Capitulo 20.

Mtodos alternativos. Generalidades

NURIA BASI MOR Midwest Research Institute Barcelona

MTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS. DEFINICIN ORIGEN DE LAS 3R DE RUSSELL Y BURCH. EVOLUCIN CLASIFICACIN DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS EN FUNCIN DE LAS 3RS Refinamiento Reduccin Reemplazo CARACTERSTICAS DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS Ventajas Limitaciones APLICACIN DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS Docencia Investigacin bsica Investigacin aplicada MTODOS ALTERNATIVOS PARA EVALUAR LA SEGURIDAD DE PRODUCTOS QUMICOS Y COSMTICOS DESARROLLO Y VALIDACIN DE UN MTODO ALTERNATIVO SITUACIN ACTUAL DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS VALIDADOS POR DIFERENTES ORGANISMOS INTERNACIONALES INSTITUCIONES VINCULADAS AL DESARROLLO DE MTODOS ALTERNATIVOS RESUMEN BIBLIOGRAFA

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La importancia que los modelos animales han significado en el avance de la investigacin biolgica, mdica y veterinaria en el pasado, presente y futuro es indiscutible. A lo largo de los aos, la comunidad cientfica se ha ido sensibilizando en el uso racional del animal de laboratorio, pero se enfrenta a una contradiccin. Por una parte la Administracin y la opinin pblica solicitan la mxima garanta de todos los productos de consumo, pero por otra parte exigen no usar la experimentacin animal en la metodologa que se utiliza para evaluar la seguridad de dichos productos. La legislacin vigente en Europa y Estados Unidos incluye que se determine que el uso de animales de experimentacin deba ser cientfica y ticamente justificado. El modo de hacerlo vara entre los distintos pases, pero coinciden en el fondo de la cuestin, ya que todos analizan la idoneidad de los procedimientos respecto a los objetivos del proyecto, promueven que se utilice el mnimo nmero de animales necesario y que los investigadores documenten que han considerado adecuadamente todas las alternativas a procedimientos que causen dolor o malestar en los animales. Sobre la base de estas consideraciones surgi la necesidad de definir, crear y desarrollar los mtodos alternativos al uso de animales de laboratorio. METODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS. DEFINICIN La palabra alternativa no est especficamente definida en el mundo de la experimentacin animal; sin embargo ha sido necesario que los investigadores comprendan su significado en dicho mbito. La definicin comnmente aceptada es la que considera como tcnicas alternativas aquellos mtodos o modelos que: 1) incorporan un refinamiento de los procedimientos, de modo que disminuyen el dolor o malestar de los animales, o bien aumentan su bienestar; 2) permiten una reduccin en el nmero de animales necesario; 3) facilitan el reemplazo del uso de animales por sistemas que no requieren seres vivos, o bien se emplean otras especies animales que sean inferiores en la escala filogentica animal. Debido a que los tres objetivos a alcanzar con los mtodos alternativos empiezan con la misma consonante, se las denomina las 3 R. Esta definicin esta basada en los conceptos establecidos por W.M.S. Russell y R.L. Burch en su libro The principles of humane experimental technique, publicado en 1959. Se trata de un magnfico libro, ameno, absolutamente vigente y cuya lectura se recomienda a los investigadores que trabajan con animales de experimentacin. Sus autores tardaron varios aos en desarrollar sus ideas en el libro y a pesar de su originalidad y de tratarse de un excelente trabajo tuvo muy poco impacto en los primeros aos tras su publicacin. De hecho los propios autores no se volvieron a encontrar hasta 30 aos ms tarde cuando una nueva generacin redescubri el libro, producindose, entonces, el gran impacto que han supuesto sus teoras en el uso racional del animal de laboratorio. En 1992 se public una segunda edicin del libro. Posteriormente se aadi el concepto de mtodos complementarios para referirse a aquellos procedimientos que aportan informaciones adicionales en cualquier disciplina biomdica sin utilizar animales, pero no sustituyen a tcnicas o modelos animales ya existentes. Las tcnicas complementarias van asociadas, en la mayora de los casos, a la aplicacin de nuevas tecnologas que permiten obtener conocimientos que no son factibles de conseguir sobre el modelo animal completo. En el campo de la investigacin farmacutica, estas tcnicas se estn aplicando, entre otras, a estudios de mecanismo de accin y de metabolismo de nuevos frmacos. ORIGEN DE LAS 3 R DE RUSSELL Y BURCH. EVOLUCIN No se conoce con precisin el origen de las 3Rs, pero el concepto se discuti en pblico por primera vez, durante una reunin cientfica organizada por la Universities Federation for Animal Welfare en 1957. Debido al gran inters del tema nombraron a Russell y Burch para que desarrollaran y reflexionaran sobre estas materias, siendo los promotores financieros la UFAW y la organizacin estadounidense Animal Welfare Institute (AWI). Como se ha mencionado anteriormente hasta varios aos despus de su publicacin no se recuperaron estos conceptos. Durante 1969, la organizacin Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments (FRAME) promocion el avance que

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supondra la aplicacin de la visin de Russell y Burch sobre las 3 R. Insistieron en que la aplicacin racional y sistemtica de las 3 R supondra beneficios cientficos y de carcter humanitario. Partiendo de la base que la reduccin y el refinamiento eran metas alcanzables a corto plazo, decidieron centrar sus actividades en las que tuvieran como objetivo final, el reemplazo. En la dcada de los setenta tuvieron lugar diversos hechos de gran relevancia. En Gran Bretaa se detect que la opinin pblica se preocupaba por el incremento sustancial del consumo de animales de laboratorio. Esto oblig a que organizaciones encargadas del Bienestar Animal organizaran campaas de sensibilizacin sobre el tema. En 1976, al cumplirse el centenario de la publicacin de la ley Cruelty of Animal Act, que regulaba y autorizaba los experimentos con animales, se cre un comit que se encargara de actualizar dicha ley. Causa cierto asombro y admiracin que en Gran Bretaa ya existieran legislaciones sobre estas materias en 1876. Paralelamente en EEUU el concepto de mtodos alternativos empezaba a ser divulgado por la AWI. De todos modos, los cambios ms importantes ocurrieron en los 80. En EEUU, Henry Spyra lanz una campaa para erradicar el ensayo de irritacin ocular en conejo, con el apoyo de ms de 400 organizaciones de todo el mundo. En Europa empieza a publicarse legislacin a nivel del Consejo de Europa y de la Comunidad Econmica Europea (86/609/EEC). En ambos documentos aparece el espritu de las 3 R, aunque sin mencionarlas como tales. En Gran Bretaa, por primera vez, representantes de asociaciones relacionadas con el bienestar animal y legisladores trabajan unidos para desarrollar una legislacin reguladora de los procedimientos con animales de experimentacin. Posteriormente Alemania, Holanda y Estados Unidos incorporan a sus legislaciones el mensaje de las 3R. En la actualidad la mayor parte de los pases europeos siguen, en mayor o menor grado, las normas comunitarias sobre esta materia. En los ltimos aos se ha podido contemplar la difusin de los mtodos alternativos en todos los foros cientficos que tratan de investigacin en cualquier rea biomdica o en congresos sobre las ciencias del animal de laboratorio. Han tenido mucha repercusin los congresos mundiales sobre Mtodos Alternativos celebrados en Baltimore (1993), en Utrecht (1996) y en Bolonia (1999), as como todas las reuniones que sobre este asunto se han organizado en un mbito ms reducido. Las 3 R muestran una estrategia racional para reducir el nmero de animales utilizados, disminuir el sufrimiento ocasionado, sin comprometer la calidad cientfica del trabajo realizado y teniendo como objetivo final la sustitucin total de los modelos animales por tcnicas alternativas. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS EN FUNCIN DE LAS 3 R Un modo habitual de clasificar los mtodos alternativos es segn las 3 R, a pesar de que en muchas ocasiones se van a encontrar procedimientos que pueden estar ubicados en ms de una categora. Esta clasificacin sistemtica se sigue utilizando porque conceptualmente las 3 R estn bien diferenciadas, y en un primer estado es de gran utilidad didctica, aunque en la prctica los investigadores van a tener que aplicarlas conjuntamente en un proyecto de investigacin. En el Captulo 11 se puede encontrar informacin complementaria. Refinamiento Los mtodos alternativos incluidos en la categora de refinamiento, engloban todos aquellos procedimientos que afectan a la vida del animal de laboratorio, y permiten aliviar o minimizar el dolor potencial o malestar, o bien aquellos que implican un aumento del bienestar animal. El dolor y el malestar tienen su origen en una actividad experimental, como la inmovilizacin prolongada o inapropiada, una infeccin experimental, efectos txicos inducidos por sustancias qumicas, procedimientos quirrgicos, dolor postoperatorio o uso inadecuado de tcnicas eutansicas o bien el dolor puede no tener su origen en el propio ensayo, como ocurre en enfermedades infecciosas

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ocurridas espontneamente, condiciones ambientales deficientes, manejo incorrecto de los animales, situaciones de alojamiento impropias como aislamiento social, lesiones provocadas por luchas, o heridas debidas al tipo de jaula o al lugar de alojamiento. Abordar tales problemas no slo contribuye a mejorar el bienestar animal, con su trascendencia tica, sino que se consigue trabajar de un modo cientficamente ms correcto. El dolor o estrs probablemente incidirn en cambios fisiolgicos que pueden aumentar la variabilidad de los resultados experimentales. Para contribuir en mtodos alternativos en el mbito del refinamiento, un primer aspecto a tener en cuenta por los cientficos es asegurar que los animales disponen de las mejores condiciones de estabulacin. Esta categora incluye, por ejemplo, la obtencin y mantenimiento de animales libres de organismos patgenos (programas de cuarentena, control sanitario, programas de medicina preventiva), disposicin de sistemas de alojamiento ptimos y procedimientos de cuidado de los animales adecuados a las necesidades de cada especie, control de las condiciones ambientales y cuando proceda, adoptar programas de enriquecimiento ambiental. Sera de gran inters que de manera rutinaria las consideraciones de refinamiento y bienestar animal se incluyeran en los artculos y publicaciones cientficas, ya que aportan muchos beneficios y su difusin facilitara su cumplimiento. Es una lstima que la puesta a punto de muchas de estas tcnicas slo se refleje en un procedimiento normalizado de trabajo de una institucin y que la comunidad cientfica no se pueda beneficiar de ellas. El uso adecuado de analgsicos y anestsicos es fundamental para poder realizar un trabajo cientfico de calidad. Su utilizacin implica seleccionar el frmaco en funcin de la especie y del tipo de dolor, incluido el uso de analgsicos en el postoperatorio (ver cap. 14). Uno de los aspectos ms importantes a considerar en lo que respecta al dolor es que cada protocolo experimental tiene que definir los puntos terminales. Los investigadores han de evitar la muerte como punto terminal de un ensayo, ya que el dolor y el malestar preceden siempre a la muerte. Asimismo, han de percibir si producen dolor durante el ensayo y anticiparse desarrollando un plan detallado para aliviarlo y en caso de gravedad, definir los tipos de procedimientos a seguir para una eutanasia adecuada. Una frase muy utilizada por los investigadores es que el uso de analgsicos puede interferir con el ensayo. Es cierto en algunas ocasiones, pero hay otros tipos de experimentos como pueden ser aquellos que evalan antibacterianos, antifngicos o antitumorales en los que el uso de analgsicos es una terapia concomitante en clnica y ayudara a paliar el dolor y las molestias en los animales. Estudios de investigacin en este sentido pueden contribuir a comprobar realmente si existen interferencias que desaconsejen el uso de analgsicos en muchos proyectos de investigacin (vase Captulo 3). Otra oportunidad para mejorar el refinamiento es intentar eliminar o disminuir el malestar producido por la inmovilizacin fsica. Esta ha de facilitar el movimiento postural normal del animal cuando sea posible. En el caso de los primates, las inmovilizaciones que se realizaban para procesos de cateterizacin crnica pueden sustituirse por unas chaquetas, disponibles en el mercado, que dejan protegidas las vas y les permite una total movilidad. Se contribuye a reducir la angustia y el malestar de los animales considerando la necesidad y duracin de las restricciones de comida y agua prolongada, utilizando tcnicas incruentas, por ejemplo las relacionadas con la observacin interna (Cuadro 20-1) o aplicando refinamientos a mtodos invasivos y seleccionando siempre el mtodo de eutanasia ms apropiado en funcin de la especie, tamao y caractersticas del ensayo. Asociado a todos los conceptos expuestos en este apartado, es fundamental que las personas que manejen animales estn formadas y entrenadas para causar el mnimo dolor, malestar o seres a los animales. Para profundizar en estos conceptos conviene detenerse en los Captulos 3, 14 y 24.

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Mtodo de produccin de imagen

Resonancia Magntica Nuclear Tomografa Analgica Computarizada Tomografa de Emisin de Positrones Estimulacin elctrica Campos electromagnticos Corriente de alto voltaje

Siglas
NMR TAC PET

Utilidad de la tcnica
Precisin de imgenes radiogrficas Informacin sobre estructura de los rganos Idem., por planos. La secuencia permite la apreciacin de volmenes Informacin sobre actividad fisiolgica de los rganos. A modo de histologa funcional in vivo Induccin de sueo Estimulacin de la corteza motora

Cuadro 20-1. Tipos de tcnicas de imagen y elctricas no invasoras

Reduccin El concepto de reduccin, dentro de los mtodos alternativos, cubre toda estrategia que resulte de utilizar un menor nmero de animales para obtener la misma cantidad de informacin, o bien aumentar la informacin obtenida por animal y as potencialmente limitar o evitar el consiguiente uso de animales adicionales. Existen diversas opciones para disminuir el nmero de animales usados en trabajos de investigacin y desarrollo. Segn estadsticas, en los ltimos aos se ha apreciado una reduccin en el consumo de animales de laboratorio (vase en el Captulo 12 datos de la UE) en lnea con la asociacin entre reduccin y calidad de los resultados cientficos. Actualmente, se publican artculos en revistas cientficas sobre cmo ha disminuido el consumo de animales en una determinada institucin a pesar de haber aumentado su plantilla de investigadores y de haber realizado un nmero muy superior de publicaciones cientficas. Lo primero que hay que hacer para contribuir a la reduccin, es una adecuada revisin bibliogrfica del tema cuando se inicia la preparacin de un proyecto, para evitar duplicaciones de ensayos. Russell y Burch ya sugeran en su libro que se poda alcanzar una reduccin mejorando la estrategia de los proyectos de investigacin y desarrollo. Es primordial tener los objetivos claros y bien definidos, as como los puntos crticos del proyecto que ayudarn a decidir en qu sentido debe continuar su lnea de investigacin. El investigador ha de seleccionar el modelo animal ms idneo, mxime cuando en la actualidad dispone de una gran variedad de cepas de ratones endocriados, mutantes, transgnicos que dada su uniformidad gentica pueden permitir que se utilice un nmero inferior de animales (vase Captulo 20). Aunque pueda parecer una contradiccin, cuando no se est muy familiarizado con el modelo experimental, puede ser muy til realizar un ensayo piloto con un pequeo nmero de animales, el cual proporcionar datos preliminares respecto al tamao de los grupos, problemas de dosificaciones, logstica general, para poder llevar a cabo un diseo correcto del experimento. El diseo experimental de un proyecto de investigacin, que puede implicar diversos ensayos realizados de modo secuencial o en paralelo, tiene que ser analizado con detenimiento. La ayuda de un estadstico favorece la reduccin, calculando el tamao de los grupos experimentales segn el grado de precisin de las medidas, aconsejando diseos de tipo factorial o secuencial y planificando el anlisis estadstico de los resultados. Los resultados de cada ensayo necesitan ser interpretados y en muchos casos el diseo del siguiente experimento depende de dicha interpretacin. Errores a este nivel pueden ocasionar un consumo adicional de animales. Un modo de contribuir a la reduccin es planificar la produccin de animales para investigacin en funcin de la demanda. Los excesos de produccin de los mismos plantean un problema tico, ya que se cran y sacrifican sin una razn justificada, o su disponibilidad podra animar a los investigadores a usar ms animales que los estrictamente necesarios. Aplicar tcnicas de crioconservacin reduce la necesidad de mantener colonias de animales nicamente por conservar la lnea.

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El desarrollo de modelos animales que posean una sensibilidad superior y ms especfica puede reducir el nmero de animales utilizado. El poder disponer de animales transgnicos en los que se reproducen enfermedades humanas, permite utilizarlos como el modelo ms adecuado y fiable para ensayar frmacos con fines teraputicos, y no tiene sentido seguir usando modelos clsicos de simulacin de enfermedades por administracin de sustancias qumicas con resultados ms difciles de extrapolar al hombre. La utilizacin de estos animales como fuente de clulas para ensayos in vitro ha permitido grandes avances cientficos. Actualmente se discute si los animales transgnicos son o no un modelo alternativo. El hecho, es que para desarrollar un animal transgnico til en farmacologa experimental han debido gastarse un elevado nmero de animales, sufriendo muchos de ellos efectos secundarios muy adversos. Ahora bien, una vez que se dispone del modelo transgnico, se obtienen informaciones de mxima utilidad. El uso de ratones reconstituidos con leucocitos humanos infectados con el virus HIV, resulta muy apropiado para probar estrategias de intervencin contra el SIDA. Este modelo ha permitido reducir de un modo muy significativo la utilizacin de primates. En el sector de Investigacin y Desarrollo (I+D), es fundamental coordinar y planificar todo el desarrollo de un frmaco teniendo en cuenta los ensayos que pueden hacerse sin utilizar animales de laboratorio. En las fases de seleccin, hoy en da, las nuevas tecnologas que permiten utilizar tcnicas automatizadas de cultivo celular, unin a receptor, inhibiciones enzimticas, etc., han supuesto un gran ahorro de animales, ya que stos no se utilizarn hasta etapas ms tardas del desarrollo, cuando ya se dispone de una mayor informacin del frmaco en estudio. Una tarea que se realiza con frecuencia en los laboratorios de investigacin es aprovechar los rganos o muestras de tejidos cuando un animal es sacrificado. Los cuales son repartidos a los diferentes grupos de investigacin. Otro ejemplo es el desarrollo de implantes crnicos para la recopilacin de datos, sus ventajas y limitaciones se exponen en el Cuadro 20-2.

Ventajas
El efecto de las sustancias bioactivas se estudia sobre los mismos animales a lo largo del tiempo, disminuyendo as la dispersin interindividual. Los resultados se obtienen en condiciones muy cercanas a las fisiolgicas. Principalmente: en individuos conscientes, no anestesiados. Los datos obtenidos son de mayor exactitud. La informacin suele ser mucho ms completo que la conseguida con las tcnicas convencionales. Se consigue un importante ahorro de animales, ya que las experiencias se convierten de agudas (requieren el sacrificio diario de animales) a crnicas en las que los mismos animales permanecen vivos durante periodos muy prolongados. El carcter crnico de la experiencia sirve para realizar tratamientos y observaciones de larga duracin.

Limitaciones
Tcnicas: se han de implantar los adecuados instrumentos, que en ocasiones, son complicados y costosos, si bien, hoy en da los avances tecnolgicos han aumentado su disponibilidad. Requieren realizar una intervencin quirrgica previamente con el consiguiente perodo postoperatorio. El instrumento implantado puede ser causa de molestia crnica en el animal, lo cual hay que evitar a toda costa, por el principio tico de no infringir a los animales ningn tipo de molestias innecesarias. Si se aprecia dolor o malestar en los animales se modificar la tcnica a fin de evitarlo y si no se consigue hay que prescindir de ella.

Cuadro 20-2. Caractersticas de los implantes permanentes

En la investigacin toxicolgica de productos farmacuticos tambin se van aplicando tcnicas in vitro, pero la mayor contribucin en reducir animales se ha hecho, y se sigue trabajando en ello, en los programas de armonizacin internacional de protocolos entre Europa, Estados Unidos y Japn. El

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hecho de que las autoridades legisladoras que regulan la salida al mercado de nuevos productos farmacuticos en los pases ms importantes del mundo, acuerden armonizar los protocolos de los ensayos que exigen, implica un gran avance en el ahorro del consumo de animales, pues haciendo una sola vez el ensayo, ste ser aceptado internacionalmente. Generalmente los cambios acordados han afectado al diseo y al tamao de los grupos de ensayo. Es probable que en el futuro sigan estas reuniones para discutir si es realmente necesario todo el abanico de ensayos toxicolgicos que actualmente se realizan. Cambios en este punto que implicaran la introduccin de mtodos alternativos, podran suponer una disminucin importante del nmero de animales utilizados. Reemplazo Se consideran mtodos alternativos de reemplazo a aquellos que permiten alcanzar el objetivo propuesto sin realizar ensayos u otros procedimientos experimentales con animales. Russell y Burch distinguan entre reemplazo relativo cuando un animal deba ser sacrificado para obtener clulas, tejidos u rganos destinados a un ensayo in vitro, y reemplazo absoluto si no se utiliza ninguno. En este sentido, se habla tambin de reemplazo cuando se emplean especies inferiores en la escala filogentica, en especial con un sistema nervioso menos sensible al dolor. En el momento que se inicia la planificacin de un proyecto de investigacin, es cuando hay que reflexionar sobre que tcnicas de reemplazo son aplicables. Para evitar repeticiones de ensayos intiles, tendra gran inters que existiera alguna base de datos donde se pudiera almacenar, consultar e intercambiar informacin sobre todo tipo de ensayos en animales. Se acostumbran a publicar slo los resultados brillantes y rara vez se publican experimentos que no salen bien, y desde el punto de vista tico seran de gran utilidad ya que se evitara el uso de animales en ensayos ya realizados, donde se repiten continuamente los mismos errores. Siempre que sea posible, se han de utilizar tcnicas fsicas y qumicas basadas en las propiedades de las molculas. Cada vez son ms utilizados los modelos matemticos o de simulacin. Por ejemplo, los modelos cuantitativos que relacionan estructura y actividad, aprovechando correlaciones entre la estructura molecular y la actividad biolgica de productos, pueden predecir tanto actividades farmacolgicas como efectos secundarios potenciales. Tambin se crean modelos para el diseo molecular de frmacos de unas caractersticas definidas y especficas, o bien modelos basados en sistemas de tipo bioqumico, fisiolgico, farmacolgico o toxicolgico. En los ensayos toxicolgicos se est difundiendo el uso de organismos inferiores con sensibilidad limitada, entre otros, animales no mamferos, invertebrados, plantas, microorganismos, en ensayos toxicolgicos (Cuadro20-3). Tambin se pueden utilizar embriones de vertebrados antes de alcanzar el punto a partir del cual su uso en experimentos ya est regulado. En muchas reas de la biomedicina, los mtodos in vitro son los ms elegidos y reemplazan a los modelos animales al aportar una informacin cientfica superior. Se realizan ensayos en cultivos celulares, tisulares, fracciones subcelulares, rganos perfundidos, en cultivo, reconstituidos o en cortes, explantes, reagregados celulares, cocultivos (Cuadro 20-4). Se utilizan clulas genticamente modificadas y muestras de procedencia humana, aunque, a veces, son difciles de obtener, guardar y distribuir. En el Cuadro 20-4, se resumen los mtodos in vitro ms representativos. Los estudios en humanos, incluyendo los realizados en voluntarios sanos, estudios epidemiolgicos y de vigilancia despus de estar los productos en el mercado, se consideran alternativas al uso de animales, un ejemplo clsico son los ensayos de irritacin drmica en humanos como alternativa al ensayo de cosmticos en animales.

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Multicelulares no mamferos Protozoarios Planarias Nematodos Moluscos Peces Anfibios Varios insectos Otros

Campos de aplicacin Embriologa Neurobiologa Endocrinologa Biologa ambiental Toxicologa Carcinognesis Mutagnesis Teratognesis Estudios de reproduccin

Cuadro 20-3. Especies inferiores, menos sensibles, que sustituyen a los animales de experimentacin usuales. Se indican las reas de investigacin en general en las que se est utilizando este tipo de grupos biolgicos

Metodologa Cultivos celulares de un slo tipo de clulas: primarios lneas establecidas Cocultivos: mixtos de varios tipos de clulas Cultivos tisulares Citometra de flujo Unin a ligandos o fijacin (binding) receptores subunidades de canales Parches de membrana (patch clamp) reacciones enzimticas microsomas aislados enzimas sustratos Molculas aisladas protenas aminocidos segundos mensajeros material gentico

Material Material fresco Comercializadas

Aplicaciones Accin directa sobre la diana

Material fresco

Diana en condiciones ms cercanas a las fisiolgicas Efecto sobre tejido sin desnaturalizar Reacciones endocelulares Efectos de agentes: - sinaptosomas

Cortes de tejido Clulas aisladas Fracciones subcelulares Agonistas y Antagonistas

Canales inicos Sustancias purificadas

Flujo de iones Enzimologa

Sustancias purificadas

Efectos moleculares

Cuadro 20-4. Tipo de tcnicas in vitro, con sus caractersticas y aplicaciones

Por otro lado, un buen ejemplo de ensayo alternativo que ha permitido eliminar el uso de animales, lo constituye el ensayo in vitro de deteccin del embarazo en seres humanos, ya que se ha reemplazado el uso de una gran cantidad de conejos, por un ensayo ms rpido, ms econmico y de mayor precisin. El ensayo del Lisado de Amebocitos del Limulus (LAL) ha sustituido el uso de conejos para detectar endotoxinas en ensayos de pirgenos. Otro ejemplo muy evidente, es el desarrollo de metodologas in vitro para producir anticuerpos monoclonales en sustitucin de los dolorosos modelos de ascitis en ratn.

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Un ensayo que demuestra la utilidad de aplicar tcnicas de biologa molecular para desarrollar una alternativa, es el ratn transgnico PVR que ha hecho que las compaas farmacuticas que durante ms de cuarenta aos haban utilizado primates para ensayar la neurovirulencia de las vacunas orales de polio, usen este modelo. El desarrollo de mtodos alternativos que sustituyan el uso de animales tiene que estar basado en conocimientos cientficos slidos. Una de las partes ms atractivas del libro de Russell y Burch es su discusin sobre los modelos descritos de alta fidelidad y de discriminacin. Sealan que est supervalorado el asumir que los mamferos son siempre los mejores modelos para ensayar productos, cuyo usuario final es el hombre. Continan diciendo que lo ms grave de este mito es que ignora todas las ventajas de la correlacin, ya que la respuesta de dos especies totalmente diferentes a una causa puede dar una buena correlacin, a pesar de tener otras diferencias bien manifiestas entre ellas. Este argumento sobre fidelidad, discriminacin y correlacin entre las especies sigue estando vigente y brinda muchas posibilidades de estudio. Ya que no parece probable que un modelo animal pueda ser reemplazado siempre por un nico ensayo in vitro, va a ser prioritario que se desarrollen, evalen y optimicen las estrategias de investigacin y se organicen de un modo integral. Para un resumido anlisis comparado entre las ventajas y limitaciones de las pruebas in vitro vase el Cuadro 20-5.

Ventajas
Las sustancias bioactivas actan directamente sobre las dianas biolgicas. Por tanto, aportan informacin a nivel molecular. Se evita la interferencia de la respuesta total del organismo. Se obtienen resultados en tiempos muy cortos. Precisan una cantidad muy reducida del producto en estudio: ahorro del mismo. Requieren menor espacio y estructura de laboratorio. Drstica reduccin de infraestructura y gasto de instalaciones de animales. Se puede usa material biolgico humano, lo que constituye una ventaja sin precedentes. Permiten automatizar la investigacin: robtica. Sustituyen una cantidad ingente de animales (Repetto G, 1999).

Limitaciones
No se manifiesta la respuesta total del organismo (lo que por un lado es una ventaja, pero por otro un inconveniente). Se observa la bioaccin solamente sobre el material empleado. No se evidencian los efectos secundarios. El metabolismo del producto puede ser diferente a cuando es administrado al organismo completo. No sustituyen del todo a las pruebas in vivo.

Cuadro 20-5. Ventajas y limitaciones de las pruebas in vitro

CARACTERSTICAS DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS Ventajas Su ventaja principal radica en todas las consideraciones ticas sobre las que se quiera enfatizar. Una buena reflexin se fundamenta en que los investigadores evalen la relacin coste-beneficio en funcin del dolor o malestar ocasionado a los animales cuando planifican un proyecto. Cualquier cambio o mejora en los procedimientos que colabore en el cumplimiento de las 3 R va a suponer un paso firme hacia delante, pues ayuda a que paulatinamente se modifiquen los hbitos de trabajo en las instituciones. Las 3 R proporcionan un marco que permite mejorar desde el punto de vista de la tica la realizacin de procedimientos experimentales en animales.

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Aunque no se puede ni se debe generalizar, algunos mtodos alternativos, como los realizados in vitro permiten ahorrar tiempo en su realizacin y en los costes, aunque evidentemente habr que hacer las inversiones correspondientes para adecuar el laboratorio a las nuevas tecnologas. Sobre estas tcnicas se puede ejercer un mejor control de las variables y as modificarlas de modo secuencial. En determinadas circunstancias se puede aprovechar de una mayor versatilidad en el diseo, posibilidad de poder utilizar clulas humanas y en algn tipo de estudio de nuevas molculas, puede ser de vital importancia, utilizar cantidades muy pequeas de sustancias. Otro aspecto muy positivo de los mtodos alternativos y complementarios es que pueden aportar informacin que nunca se podra conseguir en trabajos realizados con el animal completo. Mediante modelos in vitro se puede determinar con precisin el mecanismo de accin que induce un efecto farmacolgico, txico o metablico determinado. Se puede identificar el comportamiento de frmacos ante distintos citocromos, medir riesgos adversos causados por polimorfismo gentico, lo que se denomina idiosincrasia metablica, e incluso crear modelos de simulacin de situaciones no previstas. Limitaciones A veces, algunas de las ventajas enumeradas en el apartado anterior se convierten en limitaciones. Se puede considerar que algunos modelos poseen un exceso de simplicidad y por ejemplo, no permiten evaluar la reversibilidad de determinadas lesiones. Se encuentran dificultades en poder realizar ensayos de larga duracin, o estudios que requieren administraciones repetidas. Es igualmente complejo evaluar efectos secundarios provocados por interacciones entre distintos frmacos. Uno de los puntos ms limitantes de la mayora de modelos in vitro es la imposibilidad de detectar respuestas individuales, es decir siempre son de carcter uniforme. Asimismo, est el hecho de que no se obtienen efectos no buscados, siempre es el investigador el que ha de anticiparse a prever si tal efecto puede o no presentarse, y entonces disear el ensayo correspondiente. Por el contrario, cuando se trabaja con el animal aparecen con frecuencia efectos inesperados durante la realizacin de un ensayo que obligan a remodelar o a cambiar el modelo experimental para valorar estas actividades. En modelos animales, el organismo ejerce mecanismos reguladores y compensatorios de las distintas funciones, circunstancias que no son posibles en modelos ms simplificados, lo que implica una mayor dificultad cuando se extrapolan resultados a partir de modelos in vitro (Cuadro 20-6). APLICACIN DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS A continuacin, se realiza un repaso a la situacin en que se encuentran los mtodos alternativos y su nivel de utilizacin en la docencia, en los centros que realizan proyectos de investigacin bsica y en los laboratorios que llevan a cabo proyectos de investigacin aplicada al desarrollo de nuevos frmacos o productos de consumo. Docencia Las estadsticas de algunos pases europeos indican que slo se utilizan para docencia en torno al 1% de los animales empleados en investigacin. Sin embargo, este dato no es del todo fiable, dado que no todos los pases aportan informacin al respecto, por no disponer de procedimientos normalizados de recogida de datos. La enseanza universitaria en ciencias biomdicas realiza clases prcticas que implican el uso de animales o de muestras de procedencia animal en asignaturas como farmacologa, fisiologa o anatoma. El propio Consejo de Europa establece que el nmero de animales utilizados para docencia se restringir a aquellas prcticas absolutamente necesarias.

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Criterio Medidas de toxicidad inespecfica Evaluacin productos actividad metablica Simulacin rutas administracin Medida de interaccin de rganos Medidas de variacin biolgica Medida de efectos crnicos Medidas de recuperacin Deteccin de efectos secundarios Respuesta dependiente la dosis Variabilidad especfica Econmico Cuantitativo Rapidez Sensibilidad Objetivo, punto final reproducible Reproducibilidad de resultados Uso humanitario de los animales

In vivo +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + + + + ++ ++ ++ ++

In vitro + ++ + ++ ++ ++ ++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Cuadro 20-6. Comparacin entre mtodos in vivo e in vitro de diferentes criterios contemplados en un ensayo de toxicidad. Condensado de Stark & Shopsis (1983): Annals, NYAS, 1983. Muy bueno, +++; bueno, ++; regular, +; malo -

Paralelamente, las organizaciones encargadas del bienestar animal, estudiantes y algunos profesores se han cuestionado el uso de animales en algunos tipos de experiencias prcticas y han empezado a prestar atencin a diversas opciones que pueden contribuir al cumplimiento de las 3 R en la docencia. Entre ellas se pueden citar: Modelos, simuladores mecnicos. Pelculas, videos interactivos, CDROM. Modelos tridimensionales. Simulaciones por ordenador y sistemas de realidad virtual. Experimentos en plantas. Estudios de observacin y de campo. Materiales de desecho procedente de mataderos. Ensayos in vitro en cultivos celulares. Prcticas clnicas.

Con estas orientaciones se pretende que disminuya el nmero de animales utilizados en la enseanza, aunque es obvio que los estudiantes van a seguir necesitando animales para desarrollar sus habilidades quirrgicas u otras tcnicas de laboratorio. Actualmente se encuentra disponible un gran abanico de alternativas. Es fundamental el papel a realizar por los docentes, ya que deben estar muy al da de los productos existentes en el mercado, al estar obligados a justificar el uso continuado de animales en docencia. En este campo no puede argumentarse el coste de los mtodos alternativos, pues en la mayor parte de los casos el precio es muy bajo, ya que dichos modelos estn desarrollados por departamentos universitarios cuyo objetivo es difundir el medio sin nimo de lucro. As, se encuentran al alcance de todos, muchas bases de datos dedicadas a promocionar los distintos tipos de mtodos alternativos aplicados a la educacin. En NORINA, AVAR, EURONICHE y casi en todas las pginas web de universidades en las que se impartan ciencias biomdicas se consigue amplia y detallada informacin al respecto (vase Anexo 2)

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Es preciso recordar tambin que existen sistemas muy adecuados, de fcil comprensin y muy amenos, para utilizar en clases prcticas destinadas a alumnos de enseanza secundaria y preuniversitaria. Investigacin bsica En este campo es donde se ha producido una mayor difusin de los mtodos in vitro. Actualmente, en los congresos sobre cualquier disciplina mdica se detecta que ms del 50% de las presentaciones utilizan modelos in vitro, a diferencia de hace una decena de aos donde el predominio era total para los modelos animales. Esto se debe a varias causas que han confluido en el tiempo. Por una parte las consideraciones de tipo tico, aunque han sido fundamentales los avances tcnicos que permiten cultivar y mantener estables casi cualquier tipo de clula, las notables mejoras en el material de soporte y aparatos de medicin, y la buena formacin en nuevas tecnologas de los jvenes investigadores. La aplicacin de estas metodologas aporta continuamente conocimientos de gran inters y se pueden ver plasmados en el incremento de artculos publicados en revistas cientficas. Los ensayos utilizados en investigacin suelen estar diseados por los propios investigadores y requieren como nica aprobacin, la validez y aceptacin por la comunidad cientfica. Investigacin aplicada Se consideran proyectos de investigacin aplicada a aquellos cuyos resultados tienen una aplicacin que a corto plazo producir beneficios en el hombre o en otras especies animales u organismos vivos. Por ejemplo, la evaluacin de la eficacia, la seguridad, el metabolismo, o el mecanismo de accin de productos farmacuticos, cosmticos, veterinarios, sustancias qumicas, de uso agroalimentario, productos de consumo o que afectan al ambiente. Los ensayos farmacolgicos se estn realizando cada vez ms en modelos in vitro, en especial los procesos de seleccin de molculas. En los datos estadsticos publicados anualmente se aprecia una disminucin del uso de animales en general, pero de manera especfica en los animales utilizados por las industrias. En Gran Bretaa el nmero de procedimientos experimentales realizados en animales en el rea de toxicologa disminuy un 11% en 1997. Estos ensayos de seguridad son definidos por las agencias que aprueban el registro o salida al mercado de los productos. Hasta hace pocos aos todos estos estudios se realizaban con animales, pero paulatinamente se han ido desarrollando mtodos alternativos bajo el amparo de las 3 R que van sustituyendo a los primeros. Para ello, los nuevos mtodos han de ser validados y luego aceptados por los legisladores que son los que se encargan de exigir su cumplimiento. La validacin de los mtodos ha sido mucho ms lenta de lo que en principio se esperaba. Los ensayos regulados por leyes tienen que pasar tres estados el desarrollo del ensayo, la validacin formal y la aceptacin por las autoridades legisladoras. Este proceso se describe con ms detalle en este mismo captulo. Reciente investigaciones han contemplado la relacin entre biomarcadores y aspectos tales como la dieta y enfermedades de diferentes tipos. Se define al biomarcador como aquel parmetro que proporciona informacin sobre la exposicin a un xenobitico o bien el efecto actual o potencial de esta exposicin a un individuo o a un grupo de personas. Se han desarrollado muchos biomarcadores relacionados con efectos mutagnicos, genotxicos y carcinognicos. El uso de biomarcadores contribuye al cumplimiento de las 3 R adems de proporcionar un refinamiento en los ensayos con animales, pueden establecer puntos de medida ms sensibles y en etapas ms tempranas. Adems tambin ayudan a comprender los mecanismos de accin de los ensayos in vitro y facilitar su validacin y aceptacin. En el campo de control de productos biolgicos, tambin se estn registrando notables avances en el cumplimiento de las 3 R. Regularmente ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) publica informes sobre la situacin en que se encuentran los mtodos alternativos para evaluar dichos productos.

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MTODOS ALTERNATIVOS PARA EVALUAR LA SEGURIDAD DE PRODUCTOS QUMICOS Y COSMTICOS La mayor parte de los ensayos oficiales para evaluar la seguridad de productos qumicos y cosmticos se llevan a cabo en modelos animales. Los resultados de dichos estudios han sido siempre muy discutidos dada la dificultad de su extrapolacin para evaluar el riesgo potencial que supone para el hombre estar expuesto a sustancias qumicas. En las directivas comunitarias se describe que un producto cosmtico que se encuentre en el mercado no puede causar ningn tipo de dao a la salud del consumidor bajo condiciones normales de uso. Lgicamente la mayor presin social de oposicin al uso de animales en investigacin es cuando se trata de ensayar cosmticos, por la obvia razn de que no se consideran productos absolutamente necesarios para la salud humana. En febrero de 1992, el Parlamento Europeo aprob una enmienda a la directiva que regula los ensayos en cosmticos, indicando la prohibicin de lanzar al mercado cosmticos que contengan ingredientes que hubieran sido ensayados en animales, a partir del 1 de enero de 1998, siempre que existieran mtodos alternativos debidamente validados. Dado que no se cumplieron las expectativas, aprobaron una prrroga hasta el 30 de junio del 2002. La estadstica sobre el nmero de animales utilizados en Gran Bretaa para ensayar cosmticos en 1997 indica que un 8% de los animales son usados en ensayos de seguridad y slo un 0.1% se utiliz en ensayos de cosmticos. Recientemente, en este pas se ha acordado no ensayar los productos cosmticos terminados en animales, aunque se podrn realizar experimentos en animales para evaluar la seguridad de los nuevos ingredientes. Otro aspecto que confunde mucho a los consumidores es la frase que aparece en muchos cosmticos no ensayado en animales, ya que permite diversas interpretaciones, por ello se est preparando una legislacin que defina el significado exacto de esta frase. Los ensayos de irritacin ocular y drmica en conejo (test de Draize) son los ms criticados y por ello se est trabajando con el fin de encontrar mtodos que puedan reemplazarlos. El ojo del conejo, aunque similar en tamao al ojo humano, difiere de ste en numerosos aspectos. Estas diferencias en la fisiologa, unida a la subjetividad que tiene el ensayo para valorar las lesiones y a la variabilidad de resultados encontrados al ensayar un mismo producto entre distintos laboratorios, hacen lgicas las objeciones a este ensayo. Sin embargo, el ensayo de Draize, cuando es realizado por personal experto, es muy preciso para evaluar sustancias irritantes del ojo humano, especialmente cuando se trata de sustancias ligeramente irritantes. Adems, permite controlar la recuperacin de las lesiones despus de la exposicin a sustancias irritantes. Despus de haber intentado realizar diversos ensayos de validacin de muchos mtodos alternativos al de Draize, la mayora de los expertos creen que se va a necesitar una batera de ensayos in vitro, ya que ninguno es capaz de medir todas las variables. Incluso se ha detectado que algunos mtodos son apropiados y ms sensibles para determinados tipos de sustancias qumicas o dependiendo de cual sea su uso. Por otra parte, algunos ensayos son muy tiles para discernir el poder irritante de sustancias qumicas por su inters en etiquetarlas para su transporte, almacenamiento o uso accidental. La primera recomendacin de los organismos internacionales cuando se evalan efectos irritantes potenciales, es comprobar el grado de acidez o alcalinidad de los productos. Si el pH es inferior a 2 o superior a 11.5, ya se cataloga la sustancia como muy irritante y no requiere otro ensayo. Los mtodos alternativos al ensayo de irritacin ocular se pueden clasificar en: Mtodos fisicoqumicos como son la medicin del pH y otras propiedades qumicas, o bien ensayos comercializados como, Ocular Irritation (antes Eytex). Este ensayo est compuesto por

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una estructura sinttica que simula la crnea. Se correlaciona el efecto irritante provocado por las sustancias a ensayar y la desnaturalizacin de las protenas. Cultivos celulares. Se pueden utilizar diversos tipos de clulas pero mayoritariamente son fibroblastos. La citotoxicidad se determina mediante distintos indicadores, en funcin del objetivo del ensayo. Ensayos sobre tejidos aislados o embriones. Se utilizan la membrana corioalantoidea del huevo de gallina (HET-CAM) y variaciones sobre el mismo, o el ensayo de la permeabilidad ocular en crnea aislada de bovino.

En el caso de alternativas a la irritacin drmica se utiliza el Dermal Irritation (antes Skintex) que acta de manera similar al ocular, pero en este caso mide las alteraciones provocadas por las sustancias a ensayar en una estructura formada por queratina, colgeno y otras protenas drmicas. Otra aproximacin es relacionar estructuras con parmetros qumicos conocidos con el grado de corrosividad. Asimismo, existen cultivos de queratinocitos, sobre los que se miden los efectos mediante diversos indicadores. Modelos tridimensionales de piel reconstituida (Episkin, Skin2). Para clasificar sustancias qumicas corrosivas se encuentra en el mercado Corrositex que proporciona una biomembrana y un sistema de deteccin que se colorea en cuanto la sustancia produce un efecto corrosivo. Diferentes ensayos de absorcin percutnea, toxicidad aguda y subcrnica, sensibilizacin, mutagnesis, fotomutagnesis y fototoxicidad forman parte de los ensayos exigidos para evaluar la seguridad de los productos cosmticos. Se van produciendo avances en estos ensayos para ir contribuyendo al cumplimiento de las 3 R. Actualmente, slo se aplican estos ensayos en el mbito interno de las empresas para seleccionar nuevos productos o ingredientes y algn mtodo alternativo est permitido en ciertos pases europeos, pero al no existir acuerdo entre ellos, la mayora de agencias legisladoras siguen exigiendo los mtodos tradicionales en animales para evaluar la seguridad de los productos cosmticos. DESARROLLO Y VALIDACIN DE UN MTODO ALTERNATIVO La validacin es aquel proceso que demuestra la aplicabilidad y la fiabilidad de un mtodo desarrollado para alcanzar un objetivo concreto. Un ensayo se considera validado cuando han quedado perfectamente definidas las caractersticas del ensayo, con sus ventajas y sus limitaciones. La exactitud de un mtodo es una medida objetiva de la reproducibilidad dentro de un laboratorio y entre ellos. Las medidas de aplicabilidad de un ensayo han de contener la operativa de trabajo controlada, es decir conocer la sensibilidad, especificidad, etc. de las variables a medir o las tcnicas a emplear. Cuando se valida un mtodo alternativo, hay que desarrollar hiptesis que relacionen los efectos medidos con los efectos biolgicos de las especies afectadas. Esta relacin se denomina modelo de prediccin. El mtodo alternativo ideal debe medir un hecho que sea lo ms parecido posible al mecanismo de accin o bien se relacione con el efecto que interesa evaluar. Igualmente los resultados obtenidos a partir de l, se deben correlacionar con la salud humana, animal o aspectos ecolgicos. Generalmente, para sustituir un ensayo en animales por un alternativo hay que demostrar que el ensayo proporciona unos resultados equivalentes o mejores que los originales. Un problema es la disponibilidad tan limitada de datos en humanos o en las especies de referencia. No siempre han sido buena referencia los datos disponibles y ello ha hecho retrasar la validacin de mtodos alternativos, pues se les exiga ms de lo que aportan los ensayos in vivo en curso. Para desarrollar un nuevo ensayo, ha surgido un enfoque ms realista. Los esfuerzos de validacin deben ir ms orientados a proporcionar los conocimientos basados en objetivos cientficos que en hacer una sustitucin directa del ensayo en animales. No es preciso saber qu sustancias qumicas provocan cncer en roedores, interesa averiguar qu sustancias van a causar cncer con mayor probabilidad en los seres humanos, sobre la base de un buen conocimiento de su accin cancergena en stos. Es decir, los ensayos tienen que estar fundamentados en una mejor comprensin de los

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mecanismos de accin de los procesos farmacolgicos y toxicolgicos, que basados en unas correlaciones estadsticamente significativas entre dos tipos de efectos o a veces en suposiciones poco fundadas de semejanza entre especies. Existen organizaciones internacionales que se dedican a la validacin y armonizacin de los mtodos alternativos para resolver los problemas mencionados y contribuir al avance de mtodos alternativos. Despus de varias reuniones internacionales entre ECVAM, ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) y OCDE (Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmico) han acordado una serie de criterios para la validacin y aceptacin de los nuevos mtodos. ECVAM fue creado por la UE en 1991 y sus funciones son las siguientes: Coordinar la validacin de mtodos alternativos en el mbito de la Unin Europea. Actuar como lugar de intercambio de informacin sobre el desarrollo de mtodos alternativos. Crear, mantener y gestionar una base de datos sobre procedimientos alternativos. Fomentar el dilogo entre legisladores, industrias, cientficos, asociaciones de consumidores, organizaciones defensoras del bienestar animal, con el fin de desarrollar, validar y conseguir el reconocimiento internacional de los mtodos alternativos.

ECVAM se estableci como una unidad del Environmental Institute del Joint Research Centre en Ispra, Italia, pero actualmente est adscrito al Institute for Health and Consumer Protection. Hay que tener en cuenta que slo precisan ser validados aquellos mtodos alternativos que estn controlados por los organismos legisladores. El proceso de validacin se encuentra esquematizado en el Cuadro 20-7. Un investigador que haya desarrollado un mtodo alternativo y considera que tiene inters para que sea validado, ha de presentarlo al ECVAM, si pertenece a un pas de la Unin Europea, siguiendo las indicaciones correspondientes y en caso de ser aceptado deber pasar por un proceso arduo y complejo. En el Cuadro 20-8 se describen las etapas a seguir para desarrollar y validar un ensayo toxicolgico. Con el fin de evitar fracasos durante la validacin, actualmente es muy exigente la etapa de prevalidacin. En esta etapa quedar bien establecido que se dispone de un protocolo normalizado y que existen laboratorios capaces de realizar el ensayo. Es importante seleccionar los controles positivos y negativos idneos para el ensayo. Se definir el modelo de prediccin y qu tipo de sustancia se ensaya en el experimento, tener la seguridad de que el mtodo es transferible y reproducible y establecer una relacin de las limitaciones del ensayo. La validacin de un mtodo alternativo es un requisito imprescindible para que sea aceptado como ensayo con fines legislativos. Los criterios que tiene que cumplir una validacin son: Definicin de una base cientfica del mtodo, que contenga una exposicin clara de la utilizacin y aplicacin del mismo. Definicin de la relacin existente entre los parmetros que se evalan en el nuevo mtodo y el efecto biolgico u objetivo del ensayo Descripcin de un protocolo detallado que incluya los materiales necesarios, qu y cmo se van a realizar las medidas, criterios de aceptacin del ensayo, cmo se analizarn los resultados, limitaciones del experimento. Valoracin de la variabilidad de las medidas en el ensayo y de la reproducibilidad dentro de un mismo laboratorio y entre todos ellos. Demostracin de la validez del ensayo utilizando sustancias qumicas de referencia. Obtencin de un nmero suficiente de resultados que permita una buena comparacin con el ensayo al que se pretende sustituir. Disponibilidad de datos de referencia de reconocida calidad del ensayo tradicional con el que se compara. Realizacin del ensayo, a ser posible, segn las buenas prcticas de laboratorio (BPL). Disponibilidad de todos los resultados que avalan la validacin para ser revisados.

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I. II.

Desarrollo del ensayo Prevalidacin / optimizacin del ensayo

Plan preliminar Definir las bases y objetivos del ensayo Desarrollar el protocolo Desarrollar los valores control Perfeccionar los datos/resultados del modelo de prediccin B. Actividades Capacitar y formar los laboratorios Medir la reproducibilidad dentro y entre laboratorios Identificar las limitaciones del ensayo A.

III. IV.

Determinar las posibilidades de la validacin

A. Analizar el desarrollo del ensayo y los resultados de la prevalidacin B. Normalizar el protocolo

Validacin del ensayo

A. Constituir el comit de gestin Definir el objetivo del estudio de validacin Disear el estudio Seleccionar los laboratorios participantes Establecer los procedimientos de gestin y supervisin B. Procedimientos a realizar antes de iniciar el ensayo Realizar los procedimientos de recogida de registros Seleccionar las sustancias qumicas de referencia Codificar y distribuir las sustancias qumicas de referencia C. Ensayar las sustancias qumicas codificadas Medir las acciones realizadas entre los laboratorios Recopilar y evaluar los resultados D. Interpretacin del ensayo Analizar y resumir los resultados del ensayo Comparar los resultados con el modelo de prediccin establecido Aceptar o rechazar el modelo

V.

Solicitar la aprobacin del ensayo a efectos legislativos

A. Preparar el informe B. Presentar los resultados que avalan la solicitud C. Preparar los resultados para su publicacin

Cuadro 20-7. Esquema orientativo del proceso de validacin de un ensayo

Situacin Investigacin Comprensin de los mecanismos txicos bsicos Desarrollo del mtodo Nuevos mtodos para aplicaciones concretas Prevalidacin Optimizacin del protocolo para ser transferible Validacin Establecimiento de la exactitud y la aceptabilidad Revisin Revisin exhaustiva por cientficos independientes Consideraciones del organismo legislador Decisin por el organismo legislador sobre la del ensayo para una aplicacin concreta aceptacin Utilizacin del mtodo Uso obligado del nuevo mtodo aceptado
Cuadro 20-8. Etapas en el desarrollo de un nuevo mtodo alternativo para un ensayo toxicolgico

Etapas

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Realizar la validacin de un mtodo requiere un gran esfuerzo y supone un coste econmico considerable, siendo imprescindible la colaboracin entre los organismos internacionales encargados de fomentar los mtodos alternativos que reemplazan modelos en animales, gobiernos, cientficos del mundo acadmico y de la industria, organismos legisladores y asociaciones preocupadas por el bienestar animal. Se podrn conseguir los mejores beneficios si se proponen metas realistas que sean alcanzables. Dada la complejidad del proceso de validacin y aceptacin de los mtodos alternativos, es preciso modificar los sistemas y adaptarlos a las necesidades actuales. La aceptacin de mtodos alternativos se enfrenta a algunas dificultades, adems de la propia validacin, como es el caso de la competencia entre los propios cientficos para imponer sus mtodos y criticar el propuesto por otra institucin, as como la dificultad en asumir la responsabilidad de aceptar un cambio en los mtodos que evalan la seguridad de los productos por los consumidores ante posibles efectos adversos. SITUACIN ACTUAL DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS VALIDADOS POR DIFERENTES ORGANISMOS INTERNACIONALES A pesar de llevarse muchos aos trabajando en conseguir validar mtodos y de haberse destinado importantes recursos, lamentablemente la lista de ensayos validados es muy corta. En el Cuadro 20-7 se indican los pasos del proceso de validacin de un ensayo. Buena parte de los esfuerzos se desarrollan en el rea de la toxicologa, con diferentes etapas antes de la validacin definitiva de un mtodo (vase Cuadro 20-8). Recientemente han superado las pruebas de validacin del ECVAM los siguientes ensayos: Fototoxicidad Fijacin del rojo neutro en clulas 3T3. Corrosividad Ensayo de la resistencia elctrica transcutnea en piel de rata (TER). Modelo de piel humana constituida (Episkin). Estos ensayos se encuentran en fase de estudio por la OCDE, como organismo responsable de elaborar las directrices y protocolos de ensayos que luego solicitan las agencias legisladoras de cada pas para autorizar la salida al mercado de los productos correspondientes. En EEUU, el ICCVAM ha aprobado como mtodo alternativo el test del Ndulo Linftico en ratn (LLNA) que evala la sensibilizacin drmica. Este mtodo utiliza el ratn y dura seis das, lo que aporta ventajas al ensayo tradicional de maximizacin. Actualmente la legislacin europea admite que el modelo LLNA sea el primero en realizarse y si el resultado es positivo, no es necesario hacer el de maximizacin, en caso de resultado negativo se hace el ensayo habitual. Est en estudio que el LLNA quede como nico ensayo de sensibilizacin drmica. Un ensayo que siempre se menciona como alternativo es el ensayo de genotoxicidad o test de Ames (vase Captulo 18), pero en honor a la verdad, no ha reemplazado a ningn ensayo existente, se desarroll, a mediados de los ochenta, como tal y no pas ningn ensayo de validacin del sistema actual. Se encuentra incorporado en las directrices OCDE y es el primer modelo de eleccin para valorar el efecto mutagnico de una sustancia qumica. Su importancia e inters radican en que se trata de un modelo que utiliza microorganismos y est aceptado internacionalmente. Muchos mtodos han ido reduciendo el nmero de animales, tal es el caso de la prueba de sensibilizacin drmica en cobayo. Otros han modificado el ensayo. Las toxicidades agudas tradicionales (DL50) en muchos casos se han sustituido por el clculo de la Dosis Lmite o los procedimientos de la Dosis Fija o del Up and Down.

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El mtodo de medicin del efecto pirgeno en conejos, realizado de manera continuada en los laboratorios de control de muchas empresas farmacuticas, se ha sustituido, para la mayor parte de productos, por el ensayo del lisado del amebocito (LAL), que detecta las endotoxinas presentes. Est admitido y aprobado por las principales farmacopeas. En algunos organismos de EEUU y Canad, aceptan el Corrositex como alternativa al ensayo en piel de conejos, para clasificar el poder corrosivo de las sustancias qumicas. ICCVAM ha emitido en enero de 1999, un informe donde se recogen los resultados del ensayo de validacin de Corrositex y ECVAM lo tiene en proceso de validacin. Es de prever que esta relacin de ensayos aumente continuamente, debido ECVAM e ICCVAM tienen muchos en proceso de validacin. No es suficiente que los organismos reguladores y los gobiernos destinen recursos al desarrollo y validacin de mtodos alternativos y que las asociaciones defensoras de los derechos de los animales defiendan y difundan el uso de alternativas a la experimentacin animal. Es absolutamente necesario que los propios investigadores, usuarios de animales de laboratorio y de mtodos alternativos, se incorporen a dichas tareas y manifiesten a la opinin pblica como cumplen las 3 R y como contribuyen sus resultados al avance de la ciencia. INSTITUCIONES VINCULADAS AL DESARROLLO DE MTODOS ALTERNATIVOS En el Anexo 2 del libro se relacionan una serie de direcciones, bases de datos y pginas web donde se puede encontrar informacin de inters respecto a mtodos alternativos. RESUMEN La opinin pblica quiere que se desarrollen y difundan los mtodos alternativos. Los cientficos deben satisfacer las preocupaciones del pblico sin comprometer la calidad cientfica de su investigacin. Para ello se han desarrollado los mtodos alternativos a la experimentacin animal, gracias a los conceptos, reduccin, refinamiento y reemplazo introducidos por Russell y Burch. En el captulo se reflexiona sobre como pueden contribuir los usuarios de animales de laboratorio al cumplimiento de las 3 R. El uso de estas tcnicas permite a los cientficos realizar su trabajo de un modo ms rentable y eficaz. Se describe tambin la situacin en que se encuentran los mtodos alternativos y cuando han de aplicarse a la docencia, en proyectos de investigacin bsica e investigacin aplicada. Dado que la mayor presin social en lo que se refiere a la oposicin al uso de animales de experimentacin se produce cuando se trata de ensayar cosmticos y sustancias qumicas, se dedica un apartado a repasar los mtodos alternativos disponibles. Se presta una especial atencin al desarrollo y validacin de mtodos alternativos, proceso requerido para todos los mtodos oficiales que exigen los organismos legisladores encargados de garantizar la seguridad de los ciudadanos. Se aporta informacin complementaria sobre los mtodos validados y aceptados hasta la fecha de edicin del libro. El progreso de la ciencia depende de que se realicen conjuntamente trabajos de investigacin in vivo, in vitro y ensayos clnicos. Para conseguir este objetivo, hay que tener en mente, la realizacin de una buena ciencia, el cumplimiento de todas las consideraciones ticas aplicables y una buena dosis de lgica y sentido comn. BIBLIOGRAFA Balls M, Goldberg AM, Fentem JH et al: The three Rs: the way foirward, ATLA, 23:838,1995 Balls M., Berg N., Bruner L.H. et al: Eye irritation testing: the way forward, ATLA, 27:53, 1999 Balls M, Straughan D.W.: The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand 1996;86:11-8 Balls M.: Replacement of animal procedures: alternatives in research, education and testing. Lab Anim, 28(3):193-211 1994

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