PROJET DE THESE MASTER 2 Recherche Fonctionnement des Ecosystmes et Anthropisation: Biosciences de lEnvironnement

Variabilit specifica ed infraspecifica delle attivit enzimatiche prodotte dalle tre specie dominanti di ipomiceti acquatici
Problmatique scientifique gnrale Les hyphomyctes aquatiques forment un groupe de microchampignons qui colonisent les litires ds leur immersion en automne (Brlocher, 1992). Les litires constituent un substrat trs fragment ncessitant de nombreuses propagules fongiques pour tre colonis en totalit. Dune espce lautre, la biomasse reproductive est constante et les espces dont la masse conidienne individuelle est faible sont a priori avantages dans ltape de colonisation des litires puisquelles produisent un grand nombre de conidies. Une feuille immerge est colonise simultanment par 4 12 espces dhyphomyctes aquatiques, plusieurs espces se succdant au cours des saisons. Les hyphomyctes aquatiques constituent un modle de champignons avec lequel on peut recrer en conditions exprimentales, dans des microcosmes, la colonisation du substrat naturel par des conidies. Il a t montr rcemment avec deux espces pionnires dominantes que (i) celle qui produit le moins de conidies prsente, par rapport lautre, des avantages qui peuvent pallier sa faible production de conidies et (ii) que linteraction entre ces deux espces est globalement dfavorable leur dveloppement mais se traduit par une augmentation du processus de dcomposition (Treton et al, 2004). La biomasse fongique, la sporulation et lactivit enzymatique des hyphomyctes aquatiques sont affectes par un certain nombre de variables. Le taux de dcomposition est influenc principalement par des facteurs abiotiques dont la qualit de la ressource dcompose (Lockaby et al. 1995), les proprits physico-chimiques du milieu (Swift et al. 1979) et la dure du temps de contact de la ressource avec lenvironnement (Lockaby and Walbridge, 1998). Les facteurs biotiques qui affectent lactivit enzymatique des hyphomyctes aquatiques ont t peu tudis. Les litires de plantes contiennent un certain nombre de polymres qui ne sont pas facilement digrs par les consommateurs animaux. Ainsi la colonisation et la dgradation microbiennes sont ncessaires pour transformer de tels dtritus en source approprie de nourriture pour des dtritivores. Les hyphomyctes aquatiques sont capables dutiliser de trs nombreux sucres comme source de carbone grce une large gamme denzymes extracellulaires qui dgradent les polymres structuraux des feuilles (Suberkropp et Klug 1981, Chamier 1985, Suberkropp 1992). Ces polymres sont fragments en oligomres (premire tape de la dgradation), puis en monomres (deuxime tape de la dgradation) par diffrents exoenzymes. Toutefois, peu dinformations sont disponibles en ce qui concerne les activits des ces exoenzymes. Une variabilit spcifique a t dcrite (Suberkropp et al., 1983), mais la variabilit infraspecifique na jamais t tudie. Par ailleurs, ce groupe de champignons est considr habituellement comme un groupe relativement homogne et gnraliste mais ces conclusions ne sont pas supports par les rsultats publis. Ainsi Suberkropp et al. (1983) ont rapport que Flagellospora curvula produit 8 fois plus dactivit pectine lyase que Tetrachaetum elegans et une activit protase qui nest pas prsente chez cette dernire. En revanche les activits -D-

galactosidase et carboxymethylcellulase de T. elegans sont 11 et 7 fois plus fortes que celles qui sont produits par F. curvula.

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION MATERIEL ET METHODES Site de prlvement Isolement et maintien des souches de champignons Collecte et conditionnement du matriel foliaire Expriences de sporulation en microcosmes Test de lactivit enzymatique Extraction et dosage de lergostrol Analyse statistique RESULTATS Influence de la temprature Influence du pH La variabilit interspcifique et infraspcifique des activits enzymatiques DISCUSSION CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

1 7 7 8 9 10 11 12

13 15 16 19 21 23

ANNEXES Annexe 2. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la a-L-arabinosidase obtenues pour la premire et la deuxime rplication

Annexe 1. Les activits enzymatiques (nm/ml/h/mg biomasse myclienne) en deux rplication

Annexe 3. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la a-Dgalactosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication Annexe 4. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la Dgalactosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication Annexe 5. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la Dxylosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication Annexe 6. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la Dglucosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication
BIBLIOGRAPHIE 26

Introduction
La dcomposition des litires vgtales est un processus central pour un ventail de systmes aquatiques terrestres et benthiques, y compris les rivires, des zones littorales de lacs, et des environnements marins ctiers (Cadisch et Giller 1997, Gessner et al. 1997). Il est connu que les apports allochtones de matire organique aux systmes aquatiques lotiques sont fondamentaux dans les parties amont des rseaux hydrographiques, pour leur fonctionnement trophique. Ces apports allochtones qui arrivent dans le milieu aquatique principalement sous forme de feuilles seront rduits en particules plus fines, et entreront ainsi dans le fonctionnement du systme aquatique. La dcomposition des feuilles est le rsultat de processus physiques (lixiviation, abrasion, fragmentation) et de processus biologiques de minralisation et de transformation, ayant pour rsultat la gnration du CO2 et d'autres composs inorganiques, dissouts (DOM) et matire organique fine-particulaire (FPOM) (Webster et Benfield 1986, Suberkropp 1998, Gessner et al. 1999). Les organismes qui conduisent ces processus incluent les macroinvertbrs dtritivores appels des dchiqueteurs (Wallace et Webster, 1996), des bactries, et des myctes filamenteux comme les hyphomyctes aquatiques (Brlocher 1992, Suberkropp 1998). videmment chacun des trois groupes joue un rle significatif dans le processus de dcomposition de la litire (Anderson et Sedell 1979, Webster et Benfield 1986, Boulton et Boon 1991, Suberkropp 1992, 1998, Gessner et al. 1997, 1999). Daprs la littrature, les myctes ont une grande importance dans la dcomposition de la litire. La biomasse fongique compte de 63% 99% de la biomasse microbienne totale associe la dcomposition de la litire (Findlay et Arsuffi 1989, Baldy et al. 1995, Weyer et Suberkropp 1996, Baldy et Gessner 1997, Gessner 1997). Les mcanismes de la colonisation des feuilles diffrent de faon saisissante entre les animaux et les micro-organismes. Les microorganismes s'tablissent sur des feuilles par la croissance aprs une fixation initiale de spores, tandis que l'accumulation de biomasse des macroinvertbrs rsulte principalement de l'immigration. En consquence, les comparaisons de la biomasse des dcomposeurs surestiment la contribution des dchiqueteurs pour la dcomposition de la litire et peut sousestimer le rle des microorganismes, en particulier celui des bactries (Hieber et Gessner 2002). Les litires de plantes contiennent un certain nombre de polymres qui ne sont pas facilement digrs par les consommateurs animaux. Ainsi la colonisation et la dgradation 1

microbiennes sont ncessaires pour transformer de tels dtritus en source approprie de nourriture pour des dtritivores. Quelques myctes transforment galement la litire en source plus attirante et priori plus nutritive pour les dtritivores invertbrs, indiquant que les myctes sont galement des intermdiaires importants du flux d'nergie entre les dtritus de feuille et les niveaux trophiques plus levs (Suberkropp, 2001). Les myctes dominant la dcomposition de litire dans les rivires sont les hyphomyctes aquatiques, un groupe cologique phylogntiquement htrogne. La biomasse fongique, la sporulation et lactivit enzymatique des hyphomyctes aquatiques sont affectes par un certain nombre de variables. Le taux de dcomposition est influenc principalement par (i) la qualit de la ressource dcompose (McClaugherty et al. 1985; Meentemeyer et Berg 1986, Lockaby et al. 1995, Cornelissen 1996, Hobbie 1996, Heal et al. 1997), (ii) les proprits physico-chimiques du milieu (la temprature et l'humidit, le pH, l'oxygne) qui affectent les communauts des dcomposeurs (Swift et al. 1979, Berg et al. 1993), et (iii) la dure du temps de contact de la ressource avec lenvironnement ( Lockaby and Walbridge, 1998) (Fig. 1). La temprature semble tre un facteur important affectant la frquence et la distribution dhyphomyctes aquatiques (Suberkropp 1984). Quelques espces sont plus communes dans les climats temprs, et d'autres sont plus communes dans les tropiques. Dans les climats temprs, des variations saisonnires dans la composition en espces peuvent se produire, avec des espces communes dans les tropiques devenant dominants pendant l't et absentes pendant l'hiver (Chauvet, E. 1991). Rcemment, l'activit des hyphomyctes aquatiques cultivs sur des feuilles a t tudie dans des microcosmes de laboratoire (Suberkropp 1991). Dans ces microcosmes, les hyphomyctes aquatiques produisent des changements dans les feuilles semblables aux changements qui se produisent dans l'environnement naturel. La temprature peut affecter les voies, les produits biochimiques de la dcomposition et les taux mtaboliques. Berg et al. (1993) ont prouv qu'une litire standard de pin prsente des produits de dcomposition plus rfractaires par unit de perte de masse accumule quand elle s'est dcompose rapidement (dans des conditions chaudes et humides) que quand elle s'est dcompose plus lentement (dans des environnements froids et secs). Dans une tude sur le terrain, Homann et Grigal (1996) ont rapport que le potentiel de dcomposition est reli de faon bimodale la temprature, avec la dcomposition augmentant basse temprature mais diminuant temprature leve. En gnral, l'activit enzymatique augmente avec la temprature, mais tombe rapidement quand la temprature s'lve au-dessus d'une valeur optimale (Coteaux et Bottner, 1995). 2

Le pH ou l'alcalinit de l'eau semble galement affecter l'activit fongique. Beaucoup dtudes ont t consacres l'impact de l'acidification de l'eau sur la qualit des litires. Elles montrent que l'acidification produit un changement des communauts microbiennes induisant un effet sur la qualit de la litire. Les macroinvertbrs sont influencs par le contenu nutritif des feuilles, donc le pH reprsente un facteur indirect qui affecte ces communauts. Beaucoup de ces tudes incluent des inventaires de bactries et de conidies et des taux bactrien de production. Quelques tudes ont t spcifiquement ralises sur dhyphomyctes aquatiques en raison de leur rle dans le traitement des feuilles pour la consommation par les dtritivores invertbrs (Chamier 1987, Groom et Hildrew 1989, Barlocher et Kendrick 1981). Ces tudes naboutissent pas une conclusion claire au sujet des effets du pH sur les communauts fongiques aquatiques. D'une part, plusieurs tudes ont montr que les hyphomyctes aquatiques prfraient des conditions neutres des conditions acide (Rosset et Barlocher 1982). D'autre part, il est rapport que le pH acide a des effets dltres sur les hyphomyctes aquatiques, en termes de diversit spcifique (Groom et Hildrew, 1989) ou sur lactivit de dcomposition de feuille (Suberkropp et Klug, 1980). Quelques auteurs ont conclu que les hyphomyctes aquatiques n'ont t ni particulirement favoriss, ni ngativement affects, et taient mme remarquablement rsistant aux effets de l'acidification (Barlocher et Peterson 1988). Ces rsultats quivoques peuvent tre en partie expliqus par les protocoles variables utiliss, par rapport la procdure d'exposition (eaux acides naturelles contre artificielles) et la mthodologie. Dans ce contexte, la pertinence cologique de beaucoup d'tudes de laboratoire peut tre remise en cause du fait de la diffrence des conditions exprimentales par rapport aux conditions naturelles. La litire de feuilles contient les rsidus de paroi cellulaire dans lesquels les constituants organiques peuvent tre distingus en cinq larges groupes: a) substances hydrosolubles ; b) polymres carbohydrates comprenant la pectine, lhmicellulose et la holocellulose ; c) lignine et d'autres composs aromatiques ; d) glycoproteines riches en hydroxyproline ; e) composs hydrophobes dont les lipides et les cires (McClaugherty et Berg, 1987). Chaque fraction possde une cintique de dcomposition exponentielle caractristique et, par consquent, toute la perte de masse de litire est la somme d'un certain nombre de fonctions exponentielles. Les substances solubles et les composs labiles sont rapidement dgrads en dbut de la dcomposition par les microorganismes croissance rapide qui peut exiger une concentration leve d'azote (Swift et al. 1979).

Variables internes: qualit de la litire

Variables externes: conditions environnementales

Structure et activit des communauts bactriennes

ACTIVITE FONGIQUE

Structure et activit des communauts fongiques

Structure et activit des communauts dinsectes broyeurs

Taux de dcomposition de la litire

Succession des espces

Modle de dcomposition de la litire

Production de biomasse fongique

Dynamique des nutriments

Reproduction des champignons

Fig. 1. Reprsentation schmatique simplifie de la dcomposition de la litire. (Modifi daprs Gessner, Suberkropp et Chauvet, 1997)

Les hyphomyctes aquatiques sont capables dutiliser de trs nombreux sucres comme source de carbone. Ces champignons possdent des potentialits enzymatiques, qui lies la temprature du milieu assurent leur dominance au sein des communauts microbiennes (Triska 1970, Kaushik et Hynes 1971, Barlocher 1982). En effet, ces champignons microscopiques dgradent plus facilement, par rapport aux bactries, les polymres vgtaux complexes, et acclrent ainsi la fragmentation du matriel (Chamier et Dixon 1982, Zemek et al. 1985). Dautre part, les champignons peuvent se dvelopper lintrieur de la matrice foliaire. Ils peuvent donc coloniser et initier la dgradation de substrats submergs dorigine allochtone aussi varis que le bois (Sanders et Anderson, 1979), les feuilles de nombreuses espces vgtales riveraines, les macrophytes, les aiguilles de conifres (bien que celles-ci referment un antifongique dans leur piderme). Les hyphomyctes aquatiques possdent une large gamme denzymes extracellulaires (endoglucanases, exoglucanases, exoglucosidases, xylanases, xylosidases, arabinosidases et pectinases) qui dgradent les polymres structuraux des feuilles (Suberkropp et Klug 1980, Suberkropp et Klug 1981, Chamier et Dixon 1982, Chamier 1985, Hasija et Singhal 1991, Suberkropp 1992). De plus, des expriences de laboratoires ont mis en vidence la capacit des hypomyctes aquatiques dgrader un substrat de substitution de la lignine (Fisher et al. 1983, Zemek et al. 1985, Zare-Maivan et Shearer 1988). Lactivit hydrolytique sur la lignine et la pectine, lments rfractaires la dcomposition, conduit au ramollissement des tissus. Il en rsulte un relargage du contenu des cellules du msophylle, et une exposition de nouveaux polymres lactivit des polysaccharidases (Chamier 1985, Chamier et al. 1984, Suberkropp 1992). Du fait de leur manque apparent de spcialisation au niveau enzymatique, les hyphomyctes aquatiques apparaissent comme un groupe relativement homogne et gnraliste, en regard de leurs exigences nutritives et de leur rle fonctionnel au sein de lcosystme (Suberkropp 1992). Peu dinformations sont disponibles en ce qui concerne les activits de dgradation de la litire en rivires. La problmatique de ce stage est la place de la variabilit infraspcifique dans la variabilit interspcifique des activits enzymatiques produites par trois espces dominantes dhyphomyctes aquatiques. Suberkropp et al. (1983) avait mis en vidence une importante variabilit interspcifique des activits enzymatiques pour 10 espces dhyphomyctes aquatiques, en utilisant un seul isolat par espce. Nos objectifs taient de dterminer les activits de plusieurs enzymes ncessaires la dgradation des oligossacharides des polymres vgtaux sur diffrents isolats de chacune des espces dhyphomyctes aquatiques prsentes sur les litires dun cours deau forestier. La temprature optimale des activits 5

enzymatiques a t dtermine. Deux pH ont t tudis. Les rsultats permettront dapprcier dans quelle mesure le remplacement des espces est possible au sein des communauts dhyphomyctes aquatiques. Pour raliser cette tude, nous avons utilis trois espces frquemment prsentes en dbut de dcomposition dans les rivires du Sud Ouest de la France: Tetrachaetum elegans, Flagellospora curvula et Articulospora tetracladia. La production des exoenzymes a t ralise en microcosmes partir de disques foliaires de chne sessile (Quercus petraea) aprs la colonisation par du myclium de chacune de ces espces.

Matriel et mthodes
1. Site de prlvement
La collecte du matriel foliaire et lisolement des souches de champignons ont t fait au bord du ruisseau dOrval. Ce ruisseau est localis prs de Sorze (Tarn, France) la latitude 43 26 22 N, longitude 2 5 43 E et altitude 470 m. La temprature au moment du prlvement tait de 4,5 C, le pH 6,85, lalcalinit TAC 61,7 mgCaCO3/L, la conductivit 61,7 S.cm-1. Loccupation des sols est constitue par une fort mixte.

2. Isolement et maintien des souches de champignons

Trois espces, Tetrachaetum elegans, Articulospora tetracladia et Flagellospora curvula, ont t utilises dans cette tude. Les isolements ont t raliss en novembre 2004. Ces trois espces dhypomyctes aquatiques sont pionnires en automne en assurant le dbut de la dgradation des feuilles. Les spores de F. curvula sont des spores sigmodes longues entre 70 100 m. Les spores de A. tetracladia sont des petites spores tetraradies avec un premier bras long de 20 30 m et trois autres bras longs de 36 75 m, alors que les spores tetraradies de T. elegans sont de grande taille entre 150 200 m (Fig. 2). Seize isolements monosporiques de T. elegans, 8 de A. tetracladia et 12 de F. curvula taient raliss partir de 3 feuilles drable, 5 feuilles de noisetier, 6 feuilles de chtaigner, 8 feuilles de frne, 7 feuilles de htre, 4 feuilles de chne et 3 feuilles de robinier. Les souches ont t maintenues sur milieu solide MEA (extrait de malt 2% et agar 2%).

c
Fig.2. Spore de F. curvula (a), spore de A. tetracladia (b) et spore de T. elegans (c) colores au bleu trypan, aprs 12 jours de sporulation en microcosme et filtration sur une membrane de nitrate de cellulose. Les photographies sont accompagnes des dessins des spores (Chauvet, 1990)

3. Collecte et conditionnement du matriel foliaire

Les feuilles de chne (Quercus petraea) ont t collectes en automne juste aprs leur chute. Les feuilles dj attaques par les invertbrs, ou qui montraient une colonisation visible lil nu par des champignons ou des moisissures, ont t cartes. Ces feuilles ont t ensuite congeles en attendant dtre utilises. 8

Au laboratoire, elles ont t dcongeles lair libre et des disques de 1 cm de diamtre ont t dcoups laide dun emporte pice pour les expriences en microcosme. La dcoupe a t faite de faon inclure une nervure secondaires dans chaque disque pour avoir une qualit de matriel foliaire la plus homogne possible. Les disques de feuilles ont t spars les uns des autres et schs lair libre sur un papier absorbant. Puis ils ont t autoclavs dans une bote de Ptri en verre selon un cycle solide 121 C pendant 30 minutes.

4. Expriences de sporulation en microcosmes

Un modle de microcosme labor par Suberkropp (1991) a t utilis (Fig. 3). Une pompe, relie un dbitmtre injectant de lair un dbit de 80 100 mL par minute, assure le bullage, quatre orifices permettant laration. Lensemble des manipulations est ralis en conditions striles.

Couvercle

Expansion avec quatre orifices daration 12 cm Sortie de drainage avec pinces 3.3 cm

Tuyau daration reli la pompe Rondelles de feuilles

Fond rond

Fig. 3 Le model de microcosme dcrit par Suberkropp (1991), utilise pour les expriences

Huit rondelles de feuilles taient disposes sur chaque bote de culture de Tetrachaetum elegans, Articulospora tetracladia et de Flagellospora curvula, afin quelles soient colonises par le champignon pendant 7 jours. Avant de poser les rondelles de feuilles sur le myclium, elles taient rhydrates par incubation dans leau dminralise pendant 9

une nuit, la temprature ambiante. Puis ces disques taient transfrs dans des microcosmes striles contenant 15 ml de milieu sporulation contenant 10 mg KNO3, 0.55 mg K2PO4, 0,5 g MOPS, 0.1 g CaCl2 2H2O, 10 mg MgSO4 7 H2O, 1 L deau distille ajuste pH 7.0 avec une solution de potasse 1 M (Suberkropp 1991). Ceci permet de se replacer dans des conditions proches de la rivire o les spores colonisent du matriel dj imbib et en partie lessiv. Les microcosmes ont t incubs une temprature de 15 C durant 4 jours. Le milieu de sporulation a t filtr sur papier (n 50, Whatman International Ltd, England) et du thimerosal (Sigma) a t ajout (0,01% final) pour linhibition du dveloppement microbien. Aprs la filtration, les rondelles de feuilles taient conserves -18 C, jusqu'au dosage dergostrol. Le filtrat par microcosme est disponible pour tester lactivit enzymatique dhyphomyctes. Deux colonisations sur le mme myclium ont t faites pour pouvoir comparer statistiquement les rsultats.

5. Test de lactivit enzymatique

Lactivit enzymatique de la -L-arabinofuranosidase, -D-galactosidase, -Dgalactosidase, -D-xylosidase et -D-glucosidase a t estime par lhydrolyse respective d es p-nitrophenyl -L-arabinose, p-nitrophenyl -D-galactose, p-nitrophenyl--D-galactose, pnitrophenyl--D-xylose et p-nitrophenyl--D-glucose (Sigma). Pour tester lactivit enzymatique diffrentes tempratures, un milieu ractionnel contenant 50 L de filtrat et 50 L de substrat (tampon actate de potassium pH 4,9 dans 4nitrophenyl--D-glycoside spcifique pour chaque enzyme, 0,5 mg/ml) a t incub 5, 15, 25, 30, 40, 50 60 et 70 C, pendant 3 heures. Pour les contrles, le filtrat et le substrat taient incubs sparment. Les ractions taient stoppes et la coloration dveloppe en ajoutant 100 L Na2CO3. Pour dterminer linfluence du pH sur lactivit enzymatique, un milieu ractionnel contenant 50 L de filtrat et 50 L de substrat pH 4,9 et 7,4 a t incub 30C. Les activits enzymatiques taient dtermines par diffrence entre les essais exprimentaux et les contrles en comparant les absorbances avec une courbe de pnitrophenol standard. La courbe de p-nitrophenol standard est constitue de 8 points de diffrentes concentrations de p-nitrophenol (1 14 M). Les densits optiques taient mesures au spectrophotomtre NanoDrop (ND-1000, NanoDrop Technologies, 1mm de trajet optique), la longueur donde de 400 nm. Des essais prliminaires de comparaison des mesures avec un spectrophotomtre UVIKO 930 (Kantron, 10

10 mm de trajet optique) ont t effectues pour vrifier la validit des mesures faites au ND-1000. Lactivit enzymatique est calcule partir de la relation linaire suivante: D.O. = a x [PNP] La formule finale de calcul pour lactivit enzymatique en nmoles/ml/h est :

( D.O. E - D.O.C)
X

3a
D.O. - densit optique mesure D.O. E - densit optique dans les essais D.O. C - densit optique dans les contrles a la pente de la droite de la gamme talon Le rsultat est rapport la biomasse myclienne pour exprimer lactivit enzymatique en nmoles/ml/h/mg biomasse fongique.

6. Extraction et dosage de lergostrol

Extraction Les rondelles de feuilles conserves -18C aprs filtration des microcosmes taient lyophilises et ensuite peses ( 0.1 mg). Aprs une incubation dune nuit 4 C dans 5 ml dune solution 8 g/L KOH dans le mthanol, les chantillons taient incubs 80 C sous agitation pendant 30 minutes. Les cartouches (OASIS HLB 3CC 60 mg 100 BX, Waters) taient conditionnes en faisant passer par gravit sans les asscher 1 ml de mthanol, puis 1 ml de solution Mthanol-KOH/Mthanol-HCl 0,65 M (0.15-0.70-0.15). Trois ml dchantillon pralablement acidifi pH < 3 en ajoutant 1 ml dHCl 0,65 M sont charges sur la cartouche. Un ml de solution de 0,5 % mthanol dans leau a t utilis pour laver les cartouches. Ensuite, les cartouches taient sches sous dpression douce pendant une heure. Un standard a t fait en utilisant 100 l dergostrol (200g/ml) dans 5 ml KOH/Mthanol. Des fioles vides numrotes et peses taient connectes aux cartouches. Ensuite, les cartouches taient lues avec 3 x 400 L puis 1 x 200 L disopropanol pour rcuprer lergostrol immobilis.

11

Dosage Les fioles pleines peses taient places dans le dispositif pour doser lergostrol par HPLC en phase mobile de mthanol, flux 1,4 ml/min, colonne tempre 33C, dtection 282 nm, volume dinjection 10L. La formule finale de calcul pour la quantit dergostrol dans lchantillon est:

A 774

(m - t) 0.785 r

x 2

A aire du pic (V/min) 774 la pente de la gamme talon m masse de la fiole contenant lextrait isopropanolique t tare de la fiole 0.785 densit de lisopropanol r - rendement La concentration dergostrol (g/g de matire sche) est calcul en rapportant la quantit dergostrol dans lchantillon la masse foliaire sche.

7. Analyse statistique
Le traitement statistique des donnes a t ralis avec le logiciel Statistica. Les analyses de variance (ANOVA) hirarchises ont t effectues en subordonnant la variable dpendante isolat la variable espce . Des tests t de Student ont t effectus pour comparer les moyennes des valeurs des activits enzymatiques obtenues pour les deux colonisations et le coefficient de corrlation calcul. Le seuil de signification a t fix p = 0.05.

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RESULTATS
Les activits enzymatiques ont t calcules partir des densits optiques mesures au spectrophotomtre. La biomasse myclienne a t estime pour tenir compte du fait que la colonisation des disques des feuilles peut tre diffrent pour chaque individu.

1. Influence de la temprature
Dans un premier essai, des disques foliaires ont t coloniss par le myclium et lactivit enzymatique de la -L-arabinosidase et -D-glucosidase ont t dtermines 5, 15, 25, 30, 40 C pour deux isolats de chaque espce. Un deuxime essai a t fait pour dterminer loptimum de temprature et approcher la variation infraspcifique et interspcifique de celui-ci. La colonisation des disques foliaires a t faite par les mmes souches et lactivit enzymatique de -L-arabinosidase et de -D-glucosidase a t teste 30, 40, 50, 60 et 70 C. Les activits -L-arabinosidase et -D-glucosidase dtectes augmentent avec la temprature. Pour les trois espces des myctes tudies, les valeurs de lactivit de -L-arabinosidase et de -D-glucosidase 5 C que a 30 C (la temprature de rfrence fixe au niveau international) sont de 2,88 4,14 pour -L-arabinosidase et de 3,15 8,23 fois faibles. (Fig.4).
40
40

a
35
35

b
Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)
30

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

30

25

25

20

20

15

15

10

10

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temperature (C)

Temperature (C)

Fig. 4. Lactivit enzymatique de -L- arabinosidase (a) et de -D-glucosidase (b) en fonction de la temprature. T. elegans 11, T. elegans 15, F. curvula 4, F. curvula 8, A. tetracladia 5, - A. tetracladia 8

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Les rsultats du deuxime essai ont t obtenus partir de filtrats issus de la deuxime colonisation. Il apparat que lactivit enzymatique de -L-arabinosidase prsent un optimum de temprature entre 40 et 60 (Fig. 5). F. curvula 1696 prsente un optimum caractristique 40 C, alors que pour les autres isolats, la courbe prsente plutt un plateau.
40
40

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

a
Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

b
35 30

35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80

25

20

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10

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperature (C)

Temperature (C)

Fig. 5. Lactivit enzymatique de -L- arabinosidase (a) et de -D-glucosidase (b) en fonction de la temprature. T. elegans 11, T. elegans 15, F. curvula 4, F. curvula 8, A. tetracladia 5, - A. tetracladia 8

Lactivit de -D-glucosidase prsente des optima de temprature entre 4060 (Fig.5). les isolats peuvent tre rpartisses en quatre classes : 1. F. curvula 1696 avec un optimum 40 C, 2, T. elegans 1733 et F. curvula 1684 avec un optimum 50 C, 3, A. tetracladia 1657 avec un maximum 60 C et T. elegans 1741 et A. tetracladia 1665 avec un plateau entre 40-60C. Comme attendu, lanalyse ANOVA montre un effet significatif de la temprature sur lactivit enzymatique de ces deux enzymes. galement, il apparat un effet individu sur les activits de ces enzymes, fait qui montre une variabilit infraspcifique pour les espces tudies concernant la rponse en fonction de la temprature.

14

2. Influence du pH
Suberkropp et al. (1983) ont tests lactivit de diffrentes enzymes pour 10 espces dhyphomyctes aquatiques. Cependant, les conditions exprimentales utilises dans cette tude pour valuer les activits enzymatiques ntaient pas appropries puisque les substrats etaient solubilises dans une solution dactate de potassium 0,1 M. La solution ntait pas tamponne, le pH pouvant varier au cours de lincubation. Dans notre tude, nous avons compar les activits de -D-glucosidase un pH 7,4 (le pH de la solution utilise par Suberkropp et al.) et pH 4,9 (tampon actate de potassium). Ce dernier pH correspond au pouvoir tampon optimum de la solution tampon dactate de potassium et est voisin de la moyenne des pH optimum ( pH 5,4) des b-D-glucosidases des organismes (principalement des champignons) rpertories dans la base Enzyme Data and Metabolic Information BRENDA (www.brenda.uni-koeln.de; Institute of Biochemistry, University of Cologne). Il apparat que lactivit de -D-glucosidase est plus importante un pH acide qu un pH neutre (Fig.6). Puis que lactivit enzymatique est de 6,47 (A. tetracladia) 13,17 (F. curvula) fois plus forte.

3,5

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

pH 4,9 pH 7,4

A. tetracladia

T. elegans Espece

F. curvula

Fig. 6. Influence du pH sur lactivit de la -D-glucosidase

Le pH de 4,9 a donc t utilis pour la dtermination des activits enzymatiques sur lensemble des isolats. 15

3. La variabilit interspcifique et infraspcifique des activits enzymatiques

Les activits des enzymes de dpolymrisation ultime des polysaccharides dtectes dans les filtrats de chaque individu sont prsentes dans lAnnexe 1. Les espces tudies prsentent des capacits dgradatives pour 4-nitrophenyl -L-arabinose, 4-nitrophenyl -Dgalactose, 4-nitrophenyl -D-galactose, 4-nitrophenyl -D-glucose et 4-nitrophenyl -D-xylose. Pour toutes les espces, les activits arabinosidase et glucosidase apparassent les plus levs par rapport aux autres enzymes. Entre les espces dhyphomyctes examines, Tetrachaetum elegans pressent lactivit enzymatique la plus leve pour toutes les enzymes dans les filtrats sauf pour la -D-glucosidase qui est plus scrte par F. curvula (Fig.7). Les activits arabinosidase et glucosidase diffrent entre les espces.

3,5

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 arabinosidase glucosidase b galactosidase ENZYME a galactosidase xylosidase THEL ARTE FLCU

Fig. 7. Moyennes des activits enzymatiques de T. elegans (THEL), A .tetracladia (ARTE) et F. curvula (FLCU)

Dans la Fig. 8, il apparat que tous les individus des espces tudies (sauf A2) prsentent des activits arabinosidase. Pour chaque espce, il est observe que les activits enzymatiques produites diffrent entre les individus. Les individus A4, F4 et T8 prsentent des fortes capacits de dgradation de larabinose en comparaison avec les activits plus faibles montres des A2, F5, T10. Les diffrences entre les capacits individuelles de dgradation darabinose sont statistiquement significatives (ANOVA, p<0,0001). Il existe galement un effet espce , mais

16

les activits produites par les individus de chaque espce couvrent sensiblement la mme chelle dactivit.

4,5

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A. tetracladia

F. curvula
Souche/Espece

T. elegans
ARTE

Fig. 8. Les activits enzymatiques de -L-arabinosidase produites par lensemble des isolats Concernant les activits -D-glucosidase produites, il apparat que chaque espce prsent des individus avec des fortes capacits enzymatiques (A4, F4, T15) et des autres avec des capacits plus faibles (A2, F10, T10) (Fig. 9). Statistiquement il est montre la variabilit interspcifique des activits de -D-glucosidase produites par ces espces fongiques. Il est intressant de noter que les activits enzymatiques les plus importantes -L-arabinosidase et -D-glucosidase sont produites par les mmes individus de F. curvula et A. tetracladia.
4,5

Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A. tetracladia

F. curvula
Souche/Espece

T. elegans
ARTE

Fig. 9. Les activits enzymatiques de -D-glucosidase produites par lensemble des isolats

17

Les activits enzymatiques de -D-galactosidase, sont plus faibles (Fig. 10). Les activits obtenues pour -D-galactosidase (maximum 0.25 nm/ml/h/mg biomasse myclienne) et -D-xylosidase (0.24 nm/ml/h/mg biomasse myclienne) ne sont pas montres car les valeurs sont approches de 0. En consquence, les interprtations sont limites. Malgr les faibles activits observes, les mmes chelles dactivit sont retrouves chez les trois espces.

4,5
Activit enzymatique (nm/ml/h/mg biomasse fongique)

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A. tetracladia

F. curvula
Souche/Espece

T. elegans
ARTE

Fig. 10. Les activits enzymatiques de -D-glalactosidase produites par lensemble des isolats

18

DISCUSSION
Aucune tude na t ralise sur la variabilit infraspcifique des activits enzymatiques produits par les hyphomyctes aquatiques et ses consquences pour le processus de dcomposition des litires dorigine terrestre immerges dans les cours deau. Les mesures des activits enzymatiques spcifiques sont essentielles dans la caractrisation des capacits dgradatives des myctes croissant sur la litire vgtale et la dtermination des types de substrats qui peuvent tre dgrads dans un ensemble particulier de conditions. Les activits enzymatiques spcifiques montres dans les tudes de laboratoire ne refltent pas ncessairement le taux auquel chaque espce dgrade un substrat de spcifique. Les tudes sur le rle fonctionnel des dcomposeurs fongiques doivent confronter les activits relles des populations fongiques dans le milieu naturel aux donnes obtenues dans les conditions artificielles de culture du laboratoire. La plupart des hyphomycets aquatiques utilisent les polysaccharides pectiques et les hemicelluloses (Chamier, 1985). Chamier et al (1984) montre des importantes activits enzymatiques cellulolytiques pour cinq des sept espces tudies. Actuellement, les diffrences enzymatiques nexpliquent pas les interactions existantes entre les hyphomycets aquatiques. Tandis que Tetracladium marchalianum, Lemonniera aquatica et Heliscus lugdunensis prsentent des fortes activits cellulolytiques (Suberkropp et Klug, 1981, Suberkropp et al. 1983, Chamier et al. 1984) les premires peut tre dominantes alors que la troisime est gnralement rare. Dautres comme Tricladium splendens, Lunulospora curvula et Tetrachaetum elegans montrent des activits variables selon des tudes (Suberkropp et al. 1983, Chamier et al. 1984) alors que la dernire est habituellement une espce pionnire dominante. Ces observations peuvent tres expliques par les techniques utilises ou par le fait que les activits enzymatiques ne sont pas constantes et quelles peuvent varier de rivire rivire (Barlocher, 1992) ou dindividu indi vidu dans la mme rivire. Si la rponse est donne par la dernire hypothse, alors on peut conclure que les espces de champignons aquatiques noccupent pas une seule niche dfinie par leurs capacits enzymatiques. Dans ce travail il apparat une analogie entre les activits enzymatiques produites par A.tetracladia, F. curvula et T. elegans. Le manque de spcificit prsent par les hyphomyctes aquatiques pour les diffrents types de litires peut tre li la similitude dans le rapport des exoenzymes produits par ces myctes (Suberkropp, 1992). Ceci n'exclut pas la possibilit que les diffrences dans les caractristiques des enzymes puissent changer les rles fonctionnels des 19

myctes dans la dgradation de la litire. Cette tude montre que les espces tudies prsentent des capacits produire les enzymes testes dont les activits peuvent varier avec le pH et la temprature. Les faibles valeurs concernant les activits enzymatiques de -D-galactosidase, -D-galactosidase et -D-xylosidase peuvent tre expliques par une diffrence de pH ou de temprature optimale par rapport aux conditions utilises (pH 4,9, 30 C). Il serait donc ncessaire de dterminer les optimum de temprature et pH des ces enzymes. De plus, pour interprter nos rsultats, le pH interne de la litire il devrait tre prise en compte. Les bactries prsentent des capacits se dvelopper lintrieur des feuilles et pourrait induire un changement de pH. Aucune tude na pris en compte le pH interne de la litire. Les bactries prsentent des capacits se dvelopper dans lintrieur des feuilles et pourrait induire un changement de pH. La diffrence dactivit de-D-glucosidase (plus importante pH 4.9 qua pH 7 proche de pH de la rivire) pourrait donc tre expliqu par une modification du pH dans le microenvironnement des hyphes mycliennes. Loptimum de temprature observ dans notre tude est montr dans la littrature (Raisonnier, 2002). Au dessus de 40 ou 45 C la chaleur commence dnature les structures secondaires et tertiaires de lenzyme. En revanche, laugmentation de temprature apporte de lnergie qui facilite la raction enzymatique. Les rsultats et les interprtations exposs dans cette tude sur lactivit de -Darabinosidase (un enzyme impliqu dans la dgradation de la pectine) sont limits d la non prise en compte des rsultats de la deuxime rplication. Il apparat clairement que les activits enzymatiques et la biomasse myclienne pour toutes les espces tudies sont plus faibles dans la deuxime colonisation. Le fait que la deuxime colonisation de disques de feuilles ait t faite sur le mme myclium, a pu induire des changements concernant les activits enzymatiques. En revanche, les activits enzymatiques observes pour la -D-glucosidase (un enzyme impliqu dans la dgradation de la cellulose et de lhmicellulose) rsultent dune moyenne des valeurs de la premire et de la deuxime colonisation. Cependant, les rsultats obtenus dans notre tude concernant la variabilit interspcifique des activits enzymatiques sont confirms par la littrature. Suberkropp et al (1983) avaient tudi les activits enzymatiques des dix espces, en utilisant un isolat monosporique pour chaque espce. Il apparat que Flagellospora curvula et Tetrachaetum elegans prsentent des activits importantes d-D-arabinosidase et -Dglucosidase, mais des activits plus faibles des -D galactosidase, -D-galactosidase et -Dxylosidase. Comme Suberkropp et al. (1983) nous avons aussi observ que T. elegans prsente des activits enzymatiques plus importante que F. curvula. 20

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
En ce qui concerne nos objectifs premires, les rsultats de la prsente tude mnent trois conclusions essentielles. 1. Les espces dhyphomyctes aquatiques tudies prsentent une variabilit interspcifique concernant les activits enzymatiques de -L-arabinosidase et -Dglucosidase. 2. Les activits enzymatiques au sein de chaque espce prsentent des variations infraspcifiques. 3. Le remplacement des individus dune espce par des individus dautres

espces pour raliser la dcomposition des litires est possible, car nous avons montr que des individus appartenant une espces peuvent avoir des activits enzymatiques comparables avec des activits dindividus dune autre espce. Il serait aussi important daugmenter le nombre de rplications afin de vrifier la reproductibilit des rsultats obtenus au cours de ce travail. Il serait envisager de chercher dans les expriences suivantes le pH et la temprature optimales pour les activits enzymatiques des espces tudies (gamme de pH et de temprature). Dautre part, il serait intressant de recommencer cette exprience en tenant compte de leffet de la colonisation sur les activits enzymatiques. Il faudra envisager des expriences dans lesquelles la colonisation se faite partir dune culture frache. Il serait ncessaire afin de mieux comprendre les processus de colonisation du matriel foliaire, de raliser des ensemencements qui permettraient de dterminer les activits enzymatiques dune nouvelle espce sur une feuille dj occupe et les interactions entre les diffrentes espces dhyphomyctes. Il serait aussi intressant dtudier les ventuelles diffrences dactivits enzymatiques en colonisant les deux faces de la feuille, elles ne prsentent pas la mme structure, la face suprieure contenant plus de cutine et de polymres complexes rfractaires la dgradation que la face infrieure. Lutilisation des autres espces de feuilles plus ou moins dgradables permettrait de voir si les rponses sont les mmes suivant le substrat et les espces dhyphomyctes aquatiques. Dans tous les cas il faudra comparer les rsultats avec des litires colonises par des spores, comme dans le milieu naturel. Au cours de ce stage, on a observ que le dpt de disques foliaires sur le myclium induit un effet positif sur la croissance fongique. Une hypothse pour cette observation est que puisque les disques feuilles sont hydrates pendant une nuit avant dtres poss sur le myclium, leau ajoute au moment de la colonisation prsente un effet sur la croissance myclienne (le milieu se dessche au cours de lincubation). Une deuxime hypothse est que le milieu de culture malt 2% agar 2% nest pas dune richesse qui ne convient pas aux hyphomyctes aquatiques et que 21

la litire contient des composs qui pourraient favoriser la croissance myclienne. Des expriences en botes Petri avec des disques foliaires secs et humides, des disques de filtres en microfibre de verre secs et humides et de filtre de cellulose secs et humides, pourrait aider a prciser les effets de la qualit de la litire sur la croissance myclienne via les activits des exoenzymes produits. Lexplication de cet effet peu conduire mieux comprendre la physiologie de ce groupe fongique et son importance dans la structuration des communauts. Le substrat apparat comme un facteur important dans linteraction entre les espces (Treton, 1999). En effet, il prsente des composes rfractaires, mais aussi toxiques (tanins et autres polyphnols) qui inhiberaient le dveloppement des champignons. Dans ce contexte, il serait intressant dobserver les prfrences de substrats partir dindividus rcuprs en rivire sur une litire donne et dtudier dans quelle mesure ils peuvent dcomposer dautres litires. ce niveau, le typage molculaire interviendra comme outil de caractrisation des individus. Pour les hyphomyctes aquatiques, les dbris de bois servent comme habitat, rservoir, ressource nutritives, site pour la reproduction et comptition et de moyen de dispersion longue distance (Shearer, 1992). La persistance de ce substrat est plus importante que celle des feuilles: il peut traverser diffrentes saisons avec des conditions environnementales et diffrentes communauts dhyphomyctes aquatiques peuvent sy dvelopper. Il ap parat donc intressant dtudier les interactions dhyphomyctes aquatiques sur les dbris de bois et les capacits de dgradation de ce substrat dans des conditions de comptition. Une tude dans laquelle seraient examines les activits enzymatiques des espces dhyphomyctes aquatiques en comparaison avec des espces dhyphomyctes terrestres pourrait conduire mieux comprendre la physiologie et les adaptations de ce groupe de champignons. De plus, car il existe de formes sexues qui se dveloppent sur le bois et des formes asexues qui sont trouver sur la litire, il serait intressant dtudier la production des enzymes sur ces substrats.

22

ESPECE SOUCHE 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

ARTE

FLCU

THEL

arabino arabino alfa alfa beta beta gluco gluco I II galacto I galacto II galacto I galacto II xylo I xylo II I II 2,14 1,73 0,00 0,07 0,27 0,19 0,00 0,00 0,64 0,62 0,03 0,16 0,00 0,00 0,05 0,12 0,00 0,00 0,32 0,41 1,59 0,00 0,20 0,06 0,57 3,51 2,78 0,00 0,00 0,19 0,39 0,00 0,00 1,21 1,01 2,65 1,63 0,00 0,00 0,19 0,27 0,00 0,00 0,87 0,82 1,83 2,67 0,00 0,00 0,12 0,26 0,00 0,16 0,41 0,65 1,96 1,22 0,19 0,03 0,19 0,28 0,00 0,00 1,14 0,59 3,31 2,04 0,24 0,16 0,25 0,18 0,00 0,00 1,14 1,02 1,33 1,06 0,13 0,02 0,25 0,30 0,03 0,00 1,16 0,84 0,98 1,50 0,14 0,02 0,23 0,27 0,08 0,00 0,49 0,96 1,81 2,09 0,00 0,06 0,31 0,37 0,00 0,18 0,92 1,78 2,94 2,96 0,25 0,07 0,45 0,39 0,00 0,00 3,12 3,44 0,95 1,49 0,00 0,00 0,10 0,65 0,00 0,00 0,39 1,16 1,26 1,51 0,00 0,00 0,14 0,35 0,00 0,00 0,65 0,69 1,07 2,05 0,02 0,08 0,13 0,37 0,00 0,00 0,52 1,07 2,22 1,91 0,00 0,04 0,35 0,40 0,00 0,00 1,34 1,11 1,69 1,72 0,00 0,00 0,18 0,25 0,09 0,00 0,66 1,66 1,17 1,33 0,00 0,00 0,10 0,13 0,00 0,00 0,29 0,60 1,60 1,01 0,00 0,00 0,27 0,21 0,00 0,00 1,38 1,25 1,57 1,60 0,04 0,08 0,23 0,34 0,00 0,00 0,91 0,61 2,21 2,73 0,04 0,05 0,25 0,27 0,00 0,00 0,48 0,61 1,88 2,07 0,00 0,05 0,20 0,23 0,00 0,05 0,85 1,07 3,90 5,69 0,07 0,21 0,45 0,67 0,00 0,00 0,44 0,56 2,37 2,44 0,11 0,08 0,24 0,34 0,24 0,03 0,51 0,68 2,39 1,52 0,00 0,05 0,19 0,19 0,04 0,00 0,51 0,47 3,68 1,59 0,00 0,02 0,32 0,14 0,00 0,00 0,82 0,22 3,01 1,22 0,07 0,03 0,29 0,11 0,02 0,03 0,88 0,24 4,22 1,99 0,07 0,07 0,41 0,21 0,09 0,03 1,00 0,32 1,35 1,15 0,08 0,00 0,19 0,14 0,05 0,00 0,36 0,46 1,04 1,00 0,12 0,06 0,07 0,12 0,00 0,00 0,18 0,09 2,58 1,05 0,05 0,07 0,35 0,14 0,05 0,03 1,07 0,46 1,18 0,80 0,16 0,02 0,14 0,06 0,08 0,05 0,95 0,33 3,70 2,45 0,21 0,10 0,36 0,28 0,05 0,00 0,73 0,46 3,08 2,30 0,12 0,00 0,30 0,25 0,07 0,00 0,83 0,41 3,41 1,64 0,15 0,02 0,35 0,11 0,08 0,10 1,30 1,00 2,81 2,51 0,17 0,01 0,36 0,16 0,07 0,00 0,61 0,61

Annexe 1. Les activits enzymatiques (nm/ml/h/mg biomasse myclienne) en deux rplication

23

3,50

Activit enzymatique arabinosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

y = 0,3588x + 0,9641 R2 = 0,3034

3,00

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00 0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

Activit e nzym atique arabinos idas e (nm /m l/h/m g biom as s e )

Annexe 2. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la a-Larabinosidase obtenues pour la premire et la deuxime rplication
Activit enzymatique a-galactosidase (nm/ml/h/mg biomasse)
0,25 y = 0,1992x + 0,028 R2 = 0,1074 0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Activit enzymatique a-galactosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

Annexe 3. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la a-Dgalactosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication
0,80 y = 0,2389x + 0,2045 R2 = 0,0326

Activit enzymatique b-galactosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

Activit enzymatique b-galactosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

Annexe 4. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la-Dgalactosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication

24

0,20 0,18

y = 0,0604x + 0,0171 R2 = 0,0048

Activit enzymatique xylosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Activit enzymatique xylosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

Annexe 5. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la-Dxylosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication
4,00 y = 0,8297x + 0,1194 R2 = 0,5128

Activit enzymatique b-glucosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

Activit enzymatique b-glucosidase (nm/ml/h/mg biomasse)

Annexe 6. La courbe de tendance et le coefficient de corrlation pour les activits de la-Dglucosidase obtenues entre la premire et la deuxime rplication

25

Bibliographie
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