Realizacin e interpretacin de un anlisis de huellas de ADN mediante la utilizacin de enzimas de restriccin Kevin Quesada, Sofa Ulloa, Cristian Vargas,

Aarn Ventura Resumen En esta prctica se analizaron y compararon las muestras de tres sospechosos contra la muestra encontrada en la escena del crimen en un caso ficticio. El anlisis se realiz con las enzimas de restriccin EcoRI y Pstl para la identificacin de secuencias palindrmicas que despus de ser cortadas se sometieron a electroforesis de agarosa. Las pruebas indicaron una congruencia entre el bandeo del sospechoso 1 y la muestra encontrada. Palabras clave: enzimas de restriccin, huella de ADN, electroforesis Abstract In this practice were analyzed and compared the samples of three suspects against the sample found at the crime scene in a fictional case. The analysis was performed with restriction enzymes EcoRI and Pstl to identify palindromic sequences that after being cut were subjected to agarose electrophoresis. The tests indicated a congruency between suspect 1 and sample found's banding. Keywords: restriction enzymes, DNA fingerprinting, electrophoresis Objetivo Realizar de manera correcta un anlisis de huella de ADN con la utilizacin de las enzimas EcoRI y Pstl e interpretar los resultados con la ayuda de una electroforesis en gel de agarosa. Introduccin La tcnica de la identificacin de la huella de ADN de las personas fue utilizada por primera vez en 1985 por el Dr. Alec Jeffreys para la resolucin de un caso de inmigracin y luego, dos aos despus, l mismo lo aplic con fines forenses (Rodriguez, R., 2007). Cuando esta prctica fue ms conocida, se utiliz como una herramienta para establecer un registro gentico individual para identificar criminales. En la actualidad sus usos son ms amplios. Por ejemplo, se utiliza para realizar anlisis de ADN para diagnosticar padecimientos hereditarios y la predisposicin a enfermedades como la diabetes o el cncer (Hinke, 2003). IB Biotech Alicante (s.f.) asegura que en el ADN existen regiones especficas con gran nivel de variabilidad propias de cada persona, que se llaman polimorfismos y se utilizan como marcadores genticos para la identificacin de personas. Al conjunto de polimorfismos de cada persona se le conoce como perfil, mapa o huella gentica. Todas las personas tienen

diferentes perfiles genticos a menos que, posean un hermano gemelo monocigtico. Tiene la ventaja de que se puede obtener de cualquier muestra biolgica, es nica y no cambia a lo largo de la vida. Es utilizada en medicina forense para identificar restos humanos, para realizar pruebas de paternidad o parentesco y para comprobar la donacin de rganos. En contraste con las huellas digitales ampliamente utilizadas en la antigedad, los perfiles genticos pueden establecer relaciones de parentesco ya que el material gentico se hereda y por ende, los familiares lo comparten. Esta tcnica se est utilizando en la actualidad de manera comercial: en Estados Unidos diferentes compaas ofrecen almacenar muestras biolgicas de las personas para poder identificarlos en caso de secuestro o prdidas por largos periodos que dificulten el reconocimiento, otras empresas ofrecen hacer una tarjeta con los datos genticos individuales, estas tarjetas son solicitadas por las compaas aseguradoras para evitar fraudes al cobrar los seguros o por algunos abogados para realizar testamentos con bienes de costo elevado para asegurar que la herencia sea entregada a los verdaderos familiares (Hinke, 2003). Recientemente, se descubri otra utilidad que consiste en la deteccin de la huella gentica y la evolucin particular de las clulas cancergenas humanas. Este descubrimiento permitir dar tratamientos personalizados, la prctica es conocida como Anlisis Personalizado de Terminaciones

Reorganizadas (PARE, por sus siglas en ingls) y fue creada por investigadores de la Universidad Johns Hopkins en Estados Unidos. La tcnica busca, tras una intervencin quirrgica, los biomarcadores del tumor, adems mapea la direccin del desarrollo tumoral, su rapidez y la efectividad del tratamiento. Por el momento, la tcnica no se ha popularizado dado que es muy costosa $5.000- (Rodriguez, I., 2010). Metodologa Se realiz el procedimiento de acuerdo al manual de Laboratorio de Gentica del Tecnolgico de Costa Rica con las siguientes modificaciones: Se utilizaron tres muestras de sospechosos en lugar de cinco muestras. Se utilizaron 5L de muestra y se le agregaron 5L de la mezcla de enzimas de restriccin. Antes de incubar las muestras, se centrifugaron durante 1 minuto. Antes de la electroforesis no se le agregaron los 5L de buffer de carga a las muestras. Se agregaron 10L de muestra a cada pozo, en lugar de 20L. No se utiliz el marcador de peso molecular en la electroforesis. El resultado de la electroforesis se observ con el transiluminador, por lo que no se llev a cabo la parte de Tincin de la muestra.

Resultados En la figura 1 se observa el resultado de la electroforesis, de izquierda a derecha se tienen las bandas obtenidas para la escena del crimen (EC), el sospechoso 3 (S3), el sospechoso 2 (S2) y el sospechoso 1 (S1). Como se muestra el

patrn de bandas de la electroforesis concuerda para la muestra de la escena del crimen y para la muestra del sospechoso 1.

Figura 1. Patrones de bandas obtenidas por medio de la electroforesis para cada muestra

Discusin A partir del hecho de que solamente los gemelos monocigticos y los clones pueden tener la misma huella digital, se avala la opcin de utilizar pruebas que incluyan tcnicas de huellas de ADN para poder encontrar al posible culpable en una escena del crimen. Durante la realizacin de la prctica se utiliz una mezcla de dos enzimas de restriccin (EcoRI y Pst1) para ser agregada a cada una de las muestras de los sospechosos y a la que fue recogida en la escena del crimen (la manipulacin de las muestras fue llevada a cabo en hielo con el objetivo de evitar una posible degradacin del ADN). Su funcin es cortar ADN donde

se encuentran secuencias palindrmicas; las enzimas permiten fraccionar el ADN que en un principio estaba superenrrollado para hacerlo ms lineal y facilitar tanto la corrida durante la electroforesis como la interpretacin despus de esta (Rivera & Maldonado, 2009). Todo esto se hizo bajo el principio de que cada individuo posee distintos puntos de restriccin, de manera que dos piezas de ADN de diferente origen pueden producir fragmentos de diferente longitud cuando se cortan con la misma enzima (BioRad, 2010). El movimiento de las fracciones de ADN (por electroforesis) va a producir un patrn de bandas particular que est relacionado con el tamao de las fracciones cortadas por las enzimas de restriccin, por ende, debe coincidir con el patrn de bandas pertinente a la muestra que fue encontrada en la escena del crimen, indicando de esta forma que el tamao de las fracciones representa variaciones en el ADN de cada individuo (Bio-Rad, 2010). Se realiz la incubacin a 37 C de las muestras para promover la actividad de las enzimas de restriccin. Adems, se hace meritoria la adicin de alguna sustancia para teir las muestras, cabe destacar que no se hace para teir el ADN sino ms bien para permitir la visualizacin del avance de la electroforesis. Las muestras se colocan en un lugar especfico dentro de la cmara electrofortica, es decir, en el polo negativo ya que la molcula de ADN tiene carga global negativa. Al momento de aplicar el voltaje (100V durante 30 minutos) las muestras avanzan hacia el polo positivo de la

cmara, donde la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de la masa molecular (Rivera & Maldonado, 2009). Como cada fragmento de ADN tiene un tamao nico, se infiere que todos los fragmentos pueden ser observados y que la cantidad de fragmentos depende de cuntos sitios de restriccin identifican las enzimas (Nelson, Bradley, & workgroup, 2008) Por otra parte, los resultados fueron positivos. Se puede evidenciar (vase figura 1) la distribucin homloga entre los patrones de bandas de la muestra titulada como EC y la muestra S1, de esta forma es pertinente decir que el sospechoso nmero 1 (S1) es el que se encontr culpable mediante esta prueba. Es menester recalcar el grado de fiabilidad que posee este tipo de pruebas, haciendo hincapi en que es solamente un simulacro de lo que se debe hacer en un caso criminalista. La confiabilidad de una prueba de esta ndole depende de factores tales como la variabilidad gentica en una poblacin y la estadstica, esto es debido a que la variabilidad en una poblacin define la probabilidad de que dos individuos tengan una secuencia homloga (Curtis, 2008). Por ende no sera prudente aseverar que un individuo es culpable con solamente una prueba de este tipo ya que adems se utilizan secuencias ms amplias para poder comparar y evitar as una posible coincidencia. Para soslayar este tipo de inconvenientes se utilizan secuencias de alta variabilidad conocidos como microsatlites.

Conclusin Para efectos de la prctica se puede decir que la identificacin del culpable se llev a cabo exitosamente, ya que despus de realizada la electroforesis y comparar las bandas obtenidas se puede observar que el patrn de la muestra del sospechoso 1 coincide con el patrn obtenido de la muestra encontrada en la escena del crimen.

Recomendaciones Procurar que las muestras con las cuales se va a trabajar estn lo menos contaminadas posibles para evitar alteraciones en los resultados. Cada vez que se llena un pozo en la electroforesis, cambiar de punta entre muestra y muestra para evitar la contaminacin entre las mismas. Para la obtencin de muestras de buena calidad es recomendable aplicar voltajes bajos al gel de agarosa evitando su degradacin.

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