MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS INSTITUTO DE BIOLOGIA CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS

Biotestes na Avaliao da Fitotoxicidade de Extratos Aquosos de Plantas Medicinais Nativas do Rio Grande do Sul

SRGIO ALESSANDRO MACHADO SOUZA

MONOGRAFIA DE CONCLUSO DE CURSO

Universidade Federal de Pelotas Campus Universitrio s/n Caixa-postal 354 CEP 96010-900 Pelotas RS Brasil SRGIO ALESSANDRO MACHADO S 2005

SRGIO ALESSANDRO MACHADO SOUZA

Biotestes na Avaliao da Fitotoxicidade de Extratos Aquosos de Plantas Medicinais Nativas do Rio Grande do Sul

Monografia apresentada como um dos prrequisitos ao grau de Bacharel em Cincias Biolgicas, nfase em Meio Ambiente do Curso de Cincias Biolgicas do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS.

ORIENTADOR: a a PROF Dr BEATRIZ HELENA GOMES ROCHA

Pelotas Rio Grande do Sul Julho de 2005

AGRADECIMENTOS

A minha me Juraci, que nunca mediu esforo e incentivo para que todos os meus anseios pudessem ser alcanados. A meu pai Izidoro, a minhas irms Catiscia e Juliana, pelo carinho e dedicao. A Universidade Federal de Pelotas e ao Curso de Cincias Biolgicas, por ter possibilitado a concluso do curso e tambm a realizao desse trabalho. A Professora Dra Beatriz Helena Gomes Rocha, pela ultra pacincia, carinho, dedicao e orientao nesse trabalho. A Professora Dra Vera Lucia Bobrowski, pela amizade, dedicao e principalmente na ajuda de vez em quando nas estatsticas. A Professora Rita Aloma Pascker Vianna, que foi o elo de ligao para chegada ao laboratrio de gentica. A Professora Clause Ftima de Brum Piana e a o Professor Joo Baptista da Silva, pelo empenho na anlise estatstica desse trabalho. A Vanessa Stein, pelo auxilio, ensinamentos da citogentica e pela grande amizade que foi construda nesses quatro anos. Aos colegas de laboratrio, Leticia, Gustavo, Laura, Daiane, Joo, e Alessandra, que proporcionaram momentos mpares nesse curto intervalo de tempo. Aos colegas de aula, Marcia, Miriam e Valeska, pela amizade e carinho ao longo da graduao. A Marcio Mariot, pela coleta e identificao correta das espcies vegetais. A lvaro Martins pelo auxlio na pratica laboratorial A todos aqueles que de uma forma ou de outra ajudaram na realizao e concluso desse trabalho.

NDICE LISTA DE FIGURAS........................................................................................................IV LISTA DE TABELAS.......................................................................................................VIII RESUMO.........................................................................................................................XII 1. INTRODUO...........................................................................................................1 2. REVISO BIBLIOGRFICA................................................................................................4 2.1. E NSAIOS PARA O MONITORAMENTO DE GENOTOXICIDADE ..................................................4 2.1.1. Teste de mutao e recombinao somtica (SMART)......................................5 2.1.2. Teste de troca de cromtides irms........................................................................7 2.1.3. Teste de Ames ensaio de mutao gnica reversa em Salmonella typhimurium teste Salmonella - microssoma ................................................................8 2.1.4. Teste de mutagnese e recombinognese em Saccharomyces cerevisae.....9 2.1.5. Teste de microncleos ............................................................................................11 2.1.6. Teste de aberraes cromossmicas...................................................................12 2.2. GERMINAO .....................................................................................................................14 2.2.1. Pureza das sementes..............................................................................................16 2.2.2. Vigor das sementes .................................................................................................16 2.2.2.1. ndice de velocidade de germinao (IVG) ..................................................17 2.2.2.2. Primeira contagem ...........................................................................................18 2.3. F ITOQUMICOS ....................................................................................................................18 2.4. A LELOPATIA ........................................................................................................................21 2.4.1. Alelopatia na agricultura .........................................................................................24 2.4.2. Alelopatia e plantas invasoras ...............................................................................25 2.4.3. Alelopatia de plantas lenhosas ..............................................................................26 2.5. E SPCIES MEDICINAIS ........................................................................................................27 3. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................................36 3.1. RECURSOS MATERIAIS ......................................................................................................36 3.2. MATERIAL BOTNICO..........................................................................................................36 3.3. E XTRATO BRUTO AQUOSO INFUSO (EBA)..................................................................37 3.4. B IOTESTES .........................................................................................................................37 3.5. NDICE MITTICO ................................................................................................................39 3.6. L IMPEZA DAS LMINAS .......................................................................................................40 3.7. C OLETA E FIXAO.............................................................................................................41 3.8. A NLISE ESTATSTICA ........................................................................................................41 4. RESULTADOS E DISCUSSO ...........................................................................................43 5. CONCLUSES...........................................................................................................70 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................................71 ANEXOS.......................................................................................................................................77

LISTA DE FIGURAS

Pgina Figura 1 . Inflorescncias de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.................... Figura 2 . Ramo com inflorescncias de Mikania glomerata Spreng................ Figura 3 . Ramo floral de Stevia rebaudiana Bert.............................................. Figura 4 . Bauhinia candicans Benth. Em estgio frtil..................................... Figura 5 . Detalhe dos ramos angulosos de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. Figura 6 . Detalhe dos ramos de Casearia sylvestris Sw................................. Figura 7 . Folhas e ramos florais de Luehea divaricata Mart. et. Zucc.............. Figura 8 . Detalhes da folhas de Lippia alba (Mill.) N.E.................................... 28 29 30 31 32 33 34 35

Figura 9. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM em sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Achyrocline satureioides (Lam.) DC......................................................................................................................... Figura 10. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis Germinao e IM para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.................................... Figura 11. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng..... 49 46 45

Figura 12. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis IVG e IM para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata 50

Spreng............................................................. Figura 13. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas, para a varivel ndice Mittico em diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng................................................................................. Figura 14. Clulas meristemticas de cebola, apresentando microncleos, tratadas com extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng na concentrao de 40mg/mL ..................................................................................................... Figura 15. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para a IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Stevia rebaudiana Bert.................................................................... Figura 16. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM em sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Bauhinia candicans Benth................................................................................................ Figura 17. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para a 55 53 51 51

varivel IM em sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Bauhinia candicans Benth.............................................. 56

Figura 18. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss....................................................................................... Figura 19. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para a 58

varivel IM em sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.................................... Figura 20. Clula meristemticas de cebola, apresentando ponte anafsica, na concentrao de 40mg/mL do extrato aquoso de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.(400x).................................................................................................. Figura 21. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, IVG e IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Casearia sylvestris Sw... Figura 22. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas, para a varivel ndice Mittico em diferentes concentraes do extrato aquoso de Casearia sylvestris Sw...................................................................................... Figura 23. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Luehea divaricata Mart. et. Zucc.................................................................................... Figura 24. Clulas meristemticas de alface e cebola tratadas com extrato aquoso de Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (40 mg/mL), apresentando cromossomos perdidos (a) e microncleo (b) .................................................. 64 63 61 61 59 59

Figura 25. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Lippia alba (Mill.) N.E.......................................................................................................... Figura 26. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, IVG e IM para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Lippia alba (Mill.) N.E..................................................................................................................... Figura 27. Clulas meristemticas de cebola tratadas com extrato aquoso de Lippia alba (Mill.) N.E.. (40 mg/mL), apresentando pontes anafsicas (a) e microncleos (b)............................................................................................. 69 68 67

LISTA DE TABELAS

Pgina Tabela 1. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de germinao) e IM (ndice mittico), relativos espcie medicinal Achyrocline satureioides (Lam.) DC.................................. Tabela 2. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de germinao), relativos espcie medicinal Mikania glomerata Spreng.............................................................................. Tabela 3. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis IVG e IM. relativos a espcie Stevia rebaudiana Bert.............................................................................................. Tabela 4. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, IVG e IM,para a espcie Bauhinia candicans Benth...... Tabela 5. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM. para a espcie Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.................................. Tabela 6. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao e IVG, para a espcie Casearia sylvestris Sw................................................... 60 57 54 52 48 44

Tabela 7. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, VG e IM, para a espcie Luehea divaricata Mart. et. Zucc....................................................... Tabela 8. Mdias das observaes, por espcie, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG e IM, para a espcie Lippia alba (Mill.) N.E............................................ Tabela A1 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 68 62

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal marcela, Achyrocline satureioides (Lam.) DC............................................................... Tabela A2 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 78

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal guaco, Mikania glomerata Spreng.............................................................................. Tabela A3 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 78

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal estvia, Stevia rebaudiana Bert.................................................................................. Tabela A4 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 79

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal pata de vaca, Bauhinia candicans Benth.............................................................................. 79

Tabela A5 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de

germinao) e

IM (ndice mittico), para a espcie medicinal espinheira 80

santa, Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss......................................................... Tabela A6 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal ch de bugre, Casearia sylvestris Sw................................................................................... Tabela A7 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 80

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal aoita cavalo, Luehea divaricata Mart. et. Zucc..................................................................... Tabela A8 . Anlise da variao e testes de significncia para as variveis Primeira contagem, Germinao, IVG (ndice de velocidade de 81

germinao) e IM (ndice mittico), para a espcie medicinal slvia, Lippia alba (Mill.) N.E................................................................................................ 81

RESUMO

A utilizao de ensaios biolgicos vegetais para o monitoramento da bioatividade de extratos, fraes e compostos isolados de plantas tm sido freqentemente incorporado identificao e monitoramento de substncias potencialmente txicas. Os compostos qumicos presentes nos vegetais, so utilizados na medicina popular para a cura de doenas, onde sua preparao e seu uso apropriado trazem muitos benefcios, porm seus efeitos genotxicos e mutagnicos necessitam de maiores investigaes Esse estudo teve como objetivo utilizar sementes de alface e de cebola como biotestes para avaliar o efeito fitocitotxico do extrato de plantas medicinais nativas do Rio Grande do Sul. Os biotestes foram conduzidos em germinador (20C), com extrato aquoso obtido por infuso de folhas secas nas concentraes de: 5, 10, 20 e 40 mg/mL e gua destilada (controle). Os testes de germinao, primeira contagem e ndice de velocidade de germinao (IVG), que avaliam efeito aleloptico, foram feitos com quatro repeties de 100 sementes/concentrao/bioteste. Para determinao da

citotoxicidade, atravs do ndice mittico (IM), foram contadas, pela tcnica de varredura, 2000 clulas/concentrao/bioteste. Foram realizadas contagens dirias para o ndice de velocidade de germinao (IVG), para o teste de primeira contagem aos quatro dias para a alface e aos seis dias para a cebola e para o teste de germinao ou germinabilidade aos sete dias para alface e ao 12 para a cebola, segundo as Regras para Anlises de Sementes (BRASIL, 1992). As sementes de alface e cebola so timos organismos para biotestes, pois so sensveis a alteraes externas, as sementes de alface se demonstraram mais sensveis ao efeito aleloptico

dos extratos aquosos das espcies analisadas, as sementes de cebola podem ser utilizadas como biotestes para monitorar o efeito de compostos derivados de cumarinas, taninos e terpenos, substncias essas presente em grande quantidade em guaco, espinhiera santa, aoita cavalo e slvia, respectivamente.

1. INTRODUO

Os organismos vivos esto freqentemente expostos a agentes ambientais que podem induzir modificaes qumicas tanto ao nvel celular quanto molecular. Essas leses podem ser induzidas por agentes qumicos, fsicos ou biolgicos que so prejudiciais s clulas, uma vez que afeta processos vitais como a duplicao e a transcrio gnica. As alteraes podem tambm causar mutaes e aberraes cromossmicas, fenmeno esse que podem levar a processos cancerosos e morte celular. Pelo fato de causarem leses no material gentico e potencialmente gerarem tumores em seres humanos, esses agentes so normalmente conhecidos como genotxicos (COSTA e MENK, 2000). A utilizao de ensaios biolgicos para o monitoramento da bioatividade de extratos, fraes e compostos qumicos isolados tem sido freqentemente incorporada

 identificao e monitoramento de substncias potencialmente txicas (NOLDIN et al., 2003). O desenvolvimento dos testes de citotoxicidade in vitro e seu reconhecimento pelos rgos internacionais como Food and Drug Administration, em 1993, e Organization for Economic Cooperation and Development, em 1987, tm favorecido a substituio dos ensaios que utilizam animais em laboratrios (HUGGET et al., 1996). De acordo com Silva et al. (2003), a maioria dos biotestes busca agentes que possam afetar aos nveis fisiolgico e molecular do organismo exposto e devido a universalidade do cdigo gentico, se o agente causar danos ao DNA, ele tm potencial genotxico em qualquer tipo de clulas (animal, vegetal ou de microrganismos). Ainda segundo o mesmo autor, vrios modelos foram propostos por diversos pesquisadores, rgos de pesquisa e agncias governamentais, e a seleo de testes a serem includos no modelo de fundamental importncia para o sucesso do mesmo, pois, neste contexto, cada vez mais so necessrios novos testes para serem enquadrados nas estratgias de avaliao de risco que atendam s necessidades da vida contempornea. A utilizao de plantas medicinais nativas no tratamento de enfermidades uma pratica exploratria e largamente difundida no Pas. A maioria das espcies tem sido utilizada de forma extrativista e o crescimento da populao humana e a ocupao de reas naturais vm aumentando a presso destrutiva sobre esta flora (ROSA e FERREIRA, 2001). De acordo com Rosa (2000), o progresso da fitoterapia e a obteno de fitofrmacos dependem do acesso facilitado a plantas produtoras e a inmeras substncias ativas que esto presentes.

A importncia das plantas medicinais deve-se a suacontribuio como fonte natural de frmacos e por proporcionar grandes chances de obter-se uma molcula prottipo devido diversidade de constituintes presentes nestas (YUNES et al., 2001). No entanto, inmeras plantas que so usadas em preparaes fitoterpicas carecem de um maior controle de qualidade, uma vez que a literatura cientfica indica que muitas destas podem apresentar substncias txicas ou composio qumica varivel (CAPASSO et al., 2000). Segundo Nunes e Arajo (2003), a utilizao de plantas na medicina popular uma prtica realizada h sculos para a cura de doenas, onde sua preparao e seu uso apropriado trazem muitos benefcios, porm, seus efeitos fisiolgicos, genotxicos e mutagnicos no organismo humano necessitam de maiores investigaes. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilidade de biotestes, sementes de alface (Lactuca sativa L.) e de cebola (Allium cepa L.), no monitoramento do efeito fitocitotxico de oito espcies medicinais nativas do Rio Grande do Sul, atravs do teste de primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM).

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Ensaios para o monitoramento de genotoxicidade

A deteco de substncias potencialmente citotxicas e genotxicas e seus provveis efeitos nos organismos importante no estudo do impacto que eles podem trazer s populaes animal, vegetal e humana. Uma boa alternativa no emprego de bioindicadores a utilizao de organismos fenotipicamente mais sensveis a leses no DNA e que expressem assim qualquer alterao externa a que so submetidos (COSTA e MENK, 2000).

Um bioindicador e um biomonitor podem ser mais valiosos se detectarem os agentes poluentes ou txicos em mais de um ambiente (aqutico, terrestre e atmosfrico). Alm disso, devem permitir a deteco de muitas classes de danos em diversos tipos de clulas. Muitos organismos so utilizados como bioindicadores por avaliarem possveis efeitos de riscos naturais ou de origem antropognica. Em ambientes aquticos, moluscos, organismos bentnicos, anfbios e peixes tm sido utilizados para o monitoramento de toxicidade de poluentes. Vegetais, como Trandescantia sp, Allium cepa e Vicia faba, tm sido empregados na avaliao de agentes potencialmente citotxicos presentes tanto na gua quanto na atmosfera (SILVA et al., 2003). Ainda segundo os mesmos autores, muitas vezes espcies selvagens so utilizadas como bioindicadores de risco ecolgico, enquanto que animais domsticos so mais teis para a avaliao do risco a sade humana, servindo todos esses como excelentes bioensaios. A verificao da citotoxicidade e da genotoxicidade de substncias avaliada por uma gama de bioensaios que so considerados mais ou menos sensveis, expressando. assim, resultados satisfatrios conforme o agente a que so expostos (SILVA et al., 2003).

2.1.1. Teste de mutao e recombinao somtica (SMART)

Mutao e recombinao mittica so mecanismos importantes que levam a perda da heterozigosidade. Estudos sobre os eventos genticos relacionados com o desenvolvimento de tumores, tais como, retinoblastoma, tumores de Wilm e outros,

demonstram a importncia da perda da heterozigosidade. Nestas doenas, a condio pr-existente de heterozigosidade perdida por eventos genticos que podem levar a clulas filhas homozigotas. Por esta razo, essencial um teste de genotoxicidade sensvel e capaz de detectar, simultaneamente, as mutaes, assim como rearranjo e recombinao mittica (GUZMN-RINCN e GRAF, 1995). O teste de SMART (Somatic mutation and recombination test), desenvolvido por Becker (1976) e aprimorado por Vogel (1987), detecta a perda de heterozigosidade de genes marcadores que determinam fentipos identificados nas asas de Drosophila melanogaster. um mtodo que utiliza clulas somticas e pode ser feito em uma s gerao, aproximadamente em 10 dias. Alm disso, pode ser utilizado para um amplo espectro de agentes genotxicos de diferentes classes qumicas, misturas complexas e tambm partculas gasosas (SILVA et al., 2003). O teste da mancha da asa (SMART) baseia-se em grupos de clulas, discos imaginais, que proliferam separadamente durante o desenvolvimento at

diferenciarem-se, durante a metamorfose, em estruturas do corpo da mosca adulta (olhos, asas, etc.). Uma vantagem desse mtodo possibilitar a exposio de uma grande populao de clulas dividindo-se mitoticamente no disco imaginal da larva. Dessa maneira, se uma alterao gentica ocorre em uma clula do disco imaginal, esta poder ser representada em todas as clulas descendentes e formar um clone de clulas mutantes, que pode ser detectado como uma mancha na superfcie do corpo da mosca (FREI e WRGLER, 1995). De acordo com Silva et al. (2003), o tamanho da manha est relacionado com o tempo de atuao da genotoxina ao longo da embriognese, indicando o momento da

induo do dano. Aumentos restritos a manchas simples pequenas podem indicar aneugnese ou clastognese.

2.1.2. Teste de troca de cromtides irms

Durante a diviso celular, segmentos de DNA resultantes da replicao trocam de lugar, simetricamente. A esses eventos de translocao recproca, que ocorrem no mesmo loco, entre as cromtides irms de um cromossomo, so denominadas SCEs (Sisrter Chromatid Exchange). A anlise de freqncia de trocas entre cromtides-irms uma metodologia citogentica bastante sensvel em estudos genotxicos. Este processo de permuta considerado indicador da ocorrncia de possveis leses e reparao da molcula de DNA em clulas de mamferos, pois quanto mais o nmero de permutas aumenta, tambm aumenta o nmero de possibilidade de erros nas reunies das cadeias de DNA. A proporo entre a induo de SCE e de mutao ou aberrao cromossmica diferente para cada agente qumico testado. Os agentes testados mostram diferentes eficincias de induo e cada tipo de leso formada parece ser processada diferentemente pela clula, resultando em um tipo especfico de dano. A correlao com outros tipos de danos no DNA cromossmico bastante elevada, havendo, no entanto, substncias ou processos onde esta correlao no foi detectada. A induo de SCEs pode ser feita tanto in vitro como in vivo em quaisquer organismos onde seja possvel fazer cultura de clulas. No cultivo celular, adicionam-se os marcadores que iro corar as cromtides-irms diferentemente, evidenciando as

trocas quando ocorrem. Os ensaios de SCEs so muito sensveis, mas trabalhosos; contudo, no podem ser considerados testes de mutagnese,mas apenas indicativo, pois as trocas de cromtides-irms no resultam necessariamente em mutao (SILVA et al., 2003). 2.1.3. Teste de Ames ensaio de mutao gnica reversa em Salmonella typhimurium teste Salmonella - microssoma

O teste de Ames foi desenvolvido por Bruce Ames e colaboradores na dcada de 70. Tem sido utilizado, mundialmente, nas ltimas dcadas para avaliar a mutagenicidade de substncias qumicas puras e misturas complexas (HENRIQUES et al., 1987; ROLLA, 1995) A maioria das linhagens bacterianas utilizadas no teste apresenta caractersticas que as tornam mais sensveis para deteco de mutaes, incluindo seqncias stioespecficas no DNA que respondem positivamente para reverso, aumento da permeabilidade celular a grandes molculas, ausncia do sistema de reparo de DNA livre de erro e plasmdios contendo genes que causam aumento do processo de reparo sujeito a erro. A especificidade das linhagens fornece informaes sobre os tipos de mutaes que so induzidas por agentes genotxicos. Existem bancos de dados disponveis contendo resultados do teste com Salmonella para uma grande variedade de compostos qumicos, medicamentos e misturas complexas (GRIFFITHS et al, 2002). Este teste de mutao gnica utiliza clulas procariticas, as quais diferem das clulas de mamferos em fatores como permeabilidade, metabolismo, estrutura dos cromossomos e processo de reparo do DNA. Os testes so realizados in vitro,

acrescidos de uma fonte exgena de metabolizao visando mimetizar parcialmente as condies de metabolizao de mamferos. O teste no fornece informao direta sobre a potncia mutagnica em mamferos, apesar da alta concordncia dos resultados com o teste de Ames e ensaios de carcinogenicidade com roedores (RABELO-GAY et al, 1991). O teste emprega linhagens de Salmonella typhimurium derivadas da parental LT2, auxotrficas para histidina (his-), apresentando diferentes mutaes no operon deste aminocido. Tais linhagens so construdas para detectar mutaes do tipo deslocamento do quadro de leitura ou substituio de pares de bases no DNA. Essas linhagens no so capazes de crescer em meio de cultura mnimo, sem histidina, a menos que ocorram mutaes que restaurem sua capacidade de sntese. Suspenses de clulas bacterianas so expostas amostra-teste, na presena e na ausncia de um sistema de ativao metablica exgeno, e plaqueadas em meio de cultura mnimo. O nmero de revertentes facilmente m edido pela contagem de colnias que crescem nesse meio de cultura aps a exposio de uma populao de bactrias amostra a ser testada (HENRIQUES et al., 1987).

2.1.4. Teste de mutagnese e recombinognese em Saccharomyces cerevisae

Esse teste tem por objetivo avaliar agentes qumicos e sua atividade mutagnica, utilizando como modelo Saccharomyces cerevisae, que um fungo unicelular, que apresenta um ciclo eucaritico tpico e completo. Os efeitos genticos de mutagnicos

podem ser avaliados em culturas haplides e diplides e em todos os estgios do ciclo celular como G1, sntese de DNA, mitose e meiose, assim como os elementos genticos extracelulares, como as mitocndrias. A recombinao mittica em clulas diplides pode ser reflexo da expresso das atividades de reparao celular em resposta aos danos introduzidos no genoma pelos agentes qumicos. Substncias que produzem mutaes freqentemente podem introduzir efeitos recombinantes (SILVA et al., 2003). O ensaio de converso gnica mittica na levedura mede a converso de alelos inativos diferenciais para cada alelo do tipo selvagem pela ao de agentes mutagnicos. A linhagem da levedura diplide heterozigota tem dois alelos inativos diferentes no mesmo locus gnico. A presena desses alelos causa uma dependncia nutricional, isto , essas clulas crescem somente em meio suplementado com nutriente especifico. Quando ocorre a converso do gene, um fentipo do tipo selvagem muito ativo produzido a partir desses alelos inativos atravs da recombinao intragnica. Para avaliar a induo de permutao mittica, as linhagens de leveduras diplides heterozigotas apresentam um par de marcadores recessivos, distantes entre si, mas localizados no mesmo brao cromossmico em diferentes homlogos e frente aos alelos selvagens correspondentes. O crossing-over resulta no posicionamento de ambos os alelos recessivos no mesmo cromossomo homlogo, enquanto que os alelos selvagens localizam-se no outro cromossomo homlogo (HENRIQUES et al., 1987). A levedura possui tambm um sistema endgeno de ativao metablica, constitudo pelo complexo enzimtico citocromo p-450, o qual a torna capaz de ativar vrios pr-mutagnicos sem necessidade de ativao de um sistema exgeno (SILVA et al., 2003).

2.1.5. Teste de microncleos

Microncleos

(MN)

so

pequenos

corpsculos

compostos

de

material

cromossmico. Aps a separao das cromtides no processo mittico, dois ncleos so reconstitudos, um em cada plo. A membrana nuclear refeita ao redor destes dois conjuntos cromossmicos. Mas se um cromossomo inteiro ou um fragmento cromossmico acntrico no se integra ao novo ncleo (por no ser unido ao fuso), este tambm pode ser considerado um microncleo. Os microncleos ento so, estruturalmente, pequenos ncleos representados por material gentico que foi perdido pelo ncleo principal como conseqncia de um dano gentico. Este dano pode ser causado por agentes qumicos, fsicos ou biolgicos, capazes de interferir no processo de ligao do cromossomo s fibras do fuso, ou que possam introduzir a perda de material gentico (cromossomos inteiros ou fragmentos). O teste de microncleo, portanto, detecta mutagnese cromossmica em eucariotos do tipo clastognese e danos ao fuso mittico (SILVA et al., 2003). O teste de MN em organismo sob exposio aguda, menos de quatro semanas, realizado em eritrcitos jovens, denominados policromatfitos (EPC) que por conterem RNA ribossomal se cora de forma diferenciada. Enquanto que na exposio crnica, os MN so avaliados tanto em EPC, como em eritrcitos maduros (ENC). A anlise por ser muito simples apresenta vantagem em relao a anlise dos cromossomos. Os microncleos podem ser identificados em qualquer tipo de clula.

Pode-se avaliar microncleos para diagnstico de doenas hematolgicas em clulas epiteliais da mucosa bucal, do trato urinrio, e tambm monitorar ambientes atravs de teste em roedores, plantas e peixes (SILVA et al., 2003). Em relao aos testes in vivo, os produtos a serem testados devem ser diludos, preferencialmente, em gua, pois um solvente no txico.

2.1.6. Teste de aberraes cromossmicas

A anlise de aberraes cromossmicas um teste de mutagenicidade para a deteco de alteraes estruturais. um dos poucos mtodos diretos para mensurar mutaes em sistemas expostos a mutagnicos ou carcinognicos potenciais. Para avaliar os efeitos danosos que os mutagnicos podem causar, necessrio que a amostra esteja em constante diviso mittica, pois dessa forma possvel analisar as etapas da diviso celular, com o objetivo de identificar os efeitos txicos e alteraes cromossmicas ao longo do processo de diviso celular. Este teste realizado em clulas meristemticas de Allium cepa (cebola), Vicia faba e Tradescantia. Tem sido amplamente empregado e usado rotineiramente para avaliar o potencial mutagnico de amostras ambientais (SILVA et al., 2003).

2.1.7. Teste cometa

O teste cometa ou SCGE (Single Cell Gel Eletrophoresis Assay) um teste de genotoxicidade capaz de detectar danos ao DNA induzidos por agentes alquilantes,

intercalantes e oxidantes. Este pode ser realizado tanto em animais como em vegetais, demonstrando a grande sensibilidade e rapidez dos resultados em estudos de genotoxicidade (SILVA et al., 2003). A metodologia do teste consiste, inicialmente, na disposio de uma suspenso de clulas submetidas em gel de agarose sobre a superfcie de uma lmina. Em seguida, as lminas so transferidas para uma soluo com alta concentrao de sais e detergentes afim de lisar as clulas, removendo o seu contedo citoplasmtico e membrana nuclear. Posteriormente, as lminas so imersas em um tampo de pH varivel de acordo com a verso do teste empregado: verso neutra, que detecta quebras duplas nas molculas de DNA, e verso alcalina, que detecta quebras de fita nica e dupla. Tal processo visa o desenovelamento das cadeias de DNA, pelo rompimento de estruturas secundrias e tercirias presente no ncleo. Imediatamente ao processo de desenovelamento, as lminas so submetidas a uma corrente eltrica de modo a induzir a migrao dos fragmentos de DNA no sentido da corrente eltrica (RIBEIRO, et al., 2003). O teste cometa simples e rpido, pode ser executado em qualquer eucarioto, mas como qualquer teste, possui as suas limitaes. No um teste de mutagnese, pois o dano pode ser reparado; por ser muito sensvel deve-se ter cautela, alm de um bom controle para anlise das concluses; e o tempo decorrido entre a exposio ao mutagnico e a preparao das lminas, at a lise, deve ser curto, em mdia 24 horas, pois o reparo comea imediatamente (SILVA et al., 2003).

2.2. Germinao

A germinao uma seqncia de eventos fisiolgicos influenciada por fatores externos (ambientais) e internos (dormncia, inibidores e promotores da germinao) s sementes; cada fator pode atuar por si ou em interao com os demais. A germinao um fenmeno biolgico que pode ser considerado pelos botnicos como a retomada do crescimento do embrio, com o subseqente rompimento do tegumento pela radcula (FERREIRA e BORGHETTI, 2004). Em sntese, tendo-se uma semente vivel em repouso, por quiescncia ou dormncia, quando so satisfeitas uma srie de condies externas (do ambiente) e internas (intrnsecas do indivduo), ocorrer o crescimento do embrio, o qual conduzir germinao. Por isso, do ponto de vista fisiolgico, germinar simplesmente sair do repouso e entrar em atividade metablica (VIEIRA e CARVALHO, 1994). Dentre os principais fatores que afetam a germinao pode-se citar: a luz, a temperatura, a disponibilidade de gua e o oxignio. Referente sensibilidade luminosa, existe uma ampla variao nas respostas germinativas. No incio do sculo XX, foi descoberto que a germinao de algumas espcies era inibida pela luz, enquanto que em outras a germinao era promovida (RAVEN, et al., 2001). Algumas sementes germinam somente com extensa exposio luz e outras com breve exposio, apesar de muitas se apresentarem indiferentes luminosidade. Certas sementes germinam somente no escuro e outras necessitam de um longo ou curto fotoperodo dirio. A germinao no est apenas relacionada com a presena ou ausncia de luz, mas tambm com a qualidade de luz. A qualidade de luz durante a

maturao da semente um importante fator controlador da germinao. Em geral, os fatores luz e temperatura no tm ao independente sobre a germinao de sementes (VIEIRA e CARVALHO, 1994). Assim, a temperatura exerce um importante papel na germinao de sementes fotossensveis (sensveis luz). Com relao temperatura, esta pode afetar as reaes bioqumicas que determinam todo o processo germinativo. As sementes apresentam capacidade germinativa em limites bem definidos de temperatura, varivel de espcie para espcie, que caracterizam sua distribuio geogrfica. No estudo dessa dependncia, de grande interesse ecofisiolgico a determinao das temperaturas mnima, tima e mxima. A temperatura tima pode ser aquela em que a maior germinao alcanada no menor tempo. As temperaturas extremas (abaixo e acima da temperatura tima) so aquelas onde as sementes no conseguem germinar mais. H espcies que respondem bem tanto temperatura constante como alternada. A alternncia de temperatura corresponde, provavelmente, a uma adaptao s flutuaes naturais do ambiente (POPINIGIS, 1977). Entre os fatores do ambiente, a gua o fator que mais influncia o processo de germinao. Com a absoro de gua, por embebio, ocorre a reidratao dos tecidos e, conseqentemente, a intensificao da respirao e de todas as outras atividades metablicas, que resultam com o fornecimento de energia e nutrientes necessrios para a retomada de crescimento por parte do eixo embrionrio (VIEIRA e CARVALHO, 1994). Por outro lado, o excesso de umidade, em geral, provoca decrscimo na germinao, visto que impede a penetrao do oxignio e reduz todo o processo metablico resultante. A velocidade de absoro de gua varia com a espcie, com o

nmero de poros distribudos sobre a superfcie do tegumento, disponibilidade de gua, temperatura, presso hidrosttica, rea e contato semente/gua, foras

intermoleculares, composio qumica e qualidade fisiolgica da semente. O movimento da gua para o interior da semente devido tanto ao processo de capilaridade quanto de difuso e ocorre no sentido do maior para o menor potencial hdrico. Assim sendo, a embebio essencialmente um processo fsico relacionado s caractersticas de permeabilidade do tegumento e das propriedades dos colides que constituem as sementes, cuja hidratao uma de suas primeiras conseqncias (FERREIRA e BORGHETTI, 2004).

2.2.1. Pureza das sementes

de extrema importncia avaliar a pureza das sementesSementes puras apresentam alta qualidade fsica e gentica. A pureza fsica implica na ausncia de impurezas tais como: palhas, folhas, sementes de plantas daninhas, sementes de outras culturas, etc. A pureza gentica implica que o lote de sementes contenha apenas sementes com caractersticas conhecidas da variedade ou cultivar em anlise (FERREIRA e BORGHETTI, 2004). 2.2.2. Vigor das sementes

Segundo a International Seed Testing Association (1992), o vigor de sementes a soma das propriedades que determinam o nvel potencial de atividade e desempenho

de uma semente ou de um lote de sementes durante a germinao e a emergncia da plntula. Os teste de vigor tambm podem ser expandidos para a avaliao de plntulas, sendo realizados em laboratrios em condies controladas ou em condies de campo (VIEIRA e CARVALHO, 1994). Os testes em laboratrio devem seguir as metodologias dos testes padro de germinao, ou seja, seguindo as Regras para Anlise de Sementes (BRASIL, 1992). J os testes em campo so conduzidos em condies naturais de ambiente, de preferncia em poca recomendada para a semeadura da espcie em avaliao, pois, assim obtm-se resultados diretamente aproveitveis para a implantao de cultura ou tem-se um bom indicativo para a potencialidade dos lotes em sua fase inicial de desenvolvimento em campo (FERREIRA e AQUILA, 2000).

2.2.2.1. ndice de velocidade de germinao (IVG)

A velocidade germinao um dos conceitos mais antigos de vigor de sementes (AOSA, 1983). Lotes de sementes com percentagens de germinao semelhantes, freqentemente mostram diferenas em suas velocidades de germinao, indicando que existem diferenas de vigor entre elas (VIEIRA e CARVALHO, 1994). Segundo os mesmos autores, as avaliaes das plntulas, so realizadas diariamente a mesma hora, a partir do dia em que surgem as primeiras normais. Essas plntulas normais so computadas e retiradas do substrato, para evitar alteraes no desenvolvimento de outras plntulas. O procedimento descrito de avaliao prossegue at o dia da ltima contagem estabelecido pelas Regras para Anlise de Sementes (BRASIL, 1992). Ao fim

do teste, com os dados dirios do nmero de plntulas normais, calcula-se a velocidade de germinao. Pelo IVG, quanto maior o valor obtido, subentende-se maior velocidade de germinao a maior vigor, pois o ndice calculado estima o nmero mdio de plntulas germinadas por dia (VIEIRA E CARVALHO, 1994).

2.2.2.2. Primeira contagem

O teste de primeira contagem baseia-se no princpio de que as amostras que apresentam maior percentagem de germinao de plntulas normais na primeira contagem, estabelecida pelas Regras Para Anlises de Sementes (BRASIL, 1992). No teste de germinao so as mais vigorosas. Este teste pode, muitas vezes, expressar melhor as diferenas de germinao entre lotes do que os ndices de velocidade de germinao (VIEIRA E CARVALHO, 1994).

2.3. Fitoqumicos

Considerando o metabolismo secundrio, os vegetais produzem uma gama de substncias que, alm de desempenharem funes fisiolgicas, resultam em interaes entre plantas, causando impactos no ambiente adjacente. Estas substncias qumicas so de grande importncia na adaptao das espcies e na organizao de comunidades vegetais (SILVA, 2004). De acordo com RICE (1984), as substncias qumicas identificadas como agentes alelopticos se enquadram em quatorze categorias: (1) cidos orgnicos

solveis em gua, lcoois de cadeia curta, aldedos alifticos e cetonas, (2) lactonas simples insaturadas, (3) cidos graxos de cadeia longa e poliacetilenos, (4) naftoquinonas, antraquinonas e quinonas complexas, (5) fenis simples, cido benzico, e derivados, (6) cido cianmico e derivados, (7) cumarinas, (8) flavonides, (9) taninos, (10) terpenides e esterides, (11) aminocidos e polipeptdeos, (12) alcalides e cianohidrinas, (13) derivados sulfurados e glicosdeos de leo mostarda, e (14) purinas e nucleosdeos. Alm dessas categorias, o autor tambm destaca mais uma miscelnea de fitoqumicos que no se enquadram claramente em nenhuma das divises acima, apesar de apresentarem relaes com uma ou mais categorias. Os exemplos de substncias aleloqumicas so inmeras na bibliografia, dessa forma alguns desses merecem uma melhor ateno. Saponinas so triterpenides glicosilados que tambm esto envolvidos na alelopatia. A cadeia polissacardica hidroflica e o esteride hidrofbico conferem a estas substncias propriedades de detergentes e, conseqentemente, a capacidade de ligao a membranas celulares, afetando o funcionamento celular. So conhecidas por suas propriedades hemolticas e toxidez para moluscos, insetos e fungos (RIZVI et al., 1992). RIZVI et al. (1992), identificaram trs saponinas, presentes nas folhas de Duranta repens com efeitos potencialmente alelopticos. Nesse estudo, foi constatada uma inibio no crescimento radicular de plntulas de Brassica juncea por estas substncias. Os flavonides esto presentes nas plantas em diversas formas e com variadas funes. Incluem flavonides, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas,

proantocianinas, isoflavonides, entre outros. Alm das funes de pigmentos, atrativos

ou repelentes de herbvoros, proteo contra radiao UV, estas substncias apresentam efeitos alelopticos, sendo capazes de inibir o crescimento de plantas e fungos (RICE, 1984), O mesmo autor cita alguns casos em que foram evidenciados efeitos fitotxicos de flavonas, entretanto, o autor afirma que poucos esto envolvidos em alelopatia. Os taninos possuem a capacidade de se ligar a protenas, geralmente de forma irreversvel, formando precipitados. O papel defensivo dessas molculas, contra ataque de herbvoros invertebrados e vertebrados, reside nesta caracterstica, apresentando, conseqentemente, sabor adstringente e difcil digesto, j que as enzimas digestivas no conseguem atacar esses precipitados. As proantocianinas, tambm conhecidas como taninos condensados, so polmeros de flavonides (catequina e flavan-3,4-diis). Essa classe de taninos encontrada em todas as plantas lenhosas, ao contrrio dos taninos hidrossolveis que so restritos a poucas famlias das angiospermas, estando ausentes nas

monocotiledneas. Os taninos hidrossolveis so steres de cidos fenlicos, geralmente o glico, e acares, apresentando uma sensibilidade hidrlise por cidos diludos (RICE, 1984). Os terpenides so geralmente insolveis em gua e so encontrados em resinas, ceras, ltex e leos essenciais; as plantas produzem uma grande variedade dessas substncias, que atuam como reguladores de crescimento, filoalexinas e repelentes para insetos herbvoros (RICE, 1984). Os derivados fenlicos so estruturas com anel aromtico e grupos hidroxila, tendo em sua maioria, origem a partir da fenilalanina. Estas substncias atuam na defesa contra herbvoros e patgenos, na atrao de polinizadores, na proteo contra

a radiao ultravioleta e no estabelecimento de simbiose. Os fenlicos compreendem ao maior grupo de metablicos que foram identificados como alelopticos (RICE, 1984). Os alcalides englobam mais de 12.000 estruturas j descritas, ficando atrs apenas dos terpenides. Aproximadamente 20% das espcies vegetais acumulam alcalides, molculas caracterizadas pelo baixo peso molecular e pela origem a partir de fenilalanina, tirosina, triptofano e lisina. De acordo com RICE (1984), vrios alcalides so capazes de inibir o crescimento de bactrias, alm de serem txicos para alguns invertebrados.

2.4. Alelopatia

Considerando o metabolismo secundrio, os vegetais produzem uma gama de substncias que, alm de desempenharem funes fisiolgicas, resultam em interaes entre plantas, causando impactos no ambiente adjacente. Estas substncias qumicas, denominadas aleloqumicos, so de grande importncia na adaptao das espcies e na organizao de comunidades vegetais (FERREIRA e AQUILA, 2000) As interaes qumicas so diversas e complexas e conferem as plantas doadoras e aquelas que produzem e liberam metablitos bioativos. A alelopatia um tipo de interao bioqumica entre vegetais, que tem sido amplamente estudado nos ltimos anos, devido a sua importncia em diversos ecossistemas. Esse fenmeno pode ser considerado uma adaptao qumica defensiva das plantas, alm de ser um fator de estresse ambiental para muitos vegetais (MEDEIROS, 1990).

O conceito de alelopatia sugere que biomolculas produzidas por uma planta alcancem o meio ambiente e influenciem o crescimento e desenvolvimento de plantas vizinhas (RIZVI et al., 1992). O termo alelopatia foi cunhado por Molisch (1937) e significa do grego allelon = de um para outro, paths = sofrer. O conceito descreve a influncia de um indivduo sobre o outro, seja prejudicando ou favorecendo o segundo, e sugere que o efeito realizado por biomolculas (denominadas aleloqumicos) produzidas por uma planta e lanadas no ambiente, seja na fase aquosa do solo ou substrato, seja por substncias gasosas volatilizadas no ar que cerca as plantas terrestres. Rice (1984) definiu alelopatia como: qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benfico que uma planta (incluindo microrganismos) exerce sobre outra pela produo de compostos qumicos liberados no ambiente. No entanto, a maioria das pesquisas em alelopatia refere-se ao efeito aleloqumico sobre a germinao e o crescimento da planta-teste, no considerando os efeitos celulares relacionados s mudanas fisiolgicas do bioensaio (PRATES et al., 2001). Rice (1984) relata que os aleloqumicos podem ser encontrados em todas as partes dos vegetais: caule, folhas, razes, inflorescncias e flores, frutos e sementes. Entretanto, a grande maioria dos trabalhos tem empregado folhas como principal fonte dessas substncias. Segundo Chou e Kuo (1986), existem diversas rotas de liberao dessas substncias para o ambiente, incluindo-se a volatilizao pelas partes areas da plantas, lixiviao das superfcies do vegetal atravs da chuva, orvalho e neblina, a exsudao pelas razes, a decomposio de resduos vegetais e lixvia de serrapilheira. A decomposio de resduos destaca-se como a fonte de aleloqumicos mais

importante, entretanto, esse processo de liberao no uniforme, variando conforme o ecossistema. Os efeitos que podem ser ocasionados pelos aleloqumicos sobre uma planta so diversos, pois muito difcil separar os efeitos secundrios das causas primrias (RICE, 1984). Os efeitos visveis, observados em muitos estudos de alelopatia, so, portanto, sinais secundrios de mudanas ocorridas num nvel molecular (MEDEIROS, 1990). Basicamente, os aleloqumicos podem apresentar mecanismos de ao diretos ou indiretos sobre a planta alvo. Os efeitos indiretos incluem alteraes nas propriedades e caractersticas nutricionais do solo e, tambm, nas populaes ou atividades de organismos. J os efeitos diretos, que so mais estudados, incluem alteraes no crescimento e no metabolismo vegetal. Compreendem alteraes ao

nvel celular, fitormonal, fotossinttico e respiratrio, bem como, modificaes no funcionamento de membranas, na absoro de nutrientes e nas relaes hdricas, entre outras (RICE, 1984, RIZVI et al., 1992). Os estudos com alelopatia possuem inmeras dificuldades. Tentando minimizar algumas delas, alguns autores utilizam como bioensaios sementes nativas; mas sementes de espcies cultivadas tambm so utilizadas, entre elas, as de alface e cebola. A principal vantagem do uso de Lactuca sativa como alvo nos estudos alelopticos reside na sensibilidade da espcie, mesmo em baixas concentraes de aleloqumicos. Alm disso, a espcie apresenta outras peculiaridades que favorecem sua utilizao: germinao rpida, em aproximadamente 24h; crescimento linear insensvel s diferenas de pH em ampla faixa de variao; insensibilidade aos

potenciais osmticos (RICE, 1984). Cattelan et al. (2005) e Souza et al. (2005), utilizaram sementes de cebola para avaliar o efeito aleloptico e citotxico de extratos aquosos de plantas medicinais, devido a inmeros estudos citogenticos realizaddos com a espcie e a sua visualizao cromossmica.

2.4.1. Alelopatia na agricultura

A prtica de rotao de cultivos, em agricultura, bastante difundida no Brasil e em demais pases do mundo. Assim, numa poca do ano plantada uma cultura, na seguinte, outra, de maneira que haja um rodzio de culturas. Isto visa no esgotar de forma precoce uma rea cultivando uma mesma espcie, porque os requerimentos nutritivos explorados do solo seriam os mesmos, cultivo a cultivo. A repetio dos mesmos cultivos tambm facilita a instalao e continuidade de fitopatgenos no solo. Por outro lado, este procedimento, muito recomendada, pode ter uma limitao proveniente da incorporao de restos da cultura anterior no solo, onde podem desempenhar uma funo aleloptica devido aos compostos qumicos liberados. Dependendo da cultura na rotao, os efeitos podem ser bastante danosos, com diminuio acentuada de crescimento e produtividade (FERREIRA e AQUILA, 2000). Todas as plantas produzem metablitos secundrios, que variam em qualidade e quantidade de espcie para espcie, at mesmo na quantidade do metablito de um local de ocorrncia ou ciclo de cultivo para outro, pois muitos deles tem sua sntese desencadeada por eventuais vicissitudes s quais as plantas esto expostas. A resistncia ou tolerncia aos metablitos secundrios que funcionam como

aleloqumicos mais ou menos especfica, existindo espcies mais sensveis que outras, como, por exemplo, Lactuca sativa (alface) e Lycopersicum esculentum (tomate), por isso mesmo muito usadas em biotestes de laboratrio (FERREIRA e AQUILA, 2000).

2.4.2. Alelopatia e plantas invasoras

A substituio da vegetao espontnea por uma cultura bastante comum no Brasil, pois h o costume de pousio sobre reas agricultoras em vrias regies do pas. Nestas reas j cultivadas e deixadas em repouso, instala-se uma flora espontnea, onde aparecem vrias plantas que podem contribuir para que o fenmeno de alelopatia se manifeste. H na literatura um grande nmero de exemplos de influncia aleloptica sobre plantas de culturas ou forrageiras, porm as invasoras de cada local e aquelas de pases estrangeiros de outras latitudes no sero comentadas (FERREIRA e AQUILA, 2000). Estudos com Eragrostis plana (capim-anoni), uma invasora de pastagens de azevm (Lolium multiflorum Lam), cornicho (Lotus corniculatus L.) e trevo-branco (Trifolium repens L.), verificaram a influncia dessa espcie sobre a germinao e desenvolvimento destas forragens (COELHO, 1986). O mesmo autor, explica que sua agressividade como invasora, pelo menos em parte, devido a substncias alelopticas. Para verificar efeitos alelopticos, os testes de germinao, em geral, so menos sensveis do que aqueles que avaliam o desenvolvimento das plntulas, como por exemplo, massa ou comprimento da radcula ou parte area. Ainda assim, foi

demonstrado que extratos da planta de cerrado Calea cuneifolia DC. (COUTINHO e HASHIMOTO, 1971) e o extrato de Wedelia paludosa DC. (mal-me-quer) inibiam a germinao de tomate, enquanto extratos de ervilhaca (Vicia sativa) inibiam a germinao e o crescimento das razes de alface (MEDEIROS e LUCCHESI, 1993). Castro et al. (1983) observaram que extratos aquosos da parte subterrnea de Cynodon dactylon (L.) Pers. (grama-seda), Cyperus rotundus L. (tiririca) e Sorghum halepense (L.) Pers. (capim massambar) inibiram a germinao e o crescimento do tomateiro. Em arroz o efeito foi apenas sobre o desenvolvimento da plntula (CASTRO et al., 1984). 2.4.3. Alelopatia de plantas lenhosas

Segundo Ferreira e Aquila (2000), pelo fato da maioria das lenhosas serem perenes, estando, portanto, expostas s vicissitudes do ambiente por longos perodos, incluindo, entre estes, o ataque de patgenos e predadores, favorecem o desenvolvimento de metablitos secundrios que as protegem contra a maioria desses ataques. O cafeeiro uma tpica planta com um grande arsenal qumico, no qual a xantina cafena a principal substncia. Muitas xantinas so poderosas inibidoras do crescimento e podem acumular-se no solo junto aos cafeeiros, sendo inclusive fitotxicas a radculas de plantas jovens da prpria espcie (WALLER et al., 1986). Estes mesmos autores demonstraram que a cafena importante fonte de nitrognio, mobilizada pela semente do cafeeiro na germinao. Esta substncia, como outras xantinas associadas, so poderosos aleloqumicos naturais, que controlam o

desenvolvimento de invasoras dos cafezais (ANAYA et al., 1982). Compostos fenlicos ou seus derivados, como o estilbeno e taninos presentes na casca de Picea engelmannii Parry, podem inibir o desenvolvimento de vrias outras conferas (TAYLOR e SHAW, 1983). Em plantios mistos de Juglans nigra e Alnus glutinosa foi encontrado que, aps oito anos, todas as plantas da segunda espcie morreram, comeando pelos ramos pequenos, depois pelos galhos, tendo sido determinado a causa morte como proveniente de aleloqumicos produzidos pela primeira espcie e que se acumulavam na serrapilheira (RIETVELD et al., 1983). Efeito semelhante foi encontrado quando da presena de Kalmia angustifolia L., um arbusto nativo na Amrica do Norte, impedindo o estabelecimento de mudas de Picea maritima num programa de reflorestamento (MALLIK, 1992). O gnero Eucalyptus, introduzido da Austrlia, mas muito cultivado no Brasil, tem vrias espcies consideradas alelopticas, pelo menos em potencial.

2.5. Espcies medicinais

A utilizao de plantas medicinais nativas no tratamento de enfermidades uma pratica exploratria e largamente difundida no Pas. A maioria das espcies tem sido utilizada de forma extrativista e o crescimento da populao humana e a ocupao de reas naturais vem aumentando a presso destrutiva sobre esta flora (ROSA e FERREIRA, 2001). De acordo com Rosa (2000), o progresso da fitoterapia e a obteno de fitofrmacos dependem do acesso facilitado a plantas produtoras e substncias ativas,

mas tendo cautela na utilizao desses fitoqumicos, pois muitos deles necessitam de estudos mais detalhados sobre seus efeitos. Achyrocline satureioides (Lam.) DC (Asteraceae) (Figura 1), conhecida como marcela, uma planta herbcea perene, com inmeras ramificaes, com folhas simples, encontrada nativa em campos da campanha gacha e tambm at o norte do estado do Paran (LORENZI, 2002).

Tabela 1

Figura 1 Achyrocline satureioides (Lam.) DC (marcela), modificado de Lorenzi, 2002

Na medicina caseira seu uso atribudo para o tratamento de problemas gstricos, epilepsia, e clicas de origem nervosa, e tambm muitas vezes, empregado como antiinflamatrio, analgsico e contra a diarria (LORENZI, 2002). As anlises qumicas dessa planta mostraram que ela rica em flavonides e monoterpenos, sendo muitas dessas substncias responsveis pelas suas

propriedades ativas (MARTINS et al, 2000). Simes (1988), demonstrou que em estudos in vitro com ratos Wistar, r eduziu o desenvolvimento de clulas cancerosas, quando essas cobaias foram tratadas com extratos das inflorescncias de marcela.

Mikania glomerata Spreng. (Asteraceae) (Figura 2), conhecida popularmente como guaco, uma trepadeira sublenhosa, perene com folhas obtusas, encontrada nativa em toda a regio sul do Brasil. Segundo Lorenzi (2002), esta planta utilizada na medicina tradicional, onde se atribui s suas folhas as seguintes propriedades: ao tnica, depurativa, febrfuga, peitoral e antigripal.

Figura 2 Mikania glomerata Spreng (guaco), modificado de Backes e Irgang 2003.

MARTINS et al, (1998). verificaram que apenas a propriedade de ao sobre as vias respiratrias, justificada pelo efeito broncodilatador, expectorante e antiedematoso, foi confirmada. Sua anlise fitoqumica comprovou a presena de cumarinas e outras substncias dela derivadas (SIMES, 1986). Stevia rebaudiana Bert. (Asteraceae) (Figura 3), planta herbcea perene, nativa em toda a regio sul do Brasil, e tambm encontrada ao longo da fronteira com o Paraguai, teve suas folhas utilizadas como adoante durante sculos pelos ndios guaranis (LORENZI, 2002). Segundo Lorenzi (2002), anlises fitoqumicas de estvia mostram que o composto presente em grandes quantidades nas folhas o esteviosdeo

(5 a 10 %), e que este tem um poder adoante cerca de 300 vezes maior que o da sacarose, representando cerca de at 18% da folha; por no ser calrico, desperta um grande interesse para fins alimentcios, dietticos e medicinais. Na medicina popular a planta considerada hipoglicemiante, diurtica e hipo-tensora, sendo usado com sucesso como adoante mais apropriado para pessoas diabticas.

Figura 3 Stevia rebaudiana Bert. (estvia), modificado de Lorenzi, 2002.

Bauhinia candicans Benth. (Caesalpiniaceae) (Figura 4), uma das cerca de 300 espcies do gnero Bauhinia, apresenta-se como uma rvore de porte arbreo semidecdua, encontrada do norte da regio Sudeste ao sul do Rio Grande do Sul, possuindo folhas uncinadas com formato semelhante a uma pata-de-vaca, designando assim o seu nome popular (MARTINS et al. 1998). A infuso das folhas de Bauhina candicans utilizada na medicina popular brasileira como agente diurtico, hipoglicemiante, tnico, depurativo, no combate elefantase e na reduo da glicosria (LORENZI, 2002). De acordo com Silva e Cechinel-Filho (2002), em estudos para isolamentos dos compostos qumicos do gnero Bauhinia, os efeitos farmacolgicos de B. candicans esto relacionados

diretamente presena de grande quantidade de esterides, flavonides, alcalides, lcoois e polilcoois.

Figura 4 - Bauhinia candicans Benth. (pata-de-vaca), modificado de Backes e Irgang, 2003.

Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. (Celastraceae) (Figura 5), conhecida como espinheira santa em aluso s suas folhas que possuem bordas espinhosas. uma espcie perene, de porte arbreo-arbustivo, encontrada nas matas do sul do Brasil (MAGALHES, 2002). O interesse medicinal mais comum pela espinheira santa para o tratamento de gastrites e lceras gstricas e duodenais, sendo que o efeito do ch das folhas dessa espcie pde ser comprovado cientificamente (FALEIROS , 1992). O estudo de fraes hexnicas das folhas de M. ilicifolia, desenvolvido por Faleiros(1992),

evidenciou que os compostos triterpnicos como friedelina e friedelanol, isolados por Itokawa (1991), so responsveis por 50% dos efeitos antiulcerognico da espinheira santa. Oliveira (1992), observou que as substncias 4-0-metil - epigalocatequina e seu epmero 4-0-metil-ent-galocatequina, isoladas do extrato aquoso de M. ilicifolia, reduziram a secreo gstrica de cido clordrico em ratos Wistar. M. ilicifolia. Outras

espcies da famlia Celastraceae foram investigadas sobre seus constituintes de ao citotxica (ITOKAWA, 1993; SHIROTA , 1994).

Figura 5 Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reiss (espinheira santa), modificado de Magalhes, 2002.

Alm da indicao de M. ilicifolia para o tratamento de lceras estomacais, alguns constituintes antitumorais foram encontrados nos gneros: Maytenus

(maytansine e maytanprine), Kokoona (kokzeylanol e kokzeylanonol) e Tripterygium (triptolide e triptonide). Segundo Brenger (1996), algumas espcies so utilizadas

popularmente como febrfugo (M. boaria e M. communis). Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae) (Figura 6), conhecido popularmente como ch-de-bugre, uma planta de porte arbreo, dotada de uma copa densa e arredondada, essa planta nativa em quase todo o territrio nacional, mas encontrada principalmente no Planalto Meridional (LORENZI, 2002). Tem suas folhas amplamente utilizadas na medicina tradicional no tratamento de queimaduras e da herpes, mas a grande utilizao do ch-de-brugre hoje como diurtico e redutor de apetite, tendo assim despertado grande interesse na indstria

farmacutica (LORENZI, 2002). Os efeitos farmacolgicos dessa planta devem-se principalmente a presena de terpenos e flavonides (MARTINS et al, 2000).

Figura 6 Casearia sylvestris Sw. (ch-de-bugre), modificado de Backes e Irgang, 2003.

Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (Tiliaceae) (Figura 7), popularmente conhecida como aoita cavalo, uma rvore decdua que apresenta grande importncia devido a presena de fibras extremamente resistentes que compem esse vegetal. Segundo Backes & Irgan (2003), sua madeira de extrema importncia economica, sendo utilizada desde a fabricao de mveis a confeco de hlices de avies. Sua aplicao medicinal no tratamento de bronquite, laringites e disenterias, sendo suas folhas usadas por decoco ou infuso. Os estudos fitoqumicos do aoita cavalo, indicam que esse vegetal apresenta grande quantidade de taninos e monoterpenos, tanto na casca como no caule (LORENZI, 2002).

Figura 7 Luehea divaricata Mart. et. Zucc.(aoita cavalo), modificado de Backes e Irgang, 2003.

Lippia alba (Mill.) N.E. (Verbenaceae) (Figura 8), um subarbusto com ramos arqueados, folhas inteiras com bordas serreadas, nativa em toda a regio sul do Brasil (LORENZI, 2002).

Figura 8 Lippia alba (Mill.) N.E.(slvia), modificado de Lorenzi, 2002.

O ch de slvia, como a espcie designada popularmente, utilizado como analgsico, devido presena de grande quantidade de mirceno, e tambm apresenta atividade calmante e espasmoltica atribudas a presena de citral, que desempenha

um efeito mucoltico, pois facilita a expectorao (LORENZI, 2002). De acordo com o mesmo autor, mirceno, citral e tambm limonemo, so os fitoqumicos presentes em quantidades relativamente altas, principalmente na parte area.

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Recursos materiais

O material necessrio para a execuo deste trabalho foi disponibilizado pelo Laboratrio de Gentica do Departamento de Zoologia e Gentica do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (vidrarias e reagentes, lminas, microscpio ptico, contador de clulas, etc.).

3.2. Material botnico

Para a realizao do trabalho foram utilizadas oito espcies de plantas medicinais nativas do Rio Grande do Sul, Achyrocline satureioides (Lam.) DC (marcela), Mikania glomerata Spreng. (guaco), Stevia rebaudiana Bert (estvia), Bauhinia

candicans Benth (pata-de-vaca), Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.(espinheira santa), Casearia sylvestris Sw. (ch de bugre), Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (aoita cavalo) e Lippia Alba (Mill.) N.E. (slvia), coletadas no setor de paisagismo do Conjunto Agrotcnico Visconde da Graa (CAVG) e tambm no Campus Universitrio da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Essas espcies foram secas em estufa de esterilizao a temperatura de 60C, durante 24 horas, para a obteno da matria seca.

3.3. Extrato bruto aquoso Infuso (EBA)

Para a obteno do extrato bruto aquoso (EBA), foram utilizadas folhas ou inflorescncias secas das espcies vegetais. Essas foram pesadas em balana de preciso, colocadas em erlenmeyer (500 mL) e, aps, adicionada gua destilada temperatura de 100C. Os recipientes foram hermeticamente fechados e deixados em repouso por 10 minutos. Aps filtragem, o extrato aquoso obtido foi diludo de modo a obter-se quatro concentraes de cada espcie vegetal (5, 10, 20 e 40mg/mL)

3.4. Biotestes

Os organismos testes utilizados foram sementes de alface, cultivar Rainha de Maio, e de cebola, cultivar Baia Periforme Precoce. As sementes de alface foram submetidas a resfriamento de 4C por 72h para superao da dormncia. Os

bioensaios foram realizados em cmara de germinao com temperatura controlada de 20C, para ambas as espcies, seguindo as Regras para Anlise de Sementes (BRASIL, 1992). As sementes de alface e cebola foram acondicionadas em caixas gerbox (11 x 11 cm) forradas com papel mataborro umedecido com 10mL dos extratos e gua destilada utilizada como controle negativo. Foram utilizadas quatro repeties de 100 sementes, para cada concentrao dos extratos e do controle, em delineamento estatstico inteiramente casualizado. Para a anlise dos Biotestes foram usadas quatro variveis: ndice de velocidade de germinao (IVG), com contagens dirias at o stimo dia, para a alface, e dcimo segundo dia, para a cebola, teste de primeira contagem aos quatro e seis dias, e teste de germinao ou de germinabilidade, aos sete e 12 dias para a alface e a cebola respectivamente, segundo as Regras para Anlise de Sementes (BRASIL, 1992); e o ndice mittico IM. Os valores das variveis germinao (G) e ndice de velocidade de germinao (IVG) foram obtidos atravs das seguintes expresses: G= onde: G = percentual de germinao; N = nmero total de sementes germinadas; A = nmero total de sementes colocadas para germinar; N 100 , A

e IVG =

n n t
i

i i

onde: IVG = ndice de velocidade de germinao; ni = nmero total de sementes germinadas num intervalo ti ; ti = intervalo de tempo.

3.5. ndice mittico Para a determinao do ndice mittico foi empregada a tcnica de esmagamento (GUERRA e SOUZA, 2002). Foram coletadas as radculas dos organismos testes e fixadas em Carnoy (3:1, etanol: cido actico) por um perodo de 24h temperatura ambiente e, aps, acondicionadas em freezer. A preparao do material, para posterior anlise do IM, foi realizada na seguinte ordem: gua destilada por 5 minutos; HCl 5N por 20 minutos temperatura ambiente; gua destilada por 5 minutos. Aps, as radculas foram transferidas para lmina onde, em microscpio esteroscpico, foi retirada a coifa para a obteno do meristema apical, adicionada orcena actica 2%, colocada uma lamnula sobre o material esmagado, e posteriormente aquecida. As lminas das clulas de alface e de cebola foram observadas em microscpio ptico a uma magnitude de 400x. Foram contadas, atravs da tcnica de varredura, 2000 clulas por concentrao para cada bioteste. O ndice mittico foi obtido dividindo-se o nmero de clulas em mitose pelo nmero total de clulas observado e multiplicando-se por 100, atravs da seguinte expresso. IM =
onde:

NCM 100 , NTC

IM = ndice mittico; NCM = nmero de clulas em mitose; NTC = nmero total de clulas observadas. Foi observado tambm a presena de alteraes cromossmicas, como quebras cromatdicas, pontes anafsicas, perda de cromossomos inteiros ou formao de microncleos, sendo essas anlises realizadas somente ao nvel qualitativo.

Os critrios para aceitar a presena das alteraes cromossmicas observadas, esto de acordo com Picker e Fox (1986) e esto descritas a seguir: quebras cromatdicas equivalentes a perda de cromtides do cromossomo ou por fragmentao que ocorrem nas cromtides durante a diviso celular; no disjuno dos cromossomos no final da metfase, formando estruturas denominadas de pontes anafsicas, alteraes essas observadas no incio da anfase; fuso acromtico desestabilizado podendo provocar perda de cromossomos inteiros durante o processo de diviso celular; presena de microncleo (MN) equivalente a uma estrutura de contorno regular, redondo ou oval, e devendo estar dentro do citoplasma de uma clula; o MN deve estar no mesmo plano de foco de observao e nitidamente separado do ncleo.

3.6. Limpeza das lminas

As lminas usadas para preparao do material para a anlise ao microscpio foram previamente limpas da seguinte maneira: esfregao com flanela seca; colocao em cubetas de vidro, adio de cido actico P.A. e imerso por um perodo de 24horas; retirada do cido actico e secagem a temperatura ambiente; aps secagem, colocao em lcool bruto (98%) por 15 minutos;

 secas novamente e colocadas em etanol durante 15 minutos; escorridas e, ainda umedecidas, polidas com flanela.

3.7. Coleta e fixao

A obteno das clulas meristemticas dos bioensaios, para a anlise do IM, foi realizada com coletas das sementes, aos quatro dias para a alface (2n=18), e aos seis dias para a cebola (2n=16). Aps, as sementes germinadas foram fixadas em fixador Carnoy 3:1, preparado previamente, atravs da seguinte metodologia: misturou-se 15mL de etanol com 5mL de cido actico glacial P.A. agitou-se a soluo antes e depois de acrescentar o material a ser fixado o fixador foi preparado imediatamente antes de ser usado e a quantidade foi aproximadamente 10 vezes o volume do material a ser fixado.

3.8. Anlise Estatstica

Cada uma das oito espcies medicinais constituiu um experimento, sendo todos os oito experimentos conduzidos da mesma forma. O delineamento experimental foi completamente casualizado, com quatro repeties, e o delineamento de tratamento foi fatorial 2 x 5, sendo os fatores Bioteste (Alface e Cebola) e Concentrao (0, 5, 10, 20 e 40 mg/mL).

As variveis analisadas foram: primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM). A unidade experimental consistiu de uma caixa gerbox com 100 sementes, para as variveis primeira contagem, germinao e IVG, e uma lmina onde foram observadas 500 clulas, para a varivel IM. As variveis primeira contagem, germinao e IM foram transformadas segundo arco seno de .

A anlise estatstica dos dados consistiu de anlise da variao e decomposio da variao dos fatores atravs de regresso polinomial, para o fator quantitativo (Concentrao), e comparao de mdias pelo teste DMS de Fisher, para o fator qualitativo (Bioteste). Na regresso polinomial, os critrios utilizados para a adoo do modelo foram a significncia ( = 0,05) e o coeficiente de determinao (r2) do mesmo. Estabeleceu-se arbitrariamente o valor mnimo para o r2 de 0,6. As anlises estatsticas foram executadas pelo programa WinStat Sistema de Anlise Estatstica para Windows Verso Beta (MACHADO e CONCEIO, 2005).

4. RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados abaixo descritos referem-se s variveis primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM), analisados nos biotestes para as seguintes espcies medicinais: Achyrocline satureioides (Lam.) DC (marcela), Mikania glomerata Spreng. (guaco), Stevia rebaudiana Bert (estvia), Bauhinia candicans Benth (pata-de-vaca), Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.(espinheira santa), Casearia sylvestris Sw. (ch de bugre), Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (aoita cavalo) e Lippia Alba (Mill.) N.E. (slvia). Na anlise de regresso polinomial os modelos estatsticos que no apresentaram p<0,05 e coeficiente de determinao (r2) superior a 0,60, foram desconsiderados mesmo que tenham sido significativos. Os resultados da anlise da variao, relativos espcie medicinal Achyrocline satureioides (Lam.) DC (marcela), so apresentados na tabela A1 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao

foram significativos para todas as variveis. A significncia da interao justifica o estudo dos efeitos simples de cada um dos fatores dentro dos nveis do outro. Na tabela 1 so apresentados os resultados dos testes de comparao de mdias dos Biotestes, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Foi verificado para as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM, que as mdias da alface foram superiores s mdias da cebola nas concentraes de 0, 5, 10 e 20 mg/mL. Na concentrao de 40mg/mL a mdia da alface foi superada pela da cebola na varivel primeira contagem sendo que no houve diferena entre as mdias dos biotestes para as variveis, germinao, IVG e IM. As anlises de regresso entre concentrao e todas as

variveis analisadas, para alface, esto apresentadas na figura 9, e para cebola, com as variveis germinao e IM na figura 10.

Tabela 1. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, germinao, IVG (ndice de velocidade de germinao) e IM (ndice mittico), relativas a espcie medicinal Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 40 Num. Obs. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primeira contagem 81,15 a 47,73 b 84,04 a 44,69 b 84,04 a 44,71 b 76,08 a 46,15 b 40,17 b 48,75 a

Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola

Germinao 86,07 a 51,51 b 84,42 a 47,66 b 87,13 a 50,49 b 82,14 a 53,19 b 52,48 a 58,63 a

IVG 93,82 a 17,45 b 82,42 a 14,37 b 90,00 a 16,45 b 61,75 a 16,20 b 22,63 a 17,59 a

IM 19,14 a 18,53 b 19,14 a 17,60 b 18,58 a 17,51 b 18,41 a 17,56 b 16,22 a 16,48 a

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

Na Figura 9 (a, b e d), observa-se que houve uma relao quadrtica entre a concentrao do extrato e as variveis primeira contagem, germinao e o IM, com ponto de mxima no intervalo entre as concentraes de 5 e 10mg/mL, evidenciando assim um efeito aleloptico do extrato de marcela sobre sementes de alface.

= Y

81,77 + 0,5522X 0,0399X2 r 2 = 1,00

= Y

84,92 + 0,4831X 0,0323X2 r 2 = 0,99

Concentrao a

Concentrao b

= Y

97,80 1,8449X r 2 = 0,99

= Y

18,96 + 0,0138X 0,0021X2 r 2 = 0,96

Concentrao c

d Concentrao d

Figura 9. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, ndice de Velocidade de Germinao (IVG) e ndice mittico (IM) em sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.

Gatti et al., (2004), em estudos sobre o efeito do extrato obtido das folhas de Aristolochia esperanzae O. Kuntze (papo de peru) sobre a germinao de sementes de alface e de rabanete, observaram que, o extrato aquoso obtido das folhas inibiu a germinao das sementes dos bioensaios em todas as concentraes analisadas.

Carvalho et al. (1996) tambm verificaram potencial aleloptico de folhas verdes de Sacharum officinalis L. (cana-de-acar), sobre sementes de Mimosa caesalpiniaefolia L. (sabi), que variava em funo das concentraes testadas. Atravs do teste cometa, realizado com clulas medulares de ratos Wistar, Silva et al., (2003), observaram um possvel efeito genotxico do extrato de Achyrocline satureioides. Em relao ao IVG (Figura 9c), foi observado que o mesmo apresentou uma relao linear negativa com a concentrao do extrato aquoso de marcela, isto , o aumento da soluo do extrato promoveu uma diminuio dessa varivel. Segundo Ferreira e Borghetti (2004), freqentemente, o efeito aleloptico no se d sobre a germinabilidade (percentual final de germinao), mas sobre a velocidade de germinao ou sobre outro parmetro do processo. A concentrao do extrato aquoso de marcela apresenta uma relao linear positiva com a varivel germinao e uma relao linear negativa com IM em sementes de cebola (Figura 10a e b)

= 18,16 Y

0,0417X r 2 = 0,82

= Y

48,85 + 0,23X r 2 = 0,80

Concentrao a a

Concentrao b b

Figura 10. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis Germinao e ndice Mittico (IM) para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.

Esses dados demonstram que, com o incremento da concentrao ocorreu um aumento no potencial da germinao de sementes de cebola (Figura 10a). Alves et al., (2004), verificaram efeito semelhante de extratos volteis extrados do leo essencial de Pilocarpus microphyllus Stapf. ex. Ward. (jaborandi), onde as concentraes analisadas estimularam o crescimento e o desenvolvimento de sementes de alface. Houve uma diminuio no ndice de diviso celular (IM), no bioteste cebola, acordo com o aumento da concentrao do extrato aquoso de marcela (Figura 10b). Resultado semelhante foi encontrado por Cattelan et al (2005), sobre sementes da mesma espcie na avaliao do possvel efeito citotxico e genotxico de Rosmarinus officinalis L. (alecrim). Os autores verificaram que o extrato aquosos inibiu o IM nas concentraes testadas. A anlise de variao, relativa espcie medicinal Mikania glomerata Spreng (guaco), est apresentada na tabela A2 do Anexo. Esta anlise demonstrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos, para primeira contagem, germinao e IVG. A tabela 2 apresenta os resultados dos testes de comparao de mdias dos dois biotestes dentro de cada nvel do fator Concentrao. Foi observado que nas variveis primeira contagem, germinao e IVG as mdias da alface superaram as mdias da cebola apenas no controle, sendo que nas demais concentraes as mdias da alface foram superadas pelas mdias da cebola em todas as variveis analisadas. Os resultados da ao do extrato aquoso de guaco, sobre sementes de alface, mostram que as variveis primeira contagem, germinao e IVG apresentaram uma relao quadrtica com as diferentes concentraes dessa espcie medicinal (Figura 11 a, b e c), ou seja, o incremento da concentrao acarretou decrscimo nos valores

dessas trs variveis at concentraes prximas a 30mg/mL, para aps propiciar um novo aumento das mesmas. Conforme Mazzafera (2003), o extrato aquoso de Syzygium romaticum (L) Merr. e Perry (cravo-da-ndia) apresentou uma forte inibio na germinao e na velocidade de germinao de vrias sementes entre elas, alface e tomate, demonstrando tambm o potencial aleloptico da espcie. Verificou-se que, o aumento da concentrao promoveu uma ao citotxica sobre as clulas

meristemticas de sementes de alface. Segundo Pereira et al., (2002), diversas espcies medicinais j tiveram o seu potencial citotxico e genotxico estudado, entre elas, a sucupira, a goiabeira vermelha e a carqueja, que em concentraes elevadas demonstraram a sua potencialidade txica.
Tabela 2. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG), relativos espcie medicinal Mikania glomerata Spreng. Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 40 Num, obs, 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primeira contagem 81,15 a 47,16 b 15,32 b 40,54 a 5,50 b 39,23 a 0b 29,16 a 1,43 b 26,01 a

Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola

Germinao 86,06 a 51,07 b 29,97 b 46,87 a 16,93 b 44,86 a 12,49 b 43,13 a 9,39 b 38,94 a

IVG 93,79 a 17,44 b 4,95 b 13,65 a 1,62 b 12,77a 0,79 b 9,35 a 0,78 b 7,83 a

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

 = Y

62,19 5,9573X + 0,1126X2 r 2 = 0,70

= Y

68,81 5,1750X + 0,0936X2 r 2 = 0,70

Concentrao a a a

Concentrao b b b

= Y

68,72 7,1670X + 0,1392X2 r 2 = 0,66

Concentrao

Figura 11 . Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao e ndice de Velocidade de Germinao (IVG) para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng.

Nas anlises de regresso para o bioteste cebola, houve uma relao quadrtica entre concentrao e as variveis primeira contagem e IVG, com pontos de mnimo entre as concentraes de 30 e 40mg/mL(Figura 12a e c) Resultados semelhantes foram obtidos por Prates et al., (2001), em sementes de milho tratadas com extrato aquoso de Leucaena leucocephala, os autores observaram que os extratos dessa planta inibiram o IVG e afetaram a diviso celular dos meristemas radiculares da espcie. A anlise tambm revelou que a concentrao mais elevada do extrato de guaco acarretou um efeito genotxico sobre as clulas meristemticas de cebola, levando a formao de microncleos (Figura 13).

 = Y

47,16 1,1615X + 0,0157X2 r 2 = 0,98

= Y

49,02 0,2698X r 2 = 0,90

Concentrao a Concentrao b

= Y

17,03 0,5460X + 0,0079X2 r 2 = 0,98

Concentrao c

Figura 12. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM) para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng.

Uma relao linear negativa ocorreu entre a germinao de sementes de cebola e as diferentes concentraes do extrato aquoso de guaco (Figura 12b), evidenciando que a germinabilidade das sementes do bioteste foi inversamente proporcional ao incremento da concentrao. Esses dados corroboram com os estudos de Pires et al., (2001), onde o aumento das concentraes do extrato aquoso de Leucena leucocephala (L) de Wit (leucena) apresentou efeito txico na germinao de sementes de pico-preto e caruru. Na varivel IM no houve efeito significativo da interao e nem do efeito principal de Bioteste, ou seja, as mdias das espcies alface e cebola no diferiram

estatisticamente entre si, havendo, entretanto significncia do efeito principal de Concentrao (Tabela A2 e Figura 14), melhor expressa atravs da relao quadrtica.

Figura 13. Clulas meristemticas de cebola, apresentando microncleos, tratadas com extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng na concentrao de 40mg/mL (400x).

Pinho et al (2005), utilizaram meristemas radiculares de bulbos de cebola no monitoramento do efeito do extrato aquoso de Baccharis trimera L. (carqueja), e observaram que o extrato aquoso dessa espcie reduziu o ciclo mittico, em concentraes elevadas, e tambm propiciou o surgimento de anormalidades cromossmicas.

= 18,63 0,1667X 0,0021X2 Y IM

Concentrao

Figura 14. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas, para a varivel ndice Mittico (IM) em diferentes concentraes do extrato aquoso de Mikania glomerata Spreng.

Os dados da anlise de variao, relativo espcie medicinal Stevia rebaudiana Bert. (estvia), so apresentados na tabela A3 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos nas variveis IVG e IM. Os resultados do teste de comparao de mdias dos dois biotestes, dentro de cada nvel do fator Concentrao, esto apresentados na tabela 3. Foi observado que, para a varivel IVG, as mdias da alface foram superiores em todas as concentraes analisadas. Em relao ao IM, a mdia da alface foi superior somente no controle (0 mg/mL), nas demais concentraes, no houve diferena entre os biotestes.
Tabela 3. Mdias das o bservaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis ndice de Velocidade de Germinao (IVG) e ndice Mittico (IM). relativos a espcie Stevia rebaudiana Bert. Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 40 Num, obs, 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola

IVG 90,77 a 18,87 b 75,49 a 17,84 b 59,82 a 18,92 b 60,22 a 14,81 b 65,93 a 17,19 b

IM 19,36 a 18,43 b 18,39 a 18,39 a 18,39 a 18,41 a 18,29 a 18,39 a 18,15 a 18,27 a

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

A anlise de regresso entre concentrao e IM para sementes de alface tratadas com extrato aquoso de estvia (Figura 15), demonstrou uma relao

quadrtica. Houve uma diminuio do IM com o aumento da concentrao do extrato, com ponto de mnimo entre 25 e 30mg/mL.

= Y

19,10 0,0789X + 0,0014X2 r 2 = 0,74

Concentrao

Figura 15. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para a IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Stevia rebaudiana Bert..

Em estudos para avaliar o possvel efeito citotxico e genotxico de estvia, Nunes e Arajo (2003), analisaram clulas da medula ssea de ratos Wistar, e observaram que os animais tratados com diferentes concentraes de esteviosdeo no apresentaram leses no DNA atravs do ensaio cometa. Para as variveis primeira contagem, e germinao somente o efeito prinicipal de bioteste foi significativo (Tabela A3), evidenciando uma diferena entre as mdias de primeira contagem (85,53 e 48,74) e de germinao (87,75 e 51,60), para alface e cebola, respectivamente. Os resultados da anlise de variao, relativo a espcie medicinal Bauhinia candicans Benth.. (pata de vaca), so apresentados na tabela A4 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos para as variveies IVG e IM. Na tabela 4 so apresentados os resultados dos testes de comparao de mdias dos dois bioensaios, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Foi verificado que, para a varivel IVG, as mdias da

alface superaram as mdias da cebola em todas as concentraes analisadas. Na varivel IM, as mdias da alface superaram as mdias da cebola nas concentraes de 0, 5 e 20 mg/mL, enquanto nas demais concentraes, em relao a mesma varivel, no houve diferena entre as mdias dos biotestes.
Tabela 4. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM),para a espcie Bauhinia candicans Benth. Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 40 Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Num. obs. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 IVG 93,67 a 18,92 b 85,56 a 18,12 b 85,74 a 16,95 b 75,28 a 13,81 b 57,29 a 16,10 b IM 19,56 a 17,72 b 19,44 a 17,47 b 17,91 a 17,50 a 17,56 a 16,18 b 16,79 a 16,53 a

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

As anlises de regresso entre concentrao e as variveis IVG e IM, para alface, esto apresentadas na figura 16, e para a cebola com a varivel IM, na figura 17. Na figura 16, verifica-se que houve uma relao linear negativa entre as variveis IVG e IM, ou seja, com o aumento da concentrao houve uma reduo das variveis acima citadas, demonstrando assim um efeito inibitrio do extrato aquoso de pata de vaca sobre sementes de alface. Ferreira e quila (2000), apontam que a germinao menos sensvel aos aleloqumicos do que o crescimento das plntulas, pois as substncias alelopticas podem induzir o aparecimento de plntulas anormais,

onde a necrose o sintoma mais evidente. Um efeito citotxico (Figura 16d) do extrato aquoso de pata-de-vaca tambm foi verificado, pois, o aumento da concentrao do extrato acarretou uma inibio do ciclo celular nos meristemas radiculares de alface.

= Y

92,73 - 0,8817X r 2 = 0,98

= 19,18 Y

- 0,0621X r 2 = 0,66

Concentrao a

Concentrao b

Figura 16. Grficos das curvas ajustadas e das mdiasdo observadas para as variveis de germinao menos sensvel aos aleloqumicos que o crescimento dasndice plntulas, velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM) em sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Bauhinia candicans Benth.

Silva e Cechinel-Filho (2002), estudaram os principais compostos qumicos presente nas plantas do gnero Bauhinia e encontraram entre eles, alcalides, terpenos, glicosideos, flavonides e esterides, esses fitoqumicos que, alm de promoverem efeitos inibitrios na germinao de sementes, podem ocasionar efeitos ao nvel celular da planta teste (Rice, 1984). Na figura 17 observa-se que houve uma relao linear negativa entre a concentrao e a varivel IM no bioteste utilizando sementes de cebola. Esses dados corroboram com os encontrados por Buttow et al., (2003), onde na anlise de clulas meristemticas de bulbos de cebolas tratados com o extrato aquoso de pata-de-vaca, verificaram que, o aumento da concentrao analisada promovia uma inibio do IM nesse bioensaio.

 = Y

17,57 - 0,0333X r 2 = 0,62

Concentrao

Figura 17 . Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para a varivel IM em sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Bauhinia candicans Benth.

Nas variveis primeira contagem e germinao, somente o efeito principal de Bioteste foi significativo (Tabela A4), evidenciando uma diferena entre as mdias de primeira contagem, 78,37 e 48,40 e de germinao, 79,92 e 52,06, para alface e cebola, respectivamente. Os resultados da anlise da variao relativos a espcie medicinal Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. (espinheira santa), so apresentados na tabela A5 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos para todas as variveis. A significncia da interao justifica o estudo dos efeitos simples de cada um dos fatores dentro dos nveis do outro. Na tabela 5 esto apresentados os resultados dos testes de comparao das mdias dos dois biotestes, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Para a varivel IVG, as mdias da alface foram superiores s mdias da cebola em todos as concentraes; para as variveis primeira contagem e germinao, as mdias da alface foram superiores as mdias da cebola em todas as concentraes, exceto para 40 mg/mL, onde a cebola superou a alface para a varivel primeira contagem, e no diferiu da

alface para a varivel germinao. Com relao a varivel IM, a cebola foi superior alface nas concentraes 0, 5 e 10 mg/mL, no diferindo da alface na concentrao de 20mg/mL e sendo inferior na concentrao de 40 mg/mL.
Tabela 5. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM), para a espcie Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 40 Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Num. Obs. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primira Contagem 72,48 a 39,23 b 74,74 a 37,14 b 79,12 a 38,25 b 75,35 a 38,62 b 31,19 b 41,96 a Germinao 82,70 a 47,53 b 83,96 a 42,26 b 84,73 a 42,98 b 83,44 a 43,71 b 52,97 a 44,57 a IVG 80,17 a 13,11 b 73,31 a 10,83 b 80,63 a 12,03 b 72,74 a 11,57 b 28,84 a 11,29 b IM 23,80 b 41,53 a 21,97 b 28,38 a 23,26 b 37,38 a 19,37 a 21,23 a 12,30 b 24,00 a

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

As anlises de regresso entre concentrao e as variveis primeira contagem, germinao, IVG e IM, para a alface, esto apresentadas na figura 17. Observa-se que houve uma relao quadrtica negativa entre a concentrao e as variveis analisadas. Em relao a primeira contagem e a germinao, ocorreu um aumento dessas variveis at a concentrao de 10mg/mL. Isto indica que os constituintes presentes no extrato aquoso de espinheira santa at a concentrao de 20 mg/mL, no sejam fitotxicos para as sementes de alface.

 = Y

72,57 + 1,1275X 0,0539X2 r 2 = 0,98

= Y

82,03 + 0,7302X 0,0363X2 r 2 = 0,99

Concentrao a Concentrao b

= Y

79,05 + 0,2945X 0,0384X2 r 2 = 0,98

= Y

23,92 0,1579X 0,0033X2 r 2 = 0,98

Concentrao c

Concentrao d

Figura 18. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mittico (IM) para sementes de alface Segundo Rice (1984), alguns compostos qumicos tem atividade inibitria tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Maytenus ilicifoliaaleloptica Mart. ex Reiss

Segundo Rice (1984), alguns compostos tm atividade aleloptica inibitria em altas concentraes, mas em menores tambm podem estimular o mesmo processo, corroborando assim os resultados encontrados nas sementes de alface tratados com o extrato aquoso de espinheira santa. Um efeito citotxico do extrato tambm foi

observado sobre as clulas do meristema de alface com o aumento da concentrao (Figura 18d). Camparato et al., (2002), em anlises de clulas meristemticas de bulbos de Allium cepa (cebola), verificaram que a concentrao mais elevada promoveu uma regresso no IM, mas no o surgimento de alteraes cromossmicas.

A figura 19 demonstra uma relao quadrtica entre a concentrao do extrato aquoso de espinheira santa e a varivel IM nas clulas meristemticas das sementes de cebola.

= Y

40,17 1,2071X + 0,0199X2 r 2 = 0,66

Concentrao

Figura 19. Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para a varivel IM em sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.

concentrao

de

40mg/mL

promoveu

surgimento

de

alteraes

cromossmicas como a presena de pontes anafsicas (Figura 20). Teixeira et al., (1997), atravs do teste de Smart, verificaram efeito genotxico de Maytenus ilicifolia sobre os discos imaginais de Drosophila melanogaster.

Figura 20 . Clula meristemtica de cebola, apresentando ponte anafsica, na concentrao de 40mg/mL do extrato aquoso de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.(400x).

Os resultados da anlise de variao, relativo a espcie medicinal Casearia sylvestris Sw (ch-de-bugre), so apresentados na Tabela A6 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal de Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos em todas as variveis, exceto para IM. A tabela 6 apresenta os resultados dos testes de comparao de mdias das duas espcies, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Observa-se que as mdias da alface foram superiores as mdias da cebola em todas s variveis analisadas nas concentraes de 0, 5, 10 e 40mg/mL. Para as variveis primeira contagem e germinao, na concentrao de 20 mg/mL, as mdias da cebola foram superiores as mdias da alface, enquanto que para a varivel IVG, nesta mesma concentrao, no houve diferena entre as mdias dos biotestes.
Tabela 6. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao e IVG, para a espcie Casearia sylvestris Sw Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 Num, obs, 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primeira contagem 88,57 a 67,97 b 85,70 a 63,92 b 77,10 a 60,61 b 50,96 b 62,50 a 67,88 a 59,52 b

Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola

Germinao 88,57 a 69,42 b 88,57 a 66,35 b 81,04 a 62,56 b 55,51 b 67,18 a 75,55 a 63,32 b

IVG 98,50 a 29,12 b 84,38 a 21,46 b 51,17 a 21,93 b 22,50 a 22,12 a 31,02 a 21,10 b

20 40

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

A anlise de regresso da primeira contagem e do IVG para alface, apresentou uma relao quadrtica entre essas variveis e as concentraes do extrato aquoso de

ch-de-bugre (Figura 21a e b). Esses resultados tambm foram verificados por Gatti et al., (2004), que analisaram a ao do extrato aquoso obtido das razes de Aristolochia esperanzae O Kuntze (papo-de-peru) sobre sementes de alface e rabanete.

= Y

91,79 2,5156X + 0,0470X2 r 2 = 0,66

= Y

94,14 4,458X + 0,0712X2 r 2 = 0,68

Concentrao a

Concentrao b

Figura 21 . Grficos das curvas ajustadas e das mdias observadas para as variveis primeira contagem (ndice de Velocidade de Germinao) IVG para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Casearia sylvestris Sw.

Para a varivel IM no houve significncia da interao e nem do efeito principal de Bioteste, ou seja, as mdias dos biotestes alface e cebola no diferiram estatisticamente entre si, havendo, entretanto, significncia do efeito principal de Concentrao (Tabela A6, Figura 22)

= 18,93 0,0812X 0,0014X2 Y IM

Concentrao

Figura 22. Grfico da curva ajustada e das mdias observadas, para a varivel ndice Mittico em diferentes concentraes do extrato aquoso de Casearia sylvestris Sw.

O efeito citotxico de plantas medicinais nativas da regio sul do Brasil tambm foi verificado por Bttow et al (2003), que ao utilizarem extratos aquosos de Schinus

molle L (aroeira-mansa), verificaram uma diminuio no ciclo celular em clulas meristemicas de bulbos de cebola. Os resultados da anlise da variao, relativo a espcie medicinal Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (aoita cavalo), so apresentados na tabela A7 do Anexo. Esta anlise mostrou que o efeito principal do Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos, para as variveis primeira contagem, IVG e IM. A significncia da interao justifica o estudo dos efeitos simples de cada um dos fatores dentro dos nveis do outro. Na tabela 7 so apresentados os resultados do teste de comparao das mdias dos biotestes, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Nas variveis primeira contagem, IVG e IM as mdias da alface foram superiores em s mdias da cebola nas concentraes de 0, 5, 10 e 20 mg/mL.
Tabela 7. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis primeira contagem, ndice de velocidade de germinao (VG) e ndice mittico (IM), para a espcie Luehea divaricata Mart. et. Zucc Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 Num. obs. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primeira contagem 84,74 a 50,66 b 76,90 a 47,31 b 75,63 a 51,11 b 64,86 a 45,00 b 54,85 a 49,66 a

Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola

IVG 93,67 a 18,87 b 85,97 a 17,84 b 74,91 a 18,92 b 37,72 a 14,81 b 30,38 a 17,19 b

IM 26,53 a 20,10 b 22,08 a 18,27 b 21,32 a 18,43 b 22,16 a 18,43 b 17,01 a 18,51 a

20 40

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

Na concentrao de 40mg/mL foi verificado que, no houve diferena para as variveis primeira contagem e IM entre as mdias de alface e cebola, porm para a

varivel IVG, na mesma concentrao, a mdia da alface foi superior a mdia da cebola. As anlises de regresses das variveis primeira contagem e IM (Figura23 a e c), para o bioteste alface, demonstram uma relao linear negativa com a concentraes do extrato aquoso de aoita cavalo, e para a varivel IVG, uma relao quadrtica com ponto de mnimo ao redor da concentrao 40mg/mL (Figura 23b), ou seja, as variveis se comportaram de forma inversamente proporcional ao incremento da concentrao do extrato aquoso de aoita cavalo.

= Y

82,14 0,7163X

r2 = 0,95

= Y

96,02 3,1170X 0,0359X2 r 2 = 0,86

Concentrao a

Concentrao b

= Y

24,60 0,1855X r 2 = 0,75

Concentrao c

Figura 23 . Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, (ndice de Velocidade de Germinao) IVG e (ndice Mittico) IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Luehea divaricata Mart. et. Zucc

Segundo Rodrigues et al., (1992), os compostos alelopticos so inibidores de germinao e crescimento e influenciam diretamente na velocidade de emisso das

radculas das plantas testes, pois interferem na diviso celular, nas permeabilidade das membranas e na ativao de enzimas. Na varivel germinao, somente o feito principal de Bioteste foi significativo (Tabela A7), evidenciando uma diferena entre as mdias da alface (75,84) e da cebola (51,60). Foi verificado efeito genotxico do extrato aquoso de aoita cavalo na concentrao de 40 mg/mL, tanto em meristemas radiculares de alface, atravs do surgimento de quebras cromossmicas, como nas de cebola, pela formao de microncleos (Figura 24). Silva et al., (2003), analisando a ao de extratos aquosos de plantas medicinais, verificaram a genotoxicidade, atravs do ensaio cometa, com clulas medulares de ratos Wistar, do extrato aquoso de aoita cavalo em concentraes elevadas.

Figura 24. Clulas meristemticas d e alface (a) e cebola (b) tratadas com extrato aquoso de Luehea divaricata Mart. et. Zucc. (40 mg/mL), apresentando cromossomos perdidos (a) e microncleo (b) (400x).

Os dados da anlise de variao, relativo a espcie medicinal Lippia Alba (Mill.) N.E. ( slvia), so apresentados na tabela A8 do Anexo. Esta anlise mostrou que o

efeito principal dos Bioteste e a interao Bioteste x Concentrao foram significativos, para todas as variveis. A significncia da interao justificando assim o estudo dos efeitos simples de cada um dos fatores dentro dos nveis do outro. Na tabela 8 so apresentados os resultados do teste de comparao de mdias das duas espcies, dentro de cada nvel do fator Concentrao. Observa-se que as variveis primeira contagem e germinao apresentam comportamento similar em todas as concentraes analisadas, ou seja, na concentrao do controle a mdia da alface foi superiores s mdias da cebola, na concentrao de 5 mg/mL as mdias dos biotestes no diferiram entre si e nas concentraes de 10, 20 e 40 mg/mL as mdias da cebola superaram as mdias da alface. Com relao a varivel IVG, observa-se que as mdias da alface foram superiores as mdias da cebola nas concentraes de 0 e 5 mg/mL, na concentrao de 10 mg/mL as mdias das espcies no demonstraram diferena entre si, nas concentraes de 20 e 40 mg/mL as mdias da cebola foram superiores as mdias da alface. No entanto, a varivel IM no apresentou diferena entre as mdias dos biotestes em quatro concentraes, apenas na concentrao de 40 mg/mL, onde a mdia da cebola foi superior a mdia da alface.

Tabela 8. Mdias das observaes, por bioteste, dentro de cada nvel do fator Concentrao, para as variveis Primeira contagem, Germinao, ndice de velocidade de germinao (IVG) e ndice mitico (IM), para a espcie Lippia Alba (Mill.) N.E Laboratrio de Gentica, UFPel, Pelotas, RS, 2005. Concentrao (mg/ml) 0 5 10 20 Bioteste Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Alface Cebola Num, obs, 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Primeira contagem 87,97 a 67,36 b 61,51 a 66,70 a 48,02 b 61,63 a 22,81 b 61,83 a 8,85 b 58,18 a Germinao 88,57 a 69,68 b 66,11 a 68,51 a 52,81 b 65,39 a 26,53 b 67,18 a 9,65 b 66,68 a IVG 98,50 a 25,66 b 38,05 a 23,30 b 22,03 a 21,04 a 6,76 b 20,33 a 1,02 b 19,68 a IM 19,82 a 18,48 a 18,19 a 18,24 a 18,32 a 18,27 a 16,90 a 17,83 a 10,10 b 16,92 a

40

Mdias seguidas pela mesma letra, na coluna, no diferem entre si pelo teste DMS de Fischer (p 0,05).

Na figura 25, observa-se que houve uma relao quadrtica para todas as variveis com ponto de mnimo no intervalo entre 30 e 40mg/mL para a primeira contagem, percentagem de germinao e IVG (Figura 25a, b e c), e com ponto de mnima, na ausncia do extrato de slvia (Figura 25d), na varivel IM, evidenciando assim um efeito aleloptico e citotxico do extrato de Lippia alba sobre sementes de alface. Esses dados acabam corroborando com Souza et al (2005), que avaliaram, em sementes de alface e de rcula, as mesmas variveis usadas neste trabalho, o efeito aleloptico e citotxico do extrato aquoso de Cymbopogon citratus (DC) Stapf (capim cidro), espcie medicinal que apresenta os mesmos fitoqumicos encontrados em Lippia alba.

 = Y

82,16 3,8472X + 0,0503X2 r 2 = 0,88

= Y

83,96 3,5239X + 0,0414X2 r 2 = 0,89

Concentrao a

Concentrao b

= Y

81,35 6,2200X + 0,1066X2 r 2 = 0,78

= Y

19,34 0,0548X 0,0043X2 r 2 = 0,98

Concentrao c

Concentrao d

Figura 25 . Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, germinao, (ndice de Velocidade de Germinao) IVG e (ndice Mittico) IM para sementes de alface tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Lippia Alba (Mill.) N.E..

As anlises de regresso entre concentrao e as variveis primeira contagem, IVG e IM para o bioteste cebola, cujos os resultados esto representados na figura 26, mostram uma relao linear negativa com as concentraes do extrato aquoso de slvia. Dudai et al., (1999), trabalhando com leos essncias de Cymbopogon citratus (DC) Stapf (capim cidro), que apresentam tambm como componentes majoritrios os mesmos monoterpenos encontrados em Lippia alba, observaram uma forte atividade inibitria sobre a germinabilidade e a velocidade de germinao de sementes de tomate. Segundo Simes (2003), a slvia produz metablitos secundrios como monoterpenos, e citral com funes ecolgicas conhecidas como inibidores de

germinao e, freqentemente, apresentam toxidade elevada sendo geralmente dose dependente. A literatura apresenta tambm trabalhos que relatam o efeito inibitrio de terpenos volteis sobre a germinao de Eucaliptus globus, Artemsia absithium entre outras. (ALMEIDA, 1993).

= Y

66,47 0,2219X r 2 = 0,83

= Y

23,95 12,95X r 2 = 0,69

Concentrao a
= Y

Concentrao b 18,53 0,0388X r 2 = 0,98

Concentrao c

Figura 26 . Grfico da curva ajustada e das mdias observadas para as variveis primeira contagem, (ndice de Velocidade de Germinao) IVG e (ndice Mittico) IM para sementes de cebola tratadas com diferentes concentraes do extrato aquoso de Lippia Alba (Mill.) N.E..

A concentrao de 40 mg/mL do extrato aquoso de slvia demonstrou efeito genotxico sobre as clulas meristemticas de cebola, evidenciando a presena de pontes anafsicas e de microncleos (Figura 27).

Figura 27. Clulas meristemticas de cebola tratadas com extrato aquoso de Lippia Alba (Mill.) N.E.. (40 mg/mL), apresentando pontes anafsicas (a), e microncleos (b) (400x).

Pereira et al., (2002), atravs do teste Smart verificaram a potencialidade genotxica de Hyptidendron canun, espcie medicinal rica em monoterpenos e citral, mesmos compostos encontrados em Lippia alba.

5. CONCLUSES

Os resultados obtidos no presente trabalho, permitem concluir que:

sementes de alface so mais sensveis aos efeitos aleloptico dos extratos aquosos das espcies medicinais analisadas, evidenciando-se assim, que essa espcie pode ser utilizada para monitorar a ao de substncias derivadas de flavonides, cidos fenlicos, alcalides, saponinas, taninos, cumarinas e terpenos volteis.

sementes de cebola podem se utilizadas para monitorar a atividade citotxica e genotxica de compostos derivados de cumarinas, taninos e terpenos,

substncias essas presente em grande quantidade em guaco, espinhiera santa, aoita cavalo e slvia.

6. Referncias Bibliogrficas

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