Calidad Microbiolgica del Agua

Biol. Mara Consuelo Daz Bez

Ctedra Internacional de Ingeniera 2008 - Salud Pblica y Saneamiento Ambiental Universidad Nacional de Colombia Bogot, D. C. Junio 17 Julio 11, 2008

Mecanismos de Transmisin de Enfermedades Infecciosas

Directa: contacto directo entre un individuo infectado y uno susceptible Indirecta:
Gotas o partculas infectadas Ruta oral-fecal Alimentos contaminados Transferencia mecnica Vectores: insectos

Del Ambiente:
Polvo o suelo infectado Objetos contaminados

Factores que afectan la transmisin de enfermedades infecciosas

PATGENO Latencia Persistencia Tasa de Multiplicacin

Respuesta del Husped

Infeccin con Enfermedad DOSIS INFECTANTE

Infeccin sin Enfermedad

CARGA EXCRETADA

No hay Enfermedad

Rutas de Transmisin de Enfermedades Relacionadas con el Agua y Estrategias Preventivas

RUTA
Agua de Consumo Agua de lavado

ESTRATEGIA
Calidad del agua Uso de fuentes inapropiadas Cantidad de agua Acceso a abastecimientos de agua para uso domstico Higiene Contacto con aguas infectadas Poblaciones de caracoles Contaminacin por excretas

Agua como hbitat de vectores

Agua como sitio de apareamiento de vectores

Manejo de aguas superficiales Lugares de apareamiento

Mecanismo de Transmisin de Enfermedades Diarreicas, y Fiebres Entricas

2. Disponibilidad de agua + Limpieza Personal y Domstica
4

Individuo Infectado
3 2

1. Calidad del agua

Va Agua
2

Va Alimentos
1
5

3. Disposicin de excretas

Perros Vacas

2 5

Individuo Susceptible
2 2 5

4. Tratamiento de excretas

Aves

5. Higiene de alimentos

Definiciones
Agua Potable: agua libre de microorganismos causantes de enfermedad (patgenos) y/o sustancias qumicas que afecten la salud Agua contaminada o No Potable: agua que ha estado en contacto con residuos domsticos o industriales

Objetivos relacionados con el suministro de agua potable Suministrar agua libre de microorganismos patgenos Suministrar agua libre de sustancias qumicas indeseables o que afecten la salud humana

Definiciones
Fuentes de Agua
Pozos Manantiales Aguas lluvias almacenadas Ros, quebradas Lagos, lagunas y estanques

Plantas de Potabilizacin
Sedimentacin Floculacin-Coagulacin Filtracin Desinfeccin

Examen Sanitario de Agua

Agua cruda y condiciones que afectan su calidad Operaciones de la planta o construccin de pozos Sistemas de distribucin del agua a los consumidores

Factores que pueden afectar la calidad del agua de una fuente

Cambios poblacionales Desarrollo industrial y tipo de industrias Cobertura del sistema del sistema de alcantarillado Disposicin de aguas residuales

Programas de Control y Monitoreo de Agua Potable

Seleccin de proyectos prioritarios de acuerdo al uso del agua
Consumo humano Irrigacin y adecuacin de tierras Generacin de energa

Diseo y desarrollo de programas

Seleccin del rea de estudio Seleccin de sitios de muestreo Seleccin de la metodologa del programa de calidad (sitios, frecuencia, variables, mtodos de muestreo, tcnicas de anlisis)

Clasificacin de las aguas de acuerdo a las caractersticas encontradas

Programas de Control y Monitoreo de Agua Potable

Desarrollo de programas de control de vertimientos
Domsticos Industriales Agroindustriales

Fijar objetivos de calidad a corto, mediano y largo plazo Establecer un programa de control y monitoreo de agua a largo plazo

Calidad Microbiolgica del Agua

Cumplimiento de estndares de calidad microbiolgica para prevencin de enfermedades

Calidad microbiolgica
Patgeno: organismo causante de enfermedad Aguas residuales domsticas llevan patgenos Algunos patgenos sobreviven el tratamiento (incluyendo la desinfeccin), y son descargados a cuerpos de aguas receptores Las aguas residuales descargadas o tratadas pueden ser utilizadas aguas abajo como fuente de abastecimiento

Principales grupos de patgenos excretados en heces humanas

Virus:
Virus de la hepatitis A

Bacterias
Salmonella typhi Vibrio cholerae

Protozoos
Entamoeba histolytica Giardia lamblia Cryptosporidium parvum

Helmintos

Transmisin de enfermedades
Categora I
Dosis infectiva:baja mediana (< 100) Infectiva inmediatamente despus de la excrecin Transmisin de persona a persona en condiciones de pobre higiene

Categora II
Dosis infectiva: mediana alta (>10000) Menos probable de ser transmitida de persona a persona que los de Categora I

Por que organismos indicadores?

Patgenos?
Nmero de patgenos comparado con otros microorganismos es relativamente pequeo Hay muchos tipos de patgenos y cada uno requiere una tcnica de aislamiento especfica

Indicadores?

Por qu no buscar patgenos directamente?

Deteccin de patgenos:
Tcnicamente complicada Est limitada por el tamao de la muestra Lento para obtener resultados Costoso y poco significativo Rara vez se usa en manejo y monitoreo de agua Proyectos de Investigacin y estudios especiales
Giardia, Cryptosporidium y virus entericos
Virus Entericos en fuentes de aguas subterrneas para consumo Investigaciones de brotes epidmicos

Que hacer?
Buscar un microorganismo indicador Habitante del intestino en grandes nmeros y es excretado en las heces Presencia del indicador en elevado nmero:
Evidencia contaminacin fecal Existe un riesgo que microorganismos patgenos estn presentes Si el indicador est presente en gran nmero, la contaminacin es reciente y/o severa

Un ensayo con un indicador puede ser utilizado en lugar de muchas pruebas

Como los coliformes dan evidencia de contaminacin fecal, e indica que organismos patgenos pueden estar presentes

Patgenos
Patgeno: es especfico en la enfermedad que produce o en las condiciones que causa a los organismos que infectan La capacidad de un patgeno para causar una enfermedad especfica depende de:
Producir toxinas Crecer e infectar Capacidad para entrar

Ejemplos de Microorganismos Peligrosos en Aguas Superficiales

Bacterias Virus

Salmonella spp. E. coli O157:H7 E. coli patotoxico Especies de Shigella Aeromonas spp. L. monocytogenes Klebsiella spp. Citrobacter freundii Campylobacter spp.

Virus de la Hepatitis A
Norowak virus Virus Entricos Parsitos

Cyclospora
Cryptosporidium Giardia Toxoplasma Helmintos - Ascaris

Supervivencia de Patgenos Fecales en el Agua

Patgeno Giardia Cryptosporidium Salmonella Campylobacter Yersinia E. coli O157:H7 Congelado < 1da > 1 ao > 6 mes Fro (5 C) 2 mes > 1 ao > 9 mes Caliente (30 C) < 3 semana < 3 mes > 6 mes < 1 semana < 2 semana < 3 mes

2-8 semana < 2 semana > 1 ao > 6 mes > 1 ao > 9 mes

REQUERIMIENTOS DE UN INDICADOR FECAL

Aplicable a cualquier tipo de agua Estar siempre presente cuando hay una fuente de contaminacin fecal Estar ausentes en aguas limpias y seguras Debe existir un mtodo de ensayo para cuantificarlos Ser inocuo a humanos y otros animales

Organismos Indicadores
Escherichia coli
Usado frecuentemente para establecer la presencia de contaminacin fecal Diferentes tipos de bacterias coliformes
Coliformes Totales: todas las bacterias presentes en las heces, suelos y otras fuentes Coliformes Fecales o Termotolerantes: asociados con heces humanas y de animales de sangre caliente

Organismos Indicadores
Escherichia coli patognico:
Hay una cepa de E. coli que es patgena a humanos Los problemas de salud registrados con esta cepa han estado asociados con carne contaminada, leche cruda, y jugos de frutas no pasteurizados

Clasificacin simplificada del grupo de bacterias coliformes

Familia Enterobacteriaceae Grupo Coliforme Coliformes Fecales o Termotolerantes:
1. 2. 3. Citrobacter sp Enterobacter sp Klebsiella sp Escherichia coli Incluye especies de E, coli

Clasificacin simplificada del grupo Streptococcus

Grupo Streptococcus

Group D S. equinus, S. bovis, S. gallinarum

Enterococcus Group

E. faecalis, E. faecium Groupo Q S. Avium

Indicadores de Contaminacin Fecal

Escherichia coli Streptococcus faecalis Clostridium perfringes

BACTERIAS COLIFORMES
COLIFORMES TOTALES
ALGUNAS SON INTESTINALES: indican la calidad del agua tratada

COLIFORMES FECALES
LA MAYORIA SON INTESTINALES: indican la calidad del agua para recreacin y agua tratada y la posible presencia de contaminacin fecal

ESCHERICHIA COLI
ESTRICTAMENTE INTESTINAL: indica la calidad del agua tratada y de agua para recreacin, y es evidencia directa de contaminacin fecal

Muchos de los Ensayos son cualitativos

Colilert

Coliformes Totales / E. coli

Presencia/Ausencia NMP nmero mas probable Quantitray

STREPTOCOCCUS Y GRUPOS DE ENTEROCOCCUS STREPTOCOCCUS SP.

MAYORIA INTESTINAL: indica la posible presencia de contaminacin fecal

ENTEROCOCCUS SP.
MAYORIA INTESTINAL: indica la calidad de aguas dulces y saladas utilizadas para recreacin y la probable presencia de contaminacin fecal

OTROS INDICADORES FECALES

COLIFAGOS SOMATICOS Y F-ESPECIFICOS: (virus que infectan coliformes)
Indican la presencia de aguas residuales Se presentan solo en el 5 por ciento de los humanos (a diferencia de E. coli que est presente en todos los humanos y animales de sangre caliente)

Son ms persistentes en el ambiente que E. coli

OTROS INDICADORES FECALES

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: (una
bacteria formadora de esporas)
Indica la presencia de desechos de origen humano, animal, y de aguas residuales Al igual que los protozoarios parasticos son muy resistentes a la desinfeccin y a tensores ambientales

PATOGENOS
BACTERIANOS
Salmonella sp. Shigella sp. Campylobacter sp.

VIRALES
Polio virus Norwalk virus Rotavirus

PROTOZOARIOS
Cryptosporidium parvum Giardia lamblia

Indicadores de Contaminacin Fecal

Grupo Coliforme: No es un grupo taxonmico, se define como: bacilos Gram ( - ), Oxidasa ( - ), crecimiento facultativo sobre un medio con lactosa, la cual es fermentada a 37C en 48h dando como productos cido y gas Distribucin: excretas, aguas residuales, suelo y agua Colonias: sobre medio slido, E. coli forma una colonia redonda, lisa, de 2 a 4 mm de dimetro despus de 24h a 37C; K. aerogenes, forma una colonia grande de consistencia mucosa, con abundante exopolimero

Indicadores de Contaminacin Fecal

Lactosa

Glucosa

Galactosa

Glucosa 6-P

Piruvato
85% 100% 25%

Acetil-metil Carbinol

Acidos Org nicos CO2 ; H2

E. coli

2,3-Butilen Glicol
K. aerogenes

Indicadores de Contaminacin Fecal

Ensayo
Organismo Indol Rojo de Voges Metilo Proskauer Citrato

E. coli
E. aerogenes

+
-

+
-

Indicadores de Contaminacin Fecal

Ensayo Presuntivo Inoculaci n Caldo Lactosado

Producci n de Gas Evidencia Presuntiva de Coliformes

No hay Gas Coliformes No estan Presentes

Ensayo Confirmativo Transferir del Caldo Lactosado a:

Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante

Agar Eosiina Azul de Metileno

Gas (+)

No Gas (-)

Colonias verde metalico (+)

Colonias sin Brillo Metalico (-)

Indicadores de contaminacin fecal

Complementacin del Ensayo

Colonias Tpicas de la Placa de EAM son inoculadas en:

Caldo Lactosado

Agar Nutritivo

Gas (+)

Bacilos Gram (-) No esporulados

Indicadores de contaminacin fecal

Muestreo: Las muestras se deben tomar en recipientes estriles Las muestras deben ser representativas de las fuentes Debe evitarse la contaminacin de la muestra durante el muestreo El ensayo deber realizarse tan pronto como sea posible (no mas de 24h despus de colectada la muestra) Durante el transporte, la muestra debe mantenerse refrigerada

Anlisis Bacteriolgico de Aguas

Conteo de Bacterias Heterrtrficas Indicadores de Contaminacin Fecal: Coliformes

Coliformes Totales:
Mtodo de Tubos de Fermentacin Multiple Mtodo por Filtracin con Membrana Mtdo del ONPG (o-nitrofenil--D-Galactopiranosido)

Coliformes Fecales:
Mtodo de Tubos de Fermentacin Multiple Medio EC Mtodo por Filtracin en Membrana

Escherichia coli:
Mtodo MUG (4-metilumbeliferil- -D-Glucoronido

Proteccin de las Muestras de Agua: Colectar, Refrigerar, Analizar <24h

Indicadores bacterianos y los patgenos pueden crecer Temperatura no controlada, nutrientes solubles Preocupacin por agua de escorrenta Muerte durante el almacenamiento
E. coli Grow in Filtered Run-off Water
Concentration (cfu/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 0 10 20 30 40 50 Time (hours) Eco Eco Eco Eco Eco 5C 10C 12.5C 15C 20C

Muestreo de Patgenos tiene Problemas

Probability Of Microbial Detection
Percent Contaminated 10% 5% 2% 1% 0.1% Number of Samples Analyzed 5 41 33 10 5 1 10 65 40 18 10 1 15 79 54 26 14 2 20 88 64 33 18 2 30 60 96 >99 79 95 45 70 26 45 3 6

Tamao de Muestra

Muestras Lquidas

Hot Spots

Aleatorias

Regular

Agrupacin Aleatoria

PATHATRIX Immunomagnetic Separation

PCR for Salmonella Detection in Field Samples

L=100 bp ladder 12= #1-71901-16 13= #1-71901-17 14= #1-71901-18 15= #1-71901-19 16= #1-71901-20 17= #1-71901-21 18 =#1-71901-22 19 =#1-71901-23 20 =#1-71901-24 21=#1-71901-25+C 22=#1-71901-25+CM

L=100bp ladder

L 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 L

Pathogen Screening in Water and Reservoir Sediments Non-selective enrichment Dual selective enrichment PCR- enrichment screening LOD water LOD soil = 1 CFU per 250 ml = 10 CFU per 25 gm

En donde estamos?
Un solo indicador no llena todos los criterios Un solo grupo taxonmico no es un indicador funcional para virus, bacterias y parsitos El criterio de indicador no cumple para patgenos que no estn asociados con contaminacin fecal

Indicadores Bacterianos de Contaminacin Fecal menos comunes

Bacteroides spp. y Bifidobacteria spp.
Anaerbicos Muchos en heces (mas que coliformes y estreptococo fecal de 10-1000X) Sobrevive poco en el ambiente Pobre deteccin y mtodos poco desarrollados.

Potencial para diferenciar contaminacin fecal por heces humanas y animales

Rhodococcus coprophilus
Ejemplo de un indicador nico para rumiantes Especfico de fuentes fecales animales

Indicadores Microbianos de Contaminacin de Agua con Protozoos Entricos Patgenos

Esporas de Clostridium perfringens imitan la supervivencia Muchas en heces y suelos impactados con heces. Las esporas de C. perfringens tienen una resistencia a los desinfectantes similar a quistes y ooquistes de protozoarios entricos parsitos.

Indicadores Sugeridos de Contaminacin Viral Colifagos: virus (bacteriofagos) infectan E. coli Male-specific (F+) colifagos: pueden ser especficos de heces. Otros

Estndares Microbianos de Calidad del Agua

Agua Tratada
Sedimentada Coagulada Filtrada Desinfectada Adecuadamente desinfectada = mediana CT 2.2 por 100 ml Una sola mximo 23 por 100 ml

Typical Numbers of Microbes at Different Stages of Wastewater Treatment

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Raw Sewage 1o 2o 3o Fecal coliform Salmonella Shigella Enteric virus Helminth ova Giardia lamblia cysts

Log MPN/100ml

Estndares para Agua para Recreacin Riesgo aceptable de enfermedad por contacto Problemas
Estndares se basan en contaminacin por fuentes puntuales Fallas por fuentes difusas Muestreo nunca puede tener la frecuencia necesaria para superar el agrupacin en la distribucin de los patgenos

EPA Criteria for Indicators of Bacteriological Densities

Freshwater Baseline Geometric Mean 33 Beach Area Moderate Use Lightly Used Rarely Used

Enterococci

61

89

108

151

E. coli

126

235

298

406

576

Source US EPA July 25, 2001: Strategy for Waterborne Disease Control Updated June 2002 http://www.epa.gov/waterscience/standards/bacteria/

http://www.epa.gov/ost/standards/bacteria/bacteria.pdf

Table 5: EPA's Recommended Beachwater-Quality Standards[22] Water Type Indicator Standard For multiple samples* Marine Fresh Enterococcus Enterococcus 35 per 100 ml 33 per 100 ml For a single sample 104 per 100 ml 61 per 100 ml

E. coli

126 per 100 ml 235 per 100 ml

*Geometric mean of at least 5 samples over a 30-day period.

Como Como se se hace hace el el ensayo ensayo de de NMP? NMP?

10 100 Factor de Dilucin 1000 10,000 100,000

Muestra Original

2424-36h @ 3535- 44oC

+ E. coli + Coliform

+ E. coli + Coliform

+ E. coli + Coliform

- E. coli + Coliform

- E. coli - Coliform

Buscar el NMP en la tabla para obtener el valor estadstico

Negative TTC

Positive TTC

E. coli+ Control

COLIFORMES TOTALES

5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosido (X-GAL)

COLIFORMES TOTALES

Rompimiento del Sustrato Cromgeno

Deteccin de E. coli por sustrato definido

4-metilumbeliferil--D-Glucoronido MUG

Rompimiento del sustrato fluorgeno por la -glucoronidasa

Por qu mirar virus?

Episodios Epidmicos G/Agua
NUMERO PORCENTAJE

No Determinados Virales Qumicos Protozoarios Bacterias

232 35 22 26 56

62% 9% 6% 7% 15%

La mayora de los episodios No Determinados pueden ser virales

Colifagos: Virus de E. coli

Colifagos como Indicadores Virales

Colifagos
Tamaos y estructura similar a virus entricos Ms resistentes al ambiente y al tratamiento

Concentraciones de Colifagos F+ y Bacterias Indicadoras

Organismo Colifago F+ Agua Residual 2x106 6x107 6x106 4x105 Agua Residual Tratada 1x104 1x103 90 10

Colifo. Fecales

E. coli
Enterococci
Sobsey, 1995

Distancias de Viaje Reportadas

___ Bacteria ___ ___ ______________ __ ____ Virus ______________ ___________________________ 680 m _____________________________ _____
0 ------10 -------------------50-------------100-------------- 200 m Well drained Fine texture High water table Coarse texture
Martin

Mtodo de Enriquecimiento de Dos Etapas

100-1000 mL de agua Inocular con E. coli Adicionar nutrientes
37C toda la noche
Colocar 10 L al cultivo

37C 6-12 hours

Observar la presencia de placas

Agar Simple de Una Capa (SAL)

100 mL de agua + 100 ml de agar soya tripticasa 2X + E. coli Ponga la mezcla en 5 placas
37C por la noche

Observe las placas

Conclusin
Colifagos al igual que E. coli debe ser monitoreado en aguas subterraneas Ya sean colifagos somticos o male-specific son mejores que las bacterias indicadoras solas

Protozoos ICR Mtodo (Viejo)

Aguas Tratadas y Superficiales Recuperacin Precisin Lmite Mnimo Reportado (MRL)
<1/100 L en agua tratada <10-1000/100 L en aguas superficiales

Mtodo EPA 1623 (Actual)

Aguas superficiales (Envirochek filter) Aguas Tratadas (Envirochek high volume filter; Filta-Max) Recuperacin Precisin Lmite Mnimo Reportado (MRL) <1-2/10 L en aguas superficiales <0.1-1/100 L en aguas tratadas

Comparacin

Mtodo ICR

Mtodo EPA 1623

Filta-Max Kit de Muestreo

Filtro Filta-Max

Limitaciones del Mtodo

Es realmente un positivo o un falso positivo? Es C. parvum o otras especies?

FITC DAPI

DIC

Nuevos Ensayos para

Cryptosporidium
Es realmente positivo o falso positivo? Confirmacin con PCR

Es C. parvum u otra especie? Genotificacin (PCR-RFLP)

Diagrama de PCR-RFLP
Surface or finished water Filta-Max Pellet IMS Microscopy IMS PCR RFLP

Productos de PCR de diferentes

especies de Cryptosporidium
1: MW Maker

2: C. parvum (bovine) 3: C. parvum (human) 4: C. muris 5: C. serpentis 6: C. baileyi 7: Eimeria papillata 8: Eimeria nieschulzi 9: Giardia 10: NC

Identificacin de especies por Digestion SspI y VspI (RFLP)

1: MW Maker

2: C. parvum (bovino) 3: C. parvum (humano) 4: C. muris 5: C. serpentis 6: C. baileyi

PCR de Muestras ambientales

RFLP de Muestras ambientales

Conclusin
Filta-Max filter puede ser usado tanto para aguas superficiales como tratadas Filta-Max filter puede ser usado para el mtodo 1623 y el de PCR-RFLP PCR-RFLP puede confirmar e identificar especies de Cryptosporidium