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Leon 1. Production denzymes industrielles

Gnie de la biocatalyse et gnie des procds. UVT. Pr Mohamed GARGOURI.

1. Exemple de production industrielle : BASF

denzyme

chelle

BASF est un groupe dindustries chimiques. Il sintresse de plus en plus aux activits de production denzymes pour sa propre utilisation ou pour la vente dautres secteurs. BASF produit des enzymes utilises comme des additifs dans lalimentation pour animaux : volaille et porc. Une enzyme au nom commercial Natuphos correspond une phytase. Cette enzyme est devenue la proprit industrielle exclusive de BASF depuis lachat de tous les brevets, procds et droits dune autre compagnie qui a particip au lancement du produit.

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Lenzyme est produite dans des fermenteurs de trs grands volumes (plusieurs m3) partir dorganisme gntiquement modifi du champignon Aspergillus niger avec un procd conomique en ressources. Le produit est vendu aprs extraction, et schage sans purification : sous forme de prparation enzymatique.

Source : BASF Interim Report 2nd Quarter 2006.

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Natuphos est mlange lalimentation de porc et de volaille. Une fois consomme par lanimal, elle aide mieux assimiler le phosphate contenu dans laliment dorigine vgtale. Ceci diminue significativement la quantit de phosphate inorganique ajout laliment. Les excrments de lanimal contiennent ainsi moins de phosphates et la contamination du sol et de leau est rduite de 1/3. Le mme procd permet lentreprise de produire dautres enzymes qui facilitent la digestion de certains polysaccharides comme Natugrain : xylanase.

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2. Dcouverte et screening dactivits enzymatiques

Des activits enzymatiques diverses sont dcouvertes dans des organismes vivants. Les enzymes industrielles proviennent de plantes, danimaux et essentiellement de microorganismes. 2.1. Screening disolat naturel Des milliers dchantillons du sol, de matriel vgtal et dautres peuvent faire lobjet dune recherche automatise dune activit ou dune voie enzymatique dintrt. Le screening utilise un milieu spcifique qui ne laisse pousser que les microorganismes exprimant un systme enzymatique donn. Exemple : un milieu contenant le xylan comme unique source de carbone et dnergie, ne laisse pousser que les microorganismes produisant des xylanases. Le screening peut se baser sur des donnes cologiques. Par exemple : un environnement salin comme dans les sebkhas, est uniquement habit par des organismes halophiles. On cherche alors dans ces organismes lactivit enzymatique rsistante au sel qui doit tre de prfrence stable et extracellulaire.

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Des mthodes physiques ou bases sur la composition du milieu de culture sont employes pour favoriser le dveloppement dune catgorie de microorganismes ou bien dfavoriser le dveloppement dautres. Critres de slection : pour distinguer lorganisme ayant lactivit recherche, on utilise un critre avec lequel il se distingue. Exemple : lutilisation dune couche opaque de casine comme seule source de carbone sur agar, peut rvler les microorganismes scrtant des protases en formant un halo clair d lhydrolyse de la casine autour des colonies dveloppes. Dautres mthodes utilisent des indicateurs colors ou des substrats chromognes. Le problme souvent rencontr avec le screening classique est la faible concentration de lenzyme dintrt dans les isolats microbiens naturels ou bien parfois des proprits insuffisantes pour lutilisation en industrie. Des manipulations gntiques permettent parfois damliorer les proprits du microorganisme ou de lenzyme.

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2.2. Screening molculaire Dans le cas o une enzyme aux proprits intressantes a t identifie chez une espce particulire, une recherche peut tre effectue pour des enzymes homologues chez des espces proches (reverse genetics). La squence dacides amins de la protine enzymatique peut nous donner une ide sur la squence probable des bases nuclotidiques dans le gne correspondant. En se basant sur cette information une sonde peut tre construite de 15 20 nuclotides. En utilisant la technique PCR sur lADN chromosomique despce proche, un gne homologue peut tre amplifi et transfr un organisme hte pour expression de lenzyme homologue.

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2.3. Screening gnomique Des milliers de gnes sont actuellement squencs et disponibles dans des banques de donnes. Les gnomes de plus de 800 organismes sont accessibles au public. Exemple : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome Des mthodes informatiques peuvent alors faciliter la recherche denzymes aux proprits bien dtermines.

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2.4. Screening protomique Dans le cas dexpression et de purification efficaces des protines, des analyses directes de la structure et de la fonction sont possibles grces des moyens informatiques et lautomatisme. Cette nouvelle technologie permet galement lanalyse fonctionnelle de grands nombres de protines recombinantes.

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3. Gnie protique

Le gnie des protines utilise un ensemble de techniques pour remplacer un acide amin par au autre ou une squence par une autre dans le but de modifier les proprits de la protine. Le gnie protique se base sur les progrs : o au niveau des connaissances des structures 3D dtermines par cristallographie aux rayons X ou par spectroscopie RMN, o au niveau de la modlisation informatique, o au niveau des technologies de lADN recombinant.

Les techniques de mutagense permettent maintenant deffectuer un trs grand nombre de substitutions spares dacides amins dans la mme protine pour tester les nouvelles proprits qui en dcoulent. Certaines mthodes ralises au laboratoire miment le processus dvolution naturelle ; on parle alors d volution dirige .

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Exemple dapplication industrielle : o l-amylase utilise pour lhydrolyse de lamidon en industrie doit rsister une opration de chauffage 105 C utilise pour faire exploser les granules damidon, et doit fonctionner 1 2 h 90 C. o La structure de l-amylase de Bacillus licheniformis a t dtermine et compare dautres -amylases dautres sources. Cette enzyme possde plusieurs proprits intressantes, mais elle manque de stabilit compare dautres sources. Les tudes structurales ont montr que ceci est d des diffrences certaines localits de la squence dacides amins. Le remplacement de chacun des rsidus localiss a permis damliorer la stabilit aux tempratures du procd de quelques dizaines de fois.

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4. Mthodes de production denzymes

On distingue les enzymes dextraction ( partir dorganismes vgtaux ou animaux) ou les enzymes de fermentation (microorganismes).

Le procd industriel typique pour la production denzymes est la culture en profondeur en milieu arobie utilisant un microorganisme produisant en grande quantit une enzyme extracellulaire. Les principaux avantages des enzymes de fermentation par rapport aux enzymes dextraction : o Production en grande quantit en fermenteur, o Production indpendante des contraintes gographiques et saisonnires, o Matire premire bon march, o Manipulation gntique hyperproducteurs, o Purification plus extracellulaires. facile facile en cas mutants denzymes

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Les microorganismes utiliss pour la production denzymes peuvent tre des eucaryotes tels que les levures et les champignons, ou des procaryotes tels que les gram-positifs ou les gram-ngatifs. Les caractristiques recherches dans une souche produisant une enzyme industrielle sont : taux de croissance important, productivit en enzyme importante, activit spcifique de lenzyme leve, rgulation rduite, rsistance la rpression catabolique, peu de produits secondaires, sporulation limite, nutrition rduite, enzyme extracellulaire, morphologie adapte la culture en racteur. Comme il est difficile de trouver toutes ces caractristiques chez le mme organisme, la majorit des souches servant la production denzymes industrielles ont t amliores par : o mutagense (agents chimiques ou irradiation UV) permettant datteindre rapidement des caractristiques utiles ou, o gnie gntique permettant des microorganismes de produire des enzymes dorganismes suprieurs par insertion du gne correspondant dans le microorganisme. La chymosine (E.C. 3.4.23.4) a t clone par diffrents groupes dans plusieurs microorganismes faciles cultiver comme la levure pour produire de manire industrielle des prparations enzymatiques coagulant le lait.

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La fermentation en vue de produire une enzyme se fait trs grande chelle. Quand lenzyme est extracellulaire, on peut utiliser un fermenteur jusqu 450 m3. Dans le cas denzymes intracellulaires, la ncessite de traitements pour lextraction impose une limite du volume jusqu 30 m3.

Dans un fermenteur la production denzyme est optimise grce un contrle rigoureux dun maximum de paramtres :

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