.2007 Mara Marta Escribese, Elisa Conde, Ana Martn, David Senz-Morales, David Sancho, Guillermo Prez de Lema, Javier Lucio-Cazaa, Francisco Snchez-Madrid, Mara Laura Garca-Bermejo* and Francisco Mampaso. * corresponding author. Therapeutic effect of all-trans-retinoic acid (at-RA) on an autoimmune nephritis experimental model: role of the VLA4 integrin.BMC Nephrology. 8: 3, 2007 Mara Marta Escribese, Elisa Conde, David Senz-Morales, Meter L Hordijk, Francisco Mampaso and Mara Laura GarcaBermejo*.Leukocyte extravasation in an inflammatory response is abrogated by all trans retinoic acid through inhibiting the acquisition of an appropriate migratory phenotype.J. Leukoc Biol. 2007. Maria L. Alcaide, Alicia Vara-Vega, Luis F. Garca-Fernndez, Manuel O. Landzuri and Luis del Peso. A yeast three-hybrid system that reconstitutes mammalian Hypoxia Inducible Factor regulatory machinery. BMC Cell Biology 2008. In press.

Patentes
Inventores (p.o. de firma): Isabel Mrida, Ernesto Merino, Naokai Saito. Ttulo: Procedimiento de diagnstico de enfermedades del sistema inmune y compuestos tiles para el tratamiento de las mismas. N. de solicitud: P200701552. Pas de prioridad: Espaa. Fecha de prioridad: Jun 07. Entidad titular: CSIC.