Bicarbonato eleva o pH do tumor e inibe Metstases espontnea Resumo O pH externo de tumores slidos cida como conseqncia da aumento do metabolismo

o de glicose e de m perfuso. PH cido tem sido mostrado para estimular a invaso de clulas tumorais e metstase in vitro e em clulas antes da injeo da veia da cauda in vivo. O presente estudo investiga se a inibio da Esta acidez tumor vai reduzir a incidncia de in vivo metstases. Aqui, ns mostramos que NaHCO3 oral seletivamente aumentou o pH de tumores e reduzir a formao de metstases espontnea em modelos do rato da mama metasttico cncer. Este regime de tratamento mostrou significativamente aumento do pH extracelular, mas no o pH intracelular, de tumores por espectroscopia de ressonncia 31P magntica e exportao de cido a partir de tumores de crescimento atravs de microscopia de fluorescncia de tumores cultivados em cmaras janela. terapia NaHCO3 tambm reduziu a taxa de comprometimento dos linfonodos, ainda no afetar os nveis de clulas tumorais circulantes, sugerindo que metstases rgo no foram reduzidas devido intravasation aumentado. Em contraste, a terapia NaHCO3 significativamente reduzido a formao de metstases hepticas seguintes intrasplenic injeo, sugerindo que ela inibiu o extravasamento e colonizao. Na veia da cauda de injees alternativos de cncer modelos, bicarbonato tiveram resultados mistos, inibindo a formao de metstase das clulas cancerosas da prstata PC3M, mas no os de melanoma B16. Embora o mecanismo deste terapia no conhecido com certeza, baixo pH mostrou-

aumentar a liberao de ativos catepsina B, uma importante matriz remodelao da protease. [Cancer Res 2009; 69 (6) :2260-8] Introduo O pH extracelular (phe) dos tumores malignos slidos cida, em o intervalo de 6,5 a 6,9, enquanto que o fenmeno dos tecidos normais significativamente mais alcalino, 7,2-7,5 (1-3). Os modelos matemticos de a interface tumor-hospedeiro (4) e medidas in vivo tm mostrado que o cido exportao tumores slidos no parnquima (5, 6). Anterior, em estudos in vitro demonstraram que a invaso das clulas tumorais pode ser estimulada por condies cidas e que isso pode envolver proteases lisossomais (7-9). Estas observaes levaram ''Hiptese de invaso mediada pelo cido'', onde o cido tumor derivado facilita a invaso do tumor, promovendo a morte das clulas normais e degradao da matriz extracelular do restante do parnquima tumores de crescimento. Alm disso, o pr-tratamento das clulas tumorais com antes da injeo de cido leva ao aumento da metstase experimental (10, 11), e estas observaes sugerem que o baixo pH at regulavias proinvasive e sobrevivncia. Tem sido argumentado que cancros com metstases so selecionados por sua capacidade de exportao de cido (12). O cido um subproduto do metabolismo da glicose, e, nomeadamente, elevado consumo de fluorodeoxyglucose por mais agressivo cncer tem sido observado com psitrons fluorodeoxyglucose A tomografia por emisso (13). O presente trabalho testa a hiptese de que a neutralizao do cido pH de tumores ir inibir a invaso e, conseqentemente, reduzir o incidncia de metstases espontneas. PH cido foi inibida

usando NaHCO3 oral, que tem sido mostrado previamente para efetivamente reverter gradientes de pH em tumores e no afetar o pHe de tecidos normais (14). Isto foi confirmado na atual estudo utilizando espectroscopia por ressonncia 31P magntica (MRS) e imagens de fluorescncia proporo de SNARF-1 em um dorsal da prega de pele janela da cmara. Notavelmente, o bicarbonato no afetou a sistemtica pH ou a taxa de crescimento dos tumores primrios, mas teve significativa efeitos sobre a formao de metstases espontneas. Em dois dos trs experimentos, a terapia NaHCO3 diminuiu a colonizao da linfonodos, mas em nenhum experimento fez afetar significativamente a nveis circulantes de clulas tumorais. Os resultados linftica, no obstante, Estes resultados indicam que a inibio do extremidade-rgo metstase no ocorre por uma reduo da intravasation. Em contrapartida, a formao de metstases hepticas seguintes intrasplenic injeo do MDA-MB-231 clulas foi significativamente reduzida, indicando que o rgo final de colonizao de stios metastticos foi afetada pela terapia NaHCO3. Da mesma forma, as metstases seguintes cauda injeo venosa de clulas cancerosas PC3Mpros Tate tambm foram inibidas pelo tratamento com bicarbonato, mas os de melanoma B16 no eram. As investigaes preliminares em possveis mecanismos mostrou que a liberao de catepsina B ativa no espao pericelular foi um aumento significativo de condies cidas, e, portanto, NaHCO3 terapia pode estar agindo para inibir a liberao desta importante protease remodelamento da matriz. Materiais e Mtodos Animais. Todos os animais foram mantidos sob cuidado animal

Use e aprovado pelo Comit de protocolos em ambos da Universidade do Arizona ou H. Lee Moffitt Cncer Center. Seis a oito semanas de idade grave imunodeficincia combinada (SCID) ratos foram usados como hospedeiros de MDA-MB231 tumores, 6 semanas de idade camundongos machos SCID bege para as RUP PC3Mtum, e nu / nu camundongos para B16 tumores. B-Galactosidase colorao. Colhida tecido pulmonar foi cortado em 1 mm sees e colocados em PBS contendo 2 mmol / L de MgCl2 (Mg-PBS) no gelo. Os cortes foram fixados em glutaraldedo 0,5% em PBS-Mg no gelo por 30 minutos e posteriormente lavados em PBS para remover o fixador residual. sees fixas foram incubadas por 3 horas a 37jC em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-hDgalactopyranoside tampo de reao (35 mmol / L de potssio ferrocianeto, 2 mmol / L de MgCl2, 0,02 NP40% e 0,01% de desoxicolato de sdio em PBS). Depois incubao, os cortes de tecidos foram lavados e armazenados em PBS. Sees foram analisados usando um Stereomaster 4? microscpio de disseco (Fisher Cientfico), com cmera montada DC290 ZOOMdigital (Eastman Kodak Company). As imagens foram capturadas no mesmo plano focal com uma exposio tempo de 1 / 10 s para a iluminao de luz branca. h-Galactosidase leses positiva foram medidos e contados manualmente por um observador cego. Intrasplenic injees. MDA-MB-231 clulas (5? 105) expressando uma luciferase do firefly termoestvel (15) foram injetados no bao de SCID camundongos. Trs postinjection dias, os ratos foram randomizados em bicarbonato e terapias de controle. Vinte e cinco dias postinjection, bao e fgado foram

coletados e colocados em branco, com fundo claro, placas estreis de 12 bem microtitulao. Luciferase imagens foram adquiridas usando uma 1300B VersArray refrigerao chargecoupled cmera do dispositivo (Roper Scientific), com exposies de 10 min, f 2.2. Imagem dados foram analisados com ImageJ. Depois da aquisio da imagem, bao e fgado foram homogeneizadas em tampo de homogeneizao (Promega), com cinco passes em Dounce um homogeneizador, seguido pela adio de um volume de tampo de lise celular (Promega). Homogeneizados foram misturadas 1:1 com soluo de luciferase (Promega) e emisso de luz foi determinada usando um Victor3 Wallac (Perkin-Elmer) leitor de placa de microtitulao (16). Intravasation. A primeira etapa da propagao metasttica envolve o movimento de clulas de cncer a partir do site principal para a corrente sangunea (intravasation) directa ou indirectamente, atravs dos vasos linfticos (17). Medio da MDA-MB-231/eGFP clulas no sangue de ratos portadores de tumores SCID foi determinada por trs mtodos em dois experimentos separados. Em um experimento (113.007), (n = 3) no tratados e 200 mmol / L bicarbonato animais tratados (n = 7), tendo os tumores primrios foram sacrificados aps 36 d do crescimento do tumor. Neste ponto do tempo, os tumores primrios em mdia 463 F 33,5 mm3 de tamanho em dois grupos. O sangue foi extrado por puno cardaca em tubos de microcentrfuga e misturada com igual volume de 100 mmol / L de EDTA

para prevenir a coagulao. Um volume de sangue de 10 AL foi distendido em lminas de vidro e secas. clulas de Green-fluorescentes foram contados manualmente, sob uma microscpio de fluorescncia em? ampliao de 40. clulas nucleadas do volume de sangue restante (f300 AL) foram obtidos por centrifugao com Histopaque (Sigma), e as clulas resultantes foram ressuspendidos em placas de 96 poos em 100 AL de PBS e medidas em uma Victor3 com comprimento de onda de excitao em 485 nm e emisso a 535 nm. Em outro experimento (011.508), o sangue foi extrado por puno cardaca de ratos no tratados e tratados com bicarbonato (N = 8 cada) pelos mesmos mtodos acima. O tamanho mdio do tumor foi de 121,8 F 16,4 mm3. Hemcias foram lisadas com separao de clulas ativadas por fluorescncia de lise soluo (BD Cincias) de acordo com as instrues do fabricante. Clulas foram marcadas com anti-SUD-751 corante de cido nuclico e analisados pelo fluxo citometria de um FACScan (BD Biosciences) com um laser de argnio 488nm. LDS751 a 670 nm, emite a excitao a 488 nm e detectvel com a 3 detector de fluorescncia. A fluorescncia inespecfica foi diferenciado a protena verde fluorescente (GFP) de sinal pela passagem da luz celulares propriedades de espalhamento e LDS-751. Dorsal cmara janela de dobras cutneas. Tumor construes foram projetadas usando o mtodo da gota tumor. MDA-MB-231 clulas foram suspensas em 2,5 mg / mL colgeno tipo I (BD Biosciences) e 1? DMEM em uma final concentrao de 1? 106-2,5? 106 clulas / mL. Usando um 48-bem no tissuecultured

placa, uma queda de 15-AL da suspenso de clulas tumorais foi polimerizado no centro do poo. Aps a polimerizao breve (f1-2 min) em 37jC na incubadora, 200 mL dos meios de comunicao [DMEM com 10% fetal bovino soro (FBS)] foram adicionados aos poos e as gotas ficaram at o Alm da mistura do estroma. A mistura do estroma consistia de 3 mg / mL tipo I colgeno, um? DMEM e f12, 000 a 15 mil fragmentos de microvasos / mL. Normalmente, quando fragmentos de microvasos esto diretamente reconstitudos com o tipo I colgeno, passam a angiognese espontnea por trs dias ou quatro dias in vitro e na sequncia anastamose implante, com a vasculatura do paciente e de forma uma rede vascular (dia 07/04 na cmara de janela). Aps 2 d em cultura, estas construes foram retirados com uma pina e colocados diretamente na janela da cmara. Porque os tumores eram relativamente circular, o crescimento foi analisada ao longo os dimetros horizontal e vertical. Na ampliao da imagem, cada pixel igual a F25 Am. A mdia dos ngulos horizontais e verticais dimetro foi utilizado para declarar o dimetro do tumor no momento da imagem. densidade do tumor foi estimado com base na homogeneidade da intensidade de nvel de cinza na regio do tumor de interesse. Esta densidade tumoral estimado foi calculado por primeiro o nvel de cinza de co-ocorrncia da matriz da regio do tumor. Usando as estatsticas de nvel de cinza gerada pelo nvel de cinza de coocorrncia matriz, a homogeneidade da intensidade de nvel de cinza foi calculado, uma mtrica

reflexivo da probabilidade de pixels vizinhos so a mesma intensidade. A valor maior homogeneidade era sugestivo de um tumor denso, porque o intensidades que variam de menos de pixel a pixel em regies de alta celularidade. Catepsina-B actividade. medies catepsina-B foram realizadas em um ''Tempo real''ensaio, como descrito por Linebaugh e colegas (18). Resumidamente, as clulas foram expostos a um substrato fluorogenic (Z-Arg-Arg-NHMec) em um fechado sistema que monitorava a taxa de fluorescentes produto (NH2Mec) formao. MDA-MB-231 clulas cultivadas em lamnulas de 60% a 80% de confluncia, lavadas com NaCl Dulbecco / Pi, e equilibrado em tampo de ensaio sem substrato na 37jC por 5 min. As medies consistiram de: (a) uma base de fluorescncia para o tampo de ensaio contendo 100 Amol / L de substrato Z-Arg-Arg-NHMec para 5 min, (b) a taxa de formao de produtos fluorescentes, devido introduo seguido de clulas mais de 10 min, (c) a taxa de formao do produto fluorescente aps a retirada de clulas da clula seguidos durante 10 min e (d) taxa de formao de produto fluorescente quando as clulas so colocadas de volta na clula membrana celular e permeabilizadas por adio de 0,1% (v / v) de Triton X100. atividade da catepsina-B foi medida aps o equilbrio das clulas em meio contendo 25 mmol / L tubos em pH 6,8 e 7,4 para 3 d, seguido por uma noite incubao em FBS 0,2% no respectivo pH. Um inibidor da catepsina-B, CA074, foi adicionada a uma concentrao final de 10 Amol / L para confirmar que o atividade medida deveu-se a catepsina B (19). As medidas foram

registrados em um Shimadzu RF-450 espectrofluormetro, com excitao em 380 nm e emisso a 460 nm, equipado com uma temperatura controlada suporte da cuveta, microstirrer, e um DR-3 registador de dados. Depois que os dados aquisio, o contedo de DNA em cada lamnula foi determinada por medio de fluorescncia utilizando SYBR Green I do cido nuclico mancha (Molecular Sondas) em uma microplaca de excitao de 485 nm e emisso 535 nm. As concentraes foram calculadas com base no padro de DNA de esperma de salmo curva. A taxa de formao do produto foi expressa por picomoles minuto por micrograma de DNA. Estatstica. Todos os clculos estatsticos foram determinados utilizando o recurso em anlise Prism verso 4.03 para Windows (GraphPad Software) ou Microsoft Excel. Para comparar os dois meios, a significncia estatstica foi determinada por testes de Student no pareado, unicaudal t assumindo igual varincia. Se as variaes foram significativamente diferentes (P <0,0001), Welch Correo para varincias desiguais foi aplicado. Um teste de log-rank foi aplicado os dados de sobrevivncia. A Mann-Whitney-Wilcoxon rank-sum foi usado para comparar grupos independentes, cujos dados foram ordinal, mas no intervalscaled. Resultados e Discusso Nos experimentos iniciais, metasttica MDA-MB-231 adenocarcinoma clulas foram injetadas ortotopicamente bolsas de gordura mamria de mulheres imunodeprimidos (SCID) camundongos. Seis dias aps a injeo, os ratos foram randomizados em dois grupos: um (controle) foi realizada com

gua potvel e os outros (bicarbonato) foi realizada com 200 mmol / L ad libitum NaHCO3, que continuou durante todo o perodo do experimento. terapia bicarbonato teve qualquer efeito sobre a os pesos dos animais ou das taxas de crescimento dos tumores primrios. A ausncia de efeitos sobre o peso dos animais (P = 0,98) mostrado na Fig. Complementar. S1A, e esses dados foram interpretados de indicam que esta terapia no levar desidratao, pois desidratao rapidamente leva perda de peso significativa experimental camundongos. camundongos tratados com bicarbonato bebeu, em mdia, 4,2 F 0,2 mL de gua por dia, enquanto os ratos do controle consumiu 3,3 F 0,1 mL / d. A ingesto diria de bicarbonato foi calculado para ser 36 F 1,7 mmol / kg / d (9,4 g/m2/d). Uma dose equivalente em um ser humano de 70 kg seria de 12,5 g / d (20). A falta de um efeito sobre o crescimento da tumores primrios (P = 0,80) mostrado na Fig. Complementar. S1B para D. Apesar de bicarbonato efetivamente aumentou o fenmeno dessas tumores grandes, no afetou o pH intracelular (pHi), como medido pela MRS (veja abaixo), e este pode ser refletido na falta de um efeito sobre as taxas de crescimento (21, 22). Apesar da falta de um efeito sobre o crescimento do tumor primrio, bicarbonato terapia levou a redues significativas no nmero e tamanho dos metstases para pulmo, intestino, diafragma e. Figura 1A e B mostra o tamanho eo nmero de horas-galactosidase expressando metstases pulmonares espontnea aps 30 e 60 dias da primria o crescimento do tumor, respectivamente. No experimento de 30 dias, dados agrupados (N = 12 animais por grupo) mostraram que os ratos tratados com bicarbonato tinha um total de 147 leses de pulmo metasttico, enquanto o controle

grupo tinha 326 leses pulmonares (P = 0,03). A mdia do dimetro da leso (F SE) foram de 4,5 e 5,2 F 0,12 F 0,14 milmetros na NaHCO3 e grupos de controle, respectivamente (P <0,0001). No experimento de 60 dias (N = 20 e 15 para o controle e NaHCO3 grupos, respectivamente), a nmero de pixels associados com leses> 60 Am de dimetro foram marcado. O nmero mdio de pixels leso por animal no controle e grupos de NaHCO3 foram 382 e 74, respectivamente (P = 0,0004). Nenhum dos animais tratados com NaHCO3 tinha mais de 240 pixels leso por animal, enquanto que 10 dos 20 animais do grupo controle teve mais de 240 pixels leso. Ambos os experimentos mostraram leses dramaticamente menos no grupo tratado com o bicarbonato de nos animais controle. Esta reduo de metstases tambm levou ao aumento da sobrevida. Figura 1C mostra a curva de sobrevida de Kaplan-Meier, o que mostra que terapia bicarbonato de aumento da sobrevida (log-rank, P = 0,027). Como mostrado na figura. 2, na necropsia, o grupo de controle contidas leses pulmonares significativos e notveis fluorescente, enquanto que o grupo do bicarbonato apresentou fluorescncia, pouca ou nenhuma (ranksum Wilcoxon teste, P = 0,0015). Estes dados foram quantificados para os outros stios metastticos em todos os animais e mostraram redues na freqncia e densidade de fluorescncia em vsceras (intestino, pncreas, fgado, bao, bexiga e fgado) e metstases mesentrica na grupos tratados com bicarbonato (Fig. 3A). Estes dados so notveis na medida em que o efeito da terapia bicarbonato foi maior do que em qualquer um dos os experimentos anteriores, no entanto, as idades medianas de sacrifcio > 100 dias para ambos os grupos controle e bicarbonato (ie,

significativamente maior do que qualquer uma das experincias anteriores). Embora tenha sido mostrado previamente que NaHCO3 oral crnica pode levar reverso da acidose tumor (14), o que foi confirmado aqui para o modelo de tumor MDA-MB-231 usando TMS 31P de portadores de tumor animais aps 3 semanas de tratamento (4 postinoculation semanas). pHi foi medido com a freqncia de ressonncia de fosfato inorgnico, e pHe foi medido com o indicador de pH exgena 3-aminopropylphosphonate (23, 24). espectros 31P de NaHCO3-tratados Os tumores apresentaram mudanas significativas na frequncia de ressonncia 3-aminopropylphosphonate, com pouca ou nenhuma mudana na freqncia de fosfato inorgnico (Fig. 4). pHe valores mdios foram de 7,4 F 0,06 nos tumores NaHCO3-tratado, em comparao com o pH 7,0 F 0,11 em condies controle (Fig. 4, insero). Notavelmente, o pHi de tumores no foi afetada, sendo 7,0 e 7,1 F 0,06 F 0,09 em condies de tratamento e controle, respectivamente (Figura 4, insero). O pHi e pHe tambm foram medidos em tecidos nontumor no mesmo animais (por exemplo, msculos dos membros posteriores) com a observao de que o pHi e FE foram afetados pelo bicarbonato, sendo 0,04 e 7,22 F 7,40 F 0,08, respectivamente, em ambos os grupos (dados no mostrados), que foi consistente com os resultados anteriores (14). Apesar dos efeitos significativos sobre a formao de metstases e pHe tumor, a terapia bicarbonato crnicas no teve nenhum efeito sobre o sangue qumicas, indicando que o pH sistmico foi totalmente compensada destes animais (Quadro Complementar S1). Assim, como esperado, devido

a cronicidade do tratamento, NaHCO3 no levar a sistmica alcalose metablica. Pelo contrrio, ns supor que a inibio de metstase do tumor foi devido ao aumento de bicarbonato ''Buffer''de lquido intersticial, quer do ensino primrio ou tumores metastticos. Assim, os nveis de bicarbonato de tumores foram aumentada para ser coerente com o resto do corpo, levando a uma aumento seletivo de pHe tumor. Este efeito foi modelado utilizando a modelagem cintica de reao de difuso (25) e mostrou que (a) em face de uma elevada carga cida a partir de clulas tumorais hipermetablico, o efeito bicarbonato ser incompleta, mesmo a 200 mmol / L e (b) buffers alternativas com maiores valores de pKa deve ser mais eficaz. Coerente com essas previses, a dose-resposta experimentar com um ponto final de 30 dias mostrou que as concentraes de baixos como 50 mmol / L reduziu a incidncia de espontneas metstases, no entanto, o maior efeito foi observado na maior dose investigados, 200 mmol / L (Quadro Complementar S2), indicando que, mesmo com esta dose, o efeito incompleta. A falta de um efeito completo foi investigada pela inoculao de camundongos (N = 3 por grupo), tendo cmaras janela dorsal da prega de pele com GFP-transfectadas MDA-MB-231 clulas tumorais. Como ad libitum acima, 200 mmol / L NaHCO3 postinoculation foi iniciada seis dias. Aps 1 e 2 semanas de tratamento, o fenmeno foi medida por fluorescncia relao entre imagem SNARF-1, conforme descrito em Materiais e Mtodos (5). Imagens representativas GFP utilizados para a segmentao so mostradas na Fig. Complementar. S2. Estes foram usados para definir uma regio de interesse delinear o contorno do tumor, indicados pelo vermelho slido linha. O correspondente SNARF-1-relao derivados de imagens pHe

controle e animais tratados com bicarbonato so mostrados na fig. 5A e B, respectivamente. Note-se que pHe mais cida no controle tumores e que este acidez ultrapassa o limite do tumor, Considerando que as regies de cido pHe dos camundongos foram tratados com bicarbonato confinado dentro do volume do tumor. Os dados foram analisados ao longo coaxial linhas radiais extradas do centride do tumor (Fig. 5C) e os quadrados mnimos para todos os experimentos mostrado na figura. 5D, com o baricentro''0''and localizado na borda do tumor indicaram pela linha vertical. Tabela 1C mostra que, enquanto o intratumoral pHe no foi afetada significativamente no grupo do bicarbonato (P = 0,19), o fenmeno peritumoral, medido de 0,2 mm da borda do tumor, foi significativamente maior nos tratados com bicarbonato grupo de comparao com os controles (P = 0,05). Assim, tanto a fluorescncia e MRS apresentou maiores valores de tumor pHe na bicarbonatetreated grupos, embora o MRS mostrou um efeito maior. Estes aparentes diferenas podem ser devidas a diferentes preparaes, como a medio por duas tcnicas diferentes (MRS versus fluorescncia) em dois sistemas diferentes (ortotpico versus heterotpico) aps dois diferentes perodos de tratamento (21 versus 7 dias). Follow-up de imagens de cmaras de janela 7 dias depois mostrou que as alteraes nos dimetros tumorais no foram significativamente diferentes entre os grupos, mas que no foram significativas (P = 0,002) diferenas na densidade do tumor. Especificamente, as densidades aumentou com o tempo em que os tumores de controle e diminuio na tumores tratados com bicarbonato. Considerando a importncia destas observaes no claro, pode levar a uma aplicao prtica.

densidades de clulas do tumor pode ser medido no invasiva usando ressonncia magntica ponderada em difuso (26), e, portanto, esta modalidade de imagem pode ser til como um biomarcador quantitativa para os efeitos da terapia bicarbonato in vivo. Para comear a investigar o mecanismo do efeito do bicarbonato, experimentos foram projetados para se separarem os primeiros eventos (intravasation) de acontecimentos posteriores (extravasamento e colonizao), da espontnea metstase paradigma. metstases espontneas ocorrem via movimento das clulas do tumor do tumor primrio na corrente sangnea (intravasation), quer directamente, quer indirectamente atravs de os vasos linfticos. Em xenoenxertos, isso pode envolver a invaso local ativos ou um processo passivo de derramamento (27). Aps intravasation, o clulas tumorais circulantes apresentar e colonizar em locais distantes. No h alguma controvrsia se este ocorre atravs da simples apresentao circulantes de clulas tumorais em vasos pequenos (levando a isquemia local) ou se envolve a interao especfica de clulas tumorais circulantes com endotlio ps-capilar seguida de extravasamento (17, 28). Para investigar o efeito da terapia bicarbonato de intravasation, a incidncia de envolvimento linftico e circulao de tumor clulas foram quantificadas. O status linfonodal foi avaliado em SCID camundongos inoculados com expressando GFP-MDA-MB-231 clulas tumorais, que foram randomizados em grupo controle (n = 12) e bicarbonatetreated (N = 11) grupos. Os tumores primrios foram cultivadas por 40 dias (para volumes de 800-1000 mm3), momento em que os animais foram

ndulos linfticos e se sacrificaram e outros rgos examinados por fluorescncia de imagem. Para efeitos de pontuao, linfonodos foram caracterizados como''trao'', com um colnias fluorescentes poucos, ou ''Positivo'', onde o linfonodo inteiro estava inflamado. Exemplos destes so mostrados na Fig. Complementar. S3. Os camundongos foram marcados 0-6, conforme descrito na Tabela S3 Complementar, e estes anlises mostraram que a maioria tinha envolvimento linftico, com os dos animais tratados com NaHCO3 sendo menos desenvolvidos. A maioria dos animais tratados com NaHCO3 (9 de 12) tinha apenas traos de fluorescncia de ndulos linfticos, enquanto que 7 de 11 do controle grupo tinha fortemente linfonodos positivos e / ou metstases (P = 0,044, Mann-Whitney-Wilcoxon). Da mesma forma, o comprometimento dos linfonodos no estudo de sobrevida mostraram um efeito mais significativo sobre o desenvolvimento de metstases linfonodais a> 300 mm3 (log-rank P = 0,02). Como um teste adicional de intravasation, circulando clulas tumorais foram medidos no sangue de camundongos com tumores que expressam GFPpor contagem manual de manchas de sangue total, citometria de fluxo logo aps a hemlise dos eritrcitos, e fluorescncia primas de sangue extratos. Com os pontos finais, houve nmero reduzido de circulao clulas do tumor e nenhuma evidncia para sugerir diferenas entre bicarbonato de tratados e grupo controle (Tabela 1A). A partir destes dados, conclumos que, enquanto o bicarbonato pode ter um efeito sobre colonizao dos linfonodos, isso no conclusiva levar a um aumento do nmero de clulas circulantes do tumor, embora este concluso temperado pelo baixo nmero de circulao do tumor clulas em ambas as condies.

O efeito da terapia bicarbonato de extravasamento foi medido de duas formas. Como o cncer de mama geralmente metastatiza para o fgado, a incidncia de metstases hepticas 21 dias aps a injeco de 104 intrasplenic luciferase-expressar-MDAMB 231 clulas, foi utilizado como uma medida de extravasamento para este sistema (29). Tabela 1B mostra que os nveis luciferase em fgados de camundongos tratados com bicarbonato foram significativamente menores do que aqueles em controles, se expressa em conta-primas ou a normalizada esplnica valores luciferase. Assim, neste sistema de terapia, bicarbonato teve um efeito mais pronunciado sobre o processo de extravasamento e colonizao em comparao com intravasation. A generalidade desta fenmeno foi examinado em outros modelos de cncer atravs do monitoramento metstases aps injeo veia da cauda da luciferase-expressando PC3Mhuman clulas de cncer de prstata ou de clulas de melanoma B16 mouse. Fig. Complementar. S4 mostra imagens luciferase de ambos os sistemas que mostram uma clara diferena na in PC3Msyst e uma clara falta de um efeito no sistema de B16. A progresso de metstases em PC3Mis mostrado na Fig. Complementar. S5, com a diferena entre os grupos de bicarbonato e controles sendo significativo (P = 0,04) em 35 dias. Embora as diferenas no sistema de B16 no foram significativamente diferentes, os valores agrupados para o grupo de bicarbonato foram sistematicamente inferiores aos dos controles em todos os pontos do tempo (dados no mostrados). Tambm deve ser notado que os tumores B16 muito mais rpido crescimento, levando resciso do todos os animais em 17 dias, comparado com> 42 dias para o PC3M tumores. Assim, quer colonizar essas clulas em um pH-independente

moda ou as suas taxas de produo de cido simplesmente dominar o capacidade de bicarbonato de forma eficaz o buffer do pH (25). No entanto, Esses dados mostram que, pelo menos, dois cnceres humanos (MDAMB231 e PC3M), bicarbonato reduz a eficincia do tumor colonizao em locais distantes. Os efeitos de bicarbonato observada neste estudo pode ser exercido em qualquer primria ou metasttica no site, e estes so atualmente sob investigao. Por um lado, pode ser que o cido pH do tumor primrio induz uma resposta ao estresse em clulas, levando ao aumento da sobrevida. Isso seria coerente com observaes anteriores de Hill e Rofstad, que mostrou que pr-tratamento de clulas de melanoma, com pH cido antes da injeo leva para a sobrevivncia melhorada em stios metastticos (10, 11). Alternativamente, possvel que o tampo bicarbonato inibe a invaso no local o site metasttico. Esta tem sido formulado como a mediada pelo cido hiptese de invaso, onde o cido tumor derivado excretado no do parnquima, levando degradao da em torno da matriz extracelular (5). Se na primria ou metasttica no site, o pH cido parece estimular o comportamento invasivo e uma maior sobrevida, tanto pela seleo ou induo (7-9). PH cido foi mostrado para induzir a expresso ea atividade de uma srie de sistemas envolvidos no remodelamento da matriz. Estes incluem metaloproteinases de matriz tais como colagenase (MMP1) ou gelatinases (MMP-2 e MMP-9; refs. 8, 10, 30); proteases lisossomais como a catepsina B, D ou L (9, 31, 32), que podem resultar do volume de negcios lisossomal induzida por cido (7, 33) e hialuronidase eo receptor CD44 hyaluronan

(34-36). Alm disso, o baixo pH pode estimular a neoangiognese atravs da induo do fator de crescimento endotelial vascular ou interleucina-8 (10, 37-39), ou pode estimular a invaso simplesmente induzindo a apoptose em clulas do parnquima (40, 41), temos mostrado anteriormente (5), ao mesmo tempo, selecionando para as clulas tumorais que so resistentes a apoptose. Notavelmente, CD44 est associada a clulas-tronco do cncer de mama com propriedades semelhantes a clulas, e estes so conhecida por ser resistente apoptose induzida pelo ambiente (42, 43). Para comear a investigar a mirade de tcnicas moleculares possvel mecanismos, ns ensaiadas catepsina B (18) em MDAMB tratados com cido231 clulas, e observamos que a atividade desta protease secretado na mdia foi um aumento de at 4 vezes, sem efeito sobre as actividades associadas s clulas (Fig. 3B). Assim, parece que o pHe cido de tumores podem induzir a liberao deste protease que envolvidos no volume de negcios da matriz extracelular no cncer de mama (44). Experimentos esto em andamento para determinar se a terapia com bicarbonato ir inibir esta atividade in vivo. Concluses Os dados acima mostram que a terapia oral de bicarbonato reduziu significativamente a incidncia de metstases nos experimental modelos de cncer de mama e de prstata e que o efeito parece se principalmente na distal (ou seja, a colonizao), ou seja, ao invs de (proximal, intravasation), os processos. No se sabe se o bicarbonato exercendo seus efeitos, diminuindo a sobrevida das clulas tumorais circulantes

(Embora os nmeros no so afetados) ou inibindo colonizao no local metasttico. Aumenta significativamente em pHe reduziu a liberao de uma protease lisossomal catepsina B. Medicamente, a idia de tratamento do cncer atravs da po administrao de buffers atraente, mas amarrados a advertncias. Reao de difuso modelos mostram que o efeito do bicarbonato no gradiente pHe ser ser classificados com a dose e que, na dose de 200 mmol / L, no saturar. Isto traduz-se a dose para um consumo de F1.5 Amol / h / g do mouse todo. Em comparao, a taxa de produo de cido de tumores pode ser f100 Amol / h / g de peso do tumor (45). Assim, estas doses de NaHCO3 pode ser capaz de neutralizar a carga cida de um tumor de 15 mg, que se traduz em F105 clulas ou uma micrometstase 1 mm3. A efetividade do tratamento ser reduzida com tumores maiores (25). surpreendente que esse efeito incompleto tinha como um efeito dramtico sobre as metstases. Outra preocupao que bicarbonato, com um pKa de 6,24 eficaz, parece ser pouco adequado como um buffer alcalinizante, assim, possvel que melhor controle pHe e mais dramticos efeitos antimetastatic ser observado com um buffer maior pKa. No entanto, continua a ser possvel que este efeito pode ser especfica para buffers na bicarbonate/CO2 famlia atravs do envolvimento da atividade de anidrase carbnica, que importante na regulao do pH tumores (46). No obstante estas preocupaes, no entanto, o efeito dramtico da terapia bicarbonato de a formao de metstases do cncer de mama neste sistema modelo merece mais investigao. Divulgao de potencial conflito de interesse

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