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INDICE

No. NOMBRE DE LA PRCTICA NOTA REGLAMENTO PARA EL ESTUDIANTE REGLAMENTO DEL LABORATORIO LOS DIEZ MANDAMIENTOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 EL MICROSCOPIO ESTUDIO DE LA MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS TINCION DE GRAM (Modifacion de Hucker) TINCION DE ENDOSPORAS TINCION DE CAPSULAS TINCION DE FLAGELOS TINCION DE ACIDO-RESISTENTE TINCION DE ESTIROQUETAS PRUEBA DE LA MOTILIDAD PRODUCCION DE ACIDO Y GAS PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO PRUEBA DE INDOL PRUEBA DEL ROJO DE METILO PRUEBA DE VOGES PROSKAUER PRUEBA DE CITRATOS PRUEBA DE LA REDUCCION DE NITRATOS PRUEBA DE LA LICUEFACCION DE LA GELATINA PRUEBA DE LA CATALASA PRUEBA DE LA OXIDASA PRUEBA DE LA UREASA HIDRLISIS DEL ALMIDON HIDRLISIS DE LA CASEINA CRECIMIENTO ANAEROBICO DE BACTERIAS ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS ACCION OLIGODINAMICA DE LOS METALES ACCION DE LOS ANTIBIOTICOS EFECTO DEL PH ACCION DE LA PRESION OSMOTICA ACCION BACTERIOSTATICA DE LOS COLORANTES EFECTO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA EFECTOS DE LA TEMP. SOBRE EL CRECIMIENTO IDENTIFICACION DE UNA BACTERIA PROBLEMA BIBLIOGRAFIA PGINAS 1 2 3 4 5 7 10 13 16 19 22 25 28 30 34 36 39 41 43 45 48 50 52 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79

NOTA
Las practicas que se presentan a continuacin contienen una serie de recomendaciones para poder interpretarlas adecuadamente al menos en su mayora, presentando alternativas tanto en el uso de reactivos, colorantes o medios de cultivo y tcnicas. Es recomendable de que el alumno lea anticipadamente la practica antes de realizarla, ya que en su mayora se requiere de la preparacin previa de material necesario para el desarrollo correcto del experimento. En cada practica se incluye la preparacin de los reactivos utilizados en la misma, con el propsito de que el alumno considere el factor tiempo.

REGLAMENTO PARA EL ESTUDIANTE


1.- Siempre use una BATA de laboratorio durante el periodo de clase. 2.- No saque jams del laboratorio equipo, medios o cultivos bacterianos, sin previa autorizacin del instructor. 3.- Nunca deje amontonados libros, abrigos u otras pertenencias personales en el area de trabajo de la mesa del laboratorio. 4.- No coma ni fume dentro del laboratorio. 5.- Laves bien las manos con detergente antes de salir del laboratorio, utiliza bastante agua. 6.- Deber manejar con mximo cuidado el microscpico asignado para realizar la prctica. 7.- El microscopio deber limpiarlo antes y despus de cada practica. 8.- Deber de entregar los reportes de las prcticas segn las fechas acordadas con su instructor.

REGLAMENTO DEL LABORATORIO


1.- Al inicio de cada seccin el instructor, dar una explicacin oral previa al experimento a realizar. 2.- En caso de accidente notificar al instructor. 3.- El laboratorio se cerrar diez minutos despus del comienzo de la clase. 4.- El alumno trabajara procurando mantener el mayor silencio posible dentro del laboratorio. 5.- Cada alumno se har responsable del material con que trabaje. 6.- Cada alumno dar a conocer al instructor los resultados obtenidos. 7.- Revisar que cada uno de los aparatos necesarios para la realizacin de la practica funciones correctamente. 8.- Al entrar y salir deber asegurarse de que las llaves de agua y de gas han quedado perfectamente cerradas. 9.- En caso de que el instructor no asista, el auxiliar de laboratorio llevar a cabo la realizacin de la prctica.

LOS DIEZ MANDAMIENTOS


Debido a que el microscopio es el instrumento de mayor uso en la bacteriologa por el servicio que presta, es necesario mantenerlo siempre en condiciones adecuadas para su uso. A continuacin damos varios puntos, para el mejor cuidado del microscopio, a los cuales, se les ha llamado los diez mandamientos del microscopio. Primero: No lo golpears, si lo transportas deber ser en posicin vertical y sujetndolo contra el cuerpo. Segundo: Lo inspeccionaras antes de usarlo, si encuentras averas o cualquier otra irregularidad lo notificaras al instructor. Tercero: Limpiaras siempre las lentes con algodn, usando aplicador y un poco de baho Cuarto: Nunca usaras disolventes para limpiar los lentes (xilol, tolveno, acetona, etc.), en caso muy necesario usars acetona y lo quitaras inmediatamente. Quinto: No le desmontaras ninguna pieza. Sexto: No lo colocaras en el borde de la mesa, ni lo tendrs cerca de la llama del mechero, ni lo guardaras junto a sustancias corrosivas. Sptimo: No lo arrastraras sobre la mesa cuando se encuentre encendido o recin apagado porque el foco se funde. Octavo: Al iniciar tus observaciones comenzaras siempre con el seco dbil (10x), luego si es necesario pasars al de 40x o 100x. Noveno: Usaras la lmpara siempre con bajo voltaje. Cuando termines de hacer tus observaciones apagarlo inmediatamente. Decimo: Limpiaras el microscopio peridicamente, no le pongas grasa ni aceite en sus partes mecnicas, no forzar su funcionamiento.

2.- ESTUDIO DE LA MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS


INTRODUCCION Entre las principales caractersticas de las clulas bacterianas, se cuenta el tamao, forma, agrupacin y estructura. Estos caracteres constituyen la morfologa de la clula. Las clulas individuales tienen forma esfrica, cilndrica o helicoidal, las clulas se asocian formando grupos caractersticos, las ms comunes son: pares, cadenas y racimos. Muchas bacterias en algn momento de su desarrollo presentan formas irregulares conocidas como formas pleomorficas, estas variaciones pueden ser permanentes o temporales. La morfologa de la bacteria puede ser demostrada por medio de tinciones simples, tintes que constan de un catin coloreado y un anin incoloro. Para la mayor parte de los trabajos de anatoma bacteriana se emplea un solo colorante, emplendose a menudo en un curso inicial de microbiologa pertenecen al orden EUBACTERIALES( BACTERIAS VERDADERAS). Las coloraciones simples se hacen empleando un solo colorante, a diferencia de las coloraciones diferenciales donde se usan dos o mas colorantes, unos de los cuales sirve de contraste. Material:

A) CULTIVOS DE 24 48 HS. DE
1.- Escherichia coli 2. - Staphy lococcus aureus 3. - Streptococcus sp. 4. - Sarcina sp. B) COLORANTES 1. - Cristal violeta 2. Safranina 3. - Pardo Bismarck 4.- azul de metileno C) MICROSCOPIO OPTICO D) ASA BACTERIOLOGICA E) PORTAOBJETOS

PROCEDIEMIENTO: 1.- Si tiene un cultivo liquido: tome una muestra con el asa y extindala sobre el portaobjeto. 2.- En caso de tener un cultivo solido: i) Coloque una gota de agua pequea sobre el portaobjetos ii) Flamee el asa y djela enfriar, tomando inmediatamente una pequea porcin de una colonia bacteriana, haga una pequea suspensin con la gota que esta sobre el portaobjeto, flamee el asa.

A) Haga un frotis, extendiendo la gota de cultivo sobre la superficie del portaobjetos. B) Deje secar al aire C) Fije el frotis pasndolo varias veces sobre la flama de un mechero. D) Agregue el colorante a utilizar (Safranina, Azul de metileno, Cristal Violeta) y djelo actuar por espacio de un minuto. Repita el procedimiento con cada colorante. E) Lavar con agua y dejar secar F) Observe al microscopio observaciones. con objetivo de inmersin(100X), anote sus

REACTIVOS UTILIZADOS 1.- CRISTAL VIOLETA Cristal violeta1.0 gr. Agua destilada.100ml. Disolver el cristal violeta en el agua destilada y conservar en frasco mbar. 2.- SAFRANINA 0.5 % Safranina..0.5gr. Agua destilada.100ml. Disolver la safranina en el agua, filtrar y conservar en frasco mbar. 3.- AZUL DE METILENO Azul de metileno.0.3gr. Alcohol95 C10ml Agua destilada100ml. Disolver el azul de metileno en el alcohol, agregue el agua destilada y conservar en frasco mbar.

PRECAUCIONES: Al realizar estas tcnicas se pueden cometer errores, que son comunes, que entorpecen una buena interpretacin al hacer la observacin.

A) Que el frotis hecho sea muy espeso, haciendo que acumulamientos, sin diferenciar con exactitud su morfologa.

se

observen

B) Que el colorante actu por espacio de tiempo muy corto, lo cual no permitira que la clula bacteriana se coloree lo adecuado, lo cual se entorpecer una buena identificacin de la anatoma bacteriana. C) Que el colorante actu por espacio demasiado largo D) Que el colorante no este bien disuelto, provocando que los cristales del colorante se precipiten sobre el portaobjetos, que pueden distraer al observador. E) No debe lavar con alcohol, puede quitar todo el colorante y que las bacterias sean incoloras de nuevo.
CUESTIONARIO

A) Cuales son los principales grupos de un colorante? B) Porque no se tien las clulas muertas C) Cual es la importancia de las tinciones simples

3.- TINCION DE GRAM ( MODIFICACION HUCKER)


INTRODUCCION Este mtodo de coloracin es el mas importante en la rutina bacteriolgica, considerada de gran valor taxonmico. Siendo este mtodo una tincin diferencial; separando las bacterias en dos grupos:

A) GRAM POSITIVAS B) GRAM NEGATIVAS


Estas diferencias se deban posiblemente, en su gran parte a la composicin qumica de la clula bacteriana en si. La tincin de Gram constituye el punto inicial del procedimiento de identificacin. La tincin de Gram se compone de cuatro reactivos:

A) Colorante primario B) Mordiente C) Decolorante D) Colorante de contraste


La reaccin de la tincin de gran fue propuesta por el Dr. CRISTIAN GRAM. MATERIAL:

A) CULTIVOS DE: Escherichia coli y Bacullus Subtilis B) MICROSCOPIO OPTICO C) CRISTAL VIOLETA (MODIFICACION HUCKER) D) SOLUCION YODURADA E) ALCOHOL O ACETONA O ALCOHOL ACETONA

F) SAFRANINA G) ASA BACTERIOLOGICA H) MECHERO


PROCEDIMIENTO: 1.- Haga un frotis del cultivo problema, en un portaobjeto perfectamente limpio y fjelo al calor. 2.- Cubra la preparacin con el colorante de Cristal Violeta por espacio de un minuto. 3.- Lave con agua y seque al aire. 4.- Aplique la solucin mordiente de Iodo yoduro, por espacio de un minuto 5.-Lavar y secar. 6.-Haga la decoloracin con alcohol etlico, por es espacio de 30 seg. 7.-Lavar y secar. 8.-Aplicar safranina por 10 seg. 9.-lavar secar. 10.-Observe la preparacin al microscopio ptico, primero utilice el objetivo de seco dbil,(10 X)para localizar un mejor campo de observacin y luego pase al objetivo de inmersin (100X) utilizando aceite de inmersin. RESULTADOS: a) GRAM NEGATIVOS: si las bacterias tienen un color rojo. B) GRAM POSITIVAS: si las bacterias presentan una coloracin violeta, azul o morada. REACTIVOS UTILIZADOS: 1.-CRISTAL VIOLETA Solucin A: Cristal violeta..2.0 grs. Alcohol de 95 20 ml. Disuelva perfectamente el cristal violeta en el alcohol Solucin B: Oxolato de amonio..0.8 grs. Agua destilada 80 ml. Disuelva perfectamente el oxolato en el agua.Mezcle las soluciones A y B y consrvese en frasco ambar,es recomendable que se prepare aproximadamente 24 horas antes de usarla. 2.-SOLUCION IODOYODURADA Iodo Q.P1.0gr. Yoduro de potasio.2.0gr. Agua destilada 300ml. En un mortero triture perfectamente los cristales de4 yodo y de yoduro,y disuelva perfectamente en agua.guardese en frasco mbar. 3.-SOLUCION DECOLARANTE: A) Alcohol 95 B) Acetona Q.P. C) Alcohol-acetona Alcohol 95.700ml. Acetona...300ml 10

Vierte el alcohol en la acetona, guardar de preferencia en frasco mbar.

4.- AFRANINA: Safranina.. 0.25 gr. Alcohol 95. 10 ml Agua destilada... 100ml Disuelve la safranina perfectamente en el alcohol, agregue el agua y filtre la solucin, conservar en frasco mbar.

PRECAUCIONES: El mtodo general es sencillo, pero muy engaoso, ya que el aplicar el mtodo de la tincin de GRAM se puede cometer errores que hacen variar el resultado inicial y consecuentemente la interpretacin errnea al observar la preparacin al microscopio ptico, estos errores son con frecuencia: 1.- La falta de fijacin por color del frotis, puede ocasionar que al lavar la preparacin con agua corriente, esta arrastre las bacterias. 2.- El lavado excesivo con agua corriente pude afectar, eliminando el colorante o complejo Yodo-colorante. 3.- La aplicacin del agente decolorante, es la fase mas critica, si el decolorante se deja actuar mucho tiempo, la clula bacteriana dejara escapar por completo el decolorante primario. Recuerde que la acetona decolora mas rpido que el alcohol. Puede ocurrir tambin una dbil decoloracin. 4.- La aplicacin de colorante de contrastes tambin debe de hacerse con minucioso cuidado, ya que si se deja demasiado tiempo de exposicin substituir al colorante primario en los organismos GRAM positivos. 5.-La edad del cultivo tambin es determinante en el resultado final de la tincin de GRAM. La tincin de Gram. nicamente es valida cuando se realiza a partir de cultivos de 18-24 horas de incubacin. Las bacterias de mas tiempo de incubacin varan sus propiedades con respecto a la tincin de GRAM. 6.- Existe una gran variedad de modificaciones de la tcnica de GRAM, que va desde la preparacin de los colorantes hasta el tiempo de aplicacin de cada uno de ellos.

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4.- TINCION DE ENDOSPORAS INTRODUCCION


Las endosporas son estructuras de gran resistencia producidas en el interior clulas bacterianas, Las bacterias que producen endosporas pertenecen a la familia Bacillaceae. No se debe de considerar la esporulacin bacteriana como una forma de multiplicacin. Las endosporas, son estructuras que mas resisten a la accin de calor, desecacin, falta de sustancias nutritivas, variaciones considerables del PH en el medio de cultivo, sustancias. Qumicas toxicas. Una de las diferencias mas notables entre la endospora y la clula bacteriana, es la presencia de acido dipiconilico, este compuesto se encuentra solamente en el endospora. Este mtodo de la tincin se vale de medidas para forzar la penetracin del colorante a la endospora , esto hace imposible una decoloracin con de color antes simple. MATERIAL: Cultivo de Bacillus subtilis de mas de 5 das. Escherichia coli y Staphylococcus aureus. COLORANTE, verde de malaquita 5% ALCOHOL ACIDULADO SAFRANINA MICROSCOPIO OPTICO PORTA OBJETO ASA BACTERIOLOGICA MECHERO PROCEDIMIENTO 1.- Haga un frotis de cada cultivo y fjelo al calor. 2.- Agregue suficiente verde de malaquita sobre la preparacin, pase el mechero para flamear, por debajo de la preparacin, hasta que salgan vapores por espacio de 1 o 2 min.(mientras flamear halla emisin de vapores, evite que se seque el colorante agregando cuando sea necesario. 3.-lavar con suficiente agua y secar. 12

4.-agregar el decolorante, alcohol-acido por 1 min. 5.- Lavar con agua corriente y secar. 6.-Agregu la safranina por espacio de 30 segundos. 7.-Lavar y secar 8.-Observe al microscopio y anote sus resultados.

RESULTADOS: A) La endospora se tie de color verde. B) El resto del cuerpo bacilar se tie de color rojo. REACTIVOS UTILIZADOS: 1.-Verde de malaquita 5% Verde de malaquita 5.0grs Agua destilada 100ml Disolver el verde de malaquita en el agua y conservar en frasco mbar. 2.-Alcohol acidulado Acido clorhdrico 3ml Alcohol 95 97ml Disolver el acido en el alcohol (con precaucin) conservar en frasco mbar. 3.-Safranina Safranina 0.5grs. Agua destilada 100ml Disolver el colorante en el agua, conservar en frasco mbar. ALTERNATIVA: 1.-En caso de no contar con verde de maquita, utilizar carbolfuscina. Solucin A Fusina bsica 0.3grs. Alcohol 95 10ml. Disolver el colorante en el agua, conservar en frasco mbar. Solucin B Cristales de fenol Q.P. 5gr. Agua destilada 95ml.

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Disolver el fenol en el agua destilada, mezcle la solucin A y B en un frasco, djela reposar cuando menos 48 horas., para que se disuelvan los cristales. Antes de utilizar filtros, la solucin y conserve en frasco mbar. 2.-AZUL DE METILENO (En lugar de Safranina) Azul de metileno 0.3grs. Agua destilada 100ml. Disuelva el colorante en el agua. Filtrar. Conservar la solucin en frasco mbar.

RESULTADOS: Esto es con los colorantes de sustitucin. 1.- La Endospora tomara una coloracin roja o rosada. 2.- El cuerpo de la bacteria tomar una coloracin azul. PRECAUCION: Para hacer una buena interpretacin, tome en cuenta que: A) Debe de utilizar un cultivo de ms de cuatro das de incubacin. B) Que el colorante para la Endospora este bien preparado. C) Mantener la solucin colorante sin que se seque, mientras se aplica el fuego sobre el frotis. D) Que el decolorante este bien preparado.

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5.- TINCION DE CAPSULAS INTRODUCCION


Muchos microorganismos presentan una capa de material mucilaginoso, llamado capsula, que rodea completamente a la clula y cubre la pared celular. El tamao de la cpsula y la cantidad de material capsular producido depende principalmente de las condiciones de cultivo y suelen ser mayores si existe un alto grado de ventilacin y una elevada relacin carbono-nitrgeno en el medio de cultivo. En la mayora de las especies microbianas, la cpsula y el muclago se componen de polisacridos, que reciben el nombre de POLISACARIDOS EXTRACELULARES, para distinguirlos de otros que se encuentran en el interior de la pared celular. La funcin de la cpsula parece servir de capa protectora contra los ataques por fagotitos y virus. Tambin puede contribuir a amortiguar los cambios bruscos de humedad, peligrosos para el microorganismo, en habitas donde hay fluctuaciones peridicas en el contenido de agua. La cpsula normalmente tiene capacidad de cambio inico, pudiendo colaborar en la concentracin y equilibrio de cationes esenciales, En las bacterias patgenas, la formacin de cpsulas va asociada con la virulencia, ya que confiere proteccin contra el ataque de anticuerpos.

MATERIAL
1. MICROSCOPIO 2. CULTIVOS DE ESCHERICHIA KLEBSIELLA SP. 3. ATINTA CHINA 4. AZUL DE METILENO COLI., STAPHYLOCOCCUS AUREUS,

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5. SULFATO DE COBRE 20% 6. SAFRANINA

PROCEDIMIENTO :
Coloque una gota de agua sobre el portaobjeto, con el asa tome una pequea cantidad de cultivo y haga una dilucin. a esta suspensin diluida agregue tinta China mezcle con la suspensin de bacterias (una buena suspensin quedara de color gris) coloque el cubreobjeto sobre la suspensin y observe al microscopio con el objetivo de 100x haga su observaciones

RESULTADOS
Las partculas de tinta china se vern dotadas de movimiento Browniano muy rpido y las bacterias de formas plidas como fantasmas. Si la preparacin se hizo correctamente se podr apreciar el efecto como un halo alrededor de la clula bacteriana; el halo representa la capsula.

ALTERNATIVAS
Puede usar las siguientes tcnicas. haga un frotis del cultivo Tia el frotis con cristal violeta 1% por dos minutos Lavar con sulfato de cobre al 20% Secar al aire Observar al microscopio con objetivo de 100x, haga sus anotaciones

RESULTADOS
La clula bacteriana se observara de un color azul y la cpsula de un color rosa plido. Ponga una gota de agua sobre el portaobjeto Con una pequea cantidad de cultivo haga una dilucin con la gota de agua que esta sobre el portaobjeto Haga el frotis Dejar que seque el frotis Cubrir con safranina durante 10 segundos Enjuagar con cuidado, secar con presin suave o al medio ambiente
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Observar al microscopio ptico con objetivo 100x. Haga sus observaciones.

RESULTADOS
La clula bacteriana se observara de color rojo y un halo alrededor de esta.

REACTIVOS UTILIZADOS
1. Solucin de sulfato de cobre 20% sulfato de cobre Q.p. .20.00g. agua destilada.100ml. Disolver el sulfato de cobre con el agua, conservar en frasco mbar.

6.- TINCION DE FLAGELOS INTRODUCCION


Los flagelos son rganos de locomocin delgados, de naturaleza proteica, que se originan en la regin citoplasmtica debajo de la pared celular en una estructura conocida como granulo o disco basal. La estructura exacta vara de una especie a otra. El anlisis qumico de los flagelos demuestra que estn compuestos por un solo tipo de protena homognea que se ha llamado flagelina. La disposicin y nmero de flagelos en una clula bacteriana puede ser un til criterio de identificacin y clasificacin. Los dimetros de los flagelos estn por debajo del poder de resolucin del microscopio ptico y su observacin directa es imposible, sin embargo al opticar un mordiente sobre la superficie del flagelo, ste aumentara su dimetro, y entonces si se podr observar en el microscopio ptico.

MATERIAL:
1. 2. 3. 4. 5. 6. CULTIVO LIQUIDO DE Proteus vulgaris de 8 a 16 Hrs. SOLUCIN DE Leifson A, B, C. PORTAOBJETOS ESCRUPULOSAMENTE LIMPIOS PIPETAS LIBRES DE GRASA DE 0.1 ml MICROSCOPIO OPTICO AZUL DE METILENO BORATADO

PROCEDIMIENTO:
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MTODO DE LEIFESON A) Con una pipeta saque 0.1 ml de la suspensin bacteriana de la regin superficial del medio de cultivo. B) Coloque 0.1 ml de suspensin sobre un extremo del portaobjeto. C) Incline el portaobjeto al aire 30 40 para que la gota corra por el portaobjeto. D) Seque el portaobjeto al aire sin agitar. E) Agregue el colorante de Leifson sobre la extensin por espacio de diez minutos. F) Lave con agua corriente, con cuidado y secar sin agitar. G) Agregue el colorante de azul de metileno Boratado, como colorante de contraste. H) Lave con un dado secar sin agitar. I) Observar al microscopio con objetivo de inmersin, haga sus haga sus anotaciones. Solucin de cristal violeta 1% Cristal violeta0.1 % Agua destilada10 ml Disolver el colorante en el agua, conservar en frasco ambar. C) SAFRNIN. Safranina..0.25 grs Alcohol 95 .10 ml Agua destilada100 ml Disolver la safranina en alcohol, agregar el agua y filtrar, conservar en frasco ambar. PRECAUCIONES: Posibles errores en que se puede incurrir. 1. No debe utilizar alcohol para lavar, puede diluir la capsula. 2. Una toma de muestra demasiado profusa dificultar una buena observacin debido al amontonamiento. 3. Demasiada agua en la dilucin debilitar la accin de la tinta china. CUESTIONARIO: 1. Son de importancia econmica los microorganismos productores de mucilago? 2. Los organismos capsulados pierden siempre el poder de producir una capsula? 3. Se puede correlacionar la presencia de la capsula bacteriana con la virulencia de la misma?

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RESULTADO: La clula bacteriana se observara de color azul y el flagelo tomar un color rojo plido o caf incoloro. REACTIVOS UTILIZAD0S: A).- SOLUCION DE LEIFSON (MORDIENTE) SOLUCIN A Cloruro de sodio. ... 1.5 grs_ Agua destilada 100 ml Disolver el cloruro de sodio en el agua destilada. SOLUCION B Acido tnico .3.0 gr. Agua destilada .. . . 100 ml. Disolver el acido tnico en el agua destilada. SOLUCION C Fuscina Bsica (Flagelos) .1.2 grs. Alcohol 96 100 ml. Disolver la fuscina bsica en el alcohol. Mezclar las soluciones A, B y C en igual proporcin y tutilizar de inmediato. Las tres soluciones forman el colorante de Leifson. B).- Solucin de azul de metileno boratado
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azul de metileno .. 0.1 grs. Borax ..1.0 gr. Agua destilada . 100 ml. Disolver el azul de metileno y el Borax en el agua destilada. Conservar en frasco mbar. ALTERNATIVA: En caso de que se le dificulte el mtodo de Leifson, o que le salga negativo constantemente puede sustituirlo por el METODO DE GRAY. A).- Dejar que una gota de agua destilada en el portaobjeto, se extienda aproximadamente dos cm2. B).- Tornar una asada de un cultivo joven de agar nutritivo. C).- Extender la rnuestra tocando en varios puntos de la gota extendida en el portaobjetos. D) Secar al aire sin agitar ni calentar. E) - Agregar el mordiente d GRAY y dejarlo actuar, por diez minutos. F). - Lavar con agua, con cuidado, secar aire sin agitar. G).- Agregar Carbolfuscina (Colorante de GRAY) pr tiempo de 5 a 10 mn. H).- Lavar con agua y secar sin agitar. I).- Observar al microscopio con objetivo de 100X.

REACTIVOS UTILIZADOS:
A).- MORDENTE DE GRAY Sulfato de potasio de aluminio, en solucin acuosa saturada...5 ml. Acido tarico. . 20 % Bicloruro de mercurio en solucan acuosa saturada . . 2 ml. Solucin alcalina saturada de fuscina Basica .0.4 ml. Se debe preparar cada vez que se necesite. B).- C0L0RANTE DE GRAY (Cerbol Fuscina) Fuscina bsica. 0.3 gr. Alcohol 95 10 ml. Fenol 2.P.. 5.0 gr. Agua destilada .95 ml. Disolver la fuscina bsica en alcohol. Disolver el fenol en el agua, mezclar las dos soluciones. RESULTD0:

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La clula bacteriana toma un color rojo, y el flagelo un color cafe. PRECAUCIONES: Para llevar a cabo una buena tincin de flagelos, debe evitar: 1.- Que el portaobjeto contenga grasa. Para evitar el contenido de grasa en el portaobjeto, sumrjalo en mezcla cromica 24 hrs., antes del experimento, no lo agarre de la superficie, slo de los bordes. 2.- No haga el frtis con asa Bacteriolgica, puede destruir los flagelos. 3.- Que el portaobjeto no contenga materia organica, ya que este se tie con intensidad y puede interferir en la interpretacin de la observacin. 4.- No fije el frtis a la llama.

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7.-Tincion Acido-Resistente
INTRODUCCION Otro procedimiento de tincin diferencial bastante usado, es el de acidoresistente. Ya se observo que algunos grupos de bacterias son difciles de teir y resisten igualmente los procesos de decoloracin, cuando se utiliza para este propsito agentes decolorantes eficaces como lo es el acido-alcohol. La propiedad de acidoresistencia este relacionado con la composicin qumica, estas bacterias se caracterizan por su elevado contenido de lpidos acido miclico (considrese como el sustrato de esta reaccin de tincin), ceras y fosfalipidos. Este mtodo de tincin acido-resistente fue desarrollado por Erlich en1882. En la tincin acido-resistente se utiliza un colorante primario, un agente decolorante y un colorante secundario. MATERIAL: a).- Cultivo de Mycobactyerium Tuberculosis b).-Microscopio ptico c).- Colorante de Ziehl Neelsen d).-Acido-Alcohol e).- Azul de Metilo de Loeffler f).- Mechero g).- Asa Bactereologica PROCEDIMIENTO: 1) A).-Haga u n frotis, deje que se seque al aire y fjelo al color. 2) B).-Cubra el frotis con el colorante de Ziehl Neelsen. Caliente la preparacin pasando el mechero por debajo, hasta la emisin de vapores, durante 5 minutos, cuidando que no hierva el colorante de vez en cuando para evitar que se seque. 3) Decolorar con acido-alcohol, hasta que las trazas de color rojo desaparezcan. 4) Lavar con abundante agua corriente. 5) Aplicar colorante de azul de metilo de Loeffler, durante 60 segundos (1min) 6) Lavar con agua corriente y secar al aire. 7) Observe con objeto de 100X y haga sus anotaciones.

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RESULTADOS: Los organismos acido-resistente, despus de terminar el proceso de tincin, aparecen de color ROJO; los organismos negativos a la tincin acido-resistente aparecen de color AZUL. REACTIVOS UTILIZADOS: A. Colorante de Ziehl Neelsen (Carbolfuscina) Fuscina bsica bsica.0.3 gr. Etanol 95.10 ml. Cristales de Fenol Q.P...5.0 gr. Agua destilada.95 ml. Disuelva la fuscina en el alcohol. Disuelva el fenol en el agua destilada. Mezcle las dos soluciones, conservar en frascos mbar. Puede encontrar este colorante en el comercio. B. Acido-Alcohol Acido clorhdrico.0.3 gr. Alcohol etlico 95.....92 ml. Disuelva el acido en el alcohol y conserve en un frasco mbar. C. Azul de Metileno de Loeffler Azul de metileno..0.3 gr Etanol 95.30 ml. Agua destilada100 ml. Disuelve el azul de metileno en el etanol, agregue el agua destilada. Filtrar. Consrvese en un frasco mbar ALTERNATIVA: A. Verde de Malaquita 0.5 % Verde de malaquita0.5 gr. Agua destilada...100 ml. Disuelva el colorante en el agua destilada. Consrvese en frascos de mbar. Con este colorante los organismos acido-resistentes negativos se observan VERDES. B. Caf de Bismarck. Caf de Bismarck 0.3 gr. Etanol 95.. 75 ml. Agua destilada.. 25 ml. Disuelva el colorante con el alcohol, agregu el agua destilada. Consrvese en frasco mbar. Los organismos acido- resistentes negativos se observan de color CAF.

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PRECAUSIONES
El mtodo general es sencillo, pero pueden cometerse errores que hacen variar la interpretacin de la tincin al observar al microscopio, estos errores son con frecuencia: 1.-que el frotis no se fije adecuadamente al portaobjeto, esto se debe ala gran cantidad de material graso que contiene; puede evitarse, agregando una capa de albmina al 1% sobre la superficie del portaobjeto, as como los microorganismos se adhieren fcilmente. 2.- no aplicar calor durante el tiempo suficiente. Recuerde que la composicin qumica de las bacterias cido-resistente hace difcil su coloracin, de aqu que es necesaria la aplicacin de calor para que el colorante penetre, debe tomarse en cuenta el tiempo recomendado. 3.-no debe de aplicar el decolorante en una sola etapa. La decoloracin se debe hacer en forma intermitente. 4.-El colorante secundario no debe estar diluido. Debe prepararse adecuadamente.

CUESTIONARIO
1.-Los organismos GRAM positivos o GRAM negativos son cido-resistente? 2.- puede utilizarse en este procedimiento el alcohol acetona en lugar del alcohol cido? 3.- la composicin qumica de la bacteria es importante para determinar su cidoresistencia?

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REACTIVOS UTILIZADOS: A. Solucin de Ruge Solucin a) Acido actico glacial..1 ml Formol 40%..............................................................................2 ml Agua destilada100 ml Disuelve el formol en el agua y agregar el acido actico. Solucin b) Acido Tnico..5.0 gr Agua destilada..100 ml Disuelva el acido tnico en el agua destilada. Solucin c) Nitrato de plata.4 gr Agua destilada.....200 ml. Disuelva el nitrato de plata en el agua destilada. Solucin d) Amoniaco 10%.........................................................................90 ml Agua destilada.10 ml Agregue amoniaco al agua destilada. Para conjuntar las soluciones y formas la solucin de Ruge, en un frasco ambar agregue las soluciones en el siguiente orden: a, b, c, d, y utilizar de inmediato. Es muy inestable. B. Colorante de Fontana: A 25 ml de la solucin madre de nitrato de plata (Solucin de Ruge), aadir solucin diluida de amoniaco gota a gota hasta que se forme un precipitado moreno que se re-disuelve, seque agregando mas nitrato hasta que la solucin permanezca ligeramente turbia. Use de inmediato C. Acido Tnico: Acido Tnico..5.0 gr Agua destilada..100 ml Hacer la disolucin y usarse de inmediato D. Alcohol Etlico 95

PRECAUCIONES:
Para obtener buenos resultados debe tener en cuenta: 1. Las soluciones son muy inestables y por lo tanto se recomienda su uso correcto. Las soluciones preparadas das antes no sirven.
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2. Asegrese que tanto el lente ocular como el lente objetivo de inmersin estn Perfectamente limpios. 3. Tenga cuidado al preparar el nitrato de plata.

CUESTIONARIO
A).- De que color se observan las espiroquetas en la preparacin?

Por qu? B).- Que papel desempea el acido tcnico?

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8.- TINCION DE ESPIROQUETAS.


Las espiroquetas son organismos filamentosos fin os, ondulados, en forma de tirabuzn, se encuentran en todas partes, especialmente en el agua, en el sarro dentario y en la materia orgnica en descomposicin, algunas son saprobias, otras comen sales, otras parasiyas y otras parasitas que pueden causar enfermedades graves en los humanos y en los animales. Uno de los mtodos usuales para la coloracin de espiroquetas es el de Fontana-TRIBONDEAU, el cual se basa en la depositacion de sales de plata sobre el microorganismo y la reduccin del compuesto con formol.

MATERIAL.
1.- MUESTRA DE SARRO. OPTICO. 3.- ACIDO TANICO. 5.- COLORANTE DE FONTANE. DIENTES. 7.- MECHERO. 9.- PORTA OBJETOS. 2.- MICROSCOPIO 4.- SOLUCION DE RUGE. 6.PLILLOS PARA 8.- ALCOHOL DE 95%. 10.- TELA DE ASBESTO.

PROCEDIMIENTO.
1.- Con el palillo de dientes extraiga una muestra de sarro dentario, haciendo un raspado. 2.- Haga un frotis con el sarro. 3.- Dejar secar al aire. 4.- Cubrir el frotis con la solucin de Ruge por un minuto. 5.- Lavar con agua. 6.- Fijar con alcohol. Dejando caer el alcohol gota a gota, hasta que cubra todo el frotis. 7.- Encender el alcohol que se encuentra sobre el porta objetos. 8.- Agregar el mordiente, acido tnico. 9.- Calentar suavemente hasta la emisin de vapores; dejar actuar 30seg. Mas. 10.- Lavar con agua y seco. 11.- Cubrir la preparacin con el colorante de Fontana. 12.- Calentar suavemente hasta la emisin de vapores. 13.- Dejar que el colorante actu por 30seg.mas. 14.- Lavar con agua y secar. 15.- Observar al microscopio con el objetivo de inmersin y anote sus observaciones.

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9.- PRUEBA DE LA MOTILIDAD


INTRODUCCIN: Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos, tambin algunos cocos son mviles. Lasa bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o muchos. Adems su localizacin varia con la especie bacteriana y las condiciones de cultivo, a veces las bacterias con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y rara vez se convierten en formas mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos. La temperatura de incubacin es fundamental, dado que muchos organismos con movilidad lo son a 15-25C, pero no a 37C, que es su temperatura ptima de crecimiento. Se recomienda inocular dos tubos simultneos; incubar uno a37C y otro a una temperatura de ambiente. Los medios donde se realizan la prueba son semislidos y permite interpretaciones macroscopicas de la motilidad. MATERIAL: 1.-tubos de ensayo con medios de SIM. (6) 2.-cultivos de 24 horas, de escherichia coli, klebsielle, staphylococcus aureus. 3.-mechero 4.-asa bacteriolgica 5.- etiquetas PROCEDIMIENTO: 1.- Inocular dos tubos con E.coli, dos con klebsielle y dos con staphylococcus aureus, por puncin profunda. 2.-Etiquetar cada tuvo. 3.-Incubar, uno de cada uno a 35C y los otros a temperatura de ambiente. 4.-Anote sus resultados. RESULTADOS: A).-POSITIVO: los organismos mviles migran de la lnea de inoculacin y se difunden por el medio provocando turbidez. B).- NEGATIVO: El incremento bacteriano se acenta siguiendo la lnea de crecimiento, no hay turbiedad en el medio circundante

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REACTIVOS UTILIZADOS: A).-Medio de cultivo (medio SIM) PH 7.3. Este producto existe en el mercado, preparar de acuerdo de a las indicaciones del envase. Rehidrate el medio en agua destilada, deje reposar de 5-10 minutos, calentar suavemente hasta su dilucin, verter en tubos de ensayo aproximadamente 5ml, esterilizar a 121C. ALTERNATIVA: Si no consigue el medio SIM puede utilizar: A.- AGAR BLANCO Triptosa (peptona)1.0 gr. Cloruro de sodio .0.5gr. Agar-agar...0.5gr. Agua destilada.100gr. Siga las instrucciones de preparado como se indica en el medio de SIM. Cuando las pruebas salen muy dudosas se puede utilizar un indicador para movilidad. B.- REACTIVO (cloruro de 2, 3,5-trifeniltetrazolium) Solucin acuosa Sol. De tetrazolium..0.05gr. Medio de cultivo...1000ml. 5ml. De solucin acuosa al 1%, agrandando a un litro de medio de cultivo, bertir 5ml. De medio de cultivo en un tubo de ensayo. Esterilizar a 121C, por 15 minutos. RESULTADOS: (utilizando el tetrazolium) Formacin de un pigmento rojo donde se lleva acabo el crecimiento bacteriano. PRECAUCIONES: Para esta prueba tenga en cuenta lo siguiente: 1.-si se calienta el cultivo antes de su utilizacin producir un resultado falsamente negativo. 2.-los flagelos de las bacterias pueden ser destruidos por agitacin del tubo de cultivos, lo mas frecuente es fragmentacin lo que dar dbilmente positivos o falsamente negativos. 3.-se deben utilizar cultivos jvenes para realizar la prueba. Los cultivos viejos muestran tendencia a perder la movilidad. 4.-si existe duda en la interpretacin en el tubo de ensayo, puede ayudarse utilizando la tcnica de gota pendiente. utilice un inoculo denso de 18-24hrs.

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10.- PRODUCCIN DE ACIDO Y GAS INTRODUCCIN:


El termino fermentacin se refiere generalmente a la degradacin anaerbica de los carbohidratos. La funcin principal de la fermentacin es la produccin de energa utilizable por la clula. La capacidad para fermentar un carbohidrato dado, depende de las enzimas que contenga el organismo. Los productos finales de la fermentacin varan de un organismo a otro. Varios carbohidratos son desdoblados en gas como CO2, y adems otros compuestos orgnicos como son el acido lctico, acido actico. Las bacterias al fermentar los carbohidratos pueden producir uno o mas cidos orgnicos como productos finales. La presencia de un acido en el medio se puede detectar agregando indicador de PH. Los tipos de GAS Y ACIDO dependen de la especie de microorganismo utilizado y el carbohidrato fermentado. Es preciso tener presente que cada caldo de fermentacin contiene nicamente un carbohidratos especifico. El organismo inoculado aprovecha el carbohidrato presente en el medio, despus de incubar se apreciaran ciertos cambios tanto en la produccin de acido v gas. Si el organismo inoculado no es capas de atacer el carbohidrato tanto para la produccin de acido o gas, como sea habr crecimiento, debido a los nutrientes que contiene el caldo. MATERIAL: 1.-CULTIVOS DE 24 HRS. DE ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLE SP, STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 2.- Tubos de ensayo con medios de cultivo (caldo nutritivo) (6) 3.- Asa bacteriolgica 4.- Prpura de bromocresol 5.- Mechero 6.- Etiquetas 7.- Carbohidratos (lactosa, sacarosa, glucosa). PROCEDIMIENTO: Las pruebas de produccin de acido y de gas se pueden realizar al mismo tiempo, en el mismo tubo y utilizando el mismo carbohidrato, pero las pruebas se pueden realizar por separado, si a se desea.

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PRODUCCIN DE ACIDO Y GAS


1.- en un tobo de ensayo que contenga caldo nutritivo, mas el indicador de prpura de bromocresol y mas carbohidratos y tobo de durham invertido inocular ESCHERICHIA COLI, repita el procedimiento con cada una de las bacterias asignadas, los tubos deben de inocularse dobles. 2.- incubar a 35 C por48 hrs. 3.- anote sus resultados RESULTADOS: 1.- PRODUCCIN DE GAS A) POSITIVO: aparecen burbujas dentro de el tobo durham invertido o hay desplazamiento visible dentro del mismo tubo. B) NEGATIVO: no hay produccin de burbujas ni desplazamiento de lquido dentro del tubo durham. 2.- PRODUCCIN DE ACIDO: A).- POSITIVO: hay variaje de color, de prpura a amarillo B).- NEGATIVO: no hay variacin de color, contina prpura. ALTERNATIVAS: Sin embargo las pruebas se pueden realizar por separado: 1.- PRODUCCIN DE ACIDO: a).- caldo nutritivo, mas carbohidratos, mas indicador prpura de bromocresol, inoculado con caldo escherichia coli, repetir, en diferentes tubos , inoculando las bacterias asignadas. B).- Incube a 35C por 24-48 hrs. C).- Anote sus resultados 2.- PRODUCCIN DE GAS: a).- inocule dos tubos con cada una de las bacterias asignadas. b).- incube a 35C por 24-48 hrs. c).- anote sus resultados. REACTIVOS UTILIZADOS: A) MEDIO DE CULTIVO: (caldo nutritivo) este producto se encuentra en el comercio, preprese segn indicaciones del embase. Rehidrate l medio en agua destilada, caliente suavemente para disolver, verter aproximadamente 5ml, en cada tubo antes de esterilizar, agregue por cada 100 ml. Prpura de bromocresol y carbohidrato, esterilizar a 121 C por 15 min.

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B).- PRPURA DE BROMOCRESOL Prpura de bromocresol 4.0 gr. Alcohol 95..125 ml. Agua destilada .125 ml. Disolver el prpura de bromocresol en alcohol, agregue el agua, filtrar, conservar en frasco mbar. Agregue prpura de bromocresol al medio de cultivo, hasta que tome un color prpura definido. C).- CARBOHIDRATOS 1.- lactosa1.0 gr. 2.sacarosa....1.0gr. glucosa.1.0gr. Utilizar un gramo de carbohidratos por cada 100 ml. De medio. 3.-

ALTERNATIVA: a).- en la produccin de gas, en caso de no contar con tubos de durham, puede sustituirse por ampolletas o tubos de vidrio cerrados por uno de sus extremos. b).-en la produccin de acido: el prpura de bromocresol puede ser sustituido por rojo de fenol. Obteniendo los mismos resultados. PREPARACIN: Rojo fenol.0.1 gr. Alcohol.250 ml Agua destilada ..250 ml. Disolver el indicador en el alcohol, agregue el agua destilada y filtrar, consrvese en frasco mbar, agregue al medio de cultivo, hasta que este tome un color definido. c).- en caso de que no tenga medio lquido puede sustituirse por un medio semislido: AGAR CISTINA, TRIPTICASA, nicamente sle agrega el carbohidrato al 1%. RESULTADOS: A).- POSITIVO: variacin de color rojo a amarillo B).- NEGATIVO: no hay variacin de color El medio es un semislido que se esteriliza a 10 libras por 10 minutos, se incula por puntuacin

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PRECAUCIONES: Al realizar este experimento se pueden incurrir en varios errores que pueden dar ocasin a malas interpretaciones de las observaciones. 1.- las altas o bajas concentraciones de los carbohidratos puede ocasionar la reversin de los resultados, por esto se recomienda que los carbohidratos estn entre 0.5%-1% en su mayora. 2.- esterilizar los carbohidratos a altas temperaturas provoca la descomposicin de los mismos. 3.- las altas concentraciones del indicador de PH, puede impedir el crecimiento de los microorganismos. 4.- los tubos invertidos, en el momento de su inoculacin no deben contener burbujas

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11.- PRODUCCIN DE ACIDO SULFHDRICO


INTRODUCCIN: Alguna especies bacterianas heterotrficas son capases de liberar azufre enzimaticamente de los diferentes aminocidos que la contienen produciendo gas y acodo sulfhdrico. La enzima responsable de esta actividad es la cisteina. Algunos de los productos que contienen azufre y de los cuales se obtiene H2S son: cisterna, trisulfato, acetato de plomo, medio de kligler, medio de T.S.I. Algunos ejemplos de esta reaccin son el aroma de los huevos podridos y el ennegrecimiento de los alimentos enlatados en descomposicin, en este ltimo ejemplo, en ennegrecimiento se debe a la reaccin del H2S y del metal del envase. La capacidad de un organismo de producir H2S es una caracterstica constante, y el que lo hace, por lo general produce gas (CO2 + H2) en medios con hidratos de carbono. MATERIAL: A).- Medio de cultivo (medio de kligler)(4) B).-Cultivo de escherichia coli, proteus vulgaris. C).- Mechero. D).- Asa bacteriolgica. E).- Etiquetas. PROCEDIMIENTO: A).- inocular un tobo con medio de kligler con escherichia coli, repita con proteus vulgaris. B).- incubar a 30C por 24-48 hrs. C).- haga sus observaciones. RESULTADO: A).- POSITIVO: la presencia de un color negro indica la presencia de H2S. B).- NEGATIVO: no hay coloracin negra

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REACTIVOS UTILIZADOS: A).- medio de cultivo (medio de kligler) Este producto existe en el mercado, prepara de acuerdo con las indicaciones del envase. Rehidrate el medio con agua destilada, dejar reposar de 5 a 10 minutos. Calentar suavemente hasta su disolucin, verter de 4-5 ml. De medio en un tubo de ensayo, esterilizar a 121C por 15 minutos. Dejar enfriar en forma inclinada. ALTERNATIVAS: Si no cuenta con medio de kligler-agar, puede usar: A).- TRIPLE azcar de hierro (TSI)- agar. B).- ACETATO DE PLOMO- agar. PRECAUCIONES: Para obtener resultados confiables evite: 1.- la prueba de H2S en TSI- agar, puede presentar resultados talmente negativos, ya que la sacarosa presentada en este medio puede inhibir la formacin de H2S. 2.-el empleo de temperaturas altas en la incubacin inhiben la formacin de H2S.la temperatura optima mxima de incubacin para una produccin positiva de H2 es de 30-34C. Cuestionario: a).- Cmo se demuestra la produccin de H2S en un medio de cultivo? b).- Por qu es necesario la presencia de un aminocido azufrado en el medio de cultivo? c).- Cmo se demuestra (reaccin) la formacin de H2S a partir de la cisteina?

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12.- PRUEBA DE INDOL


INTRODUCCIN: El triptofano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar indol. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre de triptofanasas, lo que indica un sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin de indol. El principal intermediario de la degradacin del triptofano es el indolpurivico del cual puede formarse indol por desaminacion. La enzima triptofanasa cataliza la accin de desaminacion, atacando la molcula triptofano solamente en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aromtico en la forma del indol. El indol desdoblado de la molcula triptofano, puede ser detectado por un reactivo que posea una combinacin qumica que produsca un color definido. La presencia o ausencia del indol se emplea para la identificacin bacteriana. El medio de cultivo utilizado para la prueba de indol debe de tener un PH ligeramente alcalino (7.4-7.8), un PH ligeramente acido provoca una reduccin en la produccin del indol. Los cultivos que se van a someter a la prueba de produccin de indol deben ser incubados aerbicamente, la falta de oxigeno en el medio de cultivo disminuye la produccin del indol. MATERIAL: A).-Tubos de ensayo con caldo de peptonado (4) B).- Cultivos de 24 hrs. De ESCHERICHIA COLI, Y ENTEROBACTER AEROGENES. C).- Reactivo de Erlich D).- Asa bacteriolgica. E).- Mechero. F).- Etiquetas. PROCEDIMIENTO: A).- sembrar dos tubos de caldo peptonado con e. coli. Y otros con e. aerogenes. B).- incubar por 24-48 hrs. A 35C C).- despus incubar, agregar 0.5ml. De reactivo de erlich, a cada tubo. Agitar y dejar reposar. D).- anote sus resultados y observaciones

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RESULTADOS: A).- POSITIVO: despus de agregar el reactivo de erlich, aparece un anillo rojo en la superficie del medio. B).- NEGATIVO: despus de agregar el reactivo, no aparece ningn color en la superficie del medio. REACTIVOS UTILIZADOS: A).- MEDIO DE CULTIVO (CALDO NUTRITIVO) Caldo nutritivo. 0.8gr. Bacto peptona.. 0.3gr. Agua destilada. 100ml. Disuelva el caldo y la bato peptona en agua destilada, calentar suavemente para disolver, verter en tubos de ensaye 5 ml. Aproximadamente por tubo, esterilizar a 212C por 15 minutos. B).- REACTIVO DE ERLICH. p-dimetilaminobenzaldehido2.0gr. Alcohol etlico.190ml. Acido clorhdrico...40ml. Disolver el aldehdo en el alcohol, agregue lentamente el acido. Agtese con cuidado, conservar el frasco mbar, gurdese en refrigerador, mientras no se utilic. MODO DE UTILIZAR: Agregue 1 ml. De ter a un tobo de caldo peptonado incubado de 24-48hrs. Esperar a que el ter suba hasta la superficie del medio, agregue suavemente 0.5ml. de el reactivo de Erlich. Inclinando el tobo para que el reactivo se deslice por la pared del tubo. ALTERNATIVA: A).- en lugar del caldo peptonado puede utilizar: Caldo triptofano. Este producto existe en el mercado, prepara de acuerdo a las indicaciones del envase. B).- el reactivo de erlich puede sustituirse por: Reactivos de kovac`s p-dimetilaminobenzaldehido10.0gr. Alcohol amilico o isoamilico.150ml. Acido clorhdrico...50.0ml. Disolver el aldehdo en el alcohol, agregar el acido lentamente y con cuidado, conservar en frasco mbar guardar en refrigeracin cuando no se utilice. MODO DE UTILIZAR: Agregue 5 gotas de reactivo de kovac`s, directamente sobre el tubo de 24-48hrs. Agite suavemente y anotar sus resultados.

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PRECAUCIONES: Para hacer una buena interpretacin tenga presente: A).- si un cultivo de 24hrs. Es negativo, deber incubarse otras 24hrs. Y repetir la prueba. B).- la bacto-peptona debe ser adecuada para la produccin del indol, algunos medios con peptona contienen suficiente triptofano para la produccin de indol. C).- no deber emplear medios de cultivo que contengan glucosa, los hidratos de carbono pueden inhibir la produccin del indol. D).- no debe interpretar resultados antes de agregar el reactivo. E).- el periodo de incubacin debe ser el ptimo. F).-si el inoculo es de un cultivo mixto de organismos indol pasivo y negativo, cuando se realiza la prueba pueden producir reacciones dbil mente positivas o falsamente negativas. G).-los reactivos deben ser frescos, si se deja a temperatura ambiente por un tiempo considerable el color del reactivo cambiara de amarillo a castao: desechar el reactivo y preparar nuevo.

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13.- PRUEBA DEL ROJO DE METILO


INTRODUCCION La prueba del rojo de metilo (R.M), se basa en el empleo de un indicador de PH rojo de metilo, para determinar la concentracin de iones (PH) presentes cuando un organismo fermenta la glucosa. Todos los miembros de la enterobacteriaceas, son por definicin, fermentadores de la glucosa. Despus de 18-24 Hrs. De incubacin, la fermentacin resultante da por resultado producto secundario, metablico acido, por lo tanto inicialmente, todos los entricos darn una reaccin positiva con el rojo de metilo. Sin embargo para llevar a cabo una prueba confiable positiva, exige una incubacin de dos a cinco das, despus del tiempo de incubacin los organismos que son positivos al rojo de metilo continan produciendo mas acido y dan como resultado un bajo PH terminal. Los organismos de rojo de metilo positivo producen cidos estables, manteniendo una alta concentracin de iones hidrogeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces cesa toda actividad. Los organismos rojo de metilo negativo, tambin producen cidos (actico, lctico, frmico), pero tienen una menor concentracin de iones hidrogeno porque hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en carbonatos y al Anhdrido carbnico. La validez de la prueba de rojo de metilo depende de un tiempo de incubacin suficiente para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa. MATERIAL: A).- Tubos de ensayo con caldo glucosado al 0.5% (4) B).- cultivos de 24 Hrs. de Escherichia coli y Enterobacter Aerogenes. C).- Indicador rojo de metilo. D).- Mechero. E).- Asa bacteriolgica. F).- Etiquetas. PROCEDIMIENTO: a). Inocule dos tubos con medio de cultivo con E.coli y otros con Enterobacter Aerogenes. b). Incubar a 37C por 24-48-72 Hrs. hasta 5 das. c). Agregue 0.3 ml de indicador, despus del tiempo de incubacin agite. d). Anote sus resultados. RESULTADOS: A).- Positivo: despus de agregar el indicador y agitar, permanece de color rojo. B).- Negativo: despus de agregar el indicador y agitar, permanece de color amarillo. REACTIVOS UTILIZADOS: A).- Medio de cultivo (caldo glucosado) 0.5%
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Caldo nutritivo................... 0.8 gr. Glucosa.. 0.5 gr. Agua destilada.. 100 ml. Disuelva el caldo nutritivo y la glucosa en el agua. Calentar suavemente hasta su disolucin. Verter 5 ml. Aproximadamente en cada tubo de ensayo, esterilizar a 125C por 15 minutos. B).- Indicador rojo de metilo. Rojo de metilo. 0.1 gr. Alcohol etlico.. 300 ml. Agua destilada. 200 ml. Disolver el indicador en el alcohol, agregue el agua, filtrar, conservar en frasco mbar. PRECAUCIONES: 1.- La reaccin de R.M. no puede acelerarse aumentando la concentracin de glucosa en el medio. 2.- No debe interpretar sus resultados antes de la 48 Hrs. de incubacin, pueden resultar equivocadas o falsamente negativas. 3.- Evite un exceso en el inoculo en el medio de cultivo, el crecimiento bacteriano puede ser inhibido. 4.- Si despus de agregar el indicador aparece un color anaranjado incube 4 das ms y agregue otra vez indicador.

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14._ PRUEBA DE VOGES PROSKAUER INTRODUCCION:


La reaccin de Voges Proskauer (UP), se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetoina), un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La produccin de acetoina es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en bacterias. La reaccin de VP se usa sobretodo para separar a la Escherichia Coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter principalmente. La reaccin de VP en la deteccin de la acetoina; un precursor de la produccin del 2,3-Butanediol. Es muy importante el PH del medio de cultivo, por de bajo del PH de 6.3 hay produccin de acetoina y 2,3butanediol. Para la mayora de los organismos VP positivos son suficientes de 18-24 hrs, de incubacin a 35C.

MATERIAL:
A. Medio de cultivo con glucosa al 1% (4) B. Alfa naftanol 5%. C. Hidrxido de potasio (KOH) 40%. D. Cultivos de Escherichia Coli y Enterobacter Aerogenes 24 hrs. E. Mechero. F. Etiquetas

PROCEDIMIENTO:
Inocular tubos de medios de cultivo con E. Coli y otros con E. Aerogenes. 1. Incubar de 18-24 hrs, a 35C. 2. Agregue 0.6 ml. de Alfa naftanol 5%. 3. Agregue 0.2 ml. de KOH -40%. 4. Agite el tubo suavemente y djelo reposar de 15 minutos a 1 hr. Anote sus resultados.

RESULTADOS:
A. POSITIVO: la aparicin de un color rojo o rosado en la superficie del medio. B. NEGATIVO: Color amarillo en la superficie del medio, puede aparecer un color cobrizo, pero aun as la reaccin es negativa.

REACTIVOS UTILIZADOS:
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A. MEDIO DE CULTIVO (caldo glucosado 1%) Caldo nutritivo Glucosa Agua destilada 0.8 gr. 1.0 gr. 100 ml.

Re hidrate el medio de cultivo y la glucosa en el agua, calentar suavemente para su dilucin. Verter 5 ml. de medio en cada tubo de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. B. ALFA NAFTANOL 5% Alfa naftanol Alcohol etlico 5.0gr. 100 ml.

Disolver los 5 gr. De alfa naftanol en menos de 100 ml. De alcohol, traspasar la solucin a un frasco volumtrico y agregar alcohol etlico hasta completar 100 ml, conservar en frasco mbar. Guardar en el refrigerador. C. HIDROXIDO DE POTACIO 40%. KOH Agua destilada 40 gr. 100 gr.

Disolver en menos de 100 ml. De agua el KOH, traspasar a un vaso volumtrico de 100 ml. Agregar agua destilada hasta completar 100 ml. Conservar en frasco mbar, guardar en refrigeracin. El KOH puede ser sustituido por hidrxido de potasio.

PRECAUCIONES:
Para obtener buenos resultados tome en cuenta. 1. Si la produccin de acetilmetilcarbinol es muy dudosa, calentar suavemente el cultivo que contiene los reactivos. Un organismo VP positivo presentara una coloracin roja en la superficie. 2. El orden de los reactivos es muy importante, agregue primero alfa naftanol, luego el KOH. La inversin de los reactivos puede ocasionar resultados falsamente negativos o dbilmente positivos. 3. No debe exceder el volumen de los reactivos, ya que pueden ocultar la reaccin de VP.

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4. Un buen resultado se obtiene despus de una hora de haber agregado los reactivos al medio de cultivo y manteniendo en reposo.

15.- PRUEBA DE CITRATOS


INTRODUCCION: Algunas bacterias pueden suministrar energa en ausencia de fermentacin o produccin de acido lctico empleando el citrato como nica fuente de carbono. El metabolismo del citrato por la mayora de las bacterias es rpido atraves del acido tricarboxilico o del acido del citrato. Comprende un sistema enzimtico sin la intervencin de la coenzima A, esta enzima se denomina CITRAZA o citrato desmolasa. Se considera actualmente que el oxalacetato y el acetato son intermediarios en el metabolismo del citrato dependen del pH del medio. Si el pH aumenta (Alcalino), se producen mas acetatos y aformatos, con una disminucin de la produccin de lactato y CO2. Con un pH acido, el acetlmetilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilizacin del citrato. El medio utilizado para la fermentacin del citrato contienen tambin sales de Amonio inorgnico. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de Carbono, utiliza tambin las sales de Amonio como nica fuente de Nitrogeno. Las sales de Amonio se desdoblan en Amoniaco(NH3) con la consiguiente alcalinidad. MATERIAL: A).-Tubos con medio de agar-citrato de Simmons (ph 6.9) (4) B).-Cultivo de 24 hrs. De Escherichia coli y enterobacter aerogenes . C).- Asa bactereologica D).-Mechero E).- Etiquetas PROCEDIMIENTO: 1.- Inocule dos tubos con medio de Escherichia coli y otros con E. androgenes. 2.-Incubar por 24-48 hrs a 35c 3.-Anote sus observaciones. RESULTADOS:
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A).-POSITIVO: Hay viraje de color verde a azul. B).- NEGATIVO: No sucede viraje de color, permanece verde. REACTIVOS UTILIZADOS: A).- Medio de cultivo (agar citrato de Simmons), estre producto existe en el comercio, preparar deacuerdo a las indicaciones del medio. Verter 5 ml del medio en tubos de ensayo. Esterilizar a 121c por 15 minutos, dejar enfriara en forma inclinada. ALTERNATIVA: A).-Medio de KOSER (liquido), este producto se encuentra en el comercio. Preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Vertir 5ml en el tubo de ensayo. Esterilizar a 121c por 15 minutos. RESULTADO: (MEDIODE KOSER) A).-POSITIVO. Hay turbiedad en el medio de cultivo debido al crecimiento de bacterias B).- NEGATIVO.- No hay crecimiento de bacterias, el medio permanece claro. PRECAUCIONES: Para obtener buenos resultados tenga en cuenta: 1.-Puede obtener resultados falsamente negativos si hay variaciones del pH del medio. Se recomienda que el pH sea de 6.9 para obtener resultados confiables. 2.- Un inoculo demasiado espeso puede provocar un resultado falsamente negativo. 3.-En los medios donde ase tenga duda en las primeras 48 hrs, de incubacin, se pueden dejar otras 48 hrs, mas , con observaciones cada 4 o 6 hrs. 4.- N o se deben interpretar resultados sino hasta despus de 24 hrs.

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PRACTICA 16 PRUEBA DE LA REDUCCION DEL NITRATO


La reduccin de Nitrato en nitrito y en gas Nitrgeno, tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas, en las cuales un organismo obtiene su oxigeno del Nitrato. La mayora de las bacterias aerbicas son anaerbicas facultativas y solo pueden reducir el nitrato en ausencia de oxigeno. Esta respiracin anaerbica es un proceso de oxidacin por el cual las sustancias inorgnicas, especialmente Nitrato y Sulfato, o raramente los hidratos de Carbono proporcionan oxigeno para que sirve como aceptor de electrones para suministrar energa. Los productos finales de la reduccin de Nitratos puedan ser: Nitrito, Amoniaco, Nitrgeno molecular, Oxido Ntrico, Oxido Nitroso, o Hidroxilamina. El producto final de la reduccin que se forme depende de la especie bacteriana. La reduccin del Nitrato en gas nitrgeno u oxido nitroso, se denomina desnitrificacin. En la reduccin de Nitratos pueden producirse varios procesos para la utilizacin de los productos terminales formados. La reduccin, por lo tanto, en la prueba de reduccin del Nitrato, se manifiesta por la presencia de un producto final catablico o la ausencia del nitrato en el medio. REACTIVOS UTILIZADOS: A).- MEDIO DE CULTIVO 1.- CALDO NITRATADO: Este producto existe en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Verter 4 ml., aproximadamente del medio de cultivo en tubo de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Dejar enfriar el medio y utilizar. 2.- AGAR CON NITRATO. Este producto existe en el comercio, prepara de acuerdo a las indicaciones del envase. Verter 4-5 ml. del medio en tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Dejar enfriar en forma inclinada. B).- ALFA NAFTILAMINA 0.5 % Alfa ( ) naftilamina0.5 gr. 46

*Acido actico (5 N) 30 %.............................100 ml. Disolver en Alfa naftilamina en menos de 100 ml. de acido actico, para disolver calentar suave. Pasar la solucin a un matraz volumtrico de 100 ml. y agregar acido actico 5 N 30 % hasta completar 100 ml.

1.- Filtrar la solucin con un algodon absorbente. Guardar en un frasco mbar bien tapado. *Acido actico.30ml. Agua destilada1000ml. 2.- Acido sulfanilico al 0.8% Acido sulfanilico0.8gr. Acido actico (5N, 30%)..100ml. Disolver el acido sulfanilico en menos de 100 ml. De acido actico. Traspasar la solucin a un matraz volumtrico de 100 ml. Y agregar acido actico hasta completar 100 ml. Guardar en un frasco de vidrio color mbar, bien tapado.

MATERIAL:
1.- Cultivos de 2.- Agar Nitratado o Caldo Nitratado en un tubo de ensayo (6) 3.- Alfa Naftlamina 0.5% 4.- Acido Sulfanilico 0.8% 5.- Pipetas o goteros 6.- Mechero 7.- Asa bacteriolgica 8.- Etiquetas

PROCEDIMIENTOS:
1.- Inocular dos tubos de ensayo con ______________________ Y dos con ___________________. 2.-Incubar a 37C de 24 a 48 horas. 3.- Agregar 1 ml. De alfa-naftilamina. 4.- Agregar 1 ml. de acido sulfanilico 5.- Dejar reposar por 30 segundos 6.- Interpretar sus resultados y haga sus anotaciones.

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INTERPRETACIONES:
a) POSITIVA: Despus de agregar los reactivos aparece un color rosado o rojo intenso, lo que indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. b) NEGATIVA: Despus de agregar los reactivos no se ha desarrollado color.

PRECAUCIONES:
A) Interpretar los resultados inmediatamente, ya que cuando se utiliza en esta prueba el reactivo de afta-naftilamina, puede desvaneserse rpidamente B) No realice esta prueba en medios que contengan nitritos, puede obtener resultados falsamente positivos. C) En ocasiones un organismo reductor del nitrato fuertemente positivo puede mostrar un precipitado color castao. D) Algunos organismos pueden reducir parcialmente el nitrato o perder temporalmente su capacidad para reducir el nitrato dando resultados falsamente negativos.

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17.- PRUEBA DE LA LICUEFACCION DE LA GELATINA


INTRODUCCION Se incorpora gelatina a diversos medios para determinar la capacidad de un organismo para producir enzimas de tipo proteoltico. Estas enzimas que son capaces de la gelatinolisis, se denominan gelatinosas. La protenas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar a una clula bacteriana, por lo tanto, para que una clula utilice las protenas, primero debe ser catalizadaen componentes mas pequeos. Las enzimas exocelulares (gelatinasas), son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las protenas, esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana. MATERIAL: A).- TUBOS DE ENSAYO CON GELATINA NUTRITIVA (6) B).- CULTIVOS DE ESCHERICHIA COLI Y ETEREROBACTER AEROGENES Y PROTEUS VULGARIS C).- MECHERO D).- ASA BACTERIOLOGICA E).- ETIQUETAS PROCEDIMIENTO: A) Inocular dos tubos con vulgaris. E. Coli, otros con E. Aerogenes y otros con preteus

B) Incubar a 35*C de 24 hrs. A 14 das. C) Observe sus resultados RESULTADOS:

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A) POSITIVO: Despus de cada 24 hrs. De incubacin colocar los tubos cundo menos una hora. En refrigeracin (6*C). Si el cultivo continuo liquido, es positivo. B) NEGATIVO: Si despus de la refrigeracin el medio continua solido. REACTIVOS UTILIZADOS: A).- Medio de cultivo (Gelatina Nutritiva). Este producto existe en el comercio, preparar de acuerdo a lo indicado en el avance. Re hidrata, el medio en agua destilada, dejar reposar por 30 minutos, calentar suavemente hasta su disolucin, distribuir 5 ml. En cada tubo de ensayo, esterilizar a 21*C por 15 minutos dejar enfriar en posicin vertical. PRECAUCIONES: Para obtener buenos resultados tenga en cuenta: 1.- la gelatina es solida cuando se incuba a 20*C y liquida a 35*C si la incubacin es a 35*C, los tubos con el medio deben de ser colocados en el refrigerador antes de su interpretacin. 2.- no agitar los tubos con medio de cultivo al sacarlos de la incubadora ya que con frecuencia y la licuefaccin se producen solamente en la capa superficial al agitar existe la posibilidad de pasar por alto un resultado positivo 3.- el PH del medio debe de ser 6.8-7.2 algunas bacterias no muestran en el medio de loa gelatina nutritiva.

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18.- PRUEBA DE LA CATALAZA INTRODUCCION


La catalaza es una hemoproteina del grupo prosttico. Esta formada por cuatro tomos de hierro trivalente por molcula, que retiene su estado oxidado durante la actividad enzimtica. La enzima catalaza se encuentra en la mayoria de la bacteria aerobias y anaerobias. Facultivas que contienen citocromo , por lo general los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen tambin de la enzima catalaza y or lo tanto no pueden descomponer el perxido de hidrgeno. El perxido de hidrogeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azucares. El perxido si se deja acumular, es toxico para las bacteria y provoca la muerte. La catalaza descompone el perxido de hidrogeno u oxidado los sustratos secundarios. La descomposicin del perxido de H se produce atravez de la accion de dos enzimas: a) la catalaza b) la peroxidasa La enzima catalaza puede emplear el perxido de H para oxidar los alcoholes metilico y etlico. El PH +optimo para la actividad de la catalaza es de 7.0.

MATERIAL
A).- Tubos de ensayo con mediosde cultivo (agar nutritivo) (4) B).- Cultivo de 24 horas. De erichia coli y basillius subtillis C).- Perxido de H al 30 % D).- Mechero E).- Asa bacteriolgica F).- Etiquetas

PROCEDIMIENTO
a).-Inocular 2 tubos con medio cultivo con E. coli y otros con B. subtillis. b).-Incubar 18-14 horas; a 35 C. c).-Agregue 0.5ml de perxido de H al 30% d).-Anote sus resultados

RESULTADOS
a).- POSITIVO: Al aadir el perxido, hay formacin inmediata de burbujas bien visibles b).- NEGATIVO: Al agregar el reactivo no hay formacin de burbujas.

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REACTIVOS UTILIZADOS
A).- MEDIO DE CULTIVO (agar nutritivo). Este producto existe en el mercado, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Antes de esterilizar vertir 5ml del medio a cada tubo de ensayo y esterilizar a 121C por 15 min, dejar enfriar en forma inclinada. B).- PEROXIDO DE HIDROGENO: Este producto existe en el comercio.

PRECAUCIONES
Para tener una buena interpretacin de esta prueba tenga presente que : 1.- Los cultivos utilizados para la prueba de la catalaza debe de ser de 18-14 horas 2.- Los cultivos viejos pueden perder la actividad de la catalaza, dando por resultados falsamente negativos. 3.- El peroxido de H al 30% es una solucin bastante custica, debe evitarse su contacto con la piel. 4.- El peroxido de hidrogeno, debe de ser un reactivo fresco, es un reactivo bastante inestable y se descompone con facilidad al exponerse a la luz. Debe mantenerse en un frasco ambar y en refrigeracin. Tenga en cuenta que la velocidad de descomposicin del peroxido de H aumenta a medida que aumenta la temperatura. 5.- No hacer las pruebas de catalaza en medio de agar chocolate, los resultados serian negativos

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19.- PRUEBA DE OXIDASA INTRODUCCION


La prueba de la oxidasa esta basada en la produccion bacteriana de una enzima oxidasa. Esta reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema ctocromoxidasa que activa la oxidacion del citocromo reducido por el oxgeno molecular. Todas las bacterias aerobias obtienen su energa de la respiracion, proceso responsable de la oxidacion de diversos sustratos. El sistema citocromo solo se encuentra, por lo general, en los organismos aerobicos, lo que los hace capaz de utilizar el oxgeno como un aceptor de hidrogeno final para reducir el oxgeno molecular en peroxido de hidrogeno, el ltimo enlace de la respiracion aerobica. Los organismos obligadamente anaerbicos carecen de la actividad de la oxidasa, porque no pueden vivir en presencia de oxgen atmosfrico y no poseen el sistema citocromooxidasa. La distribcion de los diferentes citocromos vara en cada especie bacteriana. Algunos organismos poseen solamente una oxidasa, mientras otros pueden producir dos o tres. Un resultado oxidasa psitiva esta formado por una serie de reacciones en las cuales un componente autxidable del sistema del citocromo es el catalizador final. Los diversos reactivos pera la prueba de la oxidasa son aceptores de electrones artificiales La reaccion oxidasa final muestra un producto coloreado.

MATERIAL:
A).-. CAJAS DE PETRI CON MEDIO DE CULTIVO (AGARSANGRE) (4) B).- CULTIVOS DE ESCHERICHIA COLI Y PSEUDUMONAS SP. DE 24 HRS. C).- REACTIVO DE OXIDASA D).-ASA BACTERILOGICA E).- MECHERO F). ETIQUETA

PROCEDIMIENTO:
A). Inocular dos cajas de PETRI con Escherichia Coli y otras con Pseudomonas sp. B).- Incubar a 35C por 24-48 hrs. C).- regregue de dos a tres gotas del reactivo de oxidasa sobre la colonia escogida para la prueba.

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RESULTADOS:
A).-Las colonias toman un color rosado, despus marron y finalmente negro o azul. B).- NEGATIVO: No se produce cambio de color en las colonias, o solo adquieren un color rosado palido por el reactivo, Puede producrse un color negro en el medio circundante a la colonia

REACTIVOS UTILIZADOS:
A).- MEDIO DE CULTIVO (AGARSANGRE. Este producto existe en el mercado como Agar Base para Sangre. Preparar como se indica en el envase. Depuse esterilizar y cuando el medio esta a una temperatura de 55 C Agregar la sangre (10 ml./1CO) y vertir de 15-18 ml, en cajas de petri esteriles. B) - REACTIVO DE LA OXIDASA (OXALATO DE Pamino Dimetilanilina) (xolato de P.amino Dimetilanalina . . . . . . 0.1 gr. Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml. Disolver la amina en menos de 10 ml. de agua, calentar suavemente hasta su disolucion, pasar a un fraso volumetrico y agregar agua destilada hasta completar 10 ml. Conservar en frasco ambar y no exponerlo innecesariamente a luz, guardar en refrigeracion cuando no se utilice, hasta por tres das.

ALTERNATI VA:
A).- Medio de Cultivo (Agar-Chocolate). Este producto se encuentra en el mercado como Agar Base para sangre, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Despus de esterilizar, Agregar 10!00 de sangre, vertir de 15-18 ml. en cajas de Petri esteriles
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B). Reactivo de la oxidasa. 1. Diclorhidrato de Tetrametil-P-Fenilendiamina 2. Diclorhidrato de DimetilPFenilendiamina. (N. Dimetil-P-Fenilendiamina) (Monoclorhidrato de P-aminodmetil anilina) Preparar en la misma forma y concentracion que el oxalato.

PRECAUCION :
Para poder interpretar adecuadamente esta prueba tenga en cuenta lo siguiente: 1 . No intente realizar la prueba de la oxidasa en cultivos que crezcan en un medio con glucosa. La fermentacion inhibira la accion de la oxidasa y dar resultados falsamente negativos. 2. El medio de Cultivo no deber contener una elevada concentracion de sangre; puede producir resultados falsamente positivos. 3. Se recomienda el uso de alambre de platino para la inoculacio de los cultivos, vestigios de hierro pueden catalizar la reaccion de la oxidasa dando una reaccion falsamente positiva. 4. Para la prueba de la oxidasa deben utilizarse cultivos puros, nunca cultivos mixtos. 5. Una interpretacion adecuada de esta prueba se hara. de 10-60 segundos despus de agregar el reactivo.

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20.- PRUEBA DE UREASA


INTRODUCCION

El SUSTRATO UREA ES UNA DIAMIDA DEL ACIDO CARBNICO, A LA QUE FRECUENTEMENTE SE MENCIONA COMO CARBAMIDA. LA HIDRLISIS DE LA UREA ES CATALIZADA FRECUENTEMENTE POR UNA ENZIMA ESPECIFICA, LA UREASA, PARA DAR DOS MOLCULAS DE AMONIACO, EN SOLUCIN LA UREA SE HIDROLIZA DANDO CARBONATO DE AMONIO COMO PRODUCTO FINAL. LA UREASA ES UNA IMPORTANTE ENZIMA MICROBIANA VINCULADA CON LA DESCOMPOSICIN DE LOS COMPUESTOS ORGNICOS. LA UREASA ES CONSIDERADA UNA ENZIMA CONSTITUIDA DADO QUE ES SINTETIZADA POR CIERTAS BACTERIAS SIN TENER EN CUENTA LA PRESENCIA O AUSENCIA DE SUSTRATO UREA. LA UREASA SE CLASIFICA COMO UNA AMIDASA, CATALIZANDO LA HIDRLISIS DE LAS AMIDAS.

MATERIAL
TUBOS CON MEDIO DE AGAR UREA CHRISTENSEU (ph6.8) CULTIVO DE ESCHERICHIA COLI Y PROTEUS VULGARIS DE 24 HORAS ASA BACTERIOLOGICA MECHERO ETIQUETAS

PROCEDIMIENTO
INOCULAR DOS TUBOS CON MEDIO DE E. COLI Y OTROS CON P. VULGARIS INCUBAR A 35 POR 24-48 HRS. ANOTE SUS RESULTADOS

RESULTADOS
POSITIVO: APARECE UN COLOR ROSADO INTENSO EN EL MEDIO NEGATIVO: NO PRODUCE CAMBIO DE COLOR

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REACTIVOS UTILIZADOS
MEDIO DE CULTIVO(AGAR UREA) UREA BASICA DESHIDRATADA NOTA: NO CALENTAR LA UREA NI EL MEDIO CON UREA PORQUE SE DESCOMPONE

PRECAUCION:
NO EXPONER AL CALENTAMIENTO LA UREA NI EL MEDIO CON UREA EL AUMENTO EN EL PH DA COMO RESULTADO DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA OBSERVAR LOS TUBOS INCUBADOS CADA 6 HORAS, ALGUNOS ORGANISMOS DAN RESULTADOS DURANTE LAS PRIMERAS 12 HORAS EN OCASIONES ES NECESARIO UN PERIODO PROLONGADO DE HASTA 6 DIAS.

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21.- HIDRLISIS DEL ALMIDON


El almidn es un carbohidrato completo de tipo polisacrido. Hay microorganismos que son capaces de producir una enzima que desdobla el almidn. Esta prueba servir para detectar de almidn depende de la encima amilasa. Una prueba cualitativa que demuestra la presencia de almidn consiste en agregar una solucin de lugol.

MATERIAL
A) Cajas petri con medio de cultivo (agar almidn) (10) B) Cultivos de escherichia coli, basilus subtilis, staphilococcus aureus, pseudomonas sp, proteus sp. C) Mechero D) Lugol E) Etiquetas F) Asa bacteriolgica

PROCEDIMIENTO
A) Inocular dos cajas de petri con E. coli. Segn el mismo procedimiento con cada una de las bacterias mencionadas. B) Incubar a 35 grados centgrados por 24 horas. C) Agregue lugol sobre las lneas de crecimiento. D) Anote sus resultados

RESULTADOS
A) POSITIVO: en la zona de crecimiento se presenta un color caf. B) NEGATIVO: en la zona de crecimiento se presenta un color azul. REACTIVOS UTILIZADOS A) Medio de cultivo (agar almidn). Este producto en el mercado. Preparar de acuerdo con lo indicado en el envase. Despus esterilizar, verter 15 a 28 ml. De medio en cajas de petri estriles. Dejar enfriar.

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B) REACTIVO LUGOL: Iodo Q P 5.0 g Yoduro de potasio Q P 10.0 g Agua destilada 100 ml Mezclar el iodo y el yoduro de potasio en un mortero y triturar adecuadamente, agregar agua hasta su dilucin completa; conservar en un frasco mbar. PRECAUCIONES Para interpretar los resultados en esta prueba tenga en cuenta: A) No deber interpretar los resultados antes de agregar los reactivos. B) No aumentar la concentracin del almidn, podra retardar los resultados d la prueba o dar dbilmente positivo. C) No haga inoculacin profusa sobre la superficie de agar- almidn, haga una sola lnea de inoculacin en la mitad de la caja.

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22.- HIDRLISIS DE LA CASEINA INTRODICCION


La caseina es una fosofoproteina y es el principal constituyente nitrogenado de la leche, la enzima responsable de la hidrlisis de la caseina es llamada caseinasa. La conversin de la caseinasa en otros compuestos solubles se le llama peptonizacin. Una pequea cantidad de leche se dispersa en el cultivo (agar nutritivo) para proveer de caseina a los organismos que se van a inocular. El agar va a producir una turbidez distintiva que de otra manera no se vera en otras caja de agar nutritivo normal. La turbidez se debe a que la molcula de VC caseina son coloidales, y la mayor parte de las coloides no transmiten la luz. Esta turbidez es fuincin del tamao de las molculas coloidales. Algunos organismos son capaces de proliferar en este agar y de liberar exoenzimas hidrolticas que atacan las proteinas. El cambio que se observa al hidrolizarse la caseina, es la clarificacin alrededor de las colonias que se producen caseinasa.

MATERIAL
a).- Cajas de petri con medio de cultivo (agar nutritivo) (4) b).- Cultivos de escherichia coli y basillus subtillis c).- Leche fresca descremada y estril d).- Pipetas de 1 ml estriles e).- Asa bacteriolgica f).- Mechero g).-Etiquetas

PROCEDIMIENTO
A).- Cu|ando el medio de cutlivo esterilizado tenga una temperatura aproximada de 55-50C , verter en cajas de petri esteriles de 15-18 ml de medio B).- Inmediatamente y antes que el medio de cultivo de la caja se solidifique. Agregar 1 ml de leche descremada esteril, difundir. Dejar enfriar. C).- Inocular dos cajas con medio de cultivo con E. coli y otros con B. subtillis D).- Incubar a 35 C por 24-48 horas. E): Anote sus resultados

RESULTADOS
a).- POSITIVO: Aparece un halo claro y definido alrededor de la colonia bacteriana.

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b).- NEGATIVO: No hay halo alrededor de la colonia.

REACTIVOS UTILIZADOS
a).- Medio de cultivo ( AGAR NUTRITIVO) Este producto existe en el mercado, preparace de acuerdo a las indicaciones del envase. b).- LECHE DESCREMADA ESTERIL. La leche se esteriliza hirviendola 20 min diarios por 3 dias consecutivos.

PRECAUCIONES
A).- Asegurese de que la leche que utiliza este estril B).- Cuando se utiliza leche no estril, microorganismos presentes en este pueden crecer e inhibir a los que se utilizan el la prueba. C).- No utilice la autoclave para esterilizar la leche.

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23.-CULTIVO ANAEROBICO DE BACTERIAS

El efecto del oxigeno atmosfrico sobre el crecimiento bacteriano, esta relacionado con el potencial de oxidoreduccion del medio de cultivo.. Las bacterias anaerobicas pueden ser cultivadas eliminando el oxigeno libre del medio ambiente. Se puede obtener un medio libre de oxgeno mediante la adicion-de los suficientes materiales reductores al medio de cultivo. Las bacterias anaerobicas para crecer exigen la eliminacion total del oxgeno.

MATERIAL
A).- TUBOS DE ENSAYO CON MEDIO DE CULTIVO (AGAR EXTRACTO DE DE MA.LTA) (10) B).- CULTIVOS DE ESCHERICHIA- COLI, BACILLUS SUBTILIS STAPHYLOCOCCUS AUREUS, , KLEBSIELLA, SP. ENTEROBACTER AEROGENES. C). ASA;. BACTERIOLOGICA D). PIROGALOL E). CRISTALES DE HIDRCXIDO DE SODIO F).- MECHERO G) .- TAPONES DE HULE PAR CERRAR LO TUBOS DE ENSAYO. H). ETIQUETAS

PROCEDIMIENTO:
A).- Incubar do tubos de ensayo con E. Coli. Repita el procedimiento con cada una de la bacterias asignadas , tape con algodon la Boca del tubo, corte con tijeras el algodon que sobresale. Empuje el algodon hacia el interior del tubo unos cuatro cm. llene el espacio de arriba con pirogalol, vierta una pequea cantidad de NaOH concentrado, cierre hermticamente el tubo con el tapon de hule, invierta el tubo incube en esta posicion. Repita la operacion con cada tubo inoculado. B).-Incubar a 35 C por hasta 10 dias. C).-Haga observaciones cada 24 hs. .Anote sus resultados.

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RESULTADOS:
A).- POSITIVO: Hay crecimiento de Bacterias. B).- NEGATIVO: No hay crecimiento.

REACTIVOS UTILIZADOS:
A).- MEDIO DE CULTIVO (AGAR GLUCOSA EXTRACTO DE MALTA). Este producto existe en el comercio. Preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Vertir de 5 ml. en cada tubo de ensayo. Esterilizar 121 C por 15 rninutos Dejar enfriar en forma inclinada. B).- PIROGLOL C).-Hidroxido de Sodio,

ALTERNATIVAS:
A).- Medio de Cultivo (AGAR NUTRITIVO) B).-Hidroxido de Potasio. C).- Vasija de Brewer D).-Cajas de Petri de Brewer E). Incubadora de anaerobica. F).-Colocar una veladora encendida en un frasco que se cierre her mticamente.

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PRECAUCIONES:

A).- No utilizar un inoculo demasiado denso. Puede dar resultados falsamente positivos. B).- En los tubos invertidos evitar que el algodon toque el medio de cultivo. C).-. Evitar al maximo el contacto con el Pirogalol. D).- Siempre debe conservar el tubo en forma invertida. E).- Si utiliza un frasco hermetico, asegrese de que la tapa no esta perforada.

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24. INTRODUCCION

EFECTO DE SUSTANCIAS QUIMICAS

Muchos productos qumicos, tanto inorgnicos como orgnicos, son txicos para los microorganismos. Los agentes qumicos o inhiben simplemente las actividades ye l crecimiento microbiano o son letales y causan la muerte de los microorganismos. Los desinfectantes son agentes letales para los microorganismos. Los antispticos son agentes inhibidores del crecimiento. la eficacia de un desinfectante se mide por su coeficiente de fenol (slo se alica a los desinfectantes fenlicos. Ningn desinfectante posee las mismas caractersticas ideales para su eficiencia.

MATERIALES
A) Cajas de petri con medio de cultivo (agar nutritivo) (6) B) Agentes qumicos proporcionados (fenol 5%, acetona, alcohol 95, alcohol 70%, solucin de lejia 1% y 20%, antisptico bucal). C) Hisopos. D) Etiquetas. E) Discos de papel filtro de 1cm de dimetro. F) Tubos de ensayo con solucin fisiolgica .85% (3) G) Cultivos proporcionados.

PROCEDIMIENTO
A) Impregne aproximadamente 20 discos de papel filtro de cada agente qumico proporcionado, djelos secar. (Manjelos con pinzas de diseccin). B) Haga una suspensin del cultivo en la solucin sisiolgica, tome un poco del cultivo deseado y haga la suspensin. C) Inocule toda la superficie del medio de cultivo de una caja de Petri con un organismo escogido. D) Coloque cuatro discos impregnados en el medio de cultivo inoculado. Un disco por cada sustancia. E) Incubar por 24-48 horas., a 35 C. F) Realice lo mismo con cada uno de los microorganismos asignados.

REACTIVOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO). Este producto esite en el comercio, preparar de acuerdo a lo indicado en el envase. Despus de esterilizar, verter 15-18ml en cada caja de Petri estril, dejar enfriar. B) SUSTANCIAS QUMICAS: 1. Fenol 5% Fenol Q.P (cristales).......................................5.0 gr.
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Agua destilada......................................................100 ml. Disolver el fenol en el agua destilada y conservar en frasco mbar. 2. Alcohol al 70% Alcohol 95%.........................................................25 ml. Agua destilada.....................................................75 ml. Hacer la disolucin del alcohol en el agua destilada, conservar en frasco mbar. 3. Lejia 1% Lejia (jabn amarillo)............................................1 gr. Agua destilada.....................................................100 ml. Disolver la lejia ene l agua, conservar en frasco mbar. 4. Lejia 20% Lejia (jabn amarillo)............................................20 gr. Agua destilada.....................................................100 ml. Disolver la lejia en agua y conservar en frasco mbar. 5. Antisptico bucal. 6. Alcohol 95.

PRECAUCIONES
A) No maneje el fenol con los dedos, es custico y provoca quemaduras. B) No introduzca a la boca. C) El inculo no debe ser tan denso ni tan ralo, puede dar resultados falsamente negativos o positivos. D) El inculo no debe ser profundo, provoca resultdos falsamente negativos.

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25.

ACCION OLIGODINAMICA DE LOS METALES

INTRODUCCION
Es bien sabido que muchas sustancias que son txicas en caractersticas relativamente grandes, estimulan el crecimiento a concentraciones bajas. Cuando un metal se coloca en un medio inhibiendo el crecimiento de los microorganismos en una zona situada alrededor de la pizca metlica. Este fenmeno es atribuido a la denominada accin oligodinmica de los metales. Podra suponerse que en la periferia de cesta capa estril, como sea que la concentracin de los iones metlicos constituye con la distancia de la zona de metal. Puede haber indicado un crecimiento en la cercana de la zona estril o ala estimulacin para el crecimiento por una concentracin baja ptima de los iones metlicos existen iones metlicos ms efectivos que otros.

MATERIAL
A) B) C) D) E) F) G) Cultivos en caldo de 24 hrs., de scherichia coli y Staphylococus aureus. Tubos de ensayo con 15 ml de agar nutritivo (4) Monedas de cobre y/o plata (4) Cajas de Petri estriles (4) Pinzas. Pipetas de 0.1 ml. (2) Etiquetas.

PROCEDIMIENTO
A) Lave las monedas con agua y jabn y djelas durante 5 minutos en la solucin de alcohol-cido. B) Coloque la moneda en el centro de la Caja de Petri. C) Cuando los tubos de ensayo que contengan agar nutritivo entre aproximadamente 50-45 C, inocular dos tubos con Escherichia Coli, agregando 0.5 ml. Agite bien el tubo. D) Vierta el contenido de lso tubos de ensayo inoculados uno en cada caja, dejndolo caer sobre la moneda. Aspticamente. E) Repita con Staphylococus Aereus. F) Incube a 35 C por 34-48 hrs.

RESULTADOS
A) POSITIVO: Aparece un halo alrededor de la moneda. B) NEGATIVO: No hay halo alrededor de la moneda.

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REACTIVOS UTILIZADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO). Este prodcuto existen en el comercio. Despus de disolver el medio, verter 15 ml de medio de cultivo a cada tubo de ensayo y esterilizar a 121 C por 15 minutos. B) SOLUCION DE ALCOHOL-ACIDO cido Clorhdrico.......................................................3 ml. Alcohol 95..................................................................97 ml. Disolver el cido clorhdrico en el alcohol, conservar en frasco mbar.

PRECAUCIONES
A) Si el inculo es demasiado poco, puede interpretarse como condiciones ptimas de crecimiento. B) Si el inculo es demasiado denso, puede interpretarse como condiciones ptimas de inhibicin. C) Vierta el contenido del tubo de ensayo inoculado antes de que solidifique. D) Las monedas deben estar perfectamente limpias.

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26. INTRODUCCION

ACCION DE LOS ANTIBIOTICOS

La determinacin de la sensibilidad de un microorganismo dado a los antibiticos, constituye unA tcnica habitual y de inters en muchos laboratorios, constituye una tcnica habitual y de inters en muchos laboratorios. El resultado de esas pruebas se utiliza para la seleccin de los antibiticos correctos en la teraputica de una infeccin determinada. Es de desear que los cultivos se obtengan antes de la administracin de antibiticos, as el verdadero microorganismos infectante podr se aislado. La variacin en la sensibilidad, deben desde luego realizarse preferentemente antes de la administracin. Los antibiticos pueden ser bactericidas, en tales casos provocarn la muerte de los organismos susceptibles o pueden ser Bacteriostticos, cuando inhiben y evitan la multiplicacin sin ocasionar su muerte. A dilucin adecuada un antibitico bactericida puede actuar como bacteriosttico. Si los cultivos no nacen hasta que se ha administrado el antibitico, el organismo causante puede ser inhibido y no crezcan y slo los microorganismos secundarios puedan crecer.

MATERIAL
A) B) C) D) E) F) G) H) Cajas de Petri con medio de cultivo (Agar nutritivo) (78). Tubos de ensayo con 3 ml de solucin fisiolgica. 85% c/u (4) Cultivos de Eschirichia Coli, Staphylococus Aereus, Pseudomonas. Antibiogranas. Hisopos. Pinzas. Mechero. Asa bacteriolgica.

PROCEDIMIENTO
A) B) C) D) Haga una suspensin de Eschirichia Coli en un tubo de solucin fisiolgica. Impregne un hisopo con la suspensin. Con el hisopo, siempre toda la superficie de la caja de Petri. Con pinzas de diseccin estril, tome el antibiograma y colquelo sobre el medio de cultivo inoculado. E) Incubar por 24-48 hrs. a 35 C. F) Realice el mismo procedimiento con cada uno de los cultivos asignados. G) Observe sus resultados.

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RESULTADOS
A) NEGATIVOS: No hay formacin de halo alrededor del disco que contiene el antibitico. B) POSITIVO: Se forma un halo alrededor del disco que contiene el antibitico.

REACTIVOS UTILIZADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO). Este producto existe en el comercio, prepare de acuerdo a las indicaciones del envase. Despus de esterilizar, vierta de 15-18 ml en cada caja de Petri estril. B) SOLUCIN FISIOLGICA (ESTRIL). Cloruro de Sodio........................................................0.85 gr. Agua destilada...........................................................100 ml. Disolver el cloruro en el agua, verter 3 ml en cada tubo de ensayo, esterilizar a 121 C por 15 minutos.

PRECAUCIONES
Para interpretar adecuadamente esta prueba tenga en cuenta: A) Inocule el medio de cultivo primero y luego coloque el antibiograma. B) Utilice concentraciones adecuadas de antibiticos, segn los resultados que busca. C) Utilice medios de cultivos estandarizados. D) La inoculacin debe ser superficial, nunca profunda. E) No utilice inculos demasiados densos. F) La eficacia de cada uno de los antibiticos se hace mediando el dimetro de la zona de inhibicin (Mtodo Emprico). G) No deber tomar el antibiograma con la mano.

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27. INTRODUCCION

EFECTOS DEL PH

Existen muchos factores en el medio ambiente de los microorganismos que son letales o potencialmente letales para ellos. La mayora de las bacterias soportan una concentracin de iones hidrgeno ptima para su crecimiento, aunque crecen en lmites de PH bastante amplio. Las variaciones de PH en un medio de cultivo puede afectar la viabilidad de las bacterias.

MATERIAL
A) Tubos de ensayo con caldo nutritivo ajustados a PH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0. B) Tubos de ensayo con caldo extracto de malta, ajustado a los mismos valores de PH. C) Cultivos de: a) Escherichia Coli. b) Scharomyces Cerevisiae. c) Potencimetro. d) Papel indicador de PH. e) Asa bacteriolgica. f) Mechero.

PROCEDIMIENTO
A) Siembre dos tubos de cada valor de PH con Escherichia Coli y otros con Sacharomyces Cerevisiae (Caldo nutritivo). B) Inocule dos tubos de cada valor de PH con Escherichia Coli y otros con Scharomyces Cerevisiae (Caldo extracto de malta). C) Incubar a 35 C por 24-46 hrs. D) Anote sus resultados.

RESULTADOS
A) POSITIVO: Existe crecimiento en el medio de cultivo. B) NEGATIVO. No existe crecimiento.

REACTIVOS UTILIZADOS
A) Medio de cultivo (Caldo nutritivo). Este producto existe en el mercado, preparar de acuerdo a lo indicado en el envase. Despus de disolver. Ajustar a los diferentes PH indicados anteriormente. Verter 5 ml en cada tubo de ensayo. Esterilizar a 121 por 15 minutos.
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B) MEDIO DE CULTIVO (Caldo extracto de malta). Este prodcuto existe en el mercado, preparar de acuerdo a lo indicado en el envase. Para utilizar siga las instrucciones que se den en el caldo nutritivo de esta prctica.

PRECAUCIONES
Para obtener resultados adecuados tome en cuenta: A) No utilice un inculo demasiado denso. B) Tome sus resultados despus de 25 hrs.

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28. INTRODUCCION

EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA

La presin osmtica describa la tendencia del agua a moverse en la direccin que tienda a igualar las concentraciones de agua en todos los sistemas. El cambio en la presin osmtica que de continua amenaza la existencia de los microorganismos en su medio ambiente. Cuando la concentracin de los solutos en la realizacin a los solutos dentro del organismo, se establece un equilibrio y se dice que el sistema en Isotnico. Un sistema que cause el enjuntamiento del citoplasma como resultado de la prdida de agua hacia el exterior de la clula se llama HIPERTNICO. Si la concentracin de agua es menor en el interior de la clula que en el exterior, este tendr que fluir hacia el interior, este sistema se llama HIPOTNICO.

MATERIAL
A) Tubos de Ensayo con medio de cultivo (Caldo nutritivo). Ajustados a concentraciones de Glucosa a 0.0%, 5.0%, 10.0%, 20.0%, 50.0%. Dos tubos de cada concentracin. B) Tubos de Ensayo con medio de cultivo (Caldo extracto de malta). Ajustados a concentraciones de glucosa a 0.0%, 5.0%, 10.0%, 20.0%, 50.0%. Dos tubos de cada concentracin. C) Cultivos de Escherichia Coli y Staphylococus Aereus. D) Asa bacteriolgica. E) Mechero. F) Etiquetas.

PROCEDIMIENTO
A) Inocular dos tubos de caldo nutritivo de diferentes concentraciones de Glucosa con E. Coli, otros con Staphylococus Aereus. B) Inocular dos tubos de caldo Extracto de Malta con diferentes concentraciones de glucosa con E. Coli y otros con Staphylococus Aereus. C) Incubar a 351 por 24-48 hrs. D) Anote resultados.

RESULTADOS
A) POSITIVO: Crecimiento de microorganismos. B) NEGATIVO: No hay crecimiento.
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REACTIVOS UTILIZADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (Caldo nutritivo). Este producto en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Despus de disolver, ajustar a las diferentes concentraciones de glucosa. Verter 5 ml en cada tubo. Esterilizar a 121 por 15 minutos. B) MEDIO DE CULTIVO (Caldo extracto de malta). Este producto existen en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Ajustar a las diferentes concentraciones de glucosa. Verter 5 ml en cada tubo de cada concentracin. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.

PRECAUCIONES
Para obtener buenos resultados de esta prueba, tenga en cuenta: A) No debe obtener resultados antes de las 25 hrs. de incubacin. B) Si sus resultados son negativos despus de 48 horas, incubar hasta por 5 das ms.

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29.

ACCION BACTERIOSTATICA DE LOS COLORANTES

INTRODUCCION
Varios de los colorantes empleados para teir microorganismos tienen poder antisptico. Estos colorantes son de gran utilidad para ajustar las condiciones los medios bacteriolgicos de tal manera que supriman el crecimiento de ciertas especies. Un colorante que se usa mucho con este propsito en el cristal violeta. A concentraciones relativamente altas, este colorante inhibe las bacterias gram-positivas y las gram-negativas. Al recibir las concentraciones, la accin del colorante se vuelve selectiva en cuanto que inhibe las bacterias gram-postivas, pero no las gram-negativas. Si las concentraciones se reducen todava ms, alcanza un nivel tolerable para ambos tipos de bacterias. Debido a su gran actividad contra los microorganismos, el cristal violeta es un antisptico til en caso de infeccin causada por organismos grampositivos.

MATERIAL
A) Cajas de Petri con medio de cultivo (Agar nutritivo) (9). B) Soluciones acuosas estriles de cristal violeta a las siguientes concentraciones: a) 1:1 b) 1:1000 c) 1:2000 C) Cultivos de Escherichia Coli, Bacillus Subtilis, Staphylococus Aereus. D) Discos de papel filtro de 0.5 cm. de dimetro estriles. E) asa bacteriolgica. F) Mechero. G) Etiquetas.

PROCEDIMIENTO
A) Inocule tres cajas de petri con Escherichia Coli, otras tres con Bacillus Subtilis y otras tres con Staphylococus Aereus. B) Tome un disco de papel filtro estril con las pinzas y sumerja ligeramente uno de sus bordes en uno de lso colorantes. Observe como el colorante asciende rpidamente por el papel filtro por accin capilar. Cuando el colorante haya ascendido dos tercios del disco, extrigalo, el colorante se esparcir hasta ocupar todo el disco. C) Una vez, el disco lleno de colorante, depostelo sobre el agar. D) Incube a 35 C por 24-48 hrs.

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REACTIVOS UTILIZADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO). Este producto en el comercio. Preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Despus de esterilizar. Verter de 15-18 ml en cada caja de Petri. B) CRISTAL VIOLETA 1:1 % Cristal violeta.............................................................1.0 gr. Agua destilada...........................................................10 ml. Disolver el colorante en el agua. Conservar en frasco mbar. C) CRISTAL 1:1000 % Cristal violeta.............................................................0.5 gr. Agua destilada...........................................................100 ml. Disolver el colorante en el agua, conservar en frasco mbar. D) CRISTAL VIOLETA 1:2000 % Cristal violeta.............................................................0.5 gr. Agua destilada...........................................................100 ml.

PRECAUCIONES
A) Asegrese de que el disco impregnado de colorante haga contacto con el medio e cultivo. B) Est seguro de haber inoculado en toda la superficie del medio. C) No tome el disco con los dedos.

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30. INTRODUCCION

EFECTO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA

Uno de los agentes fsicos que afectan el crecimiento de los microorganismos, es la energa radiante. aunque ciertas longitudes de ondas son benficas e incluso esenciales para algunas bacterias. Estas radiaciones pueden ser de muchas formas, tales como rayos X, rayos Beta, Rayos Gama y Luz ordianaria. Desde hace tiempo se conoce que ciertas longitudes de onda entre 2.6 y 2.7 A (Amstrong), es letal para clula en general, en particular para los microorganismos. Ciertos materiales celulares, particularmente los cidos nucleicos absorben estas radiaciones y aparentemente les causa daos irreversibles, si la intensidad y el tiempo de exposicin son suficientes. La radiacin ionizadora puede causar daos permanentes al material gentico de la clula. Las lmparas de luz ultravioleta tiene varias desventajas como agente esterilizante. Desde el punto de vista prctico, la exterminacin de bacterias son luz ultravioleta tiene usos muy limitados, puesto que son pocas kas situaciones en que las bacterias son vulnerables a este tipo de radiaciones. La capacidad exterminadora de esta luz tambin depende de la distancia de la fuente al organismo y del tiempo de exposicin. Generalmente es preciso que el organismo est razonablemente cerca de la fuente lumnica.

MATERIAL
A) B) C) D) E) F) Cajas de Petri con medio de cultivo (Agar nutritivo) (4). Cultivo de Escherichia Coli de 24 hrs. en caldo. lmpara de luz ultravioleta con longitud de onda de 2.65 A. Asa bacteriolgica. Mechero. Etiquetas.

PROCEDIMIENTO
A) Inocule cada caja de Petri con medio de cultivo con Escherichia Coli. B) Con las cajas destapadas exponga a la accin de la luz ultravioleta. 1. 10 segundos. 2. 60 segundos. 3. 30 segundos. 4. 5 minutos. C) Irradie cada caja por separado. D) Despus de la irradiacin coloque la tapa de la cha de Petri. E) Incubar a 35 C por 24-48 hrs. F) Anote sus resultados.

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RESULTADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO). Este producto existe en el comercio. Preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Esterilizar. Verter de 15-18 ml de agar en cada caja de Petri estril.

PRECAUCIONES
A) B) C) D) E) F) Procure no mirar directamente los rayos ultravioleta. Evite mirar los reflejos de la luz ultravioleta. No irradie los medios inoculados cuando la caja de Petri tenga colocada la tapa. No exponer a la luz visible durante e inmediatamente despus de la irradiacin. Despus de la irradiacin, envuelva las cajas en papel de estraza. Haga la irradiacin de preferencia en cmara oscura.

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31. INTRODUCCION

EFECTO DE LA TEMPERATURA

La temperatura es uno de los factores de ms importante influencia sobre todas las formas vitales. Las relaciones de la temperatura con el crecimiento son singulares complejas. De acuerdo con los requerimientos de temperaturas mnimas y mximas de las bacterias, se dividen en: A) MESFILAS, crecen entre los 10 - 45 C B) PSICROFILAS, crecen a 0 - 8 C C) TERMOFILAS, crecen a 50 - 72 C Las actividades metablicas de un organismo son resultados de reacciones qumicas, y como el desarrollo de estas reacciones est condicionada por la temperatura, los procesos vitales tambin se encuentran infludos por ella. La temperatura ptima de crecimiento para un organismo est en correlacin con la de su hbitat. Cuando se utiliza la temperatura para el control de los microorganismos, las temperaturas superiores a la mxima ejercen un efecto letal, mientras que las inferiores a la mnima se consideran, en general, ejercen un efecto esttico. Como el calor es uno de los agentes de esterilizacin ms eficaz y seguro, es el que se utiliza con ms frecuencia.

MATERIAL
A) B) C) D) E) Tubos con medio de cultivo (Caldo nutritivo) (36) Cultivos de Escherichia Coli, Bacillus Subtilis, Staphylococus Aereus. Mechero. Etiquetas. Asas bacteriolgicas.

PROCEDIMIENTO
A) inocule 12 tubos con medio de cultivo con Escherichia Coli, otros 12 con B. Subtilis y otros 12 con Staphylococus Aereus. B) Incubar por pares a las temperaturas de 5, 10, 20, 35, 45 y 60 por 24-48 hrs. C) Anote sus resultados.

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REACTIVOS UTILIZADOS
A) MEDIO DE CULTIVO (AGAR NUTRITIVO. Este producto existe en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Verter 5 ml de medio en cada tubo de ensayo, esterilizar a 121 C, por 15 minutos.

ALTERNATIVA
A) MEDIO DE CULTIVO 1. Caldo Glucosado: Este producto se encuentra en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Verter 5 ml de medio en cada tubo de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. 2. Agar Nutritivo. Este producto existe en el comercio, preparar de acuerdo a las indicaciones del envase. Disolver. Verter 3 ml de medio en tubos de ensayo (13 x 100). esterilizar a 121 C por 15 minutos, dejar enfriar en forma inclinada.

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32. INTRODUCCION

IDENTIFICACION DE UNA BACTERIA

La taxonoma o ciencia de la clasificacin trata del arreglo ordenado de los seres vivos en grupos de acuerdo con sus semejanzas intrnsica. Los microorganismos se podran clasificar en un reino aparte PROTISTA- distinto del animal y del vegetal. En general, la mayor parte de los organismos que nos ocupan pertenecen al orden en bacteriales (Bacterias verdaderas). Conforme ms se familiarice con la taxonoma, ms claro le parecer el esquema general de clasificacin. El gran principio unificador subyacente a todas las ciencias biolgicas es el concepto de la Evolucin Orgnica. Este concepto relaciona entre s todos los seres vivos en un rbol filogentico. La doctrina evolutiva nos afirma que todas las formas de vida se originan de otras formas de vida preexistentes. Desde hace ya tiempo que los microbilogos se han visto forzados a establecer una clasificacin de tipo claves de donde, para diferenciar un grupo de organismos de otras, se emplean factores bioqumicos observables tanto como las diferencias morfolgicas. La taxonoma de los microorganismos es una clasificacin basada en varios tipos de anlisis qumicos y tinciones. En esta prctica hemos incluido versin modificada de algunas de las claves del manual de Bergeys. Por medio de estas claves puede usted identificar tentativamente los organismos que se le asignen. Estos cuadros constituyen una lista de todos los organismos que usted pudiera encontrarse. Al tratar de identificar una bacteria, el estudiante seguido se encuentra con la dificultad de decidir si se trata de un bacilo o de un coco, a menudo se desea consultar al instructor para verificar la morfologa o el resultado de un anlisis enzimtico. El siguiente experimento debe llevarse a cabo, por el estudiante de manera completamente idependiente, sin ser asistido por su instructor. Despus de que se le haya asignado su cultivo, proceda a identificarlo lo mejor posible.

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MATERIAL
A) Cultivo asignado para su identificacin. B) Medios de cultivos necesarios. C) Reactivos.
D) E) F) G) H) I) J) Colorantes. Tubos de ensayo Cajas de Petri. Asa Bacteriolgica. Mechero. Etiquetas. Pipetas.

PRECACUCIONES
A) B) C) D) E) F) Asegrese de tener un cultivo para la identificacin. Evite que se le contamine. Que los medios de cultivo estn preparados adecuadamente. Que los colorantes sean los especficos para cada tincin. Que los reactivos sean bien preparados. Establezca un patrn de trabajo, para trabajar diariamente.

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BIBLIOGRAFA
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