AGENTES TROMBOLITICOS RECOMBINANTES Y FACTORES COAGULANTES RECOMBINANTES

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FACTORES COAGULANTES RECOMBINANTES Introduccin Ante una herida a nivel vascular se reduce el flujo sanguneo, las plaquetas cercanas al lugar de la herida se adhieren a la pared vascular en el sitio. La activacin y agregacin de plaquetas, junto con algunas reacciones enzimticas entre las que destaca la actividad de t-PA, produce la fibrina que forma el cogulo. La hemostasis es un proceso dividido en dos partes, la extrnseca y la intrnseca, diseado para mantener la integridad y buen funcionamiento del sistema circulatorio. La ruta extrnseca es el iniciador primario de la coagulacin, mientras que la ruta intrnseca se encarga de la activacin de los Factores IX y X. La figura 1 muestra un esquema donde la hemostasis se divide en 3 partes, iniciacin del cogulo, formacin del cogulo y fibrinlisis. Existen dos casos generales de

hemostasis anormal, cuando hay un exceso de coagulacin y se producen los trombos que obstruyen el flujo sanguneo, y cuando hay carencias de factores de coagulacin lo que resulta en un sangrado excesivo, como en los pacientes con hemofilia. La coagulacin se lleva a cabo mediante una compleja serie de reacciones involucrando aproximadamente 30 protenas, se le conoce como la cascada de coagulacin. sta cascada de coagulacin inicia cuando debido a una herida, la sangre entra en contacto con clulas que contienen factor tisular (TF). La figura 2 muestra la compleja cascada de coagulacin, mostrando la mayora de las reacciones, mientras que la figura 3 muestra un esquema simplificado en torno a las protenas a tratar. Rol fisiolgico Factor VIII, es una protena del plasma que funciona como cofactor al aumentar la mxima velocidad de reaccin del Factor X por el Factor IXa en la presencia de iones de calcio y fosfolipidos con carga negativa. La ausencia congnita del Factor VIII se conoce como Hemofilia A. Se puede realizar una terapia introduciendo concentrados del Factor VIII

extrados del plasma, pero conlleva riesgos asociados a la transfusin. Mientras que el Factor VIII obtenido mediante tecnologas recombinantes elimina ese riesgo. Factor VII, se sintetiza en los hepatocitos y depende de la vitamina K. Factor recombinante VIIa, circula en el plasma a la baja concentracin de 0.5 g/ml, a pesar de estar en su forma activa tiene poca actividad proteoltica; sus efectos se enfocan en el sitio de la herida tisular ya que solo el endotelio daado expresa el factor tisular. ste factor recombinante elimina fallas y riesgos relacionados con el uso de Factor VIII y Factor X en el tratamiento de la hemofilia. Factor IX, es activado por el complejo de Factor VII-Factor tisular en la ruta extrnseca de la hemostasis. El Factor IX en combinacin con el Factor VIII activa el Factor X, resultando en la conversin de protrombina a trombina, donde la trombina convierte el fibringeno en fibrina formando el cogulo en el sitio de sangrado. Clasificacin del compuesto Factor VIII es sintetizado como un polipptido de una sola cadena de 2332 amino cidos 12. Poco despus de la sntesis, ocurre una escisin que hace que el Factor VIII circule en el plasma como una asociacin de una cadena ligera de 80kDa y varias cadenas pesadas de 210kDa en un complejo dependiente de iones metlicos. La cadena metlica se procesa mediante una escisin proteoltica que reduce su tamao a 90kDa, liberndose de los residuos del dominio B, lo cual le brinda heterogeneidad. Cuenta con 25 sitios potenciales de glicosilacin con N y 22 cistenas. Los Factores recombinantes VIII que se encuentran en el mercado difieren en su estructura dependiendo de la compaa, los producidos por Bayer y Baxter Healthcare son semejantes al factor en plasma, consisten del dmero con una cadena de 80kDa y una cadena heterognea de 90-210kDa
13;

mientras que el

producido por The Genetics Institute es un mutante con una delecion de casi todo el dominio B. Factor VII, es una serina proteasa glicosilada que depende de la vitamina K. Se sintetiza como una proenzima que se vuelve activa y enganchada mediante la hidrlisis de Arg-152

e Ile-153. Tiene 406 amino cidos y su masa molecular es de aproximadamente 50kDa. La protena no es activamente funcional a menos que est -carboxilado. Tiene dos sitios para glicosilacin con N. Tiene tres dominios, uno interactua con el factor tisular en la superficie de la clula, que es el dominio Gla, dos dominios tndem EGF y un dominio serin-proteasa. Factor IX recombinante es una glicoprotena de aproximadamente 55kDa que consiste de una sola cadena de 415 amino cidos. El Factor IX de plasma posee un dimorfismo Thr/Ala en la posicin 148 y 12 residuos de gamma-carboxlcido glutmico en su dominio Gla. Mientras que el Factor IX recombinante es idntico a la forma allica Ala148. Las

diferencias estructurales no impactan en la actividad biolgica de los compuestos, slo en la farmacocintica de los mismos. Biosntesis del compuesto Factor recombinante VIII. Es de diverso origen dependiendo de la compaa que lo produce, Baxter Healthcare y Genetics Institute lo produ cen en clulas CHO, mientras que Bayer Inc lo produce mediante la transfeccin de clulas de rin de hmster beb. Factor recombinante VIIa. Se produce en clulas de rin de hmster beb. El factor VII es producido por accin del gen del Factor VII, que se encuentra en el cromosoma 13 (13q34). Factor recombinante IX. Es producido en una lnea celular CHO, las clulas secretan al medio Factor IX recombinante. El gen del Factor IX se localiza en el cromosoma X (Xq27.1q27.2). Enfermedades que mitigan/curan El factor recombinante VIII se utiliza para el tratamiento de la hemofilia clsica (Hemofilia A), enfermedad que se caracteriza por una deficiencia en la actividad del Factor VIII. La forma recombinante provee un reemplazo temporal para corregir o prevenir episodios de sangrado o en caso de que un paciente con hemofilia requiera una ciruga de emergencia.

Se corre el riesgo de que desarrollen anticuerpos al Factor recombinante VIII se correlaciona con la severidad de la enfermedad y la intensidad de la exposicin al Factor VIII. Las dosis se determinan de forma individual para cada paciente en base a la severidad de la deficiencia y de las hemorragias, la presencia de inhibidores y del aumento deseado de actividad de Factor VIII. Se puede usar la siguiente ecuacin: El factor recombinante VIIa se utiliza para tratamiento de pacientes con episodios de sangrado intenso en Hemofilia A o B en la presencia de inhibidores de Factor VIII y Factor IX. Se recomienda una dosis de 90g/kg cada dos horas hasta que se llegue a la hemostasis. Para llegar a la hemostasis, los niveles de actividad del factor de coagulacin VII (FVII:C) deben mantenerse por encima de 6U/ml. El factor recombinante IX se utiliza para el control y prevencin de episodios hemorrgicos en pacientes con hemofilia B, incluyendo el control y prevencin de sangrado excesivo por ciruga. La dosis depende de las mismas condiciones que el FrVIII. Anlisis qumico de compuesto Se realiza mediante un anlisis de sangre. Las muestras por lo general llevan como aditivo Citrato que impide la coagulacin de la sangre. Se mide la capacidad de la sangre para formar cogulos al medir el tiempo que tardan en formarse en funcin de unas sustancias que se aaden a la sangre. Pruebas de coagulacin Tiempo de protrombina (PT). Prueba del tiempo de coagulacin que se obtiene a partir de la agregacin de un exceso de tromboplastina hstica y calcio al plasma. Mide los niveles de factor I (fibringeno), factor II (protrombina), y factores V, VII y X. Tiempo de tromboplastina parcial (PTT). Detecta valores bajos de factores XII, IX y VIII. Depende de la totalidad de factores de coagulacin excepto calcio, plaquetas y factor VII. Del plasma del paciente se obtienen todos los factores de coagulacin, se somete la muestra a un anticoagulante para remocin del calcio de la sangre y a una centrifugacin

para remover las plaquetas. De forma que la muestra no provee el in calcio y las plaquetas. Al plasma se agrega un sustituto plaquetario (tromboplastina parcial) que funciona como medida del sistema intrnseco de coagulacin. Hay pruebas especificas para los factores, como la prueba del factor VIII donde se separan las clulas sanguneas del plasma, posteriormente al plasma se le quita el factor VIII y se toma el tiempo de coagulacin para comparar con el tiempo de coagulacin normal. Si el resultado es bajo, el paciente sufre hemofilia A o tiene inhibidores del factor VIII 10. Farmacocintica y Farmacodinmica La coagulacin de la sangre puede inciarse ya sea por la ruta extrinsica o la ruta instrnsica. La ruta extrnsica inicia por exposicin de sangre o factor tisular y la ruta intrnseca inicia por la activacin de factores plasmticos. Las dos rutas convergen en un solo camino que resulta en la generacin de trombina.8 Factor VIII Factor antihemoflico, es una protena plasmtica que funciona como cofactor al incrementar la Vmax en la activacin del Factor X por medio del Factor IXa en presencia de iones de calcio y fosfolpidos cargados negativamente. La concentracin del Factor VIII en el plasma es de 200 ng/ml aprox. Existe evidencia de que el bazo, hgado y rin participan en su sntesis pero es principalmente en el hgado donde esta ocurre. El Factor VIII est asociado covalentemente al Factor de von Willerbrand. Este factor protege al Factor VIII de cortes proteolticos y permite su concentracin en sitios homeostticos.8 Despues de su administracin, el incremento en la concentracin del Factor VIII es proporcional a su dosis y su disposicin es similar despus de una dosis nica o crnica. La vida media terminal es de 14-16 horas y el volumen inicial de distribucin se aproxima al volumen del plasma. (Ver Tabla 1 Anexos)

La dosis de factor recombinante VIII (en unidades internacionales) debe de individualizarse a las necesidades del paciente, la severidad de la deficiencia y de la hemorragia, la presencia de inhibidores y tambin al incremento deseado de actividad del Factor VIII.8

Riesgos Se debe de tener cuidado al administrar el factor recombinante VIII a pacientes con hipersensibilidad a antihemoflicos derivados del plasma o con hipersensibilidad a preparaciones biolgicas con rastros de murina o protenas de hmster ya que pueden quedar remanentes como contaminantes del sistema de expresin14. FACTOR VIIa Fue desarrollado ante la necesidad de que una pequea parte de los pacientes con hemoflia A y B desarrollaban anticuerpos al Factor VIII y Factor IX. El Factor VIIa es producido en clulas de rion de hmster. Este factor se expresa en una sola cadena y es activado espontneamente a Factor VIIa durante purificacin. Se estudi la farmacocintica de dosis nica para el Factor VIIa en 15 pacientes con hemofilia. Despues de la dosis intravenosa de 17.5, 35, y 70 microg/kg. La farmacocintica obtenida fue lineal y no hubo diferencia en eliminacin entre pacientes hemorrgicos y no hemorrgicos. La eliminacin media fue de 31 mL/h en pacientes no hemorrgicos y 32.6 mL/h en pacientes hemorrgicos. La vida media fue de 2.9 h en pacientes no hemorrgicos y 2.3 en pacientes hemorrgicos. Basndose en el estudio, una concentracin de 8U/mL debera resultar en hemostasis inmediata.8 (Ver Tabla 2 Anexos)

Y para que exista una hemostasis apropiada es necesario mantener los niveles arriba de 56 U/mL. El Factor recombinante VIIa est indicado para pacientes hemoflicos con episodios de sangrado y con presencia de inhibidores para Factor VIII o Factor IX. La dosis

recomendada de factor VIIa para pacientes con hemoflia A o B con inhibidores es 90 microg/Kg cada 2 horas hasta que la hemostasis sea lograda. Riesgo Factor recombinante VIIa no se debe de administrar a personas con hipersensibilidad a los componentes del Factor VII o a protenas de ratn, hmster o bovinas. Factor IX Es activado por el Factor VII en la via extrnsica y por el Factor XIa en la va intrnseca. El Factor IX activado, en combinacin con el Factor VIII activado, activan al Factor X, resultando en la conversin de protrombina en trombina. La trombina entonces convierte fibringeno a fibrina para la formacin de un cogulo de sangre en un sitio donde exista hemorragia. Factor IX recombinante es generado por lnea celular CHO. La lnea celular transformada secreta Factor IX recombinante al medio de cultivo de donde se purifica por medio de varias cromatografas. El tratamiento con factor Recombinante IX disminuy el tiempo parcial de la tromboplastina de 135-150 segundos a 46-96 segundos. Estudios preclnicos indican que el factor recombinante IX tiene bajo potencial trombognico. Tambin se report en estudio stoxicolgicos en ratones, ratas y perros que el Factor recombinante IX es bien tolerado. La vida media de eliminacin ranque entre 10.9 y 15.8 horas y fue independiente de la dosis. Estudios farmacocinticos y farmacodinmicos mostraron que un incremento en la concentracin de Factor IX en el plasma est realacionado con la actividad del mismo.

Produccion Biotecnologica del Factor Recombinante VIII El proceso encontrado se divide en dos etapas principales que se describen a continuacin as como en la Imagen en los anexos del documento. La primera consiste en una produccin continua que consiste en la produccin del medio y el proceso de fermentacin. La otra etapa es la referente a la produccin en el biorreactor, que es un cultivo de tipo Batch. Las consideraciones estequiometricas que se realizaron para el crecimiento celular, la produccin de la protena y del producto fueron las siguientes: Los sustratos principales son glucosa y glutamina. La base de clculo utilizada fue 1 mol de glucosa alimentado La cantidad de biomasa producida por sustrato utilizado (Yx/s) se defini como 0.1 g biomasa/g sustrato La cantidad total de protena producida (Yp/s) se defini como 5 g protena total/ 13 g de biomasa7. Produccion del medio De acuerdo a la bibliografa consultada, la formulacin del medio debe contener lo descrito en la Tabla, incluida en la seccin de Anexos. La produccin del medio comienza disolviendo la mezcla del medio en WFI en un tanque de 880L. Los componentes pueden ser agregados en su estado slido o como lquidos concentrados. Aqu se producen 83 L/h de medio. Una vez elaborado al medio, este es pasado por un proceso continuo de esterilizacin el cual puede causar una cierta degradacin de los componentes del medio pero se asume un 100% de presencia de los componentes del medio para simplificar los clculos. Recordemos que se alimenta continuamente medio esterilizado en 2 fermentadores en perfusin

Fermentacin en perfusin La tecnologa recombinante desarrollada por Genentech y licenciada a Bayer utiliza celulas BHK. Como ya se menciono, se alimenta continuamente un par de fermentadores de 127 L, los cuales operan con un volumen constante de 100 L. A su vez, se implementa un tercer fermentador para minimizar el riesgo de contaminacin del medio. Con estos volmenes de alimentacin y de operacin se obtiene una cosecha de 1000 L diarios en cada fermentador, de la cual se obtiene 0.957 mg/L del producto de titulo, segn el diseo del fermentador propuesto por Bayer. Se introduce Oxigeno puro al sistema por el fondo del fermentador, el cual esta comprimido a 6 bar y pasado por un filtro para asegurar su esterilidad. Los fermentadores poseen una taza de aireacin de 0.69 VVM. Por la parte superior del fermentador en donde se obtienen CO2 y O2 , 6.7% y 93.3% respectivamente. Esta mezcla de gases es pasada a travs de un filtro antes de ser liberada a la atmosfera. La absorcin de Oxigeno del sistema es de 0.54 kg-O2/h. Una vez realizado el proceso de ultrafiltracin, la cosecha procesada llamada Cultivo de Fluido de Tejido Clarificado y Ultra filtrado (UFTCF por sus siglas en ingles) posee la composicin descrita en la Tabla incluida en la seccin de Anexos Despus de esta etapa, el UFTCF es almacenado y congelado. Proceso en reactor Batch Una vez obtenido el UFTCF por fermentacin continua, este es congelado, y debe de ser calentado antes de continuar con el proceso. En este proceso, la primera alimentacin al reactor Batch es de 2000 kg/Batch del UFTCF. Esta cantidad es el equivalente aproximado a lo que se obtiene en 30 horas de fermentacin continua del producto.

Al terminar el proceso en el reactor, el 25% del UFTCF se enva a la corriente de desperdicio debido a que este representa el porcentaje de UFTCF se contamina y debe de disponerse de l. El otro 75% del UFTCF (1500 kg/Batch) se enva a purificacin. Aproximadamente se producen 245 Batches/anio con este proceso. Purificacin En esta etapa se llevan a cabo dos operaciones unitarias que son el uso de columnas de cromatografa y filtros Dead end. Despus de calentar el UFTCF se carga en una columna cromatografica de intercambio inico utilizando dietilaminoetil (DEAE) para realizar el intercambio inico. Esto se realiza con el propsito de remover la mayor cantidad posible de contaminantes en el UFTCF. El tamao de la columna debe ser de 110 L con una eficiencia de ligacin de 95% y un rendimiento del 85% refirindonos a la protena activa. Despus de realizar este paso, el producto se reduce de 1500 kg/Batch a 230 kg/Batch con 19.3% de prdida de la protena activa. Cabe resaltar que este es el paso en el cual se tiene la mayor prdida de la protena activa durante la etapa de purificacin. El filtro Dead-end se usa para estimular la inactivacin viral en el UFTCF. A continuacin, el producto se carga en una columna de Cromatografa de Afinidad a Iones Metlicos de Cobre Inmovilizados (CuIMAC) debido a que posee una gran afinidad por la protena activa (100% ligacin, 98% eficiencia) y permite una mejor separacin de los contaminantes y del producto de inters. En este paso se disminuye la corriente de producto de 230 kg/Batch a 196 kg/Batch con 1.7% de prdida de la protena activa. Una segunda columna cromatografica de afinidad se usa para concentrar aun ms el producto, y en este paso se reduce la corriente del producto de 196 kg/Batch a 64 kg/Batch con un 2.5% de prdida de la protena activa. A continuacin, se pasa la corriente obtenida al final por una unidad de ultrafiltracin para preparar el producto para su formulacin.

Formulacin Una vez purificada la protena, se requiere agregar una serie de nuevos materiales o crudos, para activar la mezcla de la protena activa en la formulacin final. Este proceso se logra a travs de una serie de pasos de mezcla, almacenamiento e intercambio de buffers. Durante la purificacin se agrego albumina, con el fin de estabilizar la protena de inters durante los tratamientos qumicos y de calor, a pesar de que esta pueda representar un riesgo de contaminacin para el producto de inters ya que para eso utilizamos el filtro Dead-end para eliminar todos los virus o fagos que puedan estar presentes en nuestra protena de inters. A continuacin se realiza un intercambio de buffer en una unidad de diafiltracion con CaCl y NaCl para ajustar el pH y remover la albumina. El siguiente paso es congelar la formulacin a -15C con el fin de enfriar el producto y asegurar la calidad de este (obtener la aprobacin QA). El producto es descongelado y la formulacin final se simula haciendo un intercambio de buffer. Se agregan glicina, Histidina y sucrosa a la formulacin en las cantidades apropiadas para obtener la composicin adecuada del producto liofilizado. Despus de este paso la concentracin del producto es apta para ser suministrada en dosis a pacientes. Liofilizacin y Almacenamiento Final Cada vial se rellena con 2.75 mL de producto, y despus liofilizado y empacado. En la simulacin, la liofilizacin se debe de realizar antes del llenado de los viales. En la liofilizacin el 97% del agua se evapora del producto y el ciclo para liofilizar dura 17 horas. Cabe recordar que un ciclo normal de liofilizacin dura entre 48 y 72 horas. El producto final contiene un vial de 1000 IU rFVIII y una jeringa. El Factor VIII es etiquetado de acuerdo a las indicaciones y requerimientos establecidos y empacado. Al final del Batch se

producen aproximadamente 3705 cajas y cada caja tiene un costo de $1000 en el mercado8 AGENTES TROMBOLITICOS RECOMBINANTES Introduccin Ante una herida, comienza el proceso de hemostasis, donde el fibringeno (protena soluble de la sangre) se convierte en la protena insoluble fibrina, que se entrelaza con las plaquetas y forma el cogulo. Vase Figura 1 que muestra la Hemostasis dividida en tres partes Por lo general, en el organismo hay un balance entre el proceso de coagulacin y la fibrinolisis, lo cual est regulado por mecanismos endgenos que aseguran un ptimo funcionamiento, de forma que el cogulo se forme en el lugar correcto y est bien controlado, evitando efectos trombognicos, es decir cogulos fuera de lugar que obstruyan el flujo sanguneo. Cuando el cogulo ya no es necesario, comienza el proceso de fibrinlisis, donde para evitar la formacin de trombos, se degradan las redes de fibrina, donde el plasmingeno es transformado a su forma activa plasmina, compuesto que ataca la fibrina recin formada. La activacin del plasmingeno a plasmina es estimulada por, entre otros compuestos, el activador tisular del plasmingeno o t-PA. Para mejorar la produccin, se desarrolla t-PA recombinante (rt-PA) tambin conocido como alteplasa. La velocidad de eliminacin de la rt-PA por funcin del hgado, da espacio al desarrollo de otros frmacos variantes de rtPA, como son: Reteplasa, Tenecteplasa y Lanoteplasa. Rol fisiolgico T-PA es una enzima que cataliza la conversin de plasmingeno en plasmina durante la fibrinlisis, mediante una hidrlisis del enlace peptdico de la estructura del plasmingeno. T-PA activa un plasmingeno altamente especfico para la fibrina, lo cual

disminuye la cantidad de efectos secundarios sistmicos. Los activadores de plasmingeno son inhibidos por la accin de los inhibidores de activador de plasmingeno PAI 1 y PAI 2, que circulan a una concentracin de entre 5 y 20 g/L en el plasma16. Los cambios en el plasma en el nivel de t-PA surgen a partir del endotelio mediante dos mecanismos (a) uno rpido, de liberacin a corto plazo, que ocurre a pocos minutos, donde se libera por el endotelio como respuesta a una estimulacin, desempeando un papel importante en la disolucin de fibrina desde la formacin y as previniendo la formacin de trombos. Mecanismo (b) un cambio a largo plazo en el flujo de sntesis y secrecin de t-PA, que es determinante de los niveles de t-PA bajo condiciones basales y estimuladas. El t-PA no se asocia con los efectos alegricos e hipotensivos reportados para los activadores de plasmingeno endgenos (estreptoquinasa y complejo activador plasmingeno acetilado estreptoquinasa). El t-PA recombinante (rt-PA) (alteplasa) es idntico al t-PA natural del humano. Se utiliza para tratamiento de pacientes hemoflicos, con infarto agudo al miocardio (AMI), pacientes con embolia pulmonar masiva, para el control de paro cardaco isqumico agudo (en un margen de 3 horas post-infarto) y post hemorragia intracraneal. Reteplasa y Tenecteplasa se utilizan para el control de infarto agudo al miocardio (AMI), mejorando el funcionamiento ventricular y reduciendo el ndice de mortandad. Lanoteplasa se encuentra en desarrollo pero por ser derivado de rt-PA al igual que Reteplasa y Tenecteplasa se espera un rol fisiolgico semejante. Clasificacin del compuesto El activador tisular del plasmingeno (t-PA) es una serina proteasa sintetizada por las clulas vasculares endoteliales (clulas aplanadas que forman el endotelio vascular que recubre la cara interna de los vasos sanguneos y el corazn) como un polipptido de una sola cadena, con una longitud de 527 amino cidos y una masa molecular de aproximadamente 64kDa15. La figura presenta un esquema de la estructura primaria de t-

PA. Cuenta con 17 enlaces disulfito , 4 glicosilaciones enlazadas con N en los residuos 117, 184, 218 y 448 15. Hay dos formas de t-PA, Tipo I, esta glicosilado en Asp 117, 184 y 448, mientras que Tipo II carece de la glicosilacin de Asn 184. Rt-PA tambin existe en dos formas que varan por la presencia/ausencia de un C residual Asn184. Fuera de eso, su estructura es semejante a la de t-PA. Reteplasa es una variacin de t-PA, pptido de una cadena, no glicosilada, con masa molecular de 39.6kDa. Tenecteplasa tiene sustitucin de amino cido en tres regiones de t-PA, lo que resulta en la incorporacin de un complejo polisacrido (T103N), la remocin de un carbohidrato alto en manosa (N117Q), un aumento en la especificidad de fibrina (KHRR496-499AAAA)8. Biosntesis de Compuesto Alteplasa (rt-PA) originalmente se produca a partir de clulas de ovario de hmster chino (CHO), que son transfectadas con cDNA del producto humano natural, utilizando un proceso de agitacin de botella (Roller Bottle, RB), la mayora de los estudios farmacoquinticos y clnicos fueron conducidos usando rt-PA a partir de este proceso. Posteriormente se desarrollo con fines comerciales un proceso a partir de un cultivo en suspensin (suspensin cultura, SC) a gran escala cuyo producto es aproximadamente un 80% rt-PA de una sola cadena. El rt-PA del proceso SC desapareca de la sangre 30% ms rpido que el obtenido del proceso RB. Aunque ambos productos tenan propiedades farmacodinmicas y teraputicas similares. Tenecteplasa, se produce a partir de la transfeccin de clulas de hmster chino (CHO) con un plsmido que contiene el gen t-PA amplificado en presencia de metotrexato, fueron cultivadas en un medio libre de suero durante 6 das, el producto fue purificado utilizando una cromatografa de afinidad de lisina. Mientras que Reteplasa se expresa en Escherichia coli como una sola cadena no glicosilada.

Enfermedades que mitigan/curan

La deposicin de fibrina y plaquetas en el sistema vascular conlleva a padecimientos trombolticos, es decir, cuando los cogulos de sangre obstruyen las venas o las arterias, impidiendo o dificultando el flujo sanguneo normal, lo que se conoce como trombosis11. Puede ser trombosis arterial, cuando el cogulo obstruye vasos sanguneos que llevan la sangre oxigenada del corazn al resto del cuerpo; O trombosis venosa, cuando el cogulo obstruye los vasos sanguneos que devuelven la sangre del cuerpo al corazn. Es un padecimiento que dependiendo de la severidad del caso puede llevar a fallas cardiacas o embolia pulmonar y con ello a la muerte. Por lo general la coagulacin y la fibrinogenolisis existen en un estado de balance en el organismo mediante mecanismos regulatorios endgenos que aseguran el ptimo funcionamiento del proceso de hemostasis y de coagulacin de sangre, de forma que el cogulo se forme en el lugar correcto y est bien controlado, evitando los efectos trombognicos. Tratamientos con agentes trombolticos recombinantes se utilizan para fomentar la disolucin de los cogulos y disminuir el ndice de mortandad ayudando al cuerpo a llegar al balance entre coagulacin y fibrinogenlisis. Alteplasa, se utiliza para tratamiento de hemofilia, infarto agudo al miocardio (AMI), embolia pulmonar masiva, para el control de paro cardaco isqumico agudo (en un margen de 3 horas post-infarto) y post hemorragia intracraneal. Reteplasa y Tenecteplasa se utilizan para el control de infarto agudo al miocardio (AMI), mejorando el funcionamiento ventricular y reduciendo el ndice de mortandad. Lanoteplasa se encuentra en desarrollo pero por ser derivado de rt-PA al igual que Reteplasa y Tenecteplasa se espera un rol fisiolgico semejante.

Anlisis qumico del compuesto Anlisis farmacocintico fue hecho en conejos a los que se les administr una dosis va intravenosa de 0.3mg/kg y se obtuvieron muestras de sangre de 0.2ml cada 2 horas, las muestras fueron recolectadas en EDTA con Phe-Pro-Arg clorometil cetona y cuantificadas en una ELISA utilizando dos anticuerpos monoclonales. Dando mayor capacidad de rendimiento para Tenecteplasa que para Alteplasa. La unin a la fibrina fue probada con Tyr-Pro-Arg clorometil cetona como agente especifico para variantes de t-PA. Donde la Tenecteplasa mostr una Kd (constante de disociacin) de 0.35 nmol/L, comparable con la Alteplasa con una Kd de 0.21 nmol/L. El rango de inhibicin por PAI1 se midi en base a la prdida de actividad amidoltica en base al tiempo. Donde se observ que Tenecteplasa es 80 veces ms resistente a la inhibicin por PAI1 que t-PA. Se midi la especificidad en comparacin de t-PA y sus derivados, Tenecteplasa y Reteplasa, en base a la actividad cataltica en cuanto a fibrina y fibringeno, siendo 15 veces superior la de rt-PA que la de t-PA17. El efecto inmunolgico fue probado en conejos blancos, tomando muestras de sangre en tubos que contienen una solucin de EDTA al 8.5%, y 50M D-Phe-Pro-Arg (PPACK) que bloquea la actividad de t-PA. La concentracin de inmuno reactividad se determin usando una prueba Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)18 Farmacocintica y Farmacodinmica del compuesto La farmacocintica de rt-PA ha sido estudiada en ratones, ratas, Conejos, primates y en humanos. Despus de la administracin intravenosa, las concentraciones en el plasma descienden rpidamente con una vida media inicial dominante de menos de 5 minutos en todas las especies. Los rangos de disminucin en el plasma van desde 27 mL/min en conejos hasta 620 mL/min en humanos. Los t-PA recombinantes exhiben una farmacocintica no linear en

concentraciones altas en el plasma. Es en concentraciones que no exceden del 10% al 20% de Km cuando se presentan de forma lineal. (Vease Tabla 5 en Anexos) Esta informacin muestra que los t-PA recombinantes tienen un volumen inicial de distribucin aproximado al volumen en plasma y un rpido aclaramiento plasmtico. No hubo diferencia en la farmacocintica con las siguientes infusiones. La ruta primaria de eliminacin de alteplasa es mediada por los receptores de mecanismos en el hgado. Tres tipos de clulas en el hgado son responsables de estos procesos: clulas parenquimales, clulas endoteliales y clulas Kupffer. Las clulas Kupffer y las clulas endoteliales median eliminacin de t-PA via receptores de manosa. Las clulas parenquimales los hacen va LRP (low-density lipoprotein receptorrelated protein). La alteplasa t-PA se usa para el tratamiento de enfermedades como el AMI y embolia pulmonar masiva en adultos. Para su administracin se han estudiado dos regmenes, un rgimen acelerado de 90 minutos y un rgimen de tres horas. Para el rgimen acelerado la dosis recomendada se basa de acuerdo al peso del paciente, sin exceder los 100 mg de alteplasa. Para pacientes que pesen ms de 67 kg, el rgimen recomendado es 100 mg distribuidos en 15 mg de inyeccin intravenosa en bolo , seguidos por 50 mg administrado por 30 minutos, y posteriormente 35 mg por los prximos 60 minutos. Para pacientes que no sobrepasan los 67 kg de peso, se recomienda un rgimen de 15 mg de inyeccin intravenosa en bolo, seguido por 0.75 mg/kg por 30 minutos y despus 0.5 mg/kg por los prximos 60 minutos pero no excediendo los 35 mg. Para el rgimen de 3 horas, la dosis recomendada es de 100 mg administrados como 60 mg en la primera hora y 20 mg durante cada una de las siguientes dos y tres horas. Reacciones adversas. La terapia tromboltica incrementa el riesgo de sangrado, por lo que la alteplasa est contraindicada para pacientes con una historia de accidentes cerebrovasculares, o

pacientes que tengan algn tipo de hemorragia interna, neoplasma intracranial, malformacin arteriovenosa o aneurisma o que hayan tenido algn trauma reciente. Segunda generacin. Reteplasa Reteplasa es una variante de t-PA que consiste de los dominios humanos de proteasa y kringle 2. Se expresa en clulas de E. Coli como un pptido no glicosilado de cadena simple. Como la alteplasa, la reteplasa es un activador fibrino-especfico plasmingeno. La reteplasa tuvo eficiencia mxima in vitro similar a la alteplasa, sin embargo, la concentracin molar requerida para producir un 50% de lisis coagular fue 6.4 veces mayor para reteplasa que para alteplasa. (Ver Tabla 6 en Anexos) Reteplasa es indicado para el tratamiento de AMI en adultos para el mejoramiento del funcionamiento ventricular despus de un infarto agudo al miocardio, la reduccin de la incidencia de problemas cardiacos y la reduccin de mortalidad relacionada con AMI. La potencia de este agente se expresa en unidades usando un estndar de referencia que es especfico para reteplasa y no puede ser comparado con unidades usadas para otros agentes trombolticos. Reteplasa es administrado como una inyeccin doble en forma de bolo de 10 U cada una y con una diferencia entre inyecciones de 30 minutos. De la misma forma que con otros trombolticos, Reteplasa esta contraidicado de la misma forma que Alteplasa. No se debe de suministrar en pacientes con historiales de sangrado interno, accidente intracrianal o cualquier trauma o ciruga. Tenecteplasa La tenecteplasa es una variante t-PA que tiene sustituciones de amino cidos en tres regiones de t-PA. La eliminacin de la tenecteplasa en el plasma de conejos fue de 1.9 mL/min/kg comparado con los 16 mL/min/kg para la alteplasa. Estudios de distribucin de

tisular muestran que el hgado es el rgano involucrado principalmente en la eliminacin. La forma de los carbohidratos en la tenecteplasa son parte del tipo oligosacrido complejo y sin la presencia de estructuras de manosa. Es por esto que la eliminacin rpida mediada por el receptor de mannosa observada para la alteplasa no ocurre con la tenecteplasa. Se cree que la tenecteplasa es eliminada por receptores de galactosa presentes en las clulas sinusoidales del hgado. Una segunda via de eliminacin de tenecteplasa es un mecanismo mediado por lipoprotenas de baja densidad relacionadas a la LRP. La dosis total de tenecteplasa no debe exceder los 50 mg y se basa en el peso del paciente. (Ver tabla 7 Anexos) El tratamiento debe ser iniciado lo ms pronto posible despus de los sntomas de un AMI. La tenecteplasa est contraindicada en pacientes con ditesis hemorrgica conocida, o sangrado interno, historia de accidente cerebrovascular, ciruga intracraneal reciente o aneurisma. Se realizaron dos estudios (TIMI10A y TIMI10B) para examinar la farmacocintica de la tenecteplasa. La concentracin en el plasma de Tenecteplasa disminuyen de forma bifsica con una vida media inicial de 11 a 20 minutos y una vida media terminal de 41 a 138 minutos. La eliminacin media de tenecteplasa qued en rango de 125 a 216 mL/min y decreca incrementando la dosis. (Ver Tabla 8 Anexos) Se pretende que la tenecteplasa sea suministrada por inyeccin intravenosa en forma de bolo despus de una reconstitucin con agua esteril. La actividad de la tenecteplasa se expresa en unidades especficas para la misma y se ha definido en 200 unidades/mg de protena. Lanoteplasa La lanoteplasa est actualmente en desarrollo. Es una variante de t-PA en la que los dominios de la fibronectina y los factores de crecimiento epidermal han sido removidos. Adems de que una sustitucin de aparagina por glutamina en el amino acido 117 produce eliminacin reducida.

Formulaciones Estreptoquinasa (Sk): Streptase La molcula de Sk se ha modificado debido a que sus propiedades teraputicas se ven limitadas a causa de su inmunogenicidad y su corta vida media en la sangre, ya que es degradada por la plasmina. Razn por la cual los trabajos de modificacin se han centrado en extender la vida media y/o reducir la inmunogenicidad mediante la mejora de la activacin del plasminogeno. La primera de estas modificaciones presente en el mercado fue el complejo activador equimolar no covalente formado por la Sk y el lis-plasminogeno humano, cuyo centro cataltico se acilo de forma reversible para incrementar la vida media de la molcula en reaccin con la Sk. PM: 46 000 Daltons Administracin intravenosa de 1.5 millones de IU por un periodo de 1 hora. La vida media del complejo activador (estreptoquinasa-plasminogeno y/o estreptoquinasa-plasmina) es de 23 min1. Estreptoquinasa recombinante: Heberquinasa La Sk recombinante producida por la levadura Pichia pastoris es glicosilada y esto le confiere determinada resistencia a la protelisis. Se han realizado polmeros con el polietilenglicol (PEG) con la finalidad de incrementar la vida media. La inmunogenicidad de los dominios de la Sk es diferente y se han obtenido mutantes recombinantes de Sk con inmunogenicidad reducida. Es obtenida del aislamiento y clonacin de el gel de Estreptoquinasa de la cepa de Streptococcus equisimilis grupo C (ATCC 9542). En cuanto a la estructura primaria de la protena, se ha caracterizado por la molcula de N-terminal de la secuencia, el anlisis de aminocidos y espectrometra de masa con el fin de demostrar la identidad, integridad y consistencia de la Heberquinasa.

La Heberquinasa contiene 5 aminocidos mutados en comparacin con la Estreptoquinasa de S. equisimilis del grupo C. El punto isoelctrico terico del producto es 0.06 unidades ms bajo que el de la estreptasa, lo que quiere decir que la protena es mas acida. La molcula de Heberquinasa tiene dos Argininas sustituidas por Histidina y Acido Glutamico, lo que provoca que cambie su densidad de carga, modificando su movilidad en el gel de electroforesis S-PAGE, migrando significativamente ms rpido que la Estreptoquinasa natural2. El mapeo de la protena se realiza frecuentemente para permitir la verificacin de su estructura completa primaria al 100%. A su vez, la determinacin de la masa molecular de la protena intacta que da un valor menor a 1 Da asegura la integridad de la protena. El cambio de los aminocidos no afecta en lo absoluto la seguridad, pureza y efectividad del producto obtenido por la tecnologa de DNA recombinante Alteplasa: Actilyse Se obtiene de la serina proteasa, que contiene 527 aminocidos, y es producido por ADN recombinante usando el ADN complementario (ADNc) para el activador natural del ser humano del plasminogeno tisular obtenido a partir de una lnea de celulas de melanoma humano. PM: 68 000 Daltons4. Estreptoquinasa recombinante Fosfato de sodio dibsico y monobsico: reguladores de pH Glutamato de sodio: Albumina humana

Produccion Biotecnologica de ALTEPLASA: PLASMINASA La lnea celular utilizada fue Celulas de Ovario de Hmster Chino (CHO) que producen activador tisular del plasminogeno humano (t-PA). La lnea celular se produjo transfectando celulas CHO con un plsmido que contena el gen que codifica para t-PA y la investigacin la realizo la empresa Genentech al final de la dcada de los ochenta. Las celulas se encuentran a la venta en la ATCC. El medio de cultivo usado es el Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) y F12 (1:1). La inoculacin de un biorreactor con la lnea celular implica el escalamiento de los volmenes que se usaran. Con este propsito se usan frascos en forma de T especiales para el cultivo de las celulas humanas. Estos frascos son rectangulares y estn hechos de policarbonato. Con el volumen adecuado, se inocula el reactor que funcionara de forma de proceso Fedbatch. Constantemente se alimentara medio fresco, y en otro recipiente se recolectara medio de cultivo con el producto. Las celulas estarn libres y para evitar el lavado de la biomasa se utilizara la tcnica de cromatografa de afinidad. Se concentrar el producto aun ms por dilisis. El fundamento de esta tcnica es retener las protenas en una membrana semipermeable y dejar pasar los solutos de bajo peso molecular. Se obtendr la protena pura en solucin que se conservara por liofilizacin. La forma farmacutica en que se vender al publico ser en viales para lo cual primero se mezclaran los componentes de la formula en una mezcladora y posteriormente se liofilizaran para obtener el producto terminado6.

REFERENCIAS 1. Hermentin P, Cuesta-Linker T, Weisse J, Schmidt KH, Knorst M, Scheld M, Thimme M. Comparative analysis of the activity and content of different streptokinase preparations. Eur Heart J. 2005; 27: 178 2. Hernndez, L., Martnez, Y., Quintana, M., Besada, V., Martnez, B. Heberkinasa: recombinant streptokinase. Eur. Heart J. 2005; 26: 1691. 3. Hernndez, L., Marrero, M.A. Estreptoquinasa: a propsito de un agente tromboltico patentado en Cuba. Biotecnologa Aplicada 2005; 22:182-190 4. Alteplase, recombinant package insert (Activase, GenentechUS), Rev 11/87. Recuperado de:http://www.drugs.com/mmx/alteplase-recombinant.html 5. AMH Pty Ltd. Actilyse. Australian Medicines Handbook: July 2005. MIMS Australia Pty Ltd. Actilyse. MIMS Online 2003. Recuperado de: http://www.virtualmedicalcentre.com/drugs.asp?drugid=2988&title=Actilyse 6. Arteaga, M.R, et al. (2006). Estudio de prefactibilidad para la instalacin de una planta productora de un medicamento GI a base de Alteplasa solucin inyectable, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Mxico D.F, Mxico. 7. M., Plzak, K., Gass, J. The Production of Recombinant Factor VIII Process design project. ChemE 250A. 2003 8. Crommelin D, Sindelar R. Pharmaceutical Biotechnology : An Introduction For Pharmacists And Pharmaceutical Scientists [e-book]. Taylor & Francis Routledge; 2002. Available from: eBook Collection (EBSCOhost), Ipswich, MA. Accessed November 14, 2011 9. Ben-Or, S., Feins, R. Effectiveness and Risks associated With Intrapleural alteplase by Means of Tube Thoracostomy. Ann thorac Surg 2011; 91:860-4. Division of Cardiothoracic Surgery. Accesado Noviembre 14, 2011 10. Gonzalez, A. Pruebas diagnosticas, analisis de sangre. Recuperado de http://www.saludalia.com/Saludalia/servlets/contenido/jsp/parser.jsp?nombre=d oc_a_sangre2 11. Levin, Bruce. Statistical aspects of the TNK-S2B trial of tenecteplase versus alteplasa in acute ischemic stroke: an efficient, dose-adaptive seamless phase II/III design.Clinical Trials Design. 2011; 8: 398-407. Accesado Noviembre 14, 2011 12. Eaton, D. et al. Characterization of recombinant human Factor VIII. J Biol Chem 1987; 262: 3285-3290 13. Schwartz, R., et al. Human recombinant DNA-derived antihemophilic factor (Factor VIII) in the treatment of hemophilia A. N. England J Med 1990; 323: 1800-1805 14. Collins, P, Faradji, A. Efficacy and safety of secondary prophylactic vs. on-demand sucrose-formulated recombinant factor VIII treatment in adults with severe hemophilia A: results from a 13-month crossover study. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 8:83-89. Accesado Noviembre 14, 2011 15. Pennica, D. et al. Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E.coli. Science 1983; 301: 214-221.

16. Collen D, De Bono DP, Lijnen HR, Development of novel thrombolytic agents: minisymposium on the role of the fibrinolytic system in the pathophysiology and treatment of thrombosis; 1993 Oct; Leuven. J Intern Med 1994; 236: 433-7 17. Stewart RJ, Fredenburgh JC, Leslie BA, Identification of the mechanism responsible for the increased fibrin specificity of TNK-tissue plasminogen activator relative to tissue plasmingeno activator. J Biol Chem 2000; 275: 10112-20 18. Eppler S, Senn T, Gilkerson E, Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant tissue-type plasmingeno activator following intravenous administration in rabbits; comparison of three dosing regimens. Biopharm Drug Dispos 1998; 19: 31-8 19. Thrombosis Adviser. Haemostasis.Bayer, 2011. Recuperado de: http://www.thrombosisadviser.com/en/understandingthrombosis/haemostasis/index.php?WT.srch=1&WT.mc_id=1&ad_group=Coagulat ion_Cascade&kw=coagulation&gclid=CMLa39zJsawCFeldtgodrmDIGA. 14/11/2011 20. Tanswell, P., Modi, N., Combs, D., Danays, T. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of tenecteplase in fibrinolytic therapy of acute myocardial infarction. Clin Pharmacokinet 2002; 41 (15): 1229-45 21. Kooistra, T., Schrauwen, Y., Arts, J., Emeis, J. Regulation of endothelial cell t-PA synthesis and release. Int J Hematol 1994; 59 (4): 233-55 22. Medicina preventiva. Pruebas de coagulacion. Dr. Rigoberto Marcano Pasquier. Junio 11, 2011. Recuperado de: http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/coagulacion.htm. 14/11/2011 23. Keyt, BA. Paoni NF et al. A faster-acting and more potent form of tissue plasminogen activator. Department of Cardiovascular Research, Genentech, Inc. 1994. Apr 26;91(9):3670-4 Accesado el 14 de noviembre de 2011 24. Mirzaahmadi, S. et al. Expression of recombinant human coagulation factor VII by the Lizard Leishmania expression system. J Biomedic Biotechnology. 2011; 2011:873874. Epub 2011 Sep 8. Accesado el 14 de noviembre de 2011 25. Dowshen, Steven. Anlisis de Sangre: Factor VIII de la coagulacin. Los problemas mdicos. Kids Health. Febrero 2011. Recuperado de http://kidshealth.org/parent/en_espanol/medicos/test_factor8_esp.html# el 14 de noviembre de 2011

ANEXOS:

Fig. 1 Esquema de Hemostasis dividida en 3 partes, Iniciacin, formacin de cogulo y Fibrinlisis.

Fig. 2 La compleja cascada de coagulacin con todos los factores de coagulacin que involucra.

Fig. 3 Esquema simplificado de la cascada de coagulacin en torno a las enzimas tratadas en este documento.

Fig. 4 Presentacin comercial de rFVIII Kogenate FS de Bayer

Fig. 5 Diagrama de flujo del proceso de produccin del Factor VIII para Kogenate (2003).

Fig. 6 Presentacin comercial de la Heberquinasa

Fig. 7 Presentacin comercial de Alteplasa Recombinante. Actilasa

Alteplase, recombinant package insert (Activase, GenentechUS)

Fig. 9a(arriba): Proceso para Kogenate versin 2010. Produccin celular

Fig. 9b (abajo): Proceso para Kogenate versin 2010. Purificacin e introduccin al mercado.

Fig. 8 Diagrama de flujo del proceso de produccin biotecnolgica de Alteplasa

Tabla 1. Farmacocintica de Factor VIII recombinante. Parmetros tomados despus de administracin intravenosa a pacientes con hemofilia A

Tabla 2. Farmacocintica clnica de Factor recombinante Va

Tabla 3. Ingredientes del medio de cultivo para la produccin del rFVIII Ingredient Name Sulfato de amonio Flow Rate (kg/hr 0.33200 Mass Comp. (%) 0.3978

Cloruro de calcio Glucosa Glutamina Insulina humana recombinante Cloruro de potasio Fosfato de potasio Sulfato de magnesio Murina IgG Polisorbato Citrato de sodio Fosfato de sodio WFI

0.08300 12.45 12.45 0.00001 0.08300 0.2075 0.166 0.032 0.00064 0.083 0.1245 57.437

0.0995 14.9194 14.9194 0.00001 0.0995 0.2487 0.1989 0.0383 0.0008 0.0995 0.1492 68.8292

Tabla 4. Composicin del UFTCF empleado en la produccin biotecnolgica de rFVIII Nombre del Ingrediente Sulfato de amonio Cloruro de calcio Factor VIII Glucosa Glutamina ADN de clula hospedera Insulina humana recombinante Cloruro de potasio Fosfato de potasio Sulfato de magnesio Murine IgG Protena que no es de inters Polisorbato Citrato de sodio Fosfato de sodio Agua (incluyendo WFI) Taza de Flujo (kg/h) 0.30286 0.07567 0.00007 10.84989 11.30047 0.02282 0.00001 0.07567 0.18917 0.15134 0.02917 0.04464 0.00058 0.07567 0.1135 43.86642 Composicin Msica 0.4511 0.1128 0.0001 16.8418 16.8418 0.0340 0.000015 0.1128 0.2819 0.2255 0.0435 0.0665 0.0009 0.1128 0.1692 63.3768

Tabla 5. Parmetros famacocinticos para alteplasa. Parmetros obtenidos despus de administracin intravenosa en pacientes saludables y pacientes con AMI (infarto agudo de miocardio).

Tabla 6. Parmetros farmacocinticos de Reteplasa. Parmetros obtenidos de estudio en fase II en pacientes con AMI.

Tabla 7. Relacin entre peso del paciente y dosis de Tenecteplasa.

Tabla 8. Parmetros farmacocinticos de Tenecteplasa. Obtenidos de la fase II de un estudio en pacientes con MIA