Precipitación de Proteínas

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Precipitacin
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
Precipitacin
En la precipitacin se concentra el soluto de una solucin convirtindolo en slido
mediante la accin de un agente precipitante.
Tericamente la precipitacin debe producir un soluto concentrado y puro, por
lo que es una operacin que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparacin
Ventajas
1. Operacin que se adapta fcilmente a gran escala
1. Puede realizase en forma continua
2. El equipo que se utiliza es sencillo
3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos stos
son baratos
Fundamentos
Principio Agente precipitante
Disminucin de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)
pH (precipitacin isoelctrica)
Solventes (etanol) Solventes (etanol)
Polmeros no inicos
Desnaturalizacin selectiva Temperatura
pH
Solventes
Afinidad Ligandos
Precipitacin por disminucin de la solubilidad
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
Al agregar un agente
precipitante
Las protenas con mayor
hidrofobicidad superficial
precipitan primero
Precipitacin de
protenas por
disminucin de la
solubilidad
Precipitacin con sales
Precipitacin isoelctrica
Precipitacin con solventes
Precipitacin con polmeros no inicos
+
+
+
+ +
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
Regiones hidrofbicas
precipitan primero
Precipitacin con sales
Insolubilizacin
por salado
Solubilizacin
por salado
S
(Salting-out) (Salting-in)
[Sal]
Mecanismo
La adicin de sales elimina el agua de la protena
hidratada, dejando las regiones hidrofbicas en
libertad de combinarse intermolecularmente
Precipitacin por incremento de la fuerza inica
(Salting-out)
Protena total
Protena de inters
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

r
e
l
a
t
i
v
a

(
%
)
80
100
Concentracin de Sal (% Saturacin)
0 20 40 60 80 100
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

r
e
l
a
t
i
v
a

(
%
)
0
20
40
60
Ecuacin de la precipitacin con sales
| | Sal log m A S =
Donde:
S = Solubilidad de la protena a un valor dado de concentracin salina.
A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante
usualmente toma un valor mnimo en el punto isoelctrico, es caracterstica de
cada protena e independiente del tipo de sal.
m = Pendiente de la curva de solubilizacin por salado. sta es independiente del
pH y la temperatura, pero vara con el tipo de sal y de protena. Las sales que
contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de m
mayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el
magnesio disminuyen el valor de m.
Naturaleza de la sal
1. Los aniones son ms efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):

> > > > > >
> > > > > >
I ClO O Br ClO Cl COO CH
PO H IO F SO
4 3 3 3
4 2 3
2
4
2 3
tartrato citrato
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que
requiere el mtodo.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea
diferente a la de la solucin para facilitar su separacin.
5. Aadirla sal en forma slida y no como solucin, para minimizar la dilucin.
> > > > > > I ClO O Br ClO Cl COO CH
4 3 3 3
+ + +
> > a K H
4
Precipitacin isoelctrica
Esta tcnica se basa en la disminucin de la solubilidad en el punto isoelctrico
Mecanismo
Las protenas por su naturaleza anfotrica presentan una carga neta negativa a
pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH
isoelctrico al cual la carga neta de la protena es cero. A este pH la molcula
es incapaz de desplazarse en un campo elctrico
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Repulsin
Atraccin
Baja interaccin
en el punto
isoelcrico
Efecto de las fuerzas
electrostticas sobre la protena
Precipitacin con solventes
Esta tcnica se basa en la disminucin de la solubilidad mediante la adicin de un
solvente orgnico ligeramente polar
Mecanismo
El agua se caracteriza por su alta constante dielctrica, lo cual significa que los iones en
solucin acuosa presentan interacciones ms dbiles que con otros medios.
La adicin de un solvente orgnico (etanol o acetona) produce agregados de molculas
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
Mecanismo
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
constante dielctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las
fuerzas de atraccin entre cargas opuestas y una disminucin en el grado de ionizacin
de los radicales de las protenas, y en consecuencia una disminucin en la solubilidad de
sta.
Lquido D
Agua 80.0
Matanol 33.0
Etanol 24.0
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9
Constantes dielctricas de algunos lquidos a 20C
Ecuacin de la precipitacin con solventes
donde:
S = Solubilidad de la protena
2
0
log log
S
D
K
S S + =
D
S
= Es la constante dielctrica de la mezcla solvente-agua, misma que vara
dependiendo de la cantidad de solvente agregada.
K = Es una constante que toma en cuenta la constante dielctrica original del
medio acuoso.
S
0
= Es la solubilidad extrapolada
Seleccin
del solvente
El solvente debe ser completamente miscible en agua
No debe reaccionar con las protenas
Debe ser un buen agente precipitante
Debe ser seguro (flamabilidad del solvente)
Precipitacin con polmeros no inicos
La precipitacin de protenas tambin puede realizarse utilizando polmeros
neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.
El mecanismo no est claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos
Mecanismo
Ogston y Laurent sugieren que los polmeros excluyen a las protenas de parte
de la solucin y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su
solvatacin.
El modelo de Ogston se basa en la teora termodinmica y concluye que los
sistemas pueden ser explicados en trminos de los coeficientes de interaccin
protena-polmero, y protena-protena de las especies presentes.
El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusin geomtrica de
regiones hidratadas de la protena por el polmero.
El mecanismo no est claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos
propuestos.
Ecuaciones de la precipitacin con solventes
Modelo de Laurent:
KC k S = log log
C = Concentracin del polmero
k = constante de proporcionalidad
3
|
|
|
+
=
p s
r r
v
K
= Volumen parcial especfico del polmero
r = Radio de la molcula de protena
v
303 . 2
|
|
\
+
=
p
p s
r
r r
v
K
r
S
= Radio de la molcula de protena
r
P
= Radio del cilindro del polmero
Modelo de Ogston:
aC X S = log
C = Concentracin del polmero
a = coeficiente de interaccin protena-polietilen glicol
RT
X
i i
0

=
= Potencial qumico de la protena en presencia del polmero
= Potencial qumico de la protena en el estado estndar
R = Contante de los gases ideales
T = Temperatura absoluta
i
0
i

Precipitacin de protenas por desnaturalizacin
selectiva
El objetivo de la desnaturalizacin selectiva es crear las condiciones en las cuales
la protena de inters no se desnaturaliza o su desnaturalizacin es mnima la protena de inters no se desnaturaliza o su desnaturalizacin es mnima
Si la protena que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas
de temperatura, pH, o en solventes orgnicos, puede utilizarse esta propiedad en
las primeras etapas del proceso de purificacin
Desnaturalizacin por temperatura
El proceso de desnaturalizacin de la protena por efecto de la temperatura puede
ser descrito como un proceso de primer orden
| |
| | P k
dt
P d
=
[P] = Concentracin de la protena disuelta
t = tiempo t = tiempo
k = Velocidad especfica de desnaturalizacin
|
\
|

=
RT
E
k k exp
0
La dependencia del proceso de desnaturalizacin con la temperatura est dado por:
| |
| | P
RT
E
k
dt
P d
|
\
|

= exp
0
k
0
= Constante caracterstica
E = Energa de activacin de la desnaturalizacin
R = Constante de los gases
T = Temperatura
Desnaturalizacin por pH
Debido a que ciertas protenas son estables a pHs extremos, se ha utilizado esta
propiedad para purificarlas mediante su precipitacin por desnaturalizacin selectiva de
las protenas contaminantes.
La velocidad de desnaturalizacin a pKs extremos ya sea cidos o bsicos depende del
tiempo que tarde la protena en abrirse y perder su conformacin.
Desnaturalizacin por solventes orgnicos
tiempo que tarde la protena en abrirse y perder su conformacin.
La estabilidad que presentan algunas protenas en una solucin con solventes orgnicos
es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificacin, mediante la
precipitacin de protenas contaminantes.
El pH y la temperatura de la solucin deben definirse y manejarse cuidadosamente con
el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la protena de inters, y de lograr la
mxima precipitacin de las protenas contaminantes.
Precipitacin por afinidad
La precipitacin de proteinas por afinidad es un mtodo de preciptacin selectivo que
se basa en la capacidad que tienen las protenas para unirse con ligandos por medio
de sus sitios activos.
En el caso de la afinidad bioespecfica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o En el caso de la afinidad bioespecfica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o
un anticuerpo.
En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.
Nota: La simple adicin de ligandos a una solucin proteica generalmente no es suficiente
para que ocurra la precipitacin. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregacin
de los complejos ligando-protena.
Equipos de precipitacin
La operacin de precipitacin puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los
que se encuentran los:
Intermitentes Continuos tipo
tanque agitado
Alimentacin
Producto
Alimentacin
Producto
Tubulares
Diseo de Precipitadores
Precipitacin a gran escala
En el diseo de un proceso de precipitacin debe tomarse como base el comportamiento
cintico de las partculas en solucin. El conocimiento de este comportamiento permite
hacer la seleccin adecuada de la geometra en la que se realizar el proceso.
Gran escala significa procesos los cuales son 10 veces o ms que los mtodos de
laboratorio existentes. En otras palabras se est interesado en el escalamiento.
La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del
proceso a pequea escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la
cintica. Se desea que ambas cinticas sean las mismas.
Se demuestra que la precipitacin se obtiene con mejor xito a una potencia por unidad
de volumen constante (P/V).
Precipitacin a gran escala
Se puede idealizar la precipitacin como un mecanismo de 6 etapas:
1. Mezclado inicial: La alimentacin conteniendo el soluto es mezclada con el
no-solvente o la sal
2. Nucleacin: Aparecen pequeas semillas e inicia la precipitacin
3. Crecimiento limitado por difusin: El precipitado crece por difusin 3. Crecimiento limitado por difusin: El precipitado crece por difusin
4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado
5. Floculacin: Partculas coloides se agregan en flculos grandes
6. Centrifugacin: Los flculos son separados por los mtodos ya descritos
Alguno de estos procesos ocurrirn simultneamente, pero se discutirn como si
ocurriesen secuencialmente
Mezclado Inicial:
El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuacin:
D
l
t
4
2
=
donde: l es el tamao promedio de los eddies turbulentos causados por el mezclado y donde: l es el tamao promedio de los eddies turbulentos causados por el mezclado y
D es el coeficiente de difusin del soluto.
El tamao de estos eddies puede ser estimado de la ecuacin:
4
1
3
/
|
|
\
|
=
V P
l

donde: es la densidad de la solucin, es la viscosidad cinemtica, y P/V es la potencia
por volumen de la agitacin.
Nucleacin:
La nucleacin es la parte del proceso donde pequeas partculas aparecen y empiezan a
crecer:
En sistemas inorgnicos, la nucleacin puede ser lenta y la sobresaturacin puede
persistir por largos periodos
Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantneo
Crecimiento limitado por difusin (Crecimiento Pericintico):
Despus de la nucleacin, las partculas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto
difunde hacia ellos de la solucin circundante. Este crecimiento usualmente sigue un
proceso de segundo orden:
2
i
i
ky
dt
dy
=
dt
donde: y
i
es la concentracin de partculas de soluto, y k es la constante de la tasa del
proceso.
La constante k es una funcin del coeficiente de difusin D:
Dd k 8 =
donde: d es el dimetro del soluto, y es el nmero de Avogadro.
La ecuacin de segundo orden puede ser fcilmente integrada:
kt
y y
i i
+ =
0
1 1
donde: y
io
es la concentracin inicial de soluto.
Sin embargo, frecuentemente es ms difcil medir y
i
que determinar el peso molecular Sin embargo, frecuentemente es ms difcil medir y
i
que determinar el peso molecular
promedio del precipitado. La ecuacin anterior se puede escribir en trminos del peso
molecular mediante un balance de masa
M
0
0
M y M y
i i
=
donde: es el peso molecular del soluto inicial.
Combinando las dos ecuaciones previas:
0 M
( ) kt y M M
i
0
1
0
+ =
As las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la
constante k.
Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregacin ortocintica):
La difusin limita el crecimiento de pequeas partculas pero es menos importante que el
crecimiento de partculas grandes.
Para estas partculas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisin entre
especies las cuales son barridas junto con el mezclado.
El crecimiento en esta regin obedece a una cintica de segundo orden:
2
i
i
ky
dt
dy
=
donde la constante de la tasa est dada por:
2 / 1
3
/
3
2
(
V P
d k
donde: es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho
de que no todas las coaliciones producen crecimiento .
La integracin directa de esta ecuacin es complicada por el hecho de que el dimetro de
la partcula y la constante de la tasa k son funcin del tiempo.
Se puede resolver la complicacin considerando una fraccin de volumen del soluto
y d
i
|
\
|
=
3
6
1

Esta fraccin de volumen es independiente del tiempo. As podemos reescribir las Esta fraccin de volumen es independiente del tiempo. As podemos reescribir las
ecuaciones anteriores en trminos de
i
i
y
V P
dt
dy
|
|
\
|
(
=
2 / 1
/ 4
Integrando encontramos:
|
|
\
|
|
|
\
|
(
= t
V P
y
y
i
i
2 / 1
/ 4
exp
0

Ejemplo 9.3
Floculacin:
Los flujos altos para el crecimiento de partculas pequeas puede destruir los flculos
ms grandes, as esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.
Los polielectrolitos sintticos pueden algunas veces ayudar a la floculacin, tal como
ocurre en la filtracin.
Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser
removido despus.

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