CLONACIN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA, PCR

BIOTECNOLOGA MDICA Ing. Cinthia Crdova Barrios

Introduccin general a la clonacin

Conjunto de elementos genticamente idnticos entre s y a su precursor. Clonacin es una amplificacin gentica

Clonacin
CLONACIN DE MOLCULAS
CELULAR: Con clulas, es la amplificacin de un inserto, asistida por vectores en clulas anfitrionas en cultivo. Tecnologa del DNA recombinante ACELULAR: Clonacin de molculas sin la intervencin de clula alguna, amplificacin in vitro de molculas de DNA y RNA mediante la reaccin en cadena de la polimerasa.

PCR

Amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA o cDNA, presentes en mezclas de muy diversas fuentes.

Amplificacin

Deteccin

Aplicaciones

Clonacin acelular de fragmentos de DNA. Deteccin de secuencias. Secuenciacin de cidos nucleicos. Establecimiento de polimorfismos de secuencia. Rastreo de mutaciones. Tipificacin de DNA para trasplante. Diagnstico de enfermedades genticas. Resolucin de problemas forenses. Resolucin de problemas arqueolgicos. Estudios evolutivos. Deteccin de clulas tumorales. Deteccin de microorganismos infecciosos.

PCR: Requerimientos
Termociclador

Cebadores o primers

DNA polimerasa

dNTPs y Mg

Sustratos para la sntesis de las innumerables copias de DNA y el cofactor (Mg de 1-4 mM)

Oligonucletidos sintticos de cadena sencilla de 18 a 30 nt. Sus secuencias son complementarias a los dos extremos 3 de la regin diana. La posicin donde hibridan los cebadores define la longitud del fragmento.

Termoestable y activa a temperaturas relativamente altas (95C). Polimerasa taq (Thermus aquaticus)

PCR: Etapas del proceso

Templado o hibridacin
Calentamiento para la separacin de las dos hebras del DNA. Tiempo: Incubacin (30-120 s). Temperatura: 68-97 C Enfriamiento rpidos por debajo de Tm. Hibridacin de las hebras sencillas del DNA con los cebadores. Tiempo:10-120 s. Temperatura: 37-65 C Amplificacin, DNA pol elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales Tiempo: Incubacin (1-3 min). Temperatura: 72-75 C

Desnaturalizacin

S e aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. Previa antes de la desnaturalizacin para inactivar proteasas y nucleasas ltima, prolongacin de la ltima elongacin, que permita que se completen todos los fragmentos.

Elongacin

PCR: Etapas del proceso

PCR: Etapas del proceso

PCR: ETAPAS DEL PROCESO

PCR: ETAPAS DEL PROCESO

PCR: Amplificacin global

N de ciclos realizados N total de copias N de copias largas N de copias dianas Dianas/total

1
2

2
4

2
4

0
0

0
0

3
4 5 10 20

8
16 32 1024 ~ 106

6
8 10 20 40

2
8 22 1004 ~ 106

25%
50% 69% 98% 99.996%

40
X

~ 1012
2X

80
2X

~ 1012
2X- 2X

100%

Caractersticas del proceso

Los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulacin de copias es exponencial. De cada etapa, debe optimizarse dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplificar Elevada, determinada por la secuencia de los cebadores y las condiciones del templado.
Rendimiento
Capacidad de deteccin

Alta, puede detectar una nica molcula de DNA

Capacidad de copiar secuencias con precisin, sin introducir mutaciones

N= nmero de copias. N0= nmero de molculas iniciales. R= rendimiento de cada ciclo (0.7 o 0.8) X= nmero de ciclos

Especificidad

Duracin

Fidelidad

Automatizacin de la PCR

Se utiliza termocicladores, para programar los cambios de temperatura segn el carcter cclico del proceso. Permite la realizacin de un nmero elevado de ciclos. Se aumenta la precisin del proceso.

Variantes del mtodo:

PCR larga o L-PCR
Supera los lmites de la PCR convencional Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamao Se aade otra enzima.

PCR anidada

Realizar una segunda reaccin de PCR con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par

PCR inversa

Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocidas. Amplificar la regin externa que flanquea a los cebadores.

Variantes del mtodo: pcr anidada

Variantes del mtodo: PCR inversa

Variantes del mtodo: PCR inversa

Variantes del mtodo:

PCR con adaptadores.
Puede amplificarse una regin de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restriccin unos adaptadores.

PCR asimtrica

Se generan copias de hebra sencilla de un DNA. Se aaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores.

RT-PCR

Amplificacin de RNA a travs de la sntesis previa de su cDNA, que despus se amplifica por PCR.

Variantes del mtodo: PCR con adaptadores

Variantes del mtodo: RT-PCR

Variantes del mtodo: RT-PCR

Variantes del mtodo: PCR real time o qPCR

Amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto.

Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y fluorforo

Se requiere de un termociclador termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.