Mtodos Cromatogrficos

Separacin e identificacin de compuestos orgnicos mediante HPLC (simulacin)

RESUMEN: Mediante el software hplcsimulator se realizan una serie de determinaciones cromatogrficas variando en las mismas la inmensa mayora de los factores que intervienen en el proceso cromatogrfico y analizando sus efectos en los resultados finales de los ejercicios propuestos. OBJETIVOS: Entender el fundamento de la HPLC (High Performance Liquid Cromatography), aprendiendo el manejo del programa de simulacin hplcsimulator, estudiando las diferentes variables que afectan la separacin cromatogrfica de compuestos mediante una tcnica de HPLC. INTRODUCCIN TERICA GENERAL La cromatografa es una metodologa que permite separar, identificar y/o analizar los componentes de mezclas complejas, que por otras tcnicas no podran resolverse. Dicha tcnica est basada en la diferente velocidad de migracin que adquieren los componentes de una mezcla al hacerlos pasar a travs de una fase estacionaria, que se fija a una columna o a una superficie slida, bajo la influencia de una fase mvil, con la que es inmiscible. Aquellos compuestos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil, mientras que los que se unen dbilmente se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente, mediante observacin y/o registro de datos, despus de que haya tenido lugar la separacin de los componentes de la mezcla. Existe un amplio grupo de tcnicas de separacin y la cromatografa puede ser preparatoria o analtica. A lo largo del desarrollo de la prctica, que consistir en la simulacin de distintas tcnicas cromatogrficas mediante el software hplcsimulator se irn aplicando, indistintamente, ciertos parmetros cromatogrficos fundamentales: Cromatograma Tiempo de retencin, tR. Tiempo muerto, tM o t0 Tiempo de retencin corregido o neto tR, es la diferencia entre los dos anteriores y mide el tiempo que el componente permanece en la fase estacionaria. Desviacin estndar, t. Altura media del pico en el punto de inflexin. Anchura de pico a la semialtura w05 (w1/2). Se define como 2345t. Anchura base del pico wb. Se define como 4t. Factor de capacidad, o factor de retencin k. Factor de selectividad, . Un sistema ser ms selectivo cuanto ms distintos sean sus tiempos de retencin. Segn esto, ha de ser mayor a 1; si = 1, no hay separacin. Nmero de platos tericos de la columna. Mide la capacidad de la columna para separar los componentes, no la retencin de los mismos. ( ) ( )

Eficacia de la columna. Viene dada por el nmero de platos tericos N: N = L/H. Resolucin, Rs de la columna. Constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Estudio de la composicin de la fase mvil, modo de separacin, resolucin y selectividad. a) Para ello se selecciona un grupo de 5 compuestos y se prepara una muestra de estndares con concentraciones 20 M. Se vara el porcentaje y el tipo de solvente orgnico, as como el modo de operacin (isocrtico, gradiente).

Qu ocurre con la resolucin? Conforme se incrementa la proporcin del solvente B, en modo isocrtico disminuye la resolucin de los picos. Qu ocurre con la retencin? En modo gradiente se consiguen mejores resoluciones a costa de un aumento de los tiempos de retencin.

Con metanol se consiguen malos resultados en ambos modos

Qu ocurre con el ensanchamiento del pico? El ensanchamiento de los picos aumenta con k como se puede observar en el grfico isocrtico, de manera que al aumentar la relacin de capacidad se hace ms difcil la resolucin y la deteccin. Propuesta de condiciones de separacin: Modo Gradiente. Agua/Acetonitrilo: 0 minutos 5% Acetonitrilo; 5 minutos 50% Acetonitrilo. Temperatura de columna 23 C. Volumen de inyeccin 5L; Flujo 3 mL/minuto. Columna 200 x 46 mm. Tamao de partcula 2.0 m.

b) Seleccionar un par de compuestos crticos (el par de menor resolucin). Cmo se puede mejorar la resolucin de dicho par? La resolucin de los picos puede mejorar aumentando la longitud de la columna. Qu factores afectan la selectividad? La selectividad se ve afectada principalmente por los tiempos de retencin: un sistema ser ms selectivo cuanto ms distintos sean sus tiempos de retencin. Depende de la naturaleza de las fases estacionarias y mviles y de la temperatura de operacin de la columna. c) Mantener un porcentaje fijo de solvente orgnico, cambiar tipo de solvente y observar el cambio de presin en las bombas. A qu se debe la diferencia entre solventes? Se produce una disminucin de la presin al usar acetonitrilo ya que la viscosidad de ste es menor. 2. Estudio de la temperatura de la columna, velocidad de flujo y volumen de inyeccin. a) Mantener las condiciones ptimas de separacin efectuadas anteriormente y modificar la temperatura de la columna. Qu sucede con el tiempo de anlisis? Va disminuyendo a costa de una prdida de resolucin. Qu sucede con la resolucin de los compuestos? Como se ha dicho, va disminuyendo. b) Mantener las condiciones ptimas de separacin y modificar la velocidad de flujo. Qu sucede con el tiempo de anlisis? Disminuye cuando aumenta la velocidad de flujo. Qu sucede con la resolucin de los compuestos? Disminuye progresivamente con el aumento de velocidad, producindose distorsiones importantes en las bandas.

c) Mantener las condiciones ptimas y modificar el volumen de inyeccin. Qu sucede con el tiempo de anlisis y la presin? No provoca cambios en ninguno de los dos parmetros. Qu sucede con la resolucin de los compuestos? A una carga excesiva de muestra se produce una deformacin de las bandas, por lo que se provoca una prdida de eficacia del sistema. 3. Influencia de la columna cromatogrfica (longitud y dimetro de la columna, tamao de partcula) a) Mantener las condiciones ptimas y modificar las dimensiones de la columna. Observar cada de presin, resolucin y tiempos de retencin. Cmo influye la longitud de la columna en la separacin cromatogrfica? Al aumentar mejora los picos aumentando su altura, aunque tambin aumenta el tiempo de retencin. Cmo influye el dimetro de la columna en la separacin cromatogrfica? El incremento del dimetro, disminuye rpida la resolucin y aumenta la distorsin de las bandas. b) Mantener las condiciones ptimas de separacin, unas dimensiones de columna adecuada y modificar el tamao de partcula. Observar las cadas de presin, la retencin (k) y el ancho del pico (Wb). Qu relacin existe ente el dimetro de partcula y la retencin? Los tiempos de retencin no varan al variar el tamao de partcula. Por qu aumenta la presin? Porque cuanto menores son las partculas de relleno mayor resistencia se opone al flujo de fase mvil, por lo que hay que trabajar con alta presin. Cmo influye el tamao de partcula en la separacin cromatogrfica? Para una fase estacionaria concreta, cuanto menor es el tamao de partcula mejor es la eficacia de la separacin ya que el soluto debe recorrer menores distancias para alcanzar el equilibrio. c) Mantener las condiciones ptimas de separacin, unas dimensiones de columna adecuadas y modificar los parmetros de la ecuacin de van Deemter. Cmo afecta a la separacin cromatogrfica cada uno de estos trminos? La variacin de A aumenta la base del pico. B afecta a , aumentando sta al aumentar B. C disminuye la resolucin y aumenta la distorsin Cul de los 3 ejerce mayor influencia en la resolucin de los picos y por qu? El efecto ms notorio es el de la variacin de C, porque el soluto requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases mvil y estacionaria, cuando el caudal es demasiado rpido no puede alcanzarse el equilibrio. EJERCICIOS: Simular la separacin cromatogrfica de los compuestos alcohol benclico y fenol, en un nivel de concentracin 20 M, (fijando las condiciones de trabajo que se reflejan en el texto base). a) Indicar el tiempo de retencin para cada compuesto. 18115 segundos para fenol y 18087 segundos para alcohol benclico. b) Modificar la composicin de la fase mvil manteniendo el modo isocrtico hasta conseguir una separacin completa de los dos compuestos. Indicar la nueva fase mvil y el tiempo de retencin de

cada uno de ellos. Adjuntar el cromatograma. 32% de metanol en isocrtico. 90692 segundos para fenol y 86928 segundos para alcohol benclico.

Utilizar acetonitrilo 95% como modificador, manteniendo el rgimen isocrtico. a) Indicar el rgimen de retencin de cada compuesto. 18028 segundos para fenol y 17988 segundos para alcohol benclico, cuatro veces ms rpido que con el uso de metanol. Acetonitrilo 72% 220.45 segundos para fenol y 211.26 segundos para alcohol benclico.

Comparar los resultados de las dos separaciones cromatogrficas obtenidas. Cul de las dos elegira para cuantificar estos dos compuestos en un laboratorio en el que se realizan un elevado

nmero de muestras al da? Justifique su respuesta. Se elegira el modo isocrtico con solventes Agua: Acetonitrilo al 72%, tanto por resolucin como por tiempo de retencin. Modifique la velocidad de flujo en ambas separaciones (aumente y disminuya). a) Comente las diferencias en la resolucin de los picos y en los tiempos de retencin, en caso de aumento y en caso de disminucin de la velocidad de flujo. Al aumentar el flujo a 4 mL/min en el modo Agua: Acetonitrilo al 72%, disminuyen considerablemente los tiempos de retencin a 55.11 y 52.82 segundos para fenol y alcohol benclico, respectivamente. No ocurre as con el metanol. b) Aumente la velocidad de flujo hasta un valor de 4 mL/min. Encuentre una composicin de fase mvil adecuada para conseguir una separacin adecuada de los analitos, empleando un modificador y otro. Con el 68% de acetonitrilo y una columna de 200 mm en un tiempo de retencin para ambos compuestos poco superior a 50 segundos y con buena resolucin de picos con un valor > 1. Simule la separacin analtica de los siguientes nueve compuestos: benzonitrilo, acetofenona, nitrobenceno, p-clorofenol, 3-fenilpropanol, anisol, metilbenzoato, bromobenceno y p-xileno, todos ellos a un nivel de concentracin de 10 M. Indique todas las condiciones ptimas de separacin y adjunte un cromatograma de la misma.

Modo Gradiente. Acetonitrilo (B) y Agua. 0 minutos 5% de B y 5 minutos hasta el final 95% de B. Temperatura 10 C. Volumen de inyeccin 10 L. Flujo 1.0 mL/minuto. Columna 200 mm x 46 mm. BIBLIOGRAFA: Gallego Pic A.; Garcinuo Martnez, R.; Morcillo Ortega, M. Experimentacin en Qumica Analtica. Uned. 2012. Yost, R.W. Ettre, L.S. Conlon, R.D. Introduccin a la Cromatografa Lquida Prctica. Perkin Elmer. 1981. Skoog, D.A. et. al. Principios de Anlisis Instrumental. 5 Ed. MacGraw Hill. ISBN 9788448127756.