1.

MATERIAL DE LABORATORIO, ESTERILlZACION

PREPARACION y

La primera parte de esta gu a tiene por objeto conocer el material indispensable de uso habitual en un laboratorio de Microbiologa, y la preparacin del material para su esteri lizacin. A continuacin damos a Ud., una lista de los princi.pales materiales que se uti lizan: a)
MATERIAL DE VIDRIO Y PORCELANA

Tubos (ensayo - hemlisis - centrfuga) - Campanas de Durham - Placas de Petri - Matraces (Erlenmeyer Kitasato - Monod) Perlas de vidrio - Morteros - Cups Desecadores - Buretas - Probetas - Embudos - Vasos de precipitado - Cubreobjetos - Portaobjetos (rectos excavados o clu la de Kaeli) Pipetas (graduadas aforadas - Kahn - Pasteur) Vidrio reloj - Pesa sustancias Esptulas - Asas de Drigalsky - Jeringas - etc. b) ~MATERIAL DIVERSO Gradillas-:'--CestifTs - Asas de platino - Mecheros Bunsen Trpodes - Rejillas de amianto - Bateras de colorantes Papeles - (indicador de pH - filtro - de envolver) Termmetro. Algodn hidrfobo e hidrfilo - Filtros Millipore - Archivador de preparaciones - Cubetas (cementerios ). c) AEAB-AIOS Autoclave - Horno Pasteur - Estufa de cultivos - Centrfuga ,Mlc_roscopios - pH metro - Balan za - Aparato de destilacin Refrigerador - Espectroftmetro (Nefelmetro) - Shaker Contador de colonias Quebec - Bao mara - Rotador de vaco - etc .

__

Existen diversos equ ipos cuyas especificaciones pueden ser consultadas en los catlogos de las casas comerciales. d) MATERIALES DE LIMPIEZA Escobillones - Ollas esmaltadas - Lavador de pipetas Detergentes - Jabn - Mezcla crmica - etc.

PROCESOS DE ESTERILIZACION

Consiste en la preparacin y esterilizacin del material de cu Itivos, para dejarlos en condiciones de uso.
a) PIPETAS

y medios

Se les coloca un trozo de algodn que acta de filtro. someten a calor seco a 180 a una o en pipeteros.
b) PLACAS PETRI
0

Se de

por 1 2 horas, envueltas

Se envuelven en papel y se esterilizan en Horno Pasteur.

e) MATRACES

a 1800 C por 1 2 horas

Erlenmeyer, frascos, tubos, morteros. Se tapan con algodn y se someten a calor seco a 1800 C por 1 a 2 horas.
I

d) BUJIAS FIL TRANTES

Se someten a ebullicin en hervidores desinfectan con desinfectantes.

TECN/CAS DE ESTERIL/ZACION

metlicos,

o bien se

I I

Seco

{ Flameado H. Pasteur

(asas - pinzas - etc.) (material Autoclave de vidrio) (medios de cultivo) ( portaobjetos) (medios azucarados)

CALOR Mtodos Corrientes Hmedo Mtodos Especiales

Ebullicin

Vapor fluente

Tindalizacin

(medios especiales)

16

FILTRACION Diversos filtros (medios lquidos termolbiles). RADIACIONES

Para esterilizar medios lquidos y Rayos U. V. corrientes de aire.

PROCEDIMIENTOS QUIMICOS

Sales Acidos y Bases Halgenos Alcohol,etc.

Para esteri lizar.material quirrgico y as~de Drigalsky.

Nota.
HORNO PASTEUR

Esteriliza a calor seco: 1800 C por 1 - 2 horas todo el material de vidrio. Ej: pipetas, tubos de ensayo, matraces, placas de Petri, etc.
AUTOCLAVE

Esteriliza a calor hmedo: 1200 C (1 atm) por 20 - 30 minutos, los medios de cultivos y material contaminado. Ej: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, placas y pipetas contaminadas, etc. Anote en los pagodel equipo las diversas indicaciones para su uso, de acuerdo a los catlogos de las diferentes marcas.

17

LAMINA

8
7. Tubo de ensayo 2. Tubo de ensayo con tapn 3. Tubo de Centrfuga 4. Campana de Durham 5. Placa de Petri 6. Matraz Erlenmeyer 7. Matraz Kitasato y equipo de filtro 8. Matraz Monod

LAMINA 2

00
9

OQ

10
(

11

12

13

21
18

9. Perlas de vidrio 10. Mortero de porcelana 11. Placa de Petri con pocillos o "cups" 12. Bureta graduada 13. Embudo de vidrio 14. Vaso de precipitado 15. Cubreobjetos 16. Portaobjetos 17. Pesa sustancias 18. Esptula de vidrio 19. Asa de Digralsky 20. Jeringa 21. Vidrio reloj

..

LAMINA

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22

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23 22. 23. 24. 25. 26. ""27. Desecador Bureta Pipeta de bola Pipeta de Kahn Pipeta Pasteur Pipeta Graduada

24

25

26

27

LAMINA 4

29

30

31

32

JI
. .

33

28. 29. 30. 31. 32. 33.

Gradilla para tubos Cestillo Asa de platino-Mechero Bunsen Trpode Rejilla

LAMINA

34

35

37

36

\34. '35. 36. 31.

Batera de colorantes Cubeta (cementerio) Cmara para anaerobios Cubeta para preparaciones

LAMINA 6

Microscopio compuesto

LAMINA 7

Microscopio electrnico

LAMINA

0
Autoclave

LAMINA 9

Horno de Pasteur

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LAMINA 12

Destilador de Agua

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Espectrofotnnetro

LAMINA

14

Contador de Colonias

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2. MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE CULTIVO.

Es aquel que contiene las sustancias nutritivas para el desarrollo de los microorganismos. Pueden prepararse en estado slido o lquido.
CULTIVO

necesarias

Es el desarrollo

activo de microorganismos

en medios nutritivos.

CLASIFICACION

DE LOS MEDIOS

DE CULTIVOS

Los medios de cultivos empleados para cultivar bacterias u otros organismos pueden ser clasificados segn su composicin qu mica o )-u aplicacin:

a)

COMPOSICION

QUIMICA O NO SINTETlCOS

1. MEDIOS NATURALES

Son aquellos que estn compuestos por ingredientes de composicin qu mica desconocida. Ej: infusiones de carne, extractos de carne o levadura, etc.
2. MEDIOS ARTIFICIALES O SINTETlCOS

Son aquellos que estn compuestos por ingredientes de composicin qu mica conocida. Ej: medios orgnicos e inorqnicos, etc.

APLlCACION DE CRECIMIENTO

~. MEDIOS

Son aquellos que contienen normalmente las sustancias nutritivas necesarias para el buen desarrollo de los microorganismo Se utilizan para la mantencin de cultivos y recuentos.

35

Ej

Agar y Caldo nutritivo Agua peptonada Agar sangre

2. MEDIOS SELECTIVOS

Son aquellos que contienen sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos que se deseen aislar, y otras que inhiben el crecimiento de los que no se desean. Se utilizan para aislar tipos especiales de organismos y recuentos. --------Ej : Chapman Stone Agar (Aislamiento de Stephylococcus Agar de eosina y azu I de metileno (Aislamiento de cotiforrnesl. Wright Agar (Aislamiento de Rhizobium)
3. MEDIOS DETERMINATIVOS

Son aquellos que tienen una sustancia nica o un g~?e sustancias en un substrato que mantenga el crecimiento del microorganismo. Se utilizan para determinar las propiedades fisiolgicas y bioqu micas de los organismos. Ej : Koser citrato (utilizacin de citrato, como nica fuente de carbono) Agar Christensen (Deteccin de ureasa) T.S.!. Agar (Deteccin de H2S)

NOTA: En el apndice aparece la composicin y preparacin de los medios de cultivo ms usuales. En los manuales sobre medios que aparecen en la bibl iograf a, puede encontrarse una gran variedad.

36

3. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

SIEMBRA

Es la operacin que consiste en depositar un germen aspticamente en un medio de cultivo. A partir de este primer medio sembrado, el pase a sucesivos medios de cultivos se llama Resiembra. Las siembras pueden hacerse: I " "1 IV De medios slidos a slidos De medios lquidos a lquidos De medios lquidos a slidos. De medios slidos a lquidos

TECNICAS

DE RESIEMBRA

DE MEDIOS SOLIDOS

A SOLIDOS INCLINADO:

a) EN TUBO DE AGAR

1. Rotule el tubo con los datos correspondientes

(microorganismo, fecha, nombre o grupo) . 2. Flamee el asa para su esterilizacin. 3. Enfre el asa en las paredes internas del tubo o en el lquido de condensacin. 4. Torne un inculo del tubo problema. 5. Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril. 6. Destape el tubo estril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes hasta el fondo. Ascienda el asa imprimindole un movimiento de zig-zag tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper ni arrastrar agar. 37

7. 8. 9.

Flamee la bo ca del tubo y tpela. Flamee el asa para su esterilizacin. Incube el tubo sembrado a la temperatura de los resuitados .

adecuada.

10. Lectura e interpretacin

.. b) EN PLACA DE PE TRI:

.,

1. Rotu le la placa con los datos correspondientes. 2. 3. 4. 5. 6.

I.S~

7. 8. 9.
e)

Flamee el asa para su esterilizacin. Enfre el asa en las paredes internas del tubo o en el I~::; de condensacin. Tome un inculo del tubo problema. Efecte la resiembra del tubo problema a la placa de Petri estril. Levante la tapa de la placa, lo necesario para introducir el asa. Imprima al asa un movimiento de zig-zag, tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper ni arrastrar agar. Tape la placa, y flamee el asa para su esterilizacin. Incube la placa sembrada a la temperatura adecuada. Lectura e interpretacin de los resultados .
EN TUBO DE AGAR RECTO (POR PICADURA)

1. Rotu le el tubo con los datos correspondientes. 2. Flamee el asa recta para su esterilizacin. 3. Enfre el asa en las paredes internas o en el lquido de condensacin. 4. Tome un inculo del tubo problema. 5. -Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril. 6. Destape el tubo estril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. Retire el asa con precaucin para producir la menor rotura posible. 7. Flamee la boca de I tu bo y tpe lo. 8. Flamee el asa para su esterilizacin. 9. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. 10. Lectura e interpretacin de los resultados. ,

~ 11 DE MEDIOS LIQUIDaS A LIQUIDaS

a) CON ASA

1. Rotule 38

el tubo con los datos correspondientes.

2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9.

10. 11.
b)

Homogenice el tu~0_E!9-!ema. Flamee el asa para su esterilizacin. Enfre el asa en las paredes internas del tubo. ( Tome un inculo del tubo problema, procurando que I quede u na pel cu la en el asa. Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril. Destape el tubo estril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, agtela en el medio de cultivo y retrela con cu idado. Flamee la boca del tubo y tpela. Flamee el asa para su esterilizacin. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. Lectura e interpretacin de los resultados .

CON PIPETA PASTEUR

1. Rotule el tubo con los datos correspondientes. ' 2. Confeccione una pipeta Pasteur estril y mantngala al lado del mechero. 3. HClmogenice el tubo problema. 4. Tome con la pipeta Pasteur un volumen pequeo del tubo problema. 5. Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril. 6. Destape el tubo estril y vierta en l el contenido de la pipeta Pasteur, sin introducir sta en el medio de cultivo. Retrela con cuidado. 7. Flamee la boca del tubo y tpela. 8. Deje la pipeta Pasteur esterilizada en la solucin desinfectante. 9. Homogenice el tubo sembrado e incbelo a la temperatura adecuada.

'111 DE MEDIOS a) CON ASA

LlQUIDOS

A SOLIDOS

1. 2. 3. 4. 5.

Rotu le el tub-o con los datos correspondientes. Homogenice el tubo problema. Flamee el asa para su esterilizacin. Enfde el asa en las paredes del tubo. Tome un inculo del tubo problema, procurando que quede una pelcula en el asa. 6. Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril.

7. Destape el tubo estril e introduzca e~ asa cargada sin tocar TiK paredes hasta el fondo. Ascienda.el.asa imprimindole un movimiento de zig-zag, tocando superficialmente el medio_9_g~ cu Itivo, procura ndo no romper ni arrastrar agar. 8. Flamee la boca del tubo y tpela. 9. Flamee el asa para 'su esterilizacin. 10. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada.
b) CON PIPETA PASTEUR (SIEMBRA EN SUPERFICIE)

1. Rotu le la placa con los datos correspondientes. 2. Confeccione una pipeta Pasteur estril y mantngala al lado del
mechero.

3. Homogenice el tubo problema. 4. Tome con la pipeta Pasteur un volumen

problema. 5. Efecte la resiembra del tubo problema estri 1.

pequeo del tubo a la placa de Petri la

6. Levante la tapa de la placa lo necesario para introducir

7. 8. 9.
10.

11.

12.
e)

pipeta Pasteur. Vierta el contenido de la pipeta en el centro de la placa, sin tocar el medio de cultivo. Tape la placa y deje la pipeta Pasteur en el cementerio. Flamee el asa de Drigalsky. Enfre el asa en la cara interna de la tapa de la placa. En seguida coloque el asa en la superficie del medio de cultivo, e imprmale un ligero movimiento de derecha a izquierda y vice-versa para distribuir el inculo en la superficie. Tape la placa e introduzca el asa en solucin desinfectante. Incube la placa sembrada a la temperatura adecuada.
CON PIPETA PASTEUR A PLACA (SIEMBRA EN PROFUNDIDAD)

1.

Rotule

la placa con los datos correspondientes.

Q

2. Funda el agar y djelo enfriar a 50 C (temperatura

que se resiste en la palma de la mano sin tener la sensacin de quemarse). 3. Siembre en este tubo y a esa temperatura 0,5 a 1 mi del inculo, Que ha recogido con la pipeta. Homogenizar por giro rotatorio, tre las palmas de la mano, y vierta en la placa de Petri.

4. Reparta uniformemente so idificar.

el agar sembrado en la placa, y djelo desinfectante.

5. a pipeta debe sumergirla en la solucin 6. Incube a la temperatura adecuada. 40

7. Lectura e interpretacin de los resultados (observe las colonia: que se desarrollan en la superficie y en la masa del agar) .

IV a)

DE MEDIOS SOLIDOS

A LIQUIDaS

EN TUBO

1. Rotule el tubo con los datos correspondientes. 2. Flamee el asa para su esterilizacin. 3. Enfre el asa en las paredes internas del tubo o en el lquido d condensacin. 4. Tome un inculo del tubo problema. 5. Efecte la resiembra del tubo problema al tubo estril. 6. Destape el tubo estril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes. Agtela en el medio de cultivo, golpeando ligeramente contra las paredes del tubo, para que se desprenda el inculo. Retire el asa con cuidado. 7. Flamee la boca del tubo y tpelo. 8. Flamee el asa para su esteri lizacin .. 9. Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

LAMINA 17

Tcnicas de Resiembra.

Agitar para homogeneizar

Flamear el asa hasta el rojo vivo.

LAMINA 18

Destapar el tubo sosteniendo el algodn en el dedo meique y flamear la boca del tubo.

Enfriar el asa en las paredes del tubo y sacar un loop.

LAMINA 19

Flamear la boca del tubo.

Taponar el tubo y sembrar.

LAMINA 20

Siembra de slido a slido en tubo.

LAMINA 21

Siembra de slido a slido en Placa de Pe tri.

LAMINA 22

Siembra de slido a slido por picadura.

LAMINA 23

I
11 1I

'~

Siembra de liquido a liquido con asa.

LAMINA 24

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11\

1\

Siembra de lquido a lquido con pipeta Pasteur.

LAMINA 25

l'

Siembra de lquido con asa.

a slido

LAMINA

26

Siembra de lquido a slido (Placa) con pipeta.

Nota: En cada uno de los procedimientos se debe flamear el asa y tubo como en las lminas 17,18 y 19. Las pipetas usadas deben depositarse en el cementerio.

LAMINA

27

Licuar el agar nutritivo a 50 C, 20 mi/e, placa de 10 cm.

Agitar el inculo y flamear la boca de los tubos y asa.

Inocular a partir del cultivo.

Flamear la boca de los tubos

y asa.

Siembra en profundidad.

LAMINA 28

Taponar los tubos.

Agitar el tubo inoculado.

Siembra en profundidad.

LAMINA 29

Flamear la boca del tubo.

Vaciar

2 tubos

por placa.

Siembra en profundidad.

4.0BSERVACION

DE BACTERIAS

Las bacterias, por su tamao, pueden ser observadas nicamente con ayuda del microscopio. Se pueden observar vivas, mediante las coloraciones vitales o la tcnica de la gota pendiente; y muertas mediante las tinciones, previamente fijadas. Las coloraciones vitales o la tcnica de la gota pendiente, permiten el estudio de la morfologa bacteriana, en vivo, por lo que conservan rasgos fundamentales, como la movilidad. Las tinciones permiten el estudio de la mortoloqa de las bacterias muertas, y tienen la ventaja de que pueden ser conservadas, permitiendo observarlas cuando se desee.
OBSERVACION DE BACTERIAS VITALES VIVAS:

a) COLORACIONES b) GOTA PENDIENTE a) COLORACIONES

V/'rALgs_,

Consisten en soluciones diluidas de diversas sustancias que impregnan las bacterias sin llegar a inmovilizarlas. Ej : Azul de metileno, azul de nilo, rojo neutro, etc. (todas Son soluciones acuosas al 0,05 %).
TECNICAS:

un portaobjeto limpio (sin grasa) coloque con el asa una muestra del cultivo lquido a estudiar. l ejcultivo es slido, debe poner previamente una gota de suero fisiolgico o agua destilada estril, en la que se diluirn las bacterias. - Luego aada una pequea cantidad de tal manera que difunda en ella. - Observe al microscopio. (una gota) de colorante,

- En

55

b) GOTA PENDIENTE

Por esta tcnica se pueden observar las bacterias en vivo, con o sin coloracin.
TECNICAS:

- Tome un cubreobjeto_limpio

(sin grasa).

"<; colquela

- Tome con el asa una muestra de cultivo lquido a estudiar y cuidadosamente en el centro del cubreobjeto. Si el cultivo es slido diluya antes con suero fisiolgico o agua desti lada estr i 1. - Si lo desea puede aadir una gota de colorante una pipeta Pasteur. con el asa o

- En seguida coloque vaselina slida en el portaobjeto excavado o clula de Kaeli formando un cuadrado (del tamao del cubreobjeto). - Luego coloque el portaobjeto excavado sobre el cubreobjeto que ten a la gota, y presione suavemente para que la vaselina slida forme un sello. - D vuelta el portaobjeto concavidad, y observar que la gota cuelga en la

- Observe al microscopio con inmersin poniendo el aceite de cedro directamente sobre el cubreobjeto donde se encuentra la gota.

OBSERVACION - TlNCIONES

DE BACTERIAS

MUERTAS

(FIJADAS)

Las tinciones pueden ser a) Simples (Tincin cristal violeta) b) Compuestas (Tincin Gram) e) Especiales (Tincin de esporas) Todas las tcnicas de Tincin exigen pasos que son fundamentales: Preparacin del frotis, Fijacin y Tincin propiamente tal.
PREPARACION DEL FROT/S :

Sobre u portaobjeto limpio (sin grasa) coloque con una pipeta Paste r una gota. de cultivo puro, si es I Iquido.-v extindala en forma delgada sobre l. Si el cultivo es slido, diluya 'en una gota de suero fisiolgico o agua destilada estril, y extindala sobre el 56

BFRNARDO
portaobjeto. Deje que la pel cula de cultivo lado del mechero Bunsen,

PARRA

seque con el aire, al

FIJACION : El frotis bien seco, se somete a la accin de la llama del mechero, flamendolo dos o tres veces, por la cara donde se encuentra el frotis. TlNCION: Tiene por objeto fijar el colorante resista la accin del lavado. TINCION SIMPLE: - Haga un frotis y fjelo

a las bacterias de manera que

a la llama. del frotis con cristal violeta,

- Cubra totalmente la superficie durante un minuto. - Lave el frotis

con agua dejndola

escurrir.

- Squelo al aire. - Observe al microscopio con inmersin, cedro directamente sobre el frotis. " TINCION GRAM: - Haga un frotis y fjelo a la llama. con cristal violeta, durante un colocando el aceite de

- Cubra la superficie minuto. - Lave el frotis

del frotis

con agua dejndola del frotis

escurrir. un minuto.

- Cubra la superficie

con lugol, durante

- Lave con agua dejndola - Cubra la superficie

escurrir. con alcohol, durante un minuto.

del frotis

- Lave con agua dejndola - Cubra la superficie

escurrir. con safranina, durante 10 segundos.

del frotis

- Lave con agua dejndola - Squelo al aire. - Observe al microscopio

escurrir.

con inmersin.

57

R ESUL TADOS :

Azul Rojo

Bacterias Gram : Bacterias Gram

ESPORAS:

(+) (-)

TINCION

- Haga un frotis

y f je lo a la llama.

- Cubra la superficie del frotis con papel filtro y agrguele verde malaquita. Mantenga el portaobjeto flamendolo constantemente sobre la llama del mechero, de manera que el colorante se evapore lentamente, y aada peridicamente evitar que se seque, durante diez minutos. - Lave el frotis con agua dejndolo del frotis escurrir. bsica, durante un colorante para

- Cubra la superficie minuto. - Lave el frotis

con fucsina

con agua dejndolo

escurrir.

- Squelo al aire. - Observe al microscopio

RESUL TADOS:

con inmersin.

Las esporas sern teidas de verde y el resto de la clula de rojo,

58

LAMINA 30

Tincin de Gram.

------Igl----

Cristal Violeta, 1 minuto

Lavar con agua.

LAMINA

31

Lugol, 1 minuto

Decolorar con alcohol.

LAMINA 32

Lavar con agua.

Safranina,

10 seg.

LAMINA

33

-~--~-._--

Lavar con agua.

Secar la preparacin

5. AISLAMIENTO

DE MICROORGANISMOS

Consiste en la separacin de dos o ms microorganismos de una muestra determinada, hasta obtener cultivos puros de ella. Esta operacin es imprescindible para poder estudiar las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de una bacteria, y lograr as su identificacin. Para estudiar un cultivo mixto de microorganismos, del cual se aislan cada uno de los componentes, deben desarrollarse las sigu ientes tcnicas:
, I AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO EN PLACA:

1. 2. 3. 4.

5. 6.

7.

8.

Prepare tres placas de Agar nutritivo. Rotule las placas con los datos correspondientes. Homogenice el tubo con cultivo mixto. Con el asa tome una muestra del cultivo mixto y siembre por estra la primera placa. Sin cargar el asa nuevamente siembre por estra la segunda y tercera placa. Incube las placas sembradas a la temperatura adecuada. Despus de algunas horas o das deber observar estas placas y anotar las caractersticas morfolgicas de las colonias que se han desarrollado, de acuerdo a la pauta adjunta. Adems deber efectuar tincin Gram de cada una de las colonias desarrolladas. Luego siembre por estra en tubos de Agar inclinado muestras de las colonias que ha aislado e incbelos a la temperatura adecuada. Posteriormente, deber realizar tinciones Gram de los tubos sembrados para verificar la pureza del cultivo .

II AISLAMIENTO POR DILUCION :

1. Prepare una placa de Agar nutritivo. 2. Rotule la placa (anverso) y divdala en cuatro partes iguales.
63

3. Con la muestra de microorganismos haga diluciones sucesivas en cuatro tubos que contengan 9 mi de suero fisiolgico estril. Proceda con la muestra problema. Tome 1 mi de ste y vacelo al primero de los tubos con suero fisiolgico estril. Homogenice bien. De este tubo tome 1 mi y traspselo al segundo tubo con suero fisiolgico estril. Homogenice bien, y as sucesivamente hasta obtener diluciones de

10-1,

10-2,

10-3,

10-4.

4. Siembre por estras en la placa, muestras de cada una de las diluciones preparadas. 5. Incube la placa sembrada a la temperatu ra adecuada. 6. A continuacin debern seguir los puntos 6, 7 y 8 de la tcnica anterior.

64

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6.' BIOQUIMICA BACTERIANA

Las pruebas bioqumicas sirven para detectar alguna propiedad fisiolgica o bioqu mica de un microorganismo con el fin de aportar datos para su identificacin. Estas pruebas pueden dividirse en los siguientes grupos:
A. PRUEBAS RELACIONADAS CON PROTEINAS, AMINOACIDOS

OTROS COMPUESTOS
&'

NITROGENADOS.

1. Hidrlisis de la gelatina 2. Hidrlisis de la caserna 3. Hidrlisis de suero coagulado 4. Produccin de indol a partir de triptfano 5. Produccin de amonio a partir de peptona o arginina 6. Produccin de H2S. 7. Produccin de amonio a partir de urea ( deteccin de masa). 8. Reduccin de nitrato 9. Accin microbiana sobre la leche.
B. PRUEBAS RELACIONADAS CON CARBOHIDRATOS y OTROS

COMPUESTOS CARBONADOS.
!'.
i

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Hidrlisis de almidn Produccin de gas a partir de lactosa Produccin de cido a partir de lactosa (Test de Rojo Metilo) Prueba de Voges - Proskauer ( deteccin de acetona) Utilizacin de citrato como nica fuente de carbono Produccin de polisacrido a partir de sacarosa Accin microbiana sobre la leche
RELACIONADAS CON LlPIDOS y SUSTANCIAS AFINES

C. PRUEBAS

1. Hidrlisis de tributirina

2. Liplisis de grasa de mantequilla, 3. Hidrlisis de compuestos Tween oleico, esterico y laurico). 4. Hidrlisis de lecitina
D. OTRAS PRUEBAS

aceite de oliva y margarina (estres de cidos palmtico,

1. '2. 3. 4. 5.

Test de catalasa Test de oxidasa Test de coagulasa Test de fosfatasa Hemlisis algunas de las ms importantes

A continuacin se desarrollan pruebas bioqu micas.

GRUPO A - HIDROLlSIS DE LA GELA TINA:

Sembrar la bacteria puntos compactos. - Incubar

RESUL
r

problema

en placas de Agar gelatina

por

a la temperatura

ptima

de crecimiento

por 2 - 14 das.

TADO:

Agregue a la placa 1 - 2 mi del reactivo de Frazier.

PRUEBA POSITIVA:

Halo transparente

en torno

a la colonia .

. PRUEBA NEGA TI VA:

Precipitado

de color blanco alrededor

de la colonia.

-PRODUCCION

DE INDOL

A PARTIR

DE TRIPTOFANO

Sembrar la bacteria problema en Caldo peptonado Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 2 - 7 das.
RESULTADO:

Agregue 1 mi de xilol al tubo. Agite. Espere unos 30". Agregue algunas gotas de reactivo de Ehrlich-Kovacs dejndolas xilol.
PRUEBA

resbalar por las paredes del tubo hasta la capa de

POSITIVA:

Coloracin

rojo cereza en la capa de xilol.

70

PRUEBA NEGA nVA:

Ausencia de coloraclon,
-PRODUCCION DE H2S

Sembrar la bacteria problema en tubos de Agar acetato de plomo con asa recta, picando al fondo del tubo y retirndola linealmente por la superficie del agar. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento, por un tiempo de hasta 7 das.
RESULTADO: PRUEBA POSITIVA: Ennegrecimiento del medio PRUEBA NEGATIVA: Ausencia de coloracin

-PRODUCCION DE AMONIO A PARTIR DE UREA

Sembrar la bacteria problema en tubos de Agar de Christensen rea con asa recta, picando al fondo del tubo y retirndolo linealmente por la superficie del agar. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 1 - 7 das.
RESUL TADOS: PRUEBA POSITIVA: Coloracin del medio PRUEBA NEGA TI VA: Ausencia de coloracin

REDUCCION DE NITRATO

Sembrar la bacteria problema en Caldo n itratado Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 2 - 7 das.
RESULTADO:

Agregar 1 mi de los Heactlvos de Griess-Ilosvay's 1 y 2 al tubo.

PRUEBA POSITIVA: PRUEBA NEGATIVA:
GRUPO B
e

Coloracin roja del medio Ausencia de coloracion

-HIDROLlSIS DEL ALMIDON

Sembrar la bacteria problema en placas de Agar a Imidn por puntos compactos. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 2 - 14 das.

 RESUL TADO:

Agregue a la placa 1 - 2 mi de solucin tincin Gram).

, PRUEBA PRUEBA POSITIVA:

de lugol (la empleada en

Halo transparente

NEGA TI VA: Presencia de color

en torno a la colonia. violeta, correspondiente

al

complejo

lugol-almidn.

-PRUEBA

DE VOGES-PROSKAUER

Con esta prueba se detecta la presencia de acetona o aceti Imeti carbinol, intermediario de la formacin del alcohol 2,3 butilen glicol. Sembrar la bacteria problema en Caldo de Clark-Lubs Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 2 - 7 das.
RESULTADO:

1-

Vacie 1 mi del Agregue 0,5 mi 6 %)Y B (sol. Agite el tubo y

cultivo a un tubo de hemlisis de los reactivos A (sol. alcohlica de L-naftol acuosa de KOH al 16 %), luego djelo reposar por 30 minutos. Coloracin roja encarnada del medio Ausencia de coloracin

al

PRUEBA POSITIVA: PRUEBA NEGATIVA:

-PRODUCCION

DE GAS y ACIDOS A PARTIR

DE LACTOSA

Sembrar la bacteria problema en tubos con Caldo lactosado provistos de campanas de Durham. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 2 - 7 das.
RESULTADO:

En caso que haya produccin de gas se apreciar dentro de la Campana de Dorham una burbuja. En caso contrario no hay produccin de gas. Para detectar la produccin de cido agregue al tubo unas 5 gotas de una solucin de rojo metilo Coloracin roja del medio PRUEBA NEGA TlVA: Ausencia de coloracin
PRUEBA POSITIVA:

UTILlZACION

DE CITRATO

COMO UNICA

FUENTE

DE CARBONO

Sembrar la bacteria problema en tubo con Caldo Koser citrato (contiene como nica fuente de carbono citrato de sodio), con asa recta. El inculo conviene tomarlo de un medio lquido. 72

Incubar a la temperatura
RESULTADO: PRUEBA POSITIVA:

ptima

de crecimiento

por 7 das.

El crecimiento
Transparencia

en el medio se denota por la del medio.

turbidez

de ste.

PRUEBA NEGATIVA:

GRUPO

e
DE LECITlNA

-HIDROLlSIS

Incubar la bacteria problema en placas de Agar yema de huevo estriando una vez a travs de la superficie del medio. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 1 - 4 das.
RESULTADO:

Se forma un halo transparente microbiano. PRUEBA NEGA TI VA: Ausencia de halo.

PRUEBA POSITIVA:

alrecador del

crecimiento

GRUPO

-TEST DE CATALASA

Se detecta la presencia de la enzima cata lasa que descompone el perxido de hidrgeno (H202) en agua y oxgeno libre. Incubar la bacteria problema en tubos con Caldo nutritivo. Incubar a la temperatura ptima de crecimiento por 1 - 2 das.
RESUL TADOS:

Tome 1 mi de cultivo y vcrelo 1 mi de H202 (10 vol).

PRUEBA POSITIVA:

a un tubo de hem6lisis.

Aada

Efervescencia producida PRUEBA NEGA TIVA: No hay efervescencia.

por la liberacin

de 02

73

7. RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Existen dos tipos de recuento de microorganismos: recuento total y recuento viable. El primero es aquel en que se cuentan todos los microorganismos existentes, es decir, tanto vivos como muertos. En el recuento viable slo se cuentan los organismos vivos. Tambin pueden ser directos o indirectos dependiendo de la tcnica que se utilice. DIRECTOS: Son aquellos en que se cuenta el nmero de clulas de una muestra directamente al microscopio. Adems son totales, es decir, se cuentan todas las c lu las ex istentes, tanto vivas como muertas. Ej: M~todo de B_r~~d, recuentos comparativos, en cmaras, etc. INDIRECTOS: Son aquellos en que se cuenta el nmero de clulas de una muestra, por determinacin de alguna variable que refleje crecimiento de los microorganismos. Pueden ser totales y viables. Ej: Mtodo de las diluciones (viable), determinacin de N, densidad ptica, etc. (totales).
RECUENTOS DIRECTOS:

METODO DE BREED ( TOTAL) -Sobre un portaobjeto limpio (sin grasa) dibuje con lpiz graso un cuadrado de un centmetro por lado. Dando vuelta el portaobjeto, se tiene una superficie bien delimitada de 1 cm2. -Homogenice la muestra problema, y con una pipeta de Kahn tome 0.01 mi y extindalo exactamente sobre el cuadrado. -Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente a la llama

75

del mechero. Cubrir la extensin con cristal violeta minuto. Lavar con agua y secar al ambiente. -Observe al microscopio por inmersin.

durante

-A continuacin, se cuenta el nmero de microorganismos en varios campos. Luego se calcula la media de microorganismos por campo y se multiplica por 3.000 (valor del campo del microscopio igual a 1/3.000 del cm2), con lo cual conocemos el nmero de microorganismos que hay en el cm2. Esto multiplicado por 100 (colocamos 0.01 mi), nos da el nmero total de microorganismos que hay en 1 mi de la muestra.
RECUENTOS -MEraDO INDIRECTOS: (VIABLE)

DE LAS DILUCIONES

-Se toma 1 mi del cultivo problema bien homogenizado con una pipeta estril y se diluye progresivamente en 10 tubos con 9 mi de suero fisiolgico estril, traspasando cada vez 1 mi de la suspensin dilucin. En lo posible se recomienda hacer cada dilucin con una pipeta nueva homogenizando bien la suspensin en cada paso. -Se obtendrn 10-1, 10-2, as las siguientes diluciones: 10-3

', '.',

.10-8,

10-9 ,

10-10

-De las tres ltimas diluciones se toma 0,1 mi y se siembran en superficie en placas de Petri con Agar nutritivo, con asa de Drigalsky. -Luego se incuban las placas a la temperatura crecimiento por 24 - 48 horas. ptima de

Despus de 18 a 48 horas se proceder al recuento que aparecern en las placas.

de colonias

El nmero de colonias multiplicado por el valor recproco de la dilucin correspondiente y por diez (colocamos 0.1 mi) nos da la muestra problema. Ejemplo: Si en la placa correspondiente a la dilucin aparecen 20 colonias, el nmero de microorganismos por mi de la muestra inicial ser: 20 x 10 8 x 10 10-8 viables

2 x 10 10m

o / mi

76

-METODO DE LAS DILUCIONES EN TUBO (TjJrL) -Verter -Rotular 100 mi de agua en un matraz estril. los tubos con los datos correspondientes.

lV \~)

-Realizar 6 diluciones fisiolgicos estri les.

sucesivas en una serie de tubos

Procedimiento: Homogenice la muestra. Tome 1 mi de sta y virtalo en el primer tubo de la serie. Homogenice bien. De ste tome y traspselo al segundo tubo de la serie. Homogenice bien. y as sucesivamente obtendr diluciones de 10- 1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6.

-A continuacin, en una serie de tubos con medio de cultivo (5 mi de Caldo nutritivo por tubo) siembre 3 5 tubos por dilucin, agregando 1 mi de la dilucin correspondiente a cada tubo. -lncubar los tubos sembrados a la temperatura creci miento. -Leer a los 7 y 14 das. Apreciar el crecimiento precipitado o velo. ptima de

por turbidez,

-Contar el No. de tubos positivos de cada dilucin. Calcular la cifra caracterstica, y determinar el No. de grmenes ms probable por mi de la muestra, de acuerdo a las Tablas de Me. Crady. Ej: La primera cifra del No. caracterstico lo da la dilucin menos concentrada donde todos los tubos son + . Di!. 7 14 10-' +++ +++ 10-2 +++ +++ 10-3 + -10-4 10-5 10-6

+ + +

+ + -

+--

Da 14 : No. caracterstico 15x103 ~ , = 15.000

321 = 15 mo/ml

77

TABLA

DE MC. CRADY

3 tubos/dilucin

....
o ....
.... Cl)

Cl)

,~
Cl) ....

"'O
Cl)

o .~
VI

Cl)

E g
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Cl) ....

"'O
Cl)

VI

E ....
Z~

E g
~

o .Q "".0 o
'::l .~

E ....

'::l

'::l

Z~

000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 201 202 210 211 212 220

0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1 1.5 1.6 0.9 1.4 2.0 1.5 2.0 3.0 2.0

221 222 223 230 231 232 300 301 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

3.0 3.5 4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0 9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110.0 140.0

78

TABLA DE MC. CRADY

5 tubos/dilucin

o u
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"CCI'l

o u +-'
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E .... Eg ':J :ti z~ zu

1.2 0.7 0.9 1.2 0.9 1.2 1.4 1.2 1.4 1.4 0.8 1.1 1.4 1.1 1.4 1.7 2.0 1.4 1.7 2.0 1.7 2.0 .. 2.0 2.5 2.5 400 401 402 403 410 411 412 420 421 422 430 431 432 440 441 450 451 500 501 502 503 504 510 511 512

0. .... .0 alo

'': ,~

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al
"CCI'l

o .... .... al al+-'

':J

E .... Ee .s ':J ro z~ zu
1.3 1.7 2.0 2.5 1.7 2.0 2.5 2.0 2.5 3.0 2.5 3.0 4.0 3.5 4.0 4.0 5.0 2.5 3.0 4.0 6.0 7.5 3.5 . 4.5 6.0 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 552 553 554 555

0. .... .0 alo

,~

o .... alu

.... $

':J.!:?

E .... z~

0. .... .0 alo

000 001 002 010 011 012 020 021 030 100 101 102 103 110 111 112 120 121 122 130 131 140 200 201 202

0.0 0.2 0.4 0.2 0.4 0.6 0.4 0.6 0.6 0.2 0.4 0.6 0.8 0.4 0.6 0.8 0.6 0.8 1.0 0.8 1.0 1.1 0.5 0.7 0.9

203 210 211 212 220 221 222 230 231 240 300 301 302 310 311 312 313 320 321 322 330 331 340 341 350

8.5 5.0 7.0 9.5 12.0 15.0 17.5 8.0 11.0 14.0 17.5 20.0 25.0 13.0 17.0 25.0 30.0 35.0 45.0 25.0 35.0 60.0 90.0 160.0 180.0

79

8. CURVA DE CRECIMIENTO DE GENERACION

y CALCULO DEL TIEMPO

Durante el crecimiento de una poblacin microbiana, se pueden distinguir diferentes fases que son: a) b) c) d) Fase de latencia Fase de crecimiento exponencial Fase estacionaria mxima Fase de muerte

En esta experiencia se determinarn las diferentes fases de crecimiento y el tiempo de generacin (Tg) de una poblacin microbiana.
A. CURVA DE CRECIMIENTO

Inocular con un asa (loopful) un tubo de ensayo que contenga 1 mi de Caldo nutritivo. El inculo se toma de un cultivo de 18 hrs en medio lquido. Poner a incubar el tubo sembrado en estufa a 37 C. Luego, cada 20 minutos por un lapso de dos horas sacar muestras (Ioopful) del cultivo en incubacin y diluirlos en 10 mi de suero fisiolgico estril distribuido en tubos. Agitar bien cada dilucin y sembrar 0.1 mi en placas con Agar nutritivo, extendiendo el inculo con asa de Drigalsky. Poner las placas a incubar en estufa a 37 C. A las 24 - 48 hrs se contarn las colonias que aparezcan en cada placa, para calcular el nmero de colonias/crn (superficie de la placa = 63 cm2), con el fin de graficar estos datos en funcin del tiempo.
8. CALCULO DEL TIEMPO DE GENERACION (Tg)

Inocular un matraz Erlenmeyer de 100 mi que contenga 5 mi de Caldo nutritivo, con un loopful de un cultivo de 18 horas.
81

Incubar en agitador rotatorio a 370 C. A los 20 minutos sacar una muestra de 0.5 mi y diluirla sucesivamente en 3 tubos con 4.5 mi de suero fisiolgico estril.

De la ltima dilucin sembrar O., mi en dos placas de Agar nutritivo, extendiendo el inculo con asa de Drigalsky.
Incubar las placas en estufa a 370 C. Repetir esta operacin a los 60 minutos de incubacin, pero esta vez haciendo cuatro diluciones. A las 24 - 48 horas se recuenta el nmero de microorganismos viables/mi a los 20 minutos y 60 minutos. Luego calcular el Tg de acuerdo a las siguientes relaciones: No. gen : lag N, - lag No 0.3

donde : No. gen

Ll t

= nmero de generaciones en tiempo

t o

lag N, lag No luego Tg

lag. del nmero de microorganismos en t, lag. del nmero de microorganismos en t o

Ll t

N gen Alternativamente se puede estimar el Tg a partir del grfico que se obtuvo con los datos del paso A.

, I
82

9. INFLUENCIA DEL AMBIENTE SOBRE LOS

MICROORGANISMOS

En la naturaleza el crecimiento de las poblaciones microbianas se ve influenciado por factores tanto fsicos como qu micos, tales como: concentracin de nutrientes, pH, temperatura, radiaciones, etc. En la presente experiencia se tratar de estimar la influencia de algunos de estos factores sobre poblaciones de microorganismos.
EFECTOS DE LA TEMPERATURA

Preparar 4 tubos de ensayo con 5 mi de Caldo nutritivo. Inocu lar cada tubo con asa (loopfu 1) de un cu Itivo de 18 horas en medio lquido del microorganismo problema. Incubar el 1er. tubo a temperatura ambiente, el 2do. tubo a 25 C, el 3er. tubo a 37 C y el 4to. tubo a 45 C. A las 24 - 48 horas observar el crecimiento por turbidez.

,
EFECTOS DEL pH

Preparar 4 tubos de ensayo con 5 mi de Caldo nutritivo y ajustar el pH de modo que el 1er. tubo tenga pH 3, el 2do. tubo tenga pH 5, el 3er. tubo tenga pH = 7 y el 4to. tubo tenga pH = 9.

Incube cada tubo con un loopful de un cultivo de 18 horas en medio lquido del microorganismo problema. ' Incubar los tubos sembrados en estufa a 28 - 37 C. A las 24 - 48 horas observar el crecimiento por turbidez.
EFECTOS DE LA RADIACION U. V.

De un cultivo de 18 horas en medio lquido del microorganismo problema, tomar un loopful y diluirlo en 10 mi de suero fisiolgico estril. De esta dilucin toma 2 mi y colocarlos en
83

una placa estri 1. Luego colocar la placa a una distancia de 25 - 30 cm de la lmpara U.V. Cada 3 - 6 - 9 - 12 - 15 minutos sacar muestras de 0.1 mi y sembrar placas con Agar.:nutritivo, extendiendo el inculo con asa de Drigalsky. Poner las placas sembradas a incubar en estufa a 28 - 37 C. A las 24 - 48 horas se contarn las colonias que aparezcan en cada placa. Luego calcular el nmero de colonias/cm2 (superficie de la placa = 63 cm2) con el fin de graficar estos datos en funcin del tiempo.

84

10. VALORACION

DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

GENE RA L/DA DES:

Un agente antimicrobiano es una sustancia qumica que mata a los microorganismos o inhibe su crecimiento. Tal agente puede ser una sustancia sinttica o natural, generalmente originada por otro microorganismo. Los agentes antimicrobianos que son productos naturales se les denominan antibiticos, los cuales en su mayora son eficaces a concentraciones bajas (por ejemplo, 10 mcg/ml). Una caracterstica importante de los antibiticos es que presentan toxicidad selectiva, vale decir, daan a las clulas del parsito sin daar o al menos nunca en la misma medida, a las clulas del husped.
TECNICAS:

L a accin antimicrobiana de un antibitico se puede cuantificar. Esto es necesario hacerlo para decidir qu antibitico usar contra un microorganismo determinado, por ejemplo, en un proceso infeccioso. Un medio adecuado para medir la inhibicin del crecimiento es determinar la "Concentracin Mnima Inhibidora" (CMI) de un antibitico. Para esto se inoculan una serie de tubos con el microorganismo a prueba. Estos tubos contienen concentraciones progresivamente ms bajas del agente antimicrobiano. La concentracin ms baja que impide completamente el crecimiento microbiano es la que se conoce como CM l. A este procedimiento para valorar antibiticos "Tcnica por Dilucin en Tubo". se le llama

85

Otro mtodo comnmente usado para cuantificar la accin antimicrobiana es el "Mtodo por Difusin en Agar" o "Antib iograma en placas". Este consiste en sembrar en forma homognea una suspensin del microorganismo problema sobre la superficie de una placa de Petri con medio de cultivo adecuado, valindose de una asa de Drigalsky, o en profundidad. A continuacin, se ponen sobre la superficie de la placa discos de papel filtro impregnados con soluciones del agente antimicrobiano a una o varias concentraciones. Tambin se pueden colocar las distintas soluciones en "cups", las cuales tienen un volumen aproximado de 0.02 mi, o ms. De esta manera, el agente antimicrobiano difunde a travs del agar establecindose una gradiente de concentraciones. A continuacin las placas se incuban y al cabo de 18 - 24 hrs. se registran los resu Itados. Si el compuesto valorado es activo aparecer alrededor del disco o cup una zona en que no hay crecimiento (halo de inhibicin), siendo su lmite el punto que corresponde a la CM I dentro de la gradiente de concentraciones. E I resultado se expresa midiendo en mm la distancia desde el borde del disco o cup hasta el borde del halo, vale decir, el radio del halo de inhibicin. Sin embargo, los resultados pueden presentar variaciones debido a varios factores, entre ellos el medio de cultivo usado, las condiciones de incubacin, la naturaleza del agente antimicrobiano probado, el inculo, etc.
ANTlBIOGRAMA EN PLACA:

Se preparan soluciones de diversos antibiticos a una concentracin determinada. Se diluyen al duplo hasta obtener las concentraciones finales. A continuacin, se siembran los microorganismos problema y se colocan en cada placa 3 cups conteniendo muestras de las 3 ltimas concentraciones de cada antibitico.

Se incuban las placas a 370 C.

A las 18 - 24 hrs se verifican los resu Itados.
exactas. antibiticos

Nota: Casas comerciales fabrican discos estandarizados, a concentraciones Con aplicadores se pueden colocar varios simultneamente con diferentes o concentraciones, en la misma placa.

86

LAMINA 38

Evaluacin de una sustancia potencialmente

antimicrobiana.

;/',',
'.

:~'-""
I '

,1

Agar nutritivo (480 e) se inocula con el microorganismo.

Se agita y se vierte en la placa.

Un disco estril se impregna con la sustancia a estudiar.

Se coloca el disco en el centro de la placa con agar nutritivo inoculado.

Despus de 24 - 48 horas de incubacin a la temperatura ptima del microorganismo, se mide la zona de inhibicin, desde el borde del disco al borde del crecimiento.

11. EXAMEN BACTERIOLOGICO

DE AGUAS

GENERALIDADES

El agua puede contener un gran nmero de grmenes que no son nocivos para el hombre. Es peligrosa cuando ha sido contaminada por heces ya sea de animales o humanos. Entre los microorganismos que se podran encontrar en aguas contaminadas por heces tenemos: Salmonella (enteritis), Shigella (disentera bacilar), Salmonella typhose (fiebre tifoidea), Vibrio cholerae (clera), etc. Debido a que estas bacterias pueden no encontrarse en un gran nmero y a las dificultades que existiran para su identificacin, se utilizan como microorganismos indicadores: Escherichia coli y Streptococcus faecalis. Estos dos microorganismos usualmente no patgenos, se encuentran siempre en el tracto intestinal y su presencia en el agua indicara contaminacin fecal y por aadidura la posible existencia de los patgenos antes sealados. Tambin virus.
TECNICA

podra

presumirse

la presencia de algunos

Determinacin del nmero ms probable coliformes fecales y E. coli.

(NMP) de coliformes,

A continuacin se describe una tcnica, basada en Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 14 Edicin. Para determinar la presencia de coliformes usualmente se realizan tres pruebas: un test presuntivo, un test confirmativo y un test completo.
EL TEST PRESUNTIVO:

Consiste en inocu lar la muestra de agua en caldo lactosado, que slo unos pocos grmenes entre ellos E. coli, producen partir del caldo lactosado cido y gas. La muestra tomada

ya a

89

aspticamente y previamente tratada dependiendo de su origen (en caso de ser agua potable es necesario neutralizar el HCI), se coloca en series de tres tubos con campana de Durham y 10 mi de medio lactosado; en la primera serie 10 mi de la muestra, en la segunda I mi y en la tercera 0.1 mi En la serie primera, el medio lactosado se encuentra a doble concentracin. Para aguas muy contaminadas se puede adicionar 1 serie ms (0.01). Despus de una incubacin de 24 - 48 hrs, a 35 C., en los tubos positivos se puede apreciar la presencia de gas en las campanas de Durham y el color amarillo por la acidez del medio.
EL TEST CONFIRMA TlVO:

Verifica la presencia de coliformes sembrando a partir de los tubos positivos placas con medio Levine (EMB) o Endo Agar. Las placas son incubadas por 24 hrs a 35 C. Los resultados positivos dan colonias nucleadas, y pueden presentar un color metlico verde brillante. El test se completa sembrando a partir de estas colonias tubos con Caldo lactosado que deben dar resultados positivos, y tubos con Agar nutritivo. Las tinciones de Gram a partir de estas muestras deben dar bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas. Con los resultados de estas pruebas podramos determinar el (NMP) de coliformes. Para conocer el (NMP) de coliformes fecales, es necesario a partir de los tubos positivos del test presuntivo sembrar en tubos con medio (EC) e incubar a 44.5 C. La formacin de gas indicara la presencia de coliformes de origen fecal. Para determinar E. coli es necesario realizar el test IMViC. El nmero ms '<)robable(NMP) se determina de acuerdo al nmero de tubos positivos, y en base a las tablas que se entregan a continuacin.

.t

90

BERNARDO
TABLA NUMERO MAS PROBABLE DE COLlFORMES

PARRA L.

PARA SERIES DE 3 TUB'OS

95
NUMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP LIMITES

DE CONFIANZA

3 con 10 mi

3 con 1 mi

3 con 0.1 mi

por 100 mi <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1.100 ~ 2.400

Bajo

Sobre

O O O
1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

O O
1

O
1

O O
1 1 2

O O
1

0.5 0.5 0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 380 380 440 470 1.300 2.400 4.800

O
1

O O
1 1 2 2

O O
1

O
1

O
1

O O O
1 1 1 2 2 2 3 3 3 3

O
1 2

O
1 2

O
1 2

O
1 2 3

91

TABLA NUME RO MAS PROBABLE PARASERIES DE 5 TUBOS 95 NUMERO 5 con DE TUBOS POSITIVOS 5 con 5 con NMP por LIMITES
%

DE CONFIANZA

10 mi

1 mi

0.1 mi

100 mi

Bajo

Sobre "

O O O O 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4

O O 1 2 O O 1 1 2 O O 1 1 2 3 O O 1 1 2 2 O O 1 1 1 2 2 3

O 1 O O O 1 O 1 O O 1 O 1 O O O 1 O 1 O 1 O 1 O 1 2 O 1 O

2
2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 27

< < < < < < < < <

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 3 5 5 7 9 7 9 9

7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 46 31 46 46 63 78 67 78 80

:.
!

92

95 NUMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP LIMITES

DE CONFIANZA

5 con

5 con

5 con

por

10 mi

1 mi

0.1 mi

100 mi

Bajo

Sobre

4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

3 4
O O O

1
O O

1 2
O

1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

1 2
O

1 2
O

1 2 3
O

1 2 3 4
O

1 2 3 4 5

33 34 23 31 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1.600 ~ 2.400

11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640

93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 220 190 250 340 500 300 490 700 850 1.000 750 1.000 1.400 3.200 5.800

93

LAMINA 39

Examen- microbiolgico de aguas determinacin de coliformes.

('I~ \1':;'11
.i.tjl,I~~

((;~ t~Jf

..,.."'"
';;:;J.'~'

Series de 3 tubos con 10 mI de medio lactosado, ters. serie doble concentracin.

,f,~;\tl I"':

.in

J1J
Muestra
\c

I ~----------~

Resultado negativo.

Resultados positivos: produccin de as y acidfJz.

~.

<,

APENO ICE

MEDIOS DE CULTIVO

(Frmulas

expresadas en gramos/litro

de agua destilada)

MEDIOS SOLIDOS -AGAR ACETATO DE PLOMO:

M edio para detectar Peptona D-Glucosa Acetato de Plomo Tiosulfato sdico Agar pH final 7

la produccin 20 1 02 0_08 15 7.2

de H2S gramos gramo gramos gramos gramos

-AGAR ALMIDON:

Medio para detectar Agar nutritivo Almidn pH final:

-AGAR

la produccin

de amilasas

100 mi 2 gramos - 7.4

UREA:

7.2

CHRISTENSEN

Medio para detectar Peptona Na CI

la produccin

de ureasa

KH2 P04 D-Glucosa Agar Rojo Fenal (0.2 % sol. acuosa) pH final : 7.0

1 gramo 5 gramos 2 gramos 1 gramo 20 gramos

6 mi

Nota: Una vez esterilizado el medio, se enfra hasta 50 C y a cada tubo de ensayo se le agrega aspticamente 0.5 mi de una solucin de urea al 20 o /0 previamente esterilizada por filtracin.
-AGAR CON EXTRACTO DE MAL TA:

Medio selectivo Maltosa Dextrina Glicerina Peptona Agar pH final

-AGAR

para aislar hongos o levaduras. 12.75 gramos 2.75 gramos 2.35 gramos 0.78 gramos 15 gramos

: 4.6 - 5.0

GELA TINA:

Medio para detectar Agar nutritivo Gelatina pH final : 7.3

la produccin

de proteasas.

1000 mi 4 gramos

.. -AGAR NUTRITIVO:

Medio tpico Peptona Extracto Agar pH final

- AGAR

de crecimiento.

5 gramos
de carne

3 gramos
15 gramos

: 7.2
SABOURAUD:

Medio para aislar hongos o levaduras. Peptona O-Glucosa Agar pH final : 5.0

10 gramos 40 gramos
15 gramos

-AGAR SANGRE:

Medio para estudiar propiedades Agar nutritivo Na CI pH final 100 : 7.2

hemol ticas.

1000 mi
3,5 gramos

Nota:

Una vez esterilizado

el medio, se enfra

y se le aade aspticamente
-AGAR TRYPTlCASE SOY:

hasta 45 - 500 C 50 mi de sangre desfibrinada estril.

Medio para valoracin Trypticase Phytone Na CI Agar

;

de antibiticos.

15 gramos
5 gramos 5 gramos 15 gramos :

pH final
-AGAR

7.0 - 7.2

WRIGHT:

Medio selectivo para aislar Rhizobium. Manitol P04 Mg S04 Na CI Ca C03 Agar Rojo de Congo (10/0 sol. acuosa)
-AGAR YEMA DE HUEVO:

K2H

10 gramos 0.5 gramos

0.2 gramos

0.1 gramos
3

15 10

gramos gramos gotas

Medio para detectar

la produccin

de lecitinasas.

Agar nutritivo Na CI Emulsin yema de huevo pH final :

1000 mi 10 gramos 100 mi

7.2

Nota: Preparacin de la emulsin yema de huevo: Separe la yema de la clara, luego mezcle la yema con agua destilada, hasta competer un volumen de 100 mi Agite y deje decantar en fro por 2 horas. A continuacin esterilice el sobrenadante por fi Itracin. Una vez esterilizado el medio, se enfra hasta la emulsin yema de huevo estrilmente.
PREPARACION:

500 C y se le aade

Todos los medios de cultivos de la sigu iente manera:

anteriormente

indicados

se preparan

101

- Se mezclan los ingred ientes con agua desti lada - Se calienta la mezcla hasta ebullicin, constantemente. - Se deja hervir por 1 - 2 minutos completa del agar. revolviendo

hasta la disolucin

- A continuacin se distribuyen los medios en recipientes adecuados, para luego esteri lizar en Autoclave a 120 oC por 20 minutos.
MEDIOS LIQUIDaS: CALDO DE CLARK-LUBS:

Medio para detectar Peptona O-Glucosa K2HP04 pH final

CALDO

la produccin

de acetona.

5 gramos 5 gramos 5 gramos : 7.5

KOSER CITRATO:

Medio para detectar fuente de carbono. Citrato de sodio HP04

la utilizacin

de citrato

como nica

Mg S04 Na. (NH4) K H2P04 . pH final

-AGAR

2 gramos 0.2 1.5

: 7.0
DE SIMMON'S:

CITRATO

Citrato Na CI

de sodio

2 - 5 gramos

5
0.2
1.0 1.0 20 0.08 1000 mi

Mg S04 NH4H2P04 K2 HP04 Agar Azul de bromo-timol Agua destilada

"

.rt

102

-CALDO

LACTOSADO:

Medio para detectar Peptona Extracto Lactosa pH final

la produccin

de cidos y gases.

5 gramos de carne

3 gramos

5 gramos
: 6.0

- 7.0
la reduccin de nitratos.

-CALDO NITRA TADO:

Medio para detectar Ca Ido peptonado

KN03
pH final:

1000 mi 0.2 gramos

7.2
de crecimiento.

-CALDO NUTRITIVO:

Medio tpico Peptona Extracto pH final:

-CALDO

de carne

5 gramos 3 gramos

7.0
O AGUA

- 7.5
PEPTONADA:

Medio tpico Peptona NaCL pH final

-CALDO

de crecimiento.

10 gramos

5 gramos
: 7.2
SABOURAUD:

Medio para aislar hongos o levaduras. Peptona D-Glucosa pH final:

10 gramos 40 gramos 5.0

y frotis.

-SUERO FISIOLOGICO:

Para preparar diluciones Na CI

PREPARACION:

8.5 gramos
indicados se

Todos los medios de cultivos anteriormente preparan de la sigu iente manera:

103

-Se mezclan los ingredientes -Se calienta completa.

con agua destilada. hasta la disolucin

la mezcla unos minutos

-A continuacin se distribuyen los medios en recipientes adecuados, para luego esterilizar en Autoclave a 1200 e por 20 minutos. Nota: Para otros medios de cultivo citados en la bibliografa. consultar los manuales

Los medios con azcares deben ser esterilizados (por la tcnica de vapor fluente) autoclave 20' a 1000 o por fi Itracin.

104

COLORANTES E INDICADORES

-CRISTAL

VIOLETA

(VIOLETA

GENCIANA)

Para tincin

simple y tincin

Gram.

Cristal violeta Agua desti lada Mezclar bien y luego fi Itrar.

-FUCSINA BASICA:

0.5 gramos 100 mi

Para tincin

de esporas.

Fucsina bsica Etanol de 95 % Agua desti lada

0.1 gramos 10 mi 90 mi 100 mi con agua

Disuelva la fucsina en etanol y luego afore a desti lada. Filtrar.

-LUGOL:

Para tincin

Gram y deteccin

de amilasa;

Yodo Yoduro de Potasio Agua destilada

1 gramo
2 gramos 300 mi
luego

Pulverizar en un mortero el yodo y yoduro de potasio, aadir agua destilada hasta completar 300 mI. Filtrar .
-SAFRANINA:

Para tincin

Gram

Safranina Etanol de 95 % Agua desti lada

1 gramo 10 mi 90 mi
105

Disuelva la safranina en etanol agua desti lada. Filtrar .

. VERDE MALAQUITA:

y luego afore a 100 mi

con

Para tincin

de esporas.

Verde Malaquita Agua desti lada Mezclar bien y luego fi Itrar.

REACTIVOS -EHRLlCH - KOVACS:

0.5 gramos
100 mi

Para detectar

la produccin

de indol,

p- Dimetil aminobenzaldehido Alcohol isoam lico HCI concentrado Disuelva el aldehido cido. Filtrar.
2fc-FRAZIER:

5 gramos 75 mi 25 mi
luego aada lentamente el

en el alcohol,

Para deteccin Hg CI2 HCI concentrado Agua desti lada

de proteasas. 15 gramos

20 mi
100 mi con agua

Disuelva el Hg CI2 en el cido y luego afore a 100 mi destilada. Filtrar.

-GRIESS - ILOVAY'

Para detectar
REACTIVO I

S: la produccin

de nitritos.

Acido sulfan lico Acido actico 5 N Mezclar bien y luego filtrar.

REACTIVO 11

0.8 gramos
100 mi
"

L - naftilamina Acido actico 5 N

mezclar bien y luego filtrar.

0.5 gramos
100 mi

106

INDICADOR -ROJO METILO:

_/
la produccin de cidos 0.02 gramos 60 mi 40 mi en alcohol y luego afore a 100 mi con

Para detectar

Rojo Metilo Etanol de 950/0 Agua destilada Disuelva el rojo metilo agua desti lada. Filtrar.

107