UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS E.A.P. DE GENTICA Y BIOTECNOLOGA

ALUMNAS: ASIGNATURA: PROFESOR: AO DE ESTUDIOS: SEMESTRE ACADEMICO: TEMA:

Jimnez Espinoza, Alejandra Katia Villafani Bravo, Yvette Vernica Ingeniera Bioqumica Raymundo Erazo Erazo Cuarto ao 2010-I y por lote y y flujo continuo

07100067 07100071

con

FECHA DE ENTREGA:

Mircoles, 11 de Agosto de 2010 Lima, Ciudad Universitaria, 2010

SEMINARIO III

Modelos y mecanismos de reaccin enzimtica con inhibidores:

Cintica y diseo de biorreactores por lote y de flujo continuo

1. Antecedentes de las enzimas

2. Propiedades y caractersticas de las enzimas

3. Introduccin a la cintica bsica de las enzimas

4. Ecuacin de Michaelis-Menten

5. Accin de efectores sobre la actividad enzimtica

6. Biorreactores enzimticos: Cintica y diseo de biorreactores por lote y de flujo continuo

Reactor por lotes Reactor de flujo continuo (CSTR y PFTR)

7. Inhibicin en los reactores enzimticos

8. Bibliografa

9. Anexos

ANTECEDENTES DE LAS ENZIMAS La palabra enzima se deriva del griego que significa en las levaduras y fue usada primero por Kuhne en 1878. Sin embargo, el primer informe publicado acerca de la capacidad de los extractos celulares (malta) para llevar a cabo una reaccin caracterstica de las clulas vivas (la hidrlisis del almidn a glucosa) fue escrito inicialmente en 1833 por Payen y Persoz. Ms tarde, Buchner (1897) demostr la capacidad de los extractos de levadura para catalizar la conversin de azcar a alcohol, mientras que Emil Fischer (1894) demostr la especificidad de las enzimas para su substrato. Subsecuentemente, Sumner (1926) cristaliz la primera enzima, la ureasa, la cual hidroliza la urea a CO2 y NH3 y mostr que las enzimas eran protenas. Fue hasta la dcada de los aos sesenta que se conoci la composicin qumica precisa de las enzimas mediante la secuencia de la ribonucleasa, junto con los estudios de conformacin tridimensional por cristalografa de rayos X. Estos trabajos permitieron que se postulara el mecanismo de accin enzimtica, junto con loas proposiciones para la forma que en sta se regula. Por ltimo, en 1969 se sintetiz qumicamente la primera enzima (ribonucleasa) a partir de los aminocidos precursores y, aunque su actividad y su pureza eran escasas, se demostr que las enzimas no son cualitativamente distintas a los catalizadores no biolgicos. Una enzima, E, es una protena o sustancia tipo protena con propiedades catalticas. Un sustrato, S, es la sustancia que se transforma qumicamente a velocidad acelerada gracias a la accin de la enzima sobre ella. Una propiedad importante de las enzimas es que son especficas en cuanto a que una enzima solo puede catalizar una reaccin. Por ejemplo, una proteasa hidroliza nicamente enlaces especficos entre aminocidos especficos en las protenas, una amilasa acta sobre enlaces entre molculas de glucosa en el almidn, y una lipasa ataca a las grasas, degradndolas a cidos grasos y glicerol. Por tanto, es fcil controlar los productos indeseables. Solo los organismos vivos producen enzimas, y las enzimas comerciales normalmente son producidas por bacterias. Las enzimas casi siempre operan (es decir, catalizan reacciones) en condiciones suaves: pH de 4 a 9 y temperaturas de 24 a 71 C. En la figura 7-10 se muestra un esquema de la enzima quimotripsina. En muchos casos, los sitios catalticos activos de la enzima se encuentran en los puntos donde interactan los diversos bucles. En el caso de la quimotripsina, los sitios catalticos se marcaron con los nmeros 57, 102 y 195 en la figura 7-10.

La mayora de las enzimas se nombra en trminos de la reaccin que cataliza. Se acostumbra aadir el sufijo asa a una parte importante del nombre del sustrato sobre el que la enzima acta. Por ejemplo, la enzima que cataliza la descomposicin de la urea es ureasa y la que ataca la tirosina es la tirosinasa. Existen tres tipos principales de reacciones enzimticas: I. II. III. Enzima soluble-sustrato insoluble Enzima insoluble-sustrato soluble Enzima soluble-sustrato soluble

Un ejemplo de reaccin de tipo I es el uso de enzimas como las proteasas o amilasas en los detergentes para la ropa; sin embargo, esta reaccin enzimtica ha causado cierta controversia en relacin con la contaminacin del agua. Una vez en solucin, la enzima soluble podra dirigir (es decir, descomponer) un sustrato insoluble como una mancha de sangre. Actualmente se esta intensificando la investigacin de las reacciones tipo II. Al unir grupos enzimticos activos a superficies slidas se pueden crear unidades de procesamiento continuo similares al reactor de lecho cataltico empacado que veremos en el capitulo 10. Es evidente que la ms intensa actividad en el estudio de las enzimas ha estado relacionada con las reacciones biolgicas, porque se ha demostrado que prcticamente todas las reacciones de sntesis y degradacin en las clulas vivas se controlan y catalizan con enzimas especificas. Muchas de estas reacciones son homogneas en la fase liquida; es decir, son reacciones tipo III (enzima solublesustrato soluble). En la breve presentacin que sigue nos limitaremos a la reacciones tipo III, auque se ha comprobado que las ecuaciones que se obtienen son aplicables a las reacciones tipo I y tipo II, en ciertos casos. Al desarrollar algunos de los principios elementales de la cintica de las reacciones enzimticas, estudiaremos una reaccin enzimtica que Levine y LaCourse han 4

sugerido como parte de un sistema que reducira el tamao de un rin artificial. El resultado deseado es la produccin de un rin artificial que el paciente pueda llevar puesto y que cuente con una unidad reemplazable para eliminar productos de desechos nitrogenados como acido rico y creatinina. En el esquema de microencapsulamiento propuesto por Levine y LaCourse, se utilizara la enzima ureasa para eliminar urea del torrente sanguneo. Aqu, la accin cataltica de la ureasa hara que la urea se descomponga para dar amoniaco y dixido de carbono. Se cree que el mecanismo de reaccin consiste en la siguiente sucesin de reacciones elementales:

Vemos que parte de la enzima aadida a la solucin se une a la urea, y parte queda sin unirse. Aunque es fcil medir la concentracin total de la enzima (Et ), es difcil medir la concentracin de la enzima libre (E). Si representamos con E, S, W, ES y P la enzima, el sustrato, agua, el complejo enzima-sustrato y los productos de reaccin, respectivamente, podemos escribir las reacciones (7-72), (7-73) y (7-74) simblicamente as:

La Forma final de la ley de velocidad:

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS Una enzima en un catalizador biolgico y, como todos los catalizadores, las enzimas aumentan la rapidez de una reaccin qumica sin sufrir un cambio qumico 6

permanente en s mismas. Un catalizador influye en la rapidez de una reaccin qumica pero no afecta el equilibrio de esta. Las enzimas, sin embargo, exhiben muchas propiedades que difieren de las mostradas por los catalizadores en general. Las tres propiedades ms importantes son: su alto contenido cataltico, su especificidad y la capacidad para regular su actividad cataltica mediante diversos compuestos de origen natural. < Poder cataltico Es difcil comparar la rapidez de reaccin de las reacciones catalizadas por enzimas con rapidez de reaccin que ocurre en ausencia de las enzimas bajo condiciones similares de temperatura, pH, etc. Este se debe principalmente a las dificultades para medir las rapideces demasiado bajas de las reacciones no catalizadas por enzimas. Koshland informo que las rapideces de ciertas reacciones eran mucho ms altas en presencia de enzimas que en ausencia de estas. As, la hexoquinasa, fosforilasa, deshidrogenasa alcohlica y la creatinina cinasa incrementaban las rapideces de reaccin en > 1010, >3x1011, >2x108 y >104, respectivamente. Otra caracterstica importante de las enzimas es su capacidad para funcionar como catalizadores en un intervalo moderado de temperatura (~300K), pH (2-10) y presin (~1atm). Un ejemplo es la fijacin de nitrgeno catalizada por el complejo de la enzima nitrogenasa, la cual se realiza ptimamente a 300K, pH neutro y presin atmosfrica. En contraste la sntesis industrial de amoniaco a partir de nitrgeno requiere una temperatura de 700-900K, presiones de 100-900atm y la presencia de hierro como catalizador.
Enzima Anhidrasa carbnica Corismato mutasa Triofosfato isomerasa Carboxipeptidasa A AMP nucleosidasa Nucleasa estafilocal Velocidad en ausencia de enzima 1.3x10-1 2.6x10-5 4.3x10-6 3.0x10-9 1.0x10-11 1.7x10-13 Velocidad de reaccin catalizada 1.0x106 50 4300 578 60 95 Rendimiento 7.7x106 1.9x106 1.0x109 1.9x1011 6.0x1012 5.6x1014

Tabla 1. Eficiencia de las reacciones catalizadas por algunas enzimas

< Especificidad de las enzimas La mayora de las enzimas, a diferencia de los catalizadores qumicos, son altamente especficas en cuanto a la naturaleza del sustrato (s) que utilizan y al tipo de reaccin que catalizan. Algunas enzimas son ms especficas que otras. As, las peptidasas, fosfatasas y esterasas utilizaran una amplia variedad de sustratos siempre que estos contengan el enlace qumico requerido, a saber, enlace peptdico, unin fosfato ester y enlace carboxilato ester, respectivamente. A menudo, se encuentra baja la especificidad con las enzimas degradativas, pero rara vez con las enzimas biosintticas. Otro grupo de enzimas, por ejemplo, la hexoquinasa, son intermedias 7

entre estos dos extremos que exhiben especificidad de grupo. As, la hexoquinasa cataliza la fosoforilacin de diversos azucares siempre que sean de aldohexosas. Muchas enzimas muestran especificidad absoluta en cuyo caso pueden utilizar un solo sustrato o un par de sustratos, si la reaccin es bimolecular, a una rapidez apreciable. Ejemplos de estas son las L- y D-lactato deshidrogenasas que catalizan la reduccin de piruvato a L- o D-lactato, respectivamente, pero no la mezcla de los dos estereoismeros. Adems, estas enzimas son absolutamente especficas en relacin con el compuesto a reducir en la reaccin. Por lo tanto, como muchas enzimas deshidrogenasas, son especficas para NAD o NADP, pero no para ambos.

Figura: A.- Reaccin catalizada por la triosafosfato isomerasa; B.- Inhibidores de su catlisis. Ntese el parecido con la estructura de los sustratos y del intermediario

< Regulacin de la actividad enzimtica Otra propiedad importante de las enzimas es que, a diferencia de la catlisis qumica, su actividad cataltica a menudo puede regularse mediante iones o molculas pequeas. As, el Ca+2 estimula a la enzima glucgeno fosforilasa, responsable del rompimiento del glucgeno a glucosa durante la contraccin muscular. Un mecanismo regulatorio que ocurre comnmente es la inhibicin retroalimentada de las enzimas participantes en vas biosintticas. As la treonina deshidratasa, la primera enzima especifica en la ruta de sntesis de la isoleucina en E.coli, es inhibida fuertemente por la isoleucina, el producto final de la va biosinttica, que tiene poca semejanza estructural con el sustrato o producto de la reaccin.

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA ENZIMAS < Cofactores Las enzimas son protenas con longitudes de cadena de 100 a 2500 residuos aminocidos. Algunas enzimas como la quimotripsina (que cataliza la hidrlisis de protenas) y la trifosfato isomerasa (que cataliza la interconversin de gliceraldehdo-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), no requieren de ningn componente adems del sustrato para su actividad. Sin embargo, muchas enzimas requieren de un componente no proteico llamado cofactor para su actividad.

Un grupo de cofactores son los iones metlicos. As, la piruvato cinasa necesita K+ (y Mg+) para su actividad; la carboxipeptidasa (que hidroliza protenas del extremo C-terminal) necesita Zn2+, el cual forma parte integral de la estructura de la enzima. La eliminacin del zinc por quelacin con EDTA desactiva la enzima. Las cinasas necesitan Mg2+ para su actividad, aunque en este caso el ion metlico se une al sustrato en lugar de la enzima, as, el verdadero sustrato es Mg-ATP2- en de ATP.

La segunda clase principal de cofactores son compuestos orgnicos que con frecuencia se derivan del grupo de vitaminas B. Por lo tanto, las carboxilasas (que incorporan CO2) necesitan la biotina que esta covalentemente unida a la enzima; las transaminasas requieren fosfato de piridoxal unido a la enzima. Los cofactores que se encuentran fuertemente unidos a la enzima a menudo se denominan grupos prostticos. La enzima que contiene el cofactor o grupo prosttico se conoce como holoenzima (activa), en tanto que la enzima que carece del cofactor se denomina apoenzima (inactiva). Compuestos orgnicos tales como NAD, NADP, FAD, Coenzima A (CoASH) y ATP pueden unirse en forma lbil a la enzima, un equilibrio entre la enzima, la apoenzima y el cofactor. Estos cofactores comnmente se denominan coenzimas.
Coenzima Biocitina Coenzima A Coenzimas de Cobalamima Coenzimas de flavina Acido lipico Coenzimas de nicotinamida Fosfato de piridoxal oo o Reaccin Carboxilacin Transferencia de acilos Alquilacin Oxidacin-reduccin Transferencia de acilos Oxidacin-reduccin Transferencia de grupo amino Transferencia de un grupo de 1 Carbono Transferencia de aldehdo Fuente vitamnica Biotina Pantotenato Cobalamina (B12) Riboflavina (B2) Enfermedad Humana por deficiencia

* *
anemia perniciosa

----Nicotinamida (niacina) Piridoxina (B6) Acido flico Tiamina (B1)

* *
Pelagra

*
anemia megaloblstica beriberi

Tiamina pirofosfato

Tabla: Relacin entre algunas coenzimas y las vitaminas a partir de las cuales se producen. Enfermedades generadas por la deficiencia. * no tiene un nombre especfico, su aparicin es muy rara.

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< Isoenzimas Ocasionalmente, en una sola especie hay varias formas de enzimas que catalizan la misma reaccin. Estas pueden diferir entre s con respecto a la secuencia de aminocidos, alguna modificacin covalente como la fosforilacin o por cambios de conformacin. Las isoenzimas son aquellas formas de una enzima que provienen de diferencias determinadas genticamente en la secuencia de aminocidos y no incluyen modificaciones postraduccionales de la secuencia o estructura. Las enzimas aspartocinasas que participan en el primer paso de la va biosinttica de la familia del aspartato de los aminocidos, son ejemplos de isoenzimas. Ciertas cepas de E.coli poseen tres isoenzimas, cuyas actividades estn sujetas a inhibicin por retroalimentacin mediante diferentes productos de la va. < Clasificacin de las enzimas Es comn dar a las enzimas nombres triviales que describen la reaccin que catalizan, por ejemplo ureasa (cataliza la hidrlisis de la urea), lactato deshidrogenasa (cataliza la oxidacin del acido lctico). En estos casos comnmente se agrega el sufijo asa al nombre del sustrato o de la reaccin catalizada por la enzima. Sin embargo, con frecuencia los nombres no reflejan la reaccin en la que participa la enzima, por ejemplo, renina, tripsina, enzima mlica, papana, etc. Como resultado, la European Comission dio a conocer una nomenclatura para las enzimas aceptada internacionalmente. Hay seis tipos principales de reacciones catalizadas por enzimas: reacciones de xido reduccin, de transferencia de grupo, hidrolticas, de eliminacin con formacin de un enlace doble, de isomerizacin y donde se unen dos molculas a expensas de una fuente de energa (ATP)

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< Bases de la catlisis enzimtica Se describi a las enzimas como catalizadores biolgicos que aceleran una reaccin qumica sin alterar el equilibrio final. Un ejemplo de una reaccin catalizada por una enzima es la conversin de glucosa-1fosfato (G-1-P) a glucosa-6-fosfato (G-6-P) en solucin acuosa a pH 7. En estas condiciones, la reaccin no catalizada por las enzimas es extremadamente lenta aun cuando el cambio de energa libre de G-1-P a G-6-P es negativo (-1.745kcal). Esto se debe a que existe una barrera para la reaccin denominada energa de activacin. El contenido de energa de las molculas en una poblacin sigue una curva de distribucin. Solo aquellas molculas con una energa suficientemente alta tienen posibilidad de reaccionar para formar el producto. Para hacer que la reaccin proceda con mayor rapidez debe elevarse el contenido de energa de toda la poblacin. Esto se podra lograr al calentar la mezcla o mediante la adicin de un catalizador. En efecto, los catalizadores disminuyen la energa de activacin de la reaccin al permitir que una poblacin mucho mayor reaccione a cualquier tiempo. El catalizador puede lograr lo anterior al formar un complejo o compuesto intermediario inestable con el sustrato, el cual se descompone rpidamente para formar el producto, con lo que se obtiene una ruta para la reaccin a travs de la barrera, es decir, la energa de activacin. La reaccin procede con rapidez cuando ha sido disminuida la energa de activacin, sin embargo, como no hay diferencia en el contenido de energa relativa de G-1-P y G-6P en las reacciones catalizadas y no catalizadas, el punto de equilibrio es el mismo.

Evolucin energtica de una reaccin qumica. Se observa la diferencia energtica entre los estados de transicin de las reacciones catalizada y no catalizada

La especificidad y sus propiedades regulatorias no se han entendido completamente. Las evidencias sugieren que la cadena polipeptdica de la enzima se dobla de tal forma que un grupo de aminocidos reactivos, como el aspartato, cistena, histidina, lisina, metionina, serina o treonina, se coloca para formar un sitio activo. Este sitio es la regin en la que se localiza la actividad cataltica de la enzima. El sustrato se une a este sitio activo mediante varios enlaces dbiles que incluyen puentes de hidrogeno y, ocasionalmente, enlaces covalentes, para formar un complejo enzima-sustrato. La reaccin se lleva a cabo mediante una serie de mecanismos y los productos se liberan de este complejo en el sitio activo. La unin del sustrato es un rea compleja, sitio activo y el sitio regulador, puede ser importante para la regulacin de la actividad de la enzima. Una molcula efectora o inhibidora puede unirse a este sitio y causar un cambio conformacional en la

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protena de modo que el sitio este mas disponible (o menos, en presencia del inhibidor) para la unin con el sustrato o para aumentar o para inhibir la rapidez de reaccin. Una complicacin mas es la presencia de enzimas con ms de una subunidad (cadena polipeptdica). En estas enzimas multimricas, por ejemplo, la hemoglobina, la unin del sustrato, el inductor o el inhibidor a una de las subunidades, provoca un efecto en la unin o actividad de las otras subunidades.

INTRODUCCIN A LA CINTICA BSICA DE LAS ENZIMAS Muchos estudiantes de biologa tienen un miedo inherente a la cintica enzimtica porque requiere habilidad para manejar ecuaciones algebraicas bsicas; asimismo, se les dificulta comprender el significado de los datos cuantitativos de la cintica, obtenidos generalmente in vitro, en relacin co lo que ocurre en la clula viva. Es verdad que con frecuencia hay mucha informacin en los datos cinticos, con teoras muy generales y, a menudo, dudosas acerca de la funcin de las enzimas en la clula. Un ejemplo es el glutamato deshidrogenasa, responsable de la asimilacin del amoniaco. Frecuentemente se informa que esta enzima tiene una Km alta, poca afinidad por el substrato amoniaco, con un valor de hasta 40 mM. Esta Km alta se obtuvo con 1 mM -oxoglutarato y 1 M de NADH. Sin embargo, si se hubiera querido ser ms real, se hubieran usado concentraciones de substrato in vivo, por ejemplo, 0.11 mM -oxoglutarato y 1 M de NADH, la Km para el amoniaco sera de aproximadamente 3-4 mM. A partir de este ejemplo resulta claro que las condiciones empleadas para medir la actividad enzimtica deben variar en un intervalo amplio de condiciones fisiolgicas antes de concluir acerca de la funcin de una enzima in vivo. El estudio de la cintica enzimtica puede producir mucha informacin importante, particularmente cuando se combina otras tcnicas, relacionada con el mecanismo

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de accin de una enzima, la forma en que responde una enzima a cambios fisiolgicos en la concentracin de substrato y cmo puede controlarse o regularse la actividad de una enzima bajo condiciones fisiolgicas. Para los biotecnlogos interesados en el uso de enzimas aisladas o de sistemas enzimticos para el rompimiento de substratos (celulosa) o para la formacin de productos (jarabes ricos en fructuosa), la importancia de la cintica enzimtica es clara en la determinacin de las condiciones ptimas para la actividad enzimtica y para la determinacin de las rapideces de conversin ptimas. Es decir, el conocimiento de los datos cinticos permite disear el proceso catalizado por enzimas de manera que se logre la mxima, o el mximo econmico, conversin de los substratos en productos. Ensayos enzimticos Para estudiar la cintica es importante crear mtodos confiables y reproducibles para la medicin de la actividad enzimtica en condiciones especficas. El propsito del ensayo enzimtico es medir la rapidez de formacin del producto o la rapidez de la desaparicin del substrato(s) en condiciones controladas de temperatura, pH y concentracin de compuestos modificadores de la actividad. Se usan dos tipos bsicos de ensayos enzimticos denominados ensayos continuos y discontinuos. En cualquier caso se debe asegurar que la rapidez inicial de la reaccin se pueda medir en presencia de una concentracin de substrato(s) fija. La rapidez inicial es importante ya que evita complicaciones debidas a la acumulacin del producto y porque la enzima puede desactivarse en el curso del ensayo. En estas condiciones, la rapidez medida ser directamente proporcional a la concentracin de la enzima. Adems, la actividad se mide normalmente bajo condiciones de estado estacionario donde la concentracin del substrato es mucho mayor que la concentracin de la enzima, para que la rapidez difcilmente vare debido a cambios en la concentracin del substrato. Una prctica comn es usar una concertacin de substrato por lo menos cinco veces mayor que la Km de la enzima del substrato. Es posible estudiar la cintica de estado estacionario o de estado pre-estacionario donde la concentracin de las enzimas y del substrato(s) es comparable, pero esto requiere equipo costoso para asegurar el mezclado rpido de los componentes y no se analizara aqu. fumarato + H2O malato 5.1

Para ensayos continuos ms complejos se necesita el acoplamiento o enlace de una reaccin catalizada por una enzima, la cual puede seguirse de manera continua, con la reaccin enzimtica que se estudiar. D-glucosa + ATP D-glucosa-6-fosfato + ADP 5.2

Ni los substratos ni los productos absorben a longitudes de onda especficas o tienen propiedades que puedan monitorearse continuamente. Esta reaccin se

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puede acoplar a la reduccin de NADP al aadir glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en exceso, es decir, a concentraciones que no limiten la rapidez de la reaccin:

D-glucosa + ATP NADP NADPH

D-glucosa-6-fosfato + ADP

5.3

D-glucosa-S-lactone-6-fosfato (6- fosfogluconlactona) En esta reaccin acoplada, la hexocinasa cataliza la formacin de D-glucosa-6fosfato, la cual se reduce inmediatamente por la accin de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para producir NADPH. El NADP+ no absorbe a 340nm pero el NADPH s. En consecuencia, la reaccin se puede monitorear continuamente a 340nm. Estos ensayos acoplados requieren que el producto de la primera reaccin, la Dglucosa-6-fosfato, sea convertida de inmediato 6-fosfogluconolactona. Es decir, la reaccin acoplada debe proceder con una rapidez mayor que la de la reaccin que se desea estudiar cinticamente. La enzima acoplante debe estar pura, presente en concentraciones no limitantes de la rapidez de la reaccin y debe estar libre de impurezas que pudieran afectar la actividad de cualquiera de las enzimas. La actividad de la hexocinasa tambin podra medirse con un procedimiento de ensayo discontinuo en el que la d-glucosa y la hexocinasa se mezclan en condiciones definidas, y las muestras se extraen a intervalos precisos para la determinacin de la glucosa. Estos ensayos requieren que las muestras sean extradas a intervalos precisos y que la reaccin sea detenida inmediatamente, por ejemplo, mediante la adiccin de acido tricloroactico para inactivar a la enzima. Siempre que es posible, se prefieren ms ensayos continuos que los discontinuos. Sin importar el tipo de ensayo, es necesario tomar las precauciones siguientes para obtener datos confiables: 1) Los componentes del sistema de ensayo deben ser de la ms alta pureza posible. 2) La preparacin de la enzima debe estar libre de compuestos que inhiban o interfieran con las actividades enzimticas. 3) La enzima, el substrato(s) y el (los) producto(s), deben ser estables el tiempo que dure el ensayo. 4) El pH y la temperatura deben mantenerse constantes mediante el uso de soluciones amortiguadoras y termostatos, ya que estos factores afectan marcadamente la rapidez de la reaccin. 5) La rapidez de reaccin medida debe ser constante durante el ensayo y debe ser proporcional a la cantidad de enzima adicionada.

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6) Debe medirse la rapidez inicial de la reaccin para evitar cambios notables en la concentracin del substrato, inhibicin del producto o que se invierta la reaccin.

Cintica de reacciones con un substrato La cintica enzimtica simple se basa en tres principios experimentales: 1) Que el substrato, S, forma un complejo intermediario enzima-substrato, ES, con la enzima, E. 2) Que la rapidez de la reaccin a tiempo t (es decir, la rapidez de desaparicin de substrato, -ds/dt, o bien, la rapidez de formacin del producto dp/dt) se representa con la pendiente de la curva P o S = f (t). Estas pendientes varan con el tiempo durante el curso de la reaccin, debido a la desaparicin del substrato. Las mediciones cinticas se basan generalmente en la parte lineal de la curva, es decir, la velocidad inicial o la rapidez inicial de reaccin. En esta regin, la concentracin del producto es extremadamente pequea y, en consecuencia, la descomposicin de producto a substrato es insignificante (determinado por la constante de rapidez K2 ) y se puede escribir:

3) Para una concentracin dada de substrato, la determinacin de la variacin en la rapidez de reaccin como funcin de la concentracin de la enzima no es lineal, sino hiperblica. Esto se debe a que todo el substrato esta en la forma de complejo enzima-substrato, [ES], a altas concentraciones de la enzima. En consecuencia, la rapidez inicial de la reaccin como funcin de la concentracin de la enzima permanece constante en estas condiciones. Para mediciones de cintica es necesario trabajar en la regin lineal de la curva a baja [E] para que la rapideces de reaccin dependan de la concentracin de la enzima. Tambin se puede decir que la concentracin de la enzima debe ser muy pequea comparada con la concentracin del substrato de tal modo que la informacin del complejo enzima-substrato [ES], tiene poco o ningn efecto con la concentracin de substrato. A. Ecuacin de Michaelis-Menten Dado que la reaccin entre la urea y la ureasa (ejemplo mencionado en la pg. 3) se efecta en solucin acuosa, el agua obviamente est en exceso y podemos considerar constante su concentracin. Sea:

Dividiendo el numerador y el denominador de la ecuacin (7-86) entre k1, obtenemos una forma de la ecuacin de Michaelis-Menten: 16

Donde Km es la constante de Michaelis. Si adems, representamos con Vmx la velocidad de reaccin mxima para una concentracin total de enzima dada,

La ecuacin de Michaelis-Menten adopta la conocida forma (7-89):

En la figura 7-11 se muestra, para una concentracin de enzima dada, una grafica d la velocidad de desaparicin del sustrato en funcin de la concentracin del sustrato. Cuan la concentracin de sustrato es baja,

Si la concentracin de sustrato es alta,

Consideremos el caso en que la concentracin del sustrato es tal, que la velocidad de reaccin es igual a la mitad de la velocidad mxima,

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Entonces Vmx V (S ) = mx 1 / 2 2 K m + (S1 / 2 ) Si despejamos la constante de Michaelis de la ecuacin (7-90) obtenemos: Km=S1/2 La constante Michaelis es igual a la concentracin del sustrato en la velocidad de reaccin es igual a la mitad de la velocidad mxima. Los parmetros Vmx y km caracterizan las reacciones enzimticas que se describen con la cinetica de Michaelis-Menten. Vmx depende de la concentracin total de la enzima, pero km no.

ACCION DE EFECTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Inhibicin de reacciones enzimticas Otro factor que influye considerablemente en las velocidades de la reacciones catalizadas por enzimas, adems pH, es la presencia de un inhibidor. Las consecuencias ms drsticas de la inhibicin de enzimas se observan en los organismos vivos, donde la inhibicin de cualquier enzima especfica que interviene en una secuencia metablica primaria hace que toda la secuencia deje de funcionar; el resultado es un dao grave o la muerte del organismo. Por ejemplo, la inhibicin de una sola enzima, citocromo oxidasa, por el cianuro hace que se detenga el proceso de oxidacin aerbica; la muerte se presenta en cuestin de minutos. Tambin existen inhibidores benficos como los que se usan en el tratamiento de la leucemia y otras enfermedades neoplsicas. Los tres tipos ms comunes de inhibicin reversible que ocurren en las reacciones enzimticas son la competitiva, anticompetitiva y no competitiva (vea el problema P7-12B). La molcula de enzima es anloga a la superficie cataltica heterognea en cuanto a que contiene sitios activos. Cuando ocurre inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor suelen ser molculas similares que compiten por el mismo sitio de la enzima. Ocurre inhibicin anticompetitiva cuando el inhibidor desactiva el complejo enzima-sustrato, por lo regular unindose a las molculas tanto de enzima como de sustrato del complejo. Ocurre inhibicin no competitiva en el caso d enzimas que contienen al menos dos tipos de sitios distintos. El inhibidor se une a un solo tipo de sitio, y el sustrato, solo al otro. La rapidez de las reacciones catalizadas por enzimas se puede modificar en presencia de ciertos compuestos, distintos del sustrato, denominados efectores.

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Estos desempean una funcin principal en la regulacin del metabolismo. Hay dos clases de efectores: activadores e inhibidores. Hay tres tipos principales de inhibicin enzimtica: competitiva, incompetitiva y nocompetitiva. < Inhibicin competitiva El inhibidor es una sustancia con una estructura qumica y espacial anloga a la del sustrato, que se une al sitio activo de la enzima inhibiendo as la unin del sustrato.
k1 k-1 k2

Grafica de Michaelis Menten para la inhibicin competitiva

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Grafica de Lineweaver-Burk para la inhibicin competitiva

Las constantes de rapidez son k1, k-1 y k2 mientras que ki es la constante de disociacin del complejo EI: ; [ES] (k-1+ k2)=k1 [E] [S] ET= [ES] + [E] + [EI] Sustituyendo [EI]: Sustituyendo [E]: ET= [ES] + [E] ET= [ES] + [E] ET= [ES] Como en ausencia del inhibidor, V=k2 [ES], entonces al sustituir [ES] obtenida de la ecuacin anterior:

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Esta ultima ecuacin muestra que Km ahora esta aumentada por el termino , lo cual produce una disminucin en la rapidez de reaccin, V. El grado de inhibicin depende claramente de la concentracin del sustrato [S] y del inhibidor [I]. La representacin de Lineweaver-Burk puede escribirse como:

< Inhibicin incompetitiva En este casi el inhibidor se une a ES pero no a las enzimas libre; por lo tanto, aun cuando la concentracin de sustrato sea saturante, la enzima se distribuir entre el complejo formador de producto ES y el complejo que contiene el inhibidor EIS, en una relacin que depende de Ki. Por lo tanto, EIS es un complejo terminal incapaz de dar producto directamente. En consecuencia, Vmx aumentara por el factor (1=I/Ki), mientras que la Km realmente disminuir. Esto se debe a que el inhibidor, I, jala la enzima hacia el estado unido con es sustrato y Km es una medida de la habilidad del sustrato para empujar la enzima hacia el complejo ES.

Ahora hay dos sitios de unin de la enzima, uno para el sustrato y otro para el inhibidor. Consecuentemente ET= [ES]

Con la ecuacin de estado estacionario se puede derivar la siguiente ecuacin para la expresin de Michaelis Menten:

La representacin de Lineweaver-Burk de la ecuacin de M-M es:

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Por lo tanto una inhibicin incompetitiva, tanto Km como Vmax varan en funcin de la concentracin de inhibidor.

< Inhibicin no competitiva Un inhibidor no competitivo se puede unir a la enzima libre, E, y al complejo enzimasustrato, ES, para formar EI e EIS. EIS no se puede descomponer para dar el producto y la enzima.

22

Si las concentracin de EI e EIS estn en equilibrio, las constantes de equilibrio para la unin de I a E (Ki ES) son idnticas e iguales a Ki, si se supone que la presencia del sustrato unido no afecta la unin del inhibidor. Como en el caso de la inhibicin incompetitiva, hay dos sitios de unin sobre la enzima, el sitio activo para la unin des sustrato y un segundo sitio al cual se une el inhibidor sin importar si el sustrato ya est unido a la enzima o no. El resultado es que la Km permanece constante mientras que la Vmax cambia: Aqu se supone que EI no puede unirse al sustrato para formar EIS, o que la Ki es tan pequea que es insignificante. Se puede llegar a la siguiente expresin:

Grafica de Michaelis Menten para la inhibicin competitiva

La presentacin de Lineweaver-Burk de la ecuacin de M-M es:

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Grafica de Lineweaver-Burk para la inhibicin competitiva

CINTICA ENZIMTICA EN LOS REACTORES Las expresiones cinticas utilizadas aqu comienzan con las reacciones con las reacciones que implican un nico producto sin que exista inhibicin por el substrato o por el producto. Posteriormente se introducirn los efectos del flujo no ideal de los reactantes y las restricciones disfuncionales. La eleccin final de la temperatura, pH, concentracin de substrato y extensin de la conversin a los que el reactor opera dependen de un balance econmico global que tenga en cuenta los costos de operacin, del sustrato, de trabajo, auxiliares, etc, y los costos de inversin del equipo necesario. El efecto global de esta aproximacin es intentar minimizar el tamao del reactor o la concentracin de enzima necesario para conseguir una productividad dada. La cintica de Michaelis-Menten debe adaptarse para proporcionar una descripcin cintica de los reactores discontinuos, aunque es mejor utilizar la ecuacin en forma integrada con respecto al tiempo. Para una reaccin irreversible sin inhibicin que emplea un nico enzima en un reactor discontinuo en condiciones isotrmicas se tiene que: XS - K m.ln(1 X ) = kE V
3.40

Donde kE es la actividad mxima del enzima total en el reactor en moles reaccionados por segundo, V e el volumen de trabajo del reactor, es el tiempo de S St operacin y X es el grado de conversin donde S es la concentracin inicial S de substrato y St la concentracin despus de un periodo de tiempo de reaccin t. De la misma forma, par una reactor de flujo pistn:

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kE kE = 3.41 q V Donde q es la velocidad volumtrica de alimentacin del substrato en segundos-1 y es el tiempo medio de resistencia de la solucin de substrato en el reactor en segundos, de tal forma que si se representa XS frente a 1n( 1-X ), la pendiente de la grafica resultante es igual a 2,303 veces la km aparente del enzima. XS - K m.ln(1 X ) = Esto tiene en cuenta el grado de conversin del substrato en producto y la velocidad de flujo de substrato a travs del reactor. Otro factor a tener en cuenta es el grado de mezcla del fluido en el reactor, as como los eventuales efectos de los inhibidores. El enzima localizado en la entrada del reactor esta expuesto a una alta concentracin de substrato con independencia del grado de conversin final conseguido en el reactor, y as opera en unas condiciones cinticas efectivas de orden cero con respecto a los substratos presentes en exceso. Sin embargo, el enzima localizado hacia la salida del reactor estar expuesto en una concentracin de substrato baja cuando el grado de conversin conseguido sea alto, operando as en condiciones cinticas de primer orden. Para un reactor continuo de mezcla completa: XS + Km kE kE X = = V 1 X q
3.42

Cuando S/Km es bajo, es decir, cuando se ha tenido un grado de conversin alto (o se ha usado una concentracin de substrato baja) la velocidad de reaccin es de primer orden, y el tiempo de reaccin requerido para obtener un grado de conversin particular es directamente proporcional de S/Km, la reaccin es esencialmente de orden cero, y en este caso el tiempo necesario para conseguir un grado de conversin dado que es virtualmente independiente de S/Km. para que un proceso resulte til a nivel industrial se requiere usualmente un alto grado de conversin de substrato en producto. Un enzima inmovilizado opera generalmente en condiciones cinticas de primer orden, en especial si se consideran las altas densidades de enzima que con frecuencia se utilizan en las preparaciones comerciales de enzimas inmovilizados. En estos casos el tiempo requerido para conseguir un incremento relativamente pequeo del grado de conversin depende claramente del valor de S/Km logrado en la operacin, de forma que este parmetro tiene gran importancia experimental. Si se tienen en cuenta las ecuaciones que describen los reactores de flujo pistn y los reactores continuos con agitacin, las prestaciones de ambos tipos de reactores son prcticamente idnticas cuando se usan concentraciones elevadas de substrato y S>Km, mientras que a concentraciones bajas de substrato S<Km, el reactor de fuljo pistn es de 20 a 30 veces ms eficaz que el reactor continuo tipo tanque con agitacin se el grado de conversin necesario es alto, con la ventaja adicional de que tiene una densidad mucho mayor de molculas de enzima.

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En los reactores en columna de relleno con flujo continuo, o e reactores con agitacin, se ha observado una importante relacin entre la velocidad de flujo a travs del reactor (q) y el grado de conversin. La forma exacta de estas curvas varia en funcin de factores como la extensin de inhibicin por el producto, aunque debera ser constante con el tamao del reactor siempre que las propiedades hidrodinmicas permanezcan inalteradas. Cuando se usan valores altos de S/Km y grados de conversin bajos el comportamiento de ambos reactores es casi siempre idntico. Sin embargo, con valores bajos de S/Km, cuando el orden de reaccin es mayor que cero, las prestaciones de los reactores tubulares son mas favorables, incluso en gran proporcin, comparadas con las de los reactores de mezcla completa. En este caso, se pueden obtener grados de conversin altos a velocidades de flujo mucho ms altas en los reactores de flujo pistn que en los de mezcla completa, en tanto que en otras formas de trabajo se obtienen valores comparables. En cada reactor la cantidad de enzima activo es la que determina la extensin de la reaccin. Por tanto, lo reactor deben compararse en base a las cantidades de enzima que necesitan para llevar a cabo una reaccin en particular. En la figura 3.18 se representa la cantidad de enzima necesario para lograr un grado de conversin dado en un reactor continuo con agitacin comparado con la cantidad de enzima requerido en un reactor con columna empaquetada para diversas concentraciones de substrato. Los valores extremos son idnticos para los tamaos de reactor de flujo pistn y con agitacin continua necesarios para obtener la misma cantidad de producto, con reacciones de orden cero y uno, cuando no se produce cambios de volumen ni existe inhibicin. En los reactores discontinuos la cantidad de enzima requerido puede ser mayor que en los reactores continuos por la prdida experimentada entre lotes. Si es la proporcin del tiempo de operacin de un reactor continuo en la que el reactor discontinuo esta operando, la cantidad de enzima y por tanto el tamao del reactor requerido para dar una productividad global igual a la del reactor de flujo pistn (P) debe ser: P 100 Operacin Ideal del reactor Caractersticas como las concentraciones finales de sustrato, de producto y de biomasa y el tiempo requerido para la conversin pueden calcularse, para los diferentes esquemas de reaccin, mediante balances de materia. Para un sistema general de reaccin es posible relacionar las velocidades de cambios de masas de los componentes del sistema con la velocidad de reaccin mediante la ecuacin: dM i M o + RG RC =M dt i es el causal Donde M es la masa del componente A en el reactor, t el tiempo, M o el caudal msico de A que sale del reactor, RG msico de A que entra al reactor, M 26
3.43

la velocidad msica de generacin de A por reaccin y RC la velocidad msica de consumo de A por reaccin. Cintica enzimtica en Reactores discontinuos. Los reactores discontinuos tienen la forma tradicional de reactor, como por ejemplo los usados en cervecera, y son muy adecuados para el uso de enzimas solubles, o cuando se requiere u volumen de produccin pequeo o la produccin es infrecuente. En general consisten en un tanque donde se mezcla el substrato o el enzima y una vez alcanzado el grado de reaccin deseado el contenido del reactor se descarga. Las desventajas de estos reactores discontinuos se deben a los cambios en las condiciones de operacin durante la reaccin, por lo que requieren un control ms complejo de proceso. Otra dificultad es tambin el mantenimiento de un buen grado de mezcla en reactores con mayor escala de produccin, debido a la imposibilidad de asegurar una entrada de potencia proporcional al aumento de tamao de reactor. Otros problemas que se presentan en los procesos discontinuos son las variaciones en la calidad del producto, el tiempo de paso entre las reacciones discontinuas, la demanda discontinua de servicios y equipo auxiliar y trabajo, y tambin la imposibilidad de reutilizar el enzima o la tendencia a perderlo durante su recuperacin entre dos lotes (aunque tambin se puede usar de forma semicontinua). Estas desventajas pueden ser secundarias especialmente cuando se necesita una buena transferencia de masa o de gases. Por ejemplo, le produccin de acido 6-aminopenicilnico se hace en un reactor discontinuo con agitacin que contiene penicilina acilasa inmovilizada, neutralizndose el acido formado durante la reaccin mediante la adicin continua de lcalis (Carleysmith y Lilly, 1979). En la industria el reactor que se utiliza ms frecuentemente es el de columna con flujo pistn. En varias aplicaciones en sistemas discontinuos de los enzimas, como por ejemplo en la produccin de extracto de malta o en la industria cervecera, es necesario que exista una actividad enzimtica elevada durante la reaccin y que no quede enzima activo residual en el producto, lo que generalmente se consigue incrementando la temperatura del reactor de forma que la ultimas molculas de substrato se consuman justo antes de que se desnaturalicen la ultimas molculas de enzima. A. Operacin discontinua de un reactor de mezcla perfecta Los procesos discontinuos operan en sistemas cerrados de manera que el sustrato se aade al comienzo del proceso y los productos son retirados slo al finalizar el mismo. Las reacciones aerobias no son operaciones discontinuas en el sentido estricto de la palabra. La baja solubilidad del oxgeno en el medio acuoso significa que ste debe suministrarse de manera continuada mientras se elimina el dixido de carbono y otros gases producidos en el proceso. Sin embargo, los reactores en los que no existe ni entrada ni salida de lquidos se consideran como discontinuos. Si no existen fugas o evaporacin en el reactor, el volumen de lquido en los reactores discontinuos puede considerarse constante. Reaccin enzimtica

27

Supngase que se aplica la ecuacin. (6,5) al sustrato limitante de un reactor i = M o =0 porque no enzimtico discontinuo como el mostrado en la Figura 13.19. M existe flujo de sustrato hacia adentro o hacia fuera del reactor. La masa de sustrato en el reactor, M, es igual a la concentracin multiplicada por el sustrato s multiplicado por el volumen de lquido V. Como no se genera sustrato en la reaccin RG= 0. La velocidad de consumo de sustrato, Rc es igual a la velocidad volumtrica de reaccin v multiplicada por V, v viene dada por la ecuacin. (11.31). Por lo tanto, el balance de materia de la ecuacin. (6,5) es:

Donde Vmx es la velocidad mxima de reaccin enzimtica y Km es la constante de Michaelis. Debido a que V es constante en los reactores por lotes, podemos tomarlo fuera de la diferencial y cancelar a travs de la ecuacin para obtener:

La integracin de esta ecuacin diferencial proporciona una expresin para el tiempo de reaccin de una reactor discontinuo. Suponiendo Vmx y Km constantes durante la reaccin, separando las variables:

e integrando con la condicin inicial s=so a t = 0 se obtiene:

Donde la tb es el tiempo de reaccin por lotes necesario para reducir la concentracin de sustrato desde so hasta sf. El tiempo de proceso por lotes para producir una determinada concentracin de producto se puede determinar de la ecuacin. (13.10) y las relaciones estequiomtricas.

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Tal como se discuti en la seccin 11.5, las enzimas estn sujetas a la desactivacin. Por lo tanto, la concentracin de enzimas activas en el reactor, y por lo tanto, el valor de Vmx puede cambiar durante la reaccin. Cuando la desactivacin es significativa, la variacin de Vmx con el tiempo se puede expresar mediante la ecuacin. (11.44), de modo que la ecuacin. (13.8) se convierte en:

Donde Vmx0 donde es el valor de Vmx antes de producirse la desactivacin y kd es la tasa de desactivacin de primer orden constante. Separando variables se obtiene:

Integrando la ecuacin (13.12) con la condicin inicial s=so a t = 0 se obtiene:

Donde tb es el tiempo de reaccin en discontinuo y sf la concentracin final de sustrato.

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Figura. Esquema de un reactor enzimtico discontinuo agitado.

Cintica enzimtica en reactores de flujo continuo A. Reactor De Mezcla Perfecta Los biorreactores operan de forma continua en algunas industrias de bioprocesos tales como destileras, en la produccin de levadura de panadera y tratamiento de residuos, y en ciertas conversiones de tipo enzimtico. Si el reactor est bien mezclado, la corriente de producto posee la misma composicin que el lquido presente en el reactor. Por lo tanto, cuando se utilizan los reactores continuos con clulas o enzimas libremente suspendidos, el catalizador es continuamente extrado del reactor en la corriente de producto. Para las enzimas, este es un serio problema ya que el catalizador no se produce en la reaccin mientras que en los cultivos de celulares el crecimiento suple las clulas que son eliminadas del reactor. Los reactores continuos utilizan enzimas libres nicamente si la enzima es barata y puede aadirse continuamente si la enzima es barata y puede aadirse continuamente con el fin de mantener constante la concentracin de catalizador en el reactor.

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Grfica de un tanque agitado de flujo continuo

Con enzimas ms caras, la operacin en continuo es ms factible si se trabaja con enzimas inmovilizadas y retenidas dentro del reactor. Los reactores continuos de mezcla perfecta se conocen generalmente mediante siglas CSTR, que significan reactor de tanque agitado continuo. Algunas veces se utiliza tambin el trmino CSTF para expresar el fermentador de tanque agitado continuo. Los parmetros de operacin caractersticos en los reactores continuos son la velocidad de dilucin D y el tiempo medio de residencia . Estos parmetros estn relacionados de la siguiente manera:

En la operacin de un reactor continuo, la cantidad de material que puede procesarse en un determinado periodo de tiempo viene expresado por el caudal, F. Por lo tanto, para una determinada capacidad de tratamiento, el tamao del reactor V y el capital y los costes de operacin a l asociados son mnimos cuando se hace tan pequeo como sea posible. La teora del reactor continuo permite calcular relaciones entre (o D) y las concentraciones de sustrato, producto y clulas en el reactor en estado estacionario.

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Estructura interna de un tanque agitado de flujo continuo

Reaccin enzimtica Apliquemos la ecuacin siguiente al sustrato limitante en reactor enzimtico continuo que opera en estado estacionario. El caudal msico de sustrato que entra al reactor, Mi, es igual a Fs mientras que el caudal msico de sustrato que sale del reactor, Mo, es igual a Fs. Como en el reactor no se genera sustrato RG=0. La velocidad de consumo de sustrato Rc es igual a la velocidad volumtrica de reaccin v multiplicada por V, donde v tiene expresada por la ecuacin . La parte izquierda es cero porque el sistema se encuentra en estado estacionario. Por lo tanto el balance de materia en estado estacionario para el sustrato en una reaccin enzimtica continua es:

Para reacciones con enzimas libres se supondr que la perdida de enzima en la corriente de producto se repone inmediatamente, por lo que vmx permanece constante y se alcanza el estado estacionario. Dividiendo por V y aplicando la definicin de velocidad de dilucin de la ecuacin se obtiene:

Si vmax, Km y Si son conocidos, la ecuacin anterior puede utilizarse directamente para calcular la velocidad de dilucin necesaria para alcanzar una determinada conversin de sustrato. La concentracin de producto en estado estacionario puede calcularse a partir de la estequiomtrica. 32

B. Reactor De Flujo Pistn En un reactor ideal de flujo pistn no existe mezcla, de manera que el lquido que entra al reactor pasa a su travs como un pistn y no reacciona con los elementos de fluido adyacentes Este tipo de flujo se alcanza a elevados caudales, los cuales hacen mnima la retromezcla y las variaciones en la velocidad del lquido. El flujo pistn se alcanza antes en reactores de columna o tubulares. Los reactores de flujo pistn pueden operar en flujo ascendente o descendente y, en algunos casos, de manera horizontal. Los reactores tubulares de flujo pistn tienen las siglas PFTR.

Grafica de un reactor de flujo pistn

El lquido en un PFTR fluye a velocidad constante, es decir, todas las partes del lquido presentan el mismo tiempo de residencia en el reactor. A medida que se produce la reaccin, en el reactor se desarrollan gradientes de concentracin de sustrato y de producto en la direccin del flujo. La concentracin de sustrato ser mxima y la concentracin de producto baja en la parte de la alimentacin del PFTR debido a que la mezcla de la reaccin acaba de entrar al reactor. Al final del reactor, la conversin de sustrato ser baja y la de producto alta. El caudal volumtrico de liquido a travs del reactor es F y la corriente de alimentacin contiene una concentracin de sustrato si. La concentracin de sustrato a la salida del reactor es sf. Esta concentracin de salida puede relacionarse 33

con las condiciones de entrada y el tiempo de residencia utilizando balances de materia. Reaccin enzimtica Para deducir las ecuaciones de n reactor enzimtico operando en flujo pistn debe de considerarse una pequea seccin del reactor de longitud 6z. Esta seccin se encuentra localizada a una distancia z del punto de alimentacin. En la ecuacin de balance de masa, Mi es el caudal msico de sustrato que entra al sistema. Por lo tanto, Mi = Fs|z donde F es el caudal volumtrico que atraviesa el reactor y s|z la concentracin de sustrato en z. De igual manera, Mo, el caudal de sustrato que abandona la seccin es Fs|z+6z. En la reaccin no se genera sustrato por lo que RG=0. La velocidad de consumo de sustrato, RC, es igual a la velocidad volumtrica de reaccin v multiplicada por el volumen de la seccin. El volumen de la seccin es igual a A6z donde A es el rea de la seccin a transversal del reactor. En estado estacionario, la ecuacin de balance es igual a cero y resulta:

Dividiendo por A6z y reordenando se obtiene:

El caudal volumtrico F dividido por el rea de la seccin transversal A es igual a la velocidad superficial a travs de la columna, u. Por lo tanto:

Para F y A constantes, u es tambin constante. La ecuacin anterior es vlida en cualquier punto del reactor de espesor 6z. Para que sea vlida en cualquier punto del reactor debe tomarse el lmite cuando 6z0:

Y aplicando la definicin de la forma diferencial de la ecuacin

La ecuacin anterior expresa el gradiente de concentracin de sustrato a lo largo de la longitud de un reactor operando en flujo pistn. Suponiendo que u y los parmetros cinticos son constantes se integrara. Separando variables e integrando

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con la condicin limite s=si en z=0 se obtiene una ecuacin que expresa la longitud de reactor L necesaria para alcanzar una determinada concentracin a la salida sf:

El tiempo de residencia para los reactores continuos se ha definido anteriormente. Si se divide V y F de la ecuacin de tiempo por A, el tiempo de residencia para los reactores de flujo puede expresarse en trminos de los parmetros L y u:

Por lo tanto, se puede reescribir:

En los reactores de flujo pistn las concentraciones varan constantemente a medida que la materia avanza por el reactor desde la entrada hasta la salida. Entonces, la operacin en flujo pistn puede verse como una forma de simular un cultivo discontinuo en un sistema de flujo continuo. La operacin en flujo pistn es generalmente poco prctica para reacciones enzimticas a menos que la enzima este inmovilizada y retenida en el interior del reactor.

INHIBICIN EN LOS REACTORES ENZIMTICOS En la mayora de los casos cuando se usan enzimas como catalizadores industriales se emplean soluciones se substrato concentradas y se consiguen altos grados de conversin, prximos al equilibrio, estos substratos. Aunque estas condiciones son muy diferentes a las encontradas en las enzimologa acadmica, en particular la lata concentracin de l producto obtenida, algunos productos que normalmente no se han considerados como inhibidores por sus valores de Ki relativamente elevados, actan como tales, de tal modo que se produce la inhibicin enzimtica de uno y otro tipo en la mayora de los reactores enzimticos. La influencia de la inhibicin del substrato en la cintica de los reactores enzimticos puede obtenerse a partir de las siguientes ecuaciones, que describen este efecto en una reaccin catalizada por enzimas.

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En los reactores discontinuos y de flujo pistn: XS - K m ln(1 X ) + kE kE S2 o (2 X X 2 ) = 2K S V q 3.44

Y par un reactor continuo tipo tanque con agitacin: XS + K m X S2 kE + ( X X 2) = (1 X ) K S q 3.45

Por tanto, la inhibicin por el substrato representa un serio problema en los reactores de flujo pistn, mientras que su efecto es mucho menor en los reactores continuos con agitacin puesto que todo el enzima opera una concertacin de substrato virtualmente idntica a la que existe en la corriente de producto, y por tanto su efecto puede minimizarse usando varios reactores en serie alimentados continuamente con substrato. La inhibicin de substrato en lo reactores discontinuos puede reducirse mediante una alimentacin en serie o intermitente de substrato, y en lo reactores de flujo pistn suministrando el substrato en varios puntos a lo largo del reactor, aunque ninguno de estos mtodos parece poderse llevar a la prctica industrialmente. El comportamiento de los reactores discontinuos y de flujo pistn, cuando est sujeto a inhibicin competitiva por el producto, puede describirse mediante la ecuacin: 1K K ip I S XS Kip kE V o kE q 3.46

K mln(1 X ) =

Y el de los reactores continuos tipo tanque con agitacin:

X XS + K m

Km X 2 S

kE 3.47

+ = 1 X K ip 1 X q Si S/Kip es pequeo la inhibicin por el producto no representa un problema serio, pero si este valor es alto y se obtienen grados de conversin elevados, la inhibicin competitiva por el producto se convierte en un problema grave. Esto afecta tanto a los reactores de flujo pistn como los agitados, aunque es ms importante en estos ltimos, puesto que todo el contenido de l rector tiene las mismas altas concentraciones del producto. Cuando u reactor discontinuo esta sujeto a inhibicin no competitiva su comportamiento cintico pude describirse mediante la ecuacin:

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K S XS 1 + m K ip K ip

(2

)X

2K ip

kE kE, K mln(1 X ) = 1+ o K ip V q

3.48

Y para los reactores con agitacin continua: XS + K m X X 2S 2 Km kE .1 + = + 1 X S (1 X ) q K ip 3,49

En presencia de inhibidores no competitivos en vez de competitivos se puede obtener una mayor extensin de la inhibicin a concentraciones iguales y con la misma concentracin de substrato y el mismo grado de conversin. Nuevamente la inhibicin es ms severa en los reactores continuos tipo tanque con agitacin que en los de flujo pistn. Estos efectos pueden expresarse convenientemente como el conciente entre la cantidad de enzima cuando el inhibido esta presente y la cantidad de enzima necesario para conseguir la misma conversin en ausencia del inhibidor. La Fig. 3.18 muestra este efecto para la inhibicin no competitiva por el producto en un reactor de flujo pistn con una conversin del 90%. Aunque las ecuaciones anteriores que describen las prestaciones de loe reactores bioqumicos pueden parece ms bien esotricas a primer vista, han demostrado ser muy tiles en la prctica. Por ejemplo, una informacin comparativamente simple como son los valores de Km y Ki puede darnos una idea de cual es el techo de prestaciones que puede logarse cuando se opera en condiciones ptimas. As incluso en una etapa comparativamente temprana el desarrollo del programa se puede predecir cual ser la productividad en el mejor de los casos, pudiendo hacer un calculo de los costos, y estimando las probables capacidades que son necesarias aguas arriba y aguas abajo del reactor enzimtico.

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BIBLIOGRAFA

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Anexos Problemas:

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