Curs 5 Analiza si Controlul Medicamentelor

CROMATOGRAFIA
METODE CROMATOGRAFICE APLICATE IN CONTROLUL MEDICAMENTELOR
CROMATOGRAFIA este una din ramurile vaste ale analizei (instrumentale) medicamentului, cu aplicatii largi in separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si in analiza si controlul medicamentelor in particular. Tehnicile cromatografice de analiza sunt in primul rand tehnici de separare, dintre cele mai selective si eficiente, inclusiv pt urme de substante si asociate cu metode de detectie. Sunt capabile sa sesizeze cantitati infime de substante, ceea ce le confera o mare sensibilitate, selectivitate si eficienta. Se poate spune ca toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si o faza mobila iar componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila, gazoasa sau lichida, cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii. Pe de alta parte, la baza tuturor metodelor cromatografice de separare, stau 4 procese fundamentale: a. Adsorbtia pe suporturi solide b. Repartitia intre faza stationara si cea mobila c. Schimbul ionic d. Excluderea, difuzia. Prin urmare, principiul separarii poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice sunt aceleasi: - Pregatirea fazei stationare - Fixarea initiala a analitilor, in capul coloanei, pe faza stationara, dupa introducerea solutiei de proba - Deplasarea selectiva, caracteristica a analitilor, antrenati de faza mobila, in cadrul procesului de elutie, developare. - Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec in detector. - Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor pick-urilor si a altor parametri si dozarea analitilor corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a rezultatelor.

Tinand cont de natura fazelor stationare si a celor mobile se poate realiza o clasificare acceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice: Cromatografia in faza gazoasa Cromatografia in faza lichida - Planara o Pe hartie o Pe strat subtire (css) - Pe coloana o De adsorbtie solid-lichid o De repartitie lichid-lichid o De schimb ionic o De excludere-difuzie Alegerea fazelor stationare se face in functie de masa moleculara a analitilor, de solubilitatea lor in solventi organici si apa, de caracterul lor (nepolar, polar sau ionic). In cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid (oxid de aluminiu) care are proprietati absorbante. In cromatografia de repartitie faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid, cele 2 faze nefiind miscibile. In cromatografia de schimb ionic faza stationara un compus macromolecular care contine un nr mare de grupari functionale, acide sau bazice, capabile sa schimbe cationi (care sunt grupari acide) sau anioni mai grei si cu sarcina mai mare. Aceste macromolecule schimbatoare de ioni se mai numesc si rasini cationice sau cationiti si anionice/anioniti. In cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie, faza stationara un gel care se comporta ca o sita moleculara, fixand anumite molecule si eliminand altele, in functie de marimea si masa lor. In afara de aceste tipuri fundamentale exista si unele procedee cromatografice specifice, caracteristice unor specii chimice: - Cromatografia chirala, de absorbtie sau de repartitie; se caracterizeaza prin structura chirala a fazei stationare sau a fazei mobile ceea ce permite separarea selectiva a analitilor chirali. - Cromatografia cu lichide super-critice, care exploateaza solubilitatea analitilor intr-un fluid super-critic; ex: CO2 ca atare sau modificat (+ metanol); - metoda asigura extragerea analitilor din matrice si ulterior separarea cromatografica. - Electro-cromatografia capilara micelara o tehnica hibrida care imbina cromatografia cu electroforeza;
2

In functie de procedeul practic utilizat: o Cromatografie pe coloana in care faza stationara este plasata pe o coloana, tub de metal, sticla, silice o Cromatografie planara/de suprafata pe hartie sau pe strat subtire In functie de migrarea fazei mobile se disting: Cromatografie prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau sunt localizati pe aceasta; in functie de directia de migrare, ascendenta sau descendenta, Cromatografie de elutie, in care analitii sunt eluati (spalati) pana la iesirea lor completa din coloana, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor de analiti si in acest caz detectia se face in eluenti. Pentru intelegerea corecta a proceselor cromatografice trebuie precizati parametri sau marimile care definesc procesele cromatografice de separatie. Ex: o proba cu 2 analiti. Pe coloana pregatita in prealabil se introduce un volum din proba, se adauga faza mobila, putin cate putin, incepe developarea, adica migrarea analitilor cu viteze diferite. Se produce elutia, adica extragerea din coloana a fiecarui analit, iar la aparatele moderne de croma eluentul se conduce direct la detector, in care se face detectia analitilor separati.

Se observa ca procesul de separare se produce treptat intre faza stationara si faza mobila existand un echilibru determinat de concentratiile fiecarui analit in cele 2 faze si a caror raport reprezenta coeficientul de repartitie sau de distributie (kd). Pentru un amestec de analiti este posibil sa se utilizeze un detector plasamt cat mai aproape de iesirea eluentului din coloana si care inregistreaza continuu semnalul analitic, semnal proportional cu variatiile concentratiilor analitilor separati si eluati, care traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma corespunzatoare, inregistrata de un inregistrator care face parte din ansamblul instrumentului de analiza cromatografica. Fiecarui analit ii corespunde un pick pe cromatograma care se inregistreaza intr-un sistem de coordonate.

Parametrii/marimile de retentie cromatografica sunt: - timpul - volumul - distanta - factorul/raportul de retentie, acestia fiind legati de coeficientul de distributie (kd) intre faza stationara si cea mobila. Timpul de retentie tr = timpul scurs de la introducerea probei de analit in coloana si momentul in care apare maximul pick-ului din coloana. t0 sau tm = timpul mort = timpul necesar ca faza mobila sa ajunga la detector si se datoreaza parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spatiile fazei stationare. De regula, eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pick al detectorului, si din acest moment, se masoara timpul de retentie al analitului, numit timp de retentie corectat. Volumul de retentie Vr = reprezinta volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cu concentratia sa maxima in detector. Similar timpului de retentie, volumul de retentie corectat. (Vr=Vr-V0) Raportul de retentie se exprima prin raportul dintre viteza medie de deplasare a analitului si viteza medie de deplasare a fazei mobile. Rr Factorul de retentie se exprima prin raportul dintre cantitatea de analit care se gaseste in faza stationara (Qs) si cantitatea de analit care se gaseste in faza mobila(Qm).

Curs

Analiza si Controlul Medicamentelor

CROMATOGRAFIA PE HARTIE (C.H.)

Realizeaza separarea sau distribuirea componentelor dintr-un amestec intre: o faza stationara, constituita din hartia cromatografica (de regula celuloza 95-99%) impregnata cu un solvent polar (apa, solutii tampon) o faza mobila, constituita dintr-un sistem de solventi de polaritate opusa, adica nepolari. Procesul de separare are la baza in general un mecanism de repartitie dar se pot intalni si mecanisme de absorbtie, schimb ionic, reactii chimice. Aparatura este dependenta de procedeul ales pentru developare. In general se utilizeaza camere sau bac-uri cromatografice din sticla sau metal (de regula inox), cu posibilitatea de inchidere etansa (cu vizoare), de forma cilindrica sau paralelipipedica, prevazute cu un dispozitiv de fixare a hartiilor cromatografice si cu o cuva care in cazul tehnicii ascendente se fixeaza pe fundul vasului cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente se fixeaza la partea superioara a vasului. Benzile de hartie cromatografica sunt specificate in monografia respectiva, sorturile utilizate (Watmann, Munktel, Schull) fiind caracterizate prin: - viteza de migrare a solventului - porozitate - aspectul suprafetei - grosime - si eventual, utilizarea ei care deriva din pretratare (ex: hartia hidrofobizata, in scopul separarii subst hidrofobe) Tehnica de lucru: daca nu se prevede altfel, cu 24 h inainte de determinarea cromatografica, vasul cromatografic se satureaza cu toate componentele fazei mobile (adica a developantului), introduse in cristalizoare la o temperatura de 20-25gradeC. Tehnica cromatografica ascendenta, descendenta, pregatirea benzilor de hartie cromatografica, developantul, modul de preparare al solutiilor de aplicat (proba si etalonul), volumele aplicate si distanta parcursa de developant sunt prevazute in monografia respectiva. Linia pe care se aplica solutiile = linie de start trebuie sa fie situata la o distanta de 5-6 cm de marginea benzii de hartie pt tehnica ascendenta si de 10-12 cm pt tehnica descendenta. Distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin 2,5 cm. Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, cu micropipete, microseringi, in puncte circulare cu diametru de cel mult 6 mm. Daca este cazul, solutia se aplica in mod repetat asteptand de fiecare data evaporarea solventului.
5

Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, hartia cromatografica se scoate, se usuca si se pun in evidenta petele conform prevederilor din monografie. Se trece la identificare, evaluare semi-cantitativa si dozare. Dozarea se mai poate efectua si dupa decuparea petei si eluarea acesteia cu un solvent potrivit conform prevederilor. Aplicatii ale cromatografiei pe hartie: - metoda oficiala pt determinarea puritatii radiochimice a substantelor radioactive - identificarea si dozarea fenobarbitalului din comprimate - identificarea si puritatea maleatului de ergometrina

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE C.S.S.

Este o metoda ce permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferentei lor de deplasare de-a lungul unui strat absorbant care acopera o placa de sticla, metal sau polimer sub actiunea unui sistem de solventi. Stratul absorbant constituie faza stationara si poate avea o grosime de 0,2-0,3 mm pentru scop calitativ si 1-2 mm pentru scop cantitativ. Separarea evidentiaza un mecanism de adsorbtie, repartitie, schimb ionic, s.a. Cei mai uzuali adsorbanti ce alcatuiesc faza stationara, utilizati in C.S.S. sunt: - silicagelul - celuloza - oxidul de Al - kieser......???? Tehnica de lucru: asemanatoare C.H., iar particularitatile sunt prevazute in monografia respectiva. In C.H. sau C.S.S. zona de migrare este definita prin Rf care reprezinta raportul dintre distantele de migrare ale componentelor si frontul fazei mobile. Pentru indentificarea substantelor se compara pe aceiasi cromatograma valoarea R f, culoarea si fluorescenta petei obtinute cu solutia probei, cu valoarea Rf, si culoarea si fluorescenta petei obtinute cu solutia etalon

a distanta parcursa de substanta de la pc de aplicate al solutiei pana la centrul petei in cm b distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei si pana la frontul developantului, trecand prin centrul petei. De obicei, punerea in evidenta a punctelor de pe cromatograma se efectueaza prin examinarea acestora ca atare, sau dupa tratarea cu reactivi potriviti in lumina vizibila sau UV. Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza dupa razuirea petelor respective si eluarea substantelor de pe absorbant cu un solvent potrivit prin spectrometrie. Compararea vizuala a dimensiunii petelor si a intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste pt evaluarea semi-cantitativa a impuritatilor. Aplicatii: identificarea teofilinei si papaverinei din supozitoare - identificarea fenacetinei, cofeinei, aspirinei din comprimate - determinarea puritatii palmitatului de cloramfenicol, care admite cel mult 2% cloramfenicol neesterificat - determinarea impuritatilor din tetraciclina
7

CROMATOGRAFIA DE GAZE C.G.

Este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este un gaz (gaz purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid, inert, aflata intr-o coloana cromatografica, confectionata de obicei din sticla sau din otel inoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul purtator trece prin detector. Cromatografia de gaz este o varianta a cromatografiei pe coloana si permite atat separarea subst volatile, cat si a celor care in urma unor reactii chimice pot fi transformate in derivati volatili si stabili. Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale: - sursa de gaz - camera de evaporare - coloana cromatografica - termostatul - detectorul - sistemul de inregistrare. Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba de analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor. La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate prin detector care emite un semnal electric proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa. Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare, iar rezultatele se prezinta sub forma unui grafic semnal/timp. Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori, camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pt a asigura o evaporare rapida si fara a produce o degradare termica a probelor. Cu ajutorul termostatului in timpul determinarii, temperatura coloanei cromatografice este mentinuta constanta. Faza mobila este constituita dintr-un gaz inert (He, neon, argon, H) = numite si gaze vector sau purtatoare, care antreneaza substantele de determinat. Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferita, fapt ce duce la separarea si la eluarea lor din coloana intr-o anumita ordine. La iesirea din coloana componentele eluate succesiv de gazul vector sunt decelate de un aparat de masura (detector) care deosebeste proprietatile componentelor de cele ale gazului vector si produce un semnal, care se inregistreaza.
8

Se traseaza o curba in clopot analog unei curbe de distributie Gauss. Varful cromatografic sau pick-ul corespunde componentei separate, iar inaltimea lui este proportionala cu concentratia componentului in faza gazoasa. Detectia componentelor din gazul vector se realizeaza cu ajutorul unor detectoare universale/specifice, adica sensibile numai la anumite elemente chimice, grupe functionale sau legaturi chimice. La baza detectiei sta in principiu orice proprietate care deosebeste componenta de detectat de eluant. Spectrometrul de masa (m.s.) cuplat la un gaz cromatograf ofera posibilitatea detectarii unui nr mare de compusi dintr-un amestec omplex, fiecare compus fiind identificat prin spectrul sau de masa, obtinut prin introducerea eluantului direct in camera de ionizare a spectrometrului de masa. Gaz-cromatograful se utilizeaza atat in determinari calitative cat si cantitative; la baza determinarilor cantitative sta relatia de proportionalitate intre aria de sub pick-ul cromatografic si cantitatea componentului eluat.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)

Sub aceasta denumire sunt descrise principalele si cele mai frecvent aplicabile metode de analiza cromatografica bazate pe repartitie lichid-lichid, adsorbtie lichid-solid, schimbator de ioni, procese de excludere-difuzie. Cromatografia de lichide clasica - pe coloana - pe strat subtire - pe hartie necesita o aparatura simpla dar este destul de lenta cu o capacitate de separare relativ mica; detectia componetelor este dificila, costisitoare si necesita cantitati mari de solvent si pregatiri tehnice laborioase. Cromatografia de gaze s-a impus ca o metoda rapida, sensibila si a cunoscut o mare extindere prin cuplarea gaz-cromatografului cu spectrometrul de masa, limitele metodei, insa, fiind impuse de conditia volatilizarii produsilor sau a transformarii lor in derivati volatili si stabili termic, aspecte ce fac posibile determinari ale unui nr scazut de substante organice (aprox 15%). Cunostintele dobandite in gaz-cromatografie, transpuse in practica cromatografiei de lichide au condus la o tehnica de inalta performanta, moderna, care se realizeaza cu o viteza mare, si elimina dezavantajele cromatografiei de gaze, utilizand absorbanti cu o structura fina, se mareste rezistenta la curgere a fazei mobile, si o data cu scaderea vitezei de curgere cresc timpii de retinere a componentelor pe coloana. In aceste conditii pt realizarea unei separari eficiente in timpi scurti de analiza trebuie realizate presiuni mari care desi impun dificultati tehnice legate de o aparatura adecvata, permit separari analitice, imposibil de realizat prin alte metode. Aceasta noua tehnica se numeste cromatografie de lichide la inalta performanta, sau la inalta presiune,sau la inalta viteza, HPLC. Denumirea la inalta performanta se refera la viteza analizei, capacitatea de separare, sensibilitatea metodei. In HPLC sunt necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere pt a asigura debite corespunzatoare ale fazei mobile. Avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC moderne este foarte mica, (diametrul particulelor = 310) aparatura utilizata este mai complicata si foarte scumpa. Avantaje HLPC comparativ cu C.G.: - substantele de analizat nu trebuie sa fie volatile - majoritatea separarilor se pot efectua la temperatura obisnuita - timpi scurti de analiza
10

- conditii de lucru simple pt pregatirea probelor, efectuarea analizei si prelucrarea datelor - polaritatea fazei mobile si a fazei stationare poate fi variata In HPLC separarea componentelor dintr-un amestec se bazeaza pe distribuirea lor intre 2 faze, iar mecanismele care stau la baza separarii definesc si tipurile de HPLC: - HPLC de absorbtie - HPLC Cu faze inverse - HPLC de repartitie - HPLC prin schimb ionic - HPLC prin ecluziune moleculara Tehnica de lucru: in fiecare monografie care utilizeaza tehnica HPLC sunt prevazute caracteristicile coloanei cromatografice (tipuri, lungimea, diametrul interior, natura fazei stationare, dimensiunea particulelor etc) si conditiile de cromatografiere (concentratia solutiei de analizat, concentratia solutiei standard, volumele de injectat din fiecare solutie, compozitia si debitul fazei mobile, temperatura, modul de lucru, sistemul de detectare). Cu ajutorul solutiilor sandard se regleaza aparatul si se determina volumul solutiilor de injectat pentru a obtine un raspuns convenabil al detectorului. Se determina suprafata si inaltimea pickurilor componentelor, iar din valorile obtinute se calculeaza concentratia componentei/componentelor de determinat. Gradul de separare a 2 suprafete intr-o cromatograma se defineste prin notiunea de rezolutie. (Rs) alt parametru.

Aplicatii HLPC: - standardizarea si verificarea medicamentelor (puritate, stabilitate, analiza cantitativa si calitativa) la analgezice, aspirina, fenacetina, acetaminofen, anestezice, procaina, lidocaina, tetracaina, antihistaminice, pseudoefedrina, clorfeniramin, steroizi, prednisolon, corticosteron, progesteron, narcotice si metabolitii lor, antibiotice (tetracicline) - izolarea principiilor active din produsele vegetale - determinarea concentratiei medicamentelor in sange si urina.

11

SPECTROMETRIA DE MASA (M.S.)

Metoda de analiza care se bazeaza pe fragmentarea moleculelor substantelor organice la energii mari de pana la 100 V, iar numarul, sarcina si masa fragmentelor rezultate dau informatii asupra structurii si identitatii substantelor cercetate. De regula, detectia compusilor organici, inclusiv medicamentosi, nu se face prin sepctrometrie de masa decat daca ei se afla in stare pura. Din aceste considerente, spectrometria de masa se utilizeaza in cuplaj cu H.P.L.C. sau/si C.G. legand capatul de iesire al coloanei cromatografice la camera de ionizare a unui spectrometru de masa. In acest fel se poate analiza fiecare fractiune (pick) care iese din coloana cromatografica pe masura ce avanseaza elutia, inclusiv in cazul urmelor de substante existente in proba. Fragmentarea moleculelor este determinata de acumularea de energie care produce ruperea unor legaturi interatomice, proces din care rezulta mai ales ioni pozitivi, rar negativi, radicali si molecule neutre. Deoarece fragmentarea produce mai ales ioni pozitivi, fragmentele sunt purtatoare de sarcina, au masa determinata si se pot caracteriza prin raportul dintre masa lor si sarcina. (m/z) Pentru a putea produce fragmentarea moleculelor, substanta care trebuie analizata se aduce in stare gazoasa, se introduce intr-o camera de ionizare, in care se produce fragmentarea, iar fragmentele sunt accelerate de un camp electric si supuse unuiproces de separare, in functie de valoarea raportului m/z si concentrata pe un colector inregistrandu-se abundenta lor relativa. Toate operatiunile se efectueaza in vid inaintat.

12