ESPECTROFOTOMETRIA: ABSORCIOMETRIA

PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA UV/VISIBLE La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiacin electromagntica. Los diferentes tipos de radiacin electromagntica, como ser rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a velocidad comn pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Se cumple que: c=x c = velocidad de la luz en el vaco = longitud de onda = frecuencia El ojo humano detecta la radiacin del rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energa a otro de mayor energa de ciertos compuestos, llamados cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiacin no absorbida. La luz solar es blanca, ya que contiene radiacin de todo el espectro visible, aparte de otras radiaciones. LEY DE LAMBERT-BEER La ley de Beer-Lambert (o Lambert-Beer) es la ley fundamental de la absorciometra, ya que relaciona la absorcin de la luz con la concentracin de soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio. El siguiente esquema ilustra la situacin: cubeta solucin de concentracin c

I0 luz incidente

I luz transmitida

Io I l c

l = intensidad del haz incidente = intensidad del haz transmitido = camino ptico (ancho interior de la cubeta medido en cm). = concentracin

Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, I es menor que Io. Cuanto mayor es el nmero de molculas de este cromforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la distancia recorrida a travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin. La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert-Beer: I = Io x 10- lc (1) ley de Beer-Lambert (forma exponencial)

La forma de esta ley usada en la prctica es ms sencilla y se obtiene de la siguiente manera: Reordenando y aplicando logaritmos: log (I/I0) = - l c Se define como absorbancia (A) de una solucin: A = log (I0/I) A=lc (2)

Luego:

(3)

ley de Beer-Lambert (forma lineal)

Por convencin se usa el siguiente sistema de unidades: l = camino ptico en cm c = concentracin en M = coeficiente de extincin molar, en cm-1M-1 Sinnimos de absorbancia: densidad ptica, extincin. El coeficiente de extincin molar: es una caracterstica propia del cromforo a una longitud de onda dada que representa la probabilidad de que el cromforo absorba la radiacin. Para explicar el significado de , se suele sealar que es igual al valor numrico de la absorbancia que tendra una solucin 1 M del cromforo si el camino ptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carcter hipottico de esta afirmacin, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de concentracin 1 M de los cromforos (si el PM es alto, 1 M es una concentracin extremadamente alta) y, por otra parte, el orden de magnitud de los coeficientes de extincin molar importantes corresponde a valores muy superiores al intervalo de absorbancias medibles. Los coeficientes de extincin pueden tener valores hasta aproximadamente 100.000 cm-1M-1. Existen coeficientes de extincin diferentes de , para los cuales la concentracin est expresada en unidades diferentes a la molaridad. Por ejemplo, para protenas se usa normalmente un coeficiente de extincin referido a concentracin en % peso/volumen, abreviado como A0,1% (l = 1 cm), el cual corresponde a la absorbancia que tiene una solucin de concentracin 0,1% p/v, medida en una cubeta de camino ptico igual a 1 cm. Para protenas globulares A0,1% (l = 1 cm) a 280 nm tpicamente tiene valores cercanos a 1. Por otra parte, se define como transmitancia (T) de una solucin: T = I/I0 (4)

Es decir, la transmitancia es la fraccin de la intensidad incidente transmitida por la solucin. Ms que T se usa el %T, el cual corresponde al porcentaje de la intensidad incidente transmitida por la solucin. Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene: A = - log T (5) Ejm: Si %T = 50, entonces T = 0,50 y A = 0,301

La ley de Lambert-Beer indica que para un cromforo a una longitud de onda dada la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentracin (con l = cte), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial (Fig. 1 y 2). A A=lc T T = 10 - l c

pendiente = x l c (M) Fig. 1 Fig. 2 c

El grfico de la absorbancia de un cromforo en solucin en funcin de la longitud de onda se denomina espectro de absorcin. Un espectro de absorcin se obtiene variando la longitud de onda para 1 y c constantes, y por lo tanto representa la variacin de con la longitud de onda (segn (3)). A continuacin se muestra como ejemplo el espectro de absorcin de riboflavina en fosfato de sodio a pH 7,0.

(nm) El espectro de absorcin de UV/visible es caracterstico para un cromforo determinado, por lo tanto se puede usar para su identificacin. Las caractersticas espectroscpicas se pueden resumir, indicando la posicin de los mximos de las bandas de absorcin ( mx) con los correspondientes coeficientes de extincin. Por ejemplo, para riboflavina a pH 7,0 estas caractersticas espectroscpicas se presentan en la siguiente tabla:

mx (nm)
266 373 445

(M-1cm-1)
31.800 10.400 12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su nica banda en la regin del visible a 445 nm, corresponde a absorcin de luz azul.

CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA De la ley de Lambert-Beer se puede deducir: a) Para diluciones, si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda, en la misma cubeta: A1/A2 = V2/V1 b) En un espectro: A1/A2 = 1/ 2 La aditividad de la absorbancia: La absorbancia de una solucin a cierta longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de todos los cromforos que contiene: AT = A1 + A2 + A3 + ... INSTRUMENTOS DE MEDIDA Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometra de UV/visible son: - Fuente de luz - Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda - Compartimento de muestra - Detector - Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a) Fotmetros de filtro: La seleccin de la longitud de onda se realiza mediante filtros intercambiables. Estos instrumentos son de poco uso, por sus limitaciones.

b) Espectrofotmetros: Poseen un monocromador. Los espectrofotmetros se pueden clasificar en instrumentos que operan solamente en el rango visible y espectrofotmetros de UV/visible. Por otra parte existen instrumentos de 1 solo haz y de doble haz. El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotmetro que opera con luz visible:

A continuacin se comentan brevemente las caractersticas de las partes de un espectrofotmetro.

1. FUENTE DE LUZ: Existen fuentes de luz diferentes para los intervalos espectrales diferentes. Las fuentes de luz visible son ampolletas de tungsteno o de halgeno, sirven para 340-850 nm aproximadamente. Fuentes de luz UV: lmparas de deuterio, sirven para 200-375 nm aproximadamente. Algunos espectrofotmetros tienen una lmpara de xenon la cual sirve tanto para el visible como para el UV. 2. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA: 2.1. Filtros No proporcionan luz realmente monocromtica sino que permiten el paso de un cierto intervalo de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de mxima transmitancia del filtro. 2.2. Monocromadores Poseen un elemento dispersor que es una red de difraccin. El elemento dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejos permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida: 493 nm 492 nm 491 nm 490 nm 489 nm 488 nm 487 nm 486 nm Monocromador Por la ranura siempre pasa un cierto intervalo de longitudes de onda (ver figura). Si la ranura es ms pequea la monocromaticidad de la luz que genera el monocromador ser mayor. La monocromaticidad se mide a travs del "ancho de banda", que es una caracterstica del espectrofotmetro y tpicamente tiene un valor entre 1 y 10 nm. En la prctica se considera que un espectrofotmetro opera con luz prcticamente monocromtica. Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin necesaria para obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es posible obtener espectros de absorcin. 3. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS: En este compartimiento est el portacubetas en el cual se insertan la o las cubetas con las soluciones de muestra y de referencia (solvente o blanco de un test). Las cubetas son de vidrio o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV). 4. DETECTOR: Los detectores son de tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Los detectores ms usuales son los fototubos y los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores. ranura 491 nm 490 nm 489 nm luz monocromtica

5. LECTURA O REGISTRO: Los espectrofotmetros informan la absorbancia en forma digital, con 3 cifras despus de la coma. El rango fotomtrico de los espectrofotmetros normalmente es desde A = 0,000 hasta A = 2,000 3,000, dependiendo del modelo. Algunos modelos pueden imprimir. En este trabajo prctico y en los subsiguientes se usarn espectrofotmetros Evolution 60 de Thermo Scientific. Estos espectrofotmetros operan entre 200 y 1100 nm (tienen una fuente de luz de xenon) con un ancho de banda de 1 nm y permiten medir absorbancias (entre -0,1 y 3,0), %T y concentracin. Para medir concentracin es necesario introducir previamente un factor de calibracin. Por otra parte, los instrumentos permiten ejecutar ciertas funciones en forma automatizada como obtener espectros de absorcin y cinticas. Los instrumentos tienen alternativamente un portacubetas para una sola cubeta con termoregulacin o un portacubetas para 6 cubetas. Instrucciones para medir A de una solucin a longitud de onda fija: - Encender el instrumento - Seleccionar la longitud de onda de trabajo - Calibrar con el solvente o con el blanco - Medir la absorbancia de la solucin

APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO 1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO Midiendo la absorbancia de la solucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el correspondiente coeficiente de extincin molar se puede calcular la concentracin. Normalmente se usa la longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor, as como el correspondiente se encuentran en la literatura. Un mtodo alternativo es construir una curva de calibracin de A en funcin de c, que ser una recta si se cumple la ley de Lambert-Beer (ver fig.1). Interpolando en la recta con la absorbancia de la muestra o solucin problema se puede determinar su concentracin. La pendiente de la curva de calibracin se ha llamado factor de calibracin, k. Luego: c = A/k (6)

Si se grafic la concentracin en unidades M, k = x 1. Si el nmero de muestras es alto, ser ms prctico determinar k desde el grfico y usar la ecuacin (6) que interpolar.

2. DETERMINACIONES A TRAVES DE UN ENSAYO O "TEST" Muchos compuestos que no pueden ser determinados directamente (midiendo su propia absorbancia), se pueden determinar por absorciometra usando un ensayo o "test". En el ensayo se agrega uno o varios reactivos cromognicos que interaccionan o reaccionan especficamente con el compuesto a determinar, generndose un compuesto o complejo que absorbe. Normalmente en los test se genera un color (absorbancia de luz visible), por lo que se denominan ensayos colorimtricos.

Casos en los cuales se realiza un test: 1. El compuesto no absorbe en todo el UV/visible: Ejemplo: Determinaciones de azcares, determinacin de fosfato. 2. El compuesto absorbe en una regin espectral (generalmente UV), pero no se puede efectuar la determinacin directa porque la muestra es una mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma regin que el compuesto a determinar o/y la absorbancia es demasiado baja. Ejemplo: Determinacin de protenas. Es indispensable un test, si se analiza una muestra con varias protenas, de coeficientes de extincin desconocidos. El test se realiza en paralelo con la muestra problema, con una o varias soluciones del compuesto a determinar, de concentracin conocida (soluciones patrn o estndar) y con el solvente (blanco del test). Posteriormente se miden las absorbancias "contra" el blanco, es decir, se calibra A = 0 con el blanco en el haz. Alternativamente se pueden medir contra agua, y restar la absorbancia del blanco de todas las absorbancias. La absorbancia es proporcional a la concentracin del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de concentraciones, especfico para cada test. Si se us solamente una solucin, se calcula la concentracin por proporcin directa: C (problema) = A (problema) C (estndard) A (estndard) Si se usaron varias soluciones estndard se construye la curva de calibracin del test. Para determinar la concentracin del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta o usar el factor de calibracin, como se explic anteriormente. Es necesario destacar que para un test no se maneja el valor de un . Al usarse un test, se debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el test, sealados normalmente en la literatura. BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. D. Freifelder, "Physical Biochemisty". H.Willard, L.Merrit, J.Dean "Instrumental Methods of Analysis". G.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis". S.B.Brown, Ed. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists".

PARTE EXPERIMENTAL El objetivo del presente prctico es aprender a determinar la concentracin de un cromforo por medio de una curva de calibracin. Los pasos a seguir son: 1. Escoger la longitud de onda de trabajo, que normalmente corresponder al mximo de una banda de absorcin. 2. Construir la curva de calibracin, lo cual significa: - Decidir la concentracin de las soluciones estndar (se debe considerar el intervalo de absorbancias medibles en forma confiable, aproximadamente entre 0,1 y 1,4). - Preparar las soluciones estndar. - Medir A de las soluciones estndar. - Graficar A en funcin de la concentracin. 3. Determinar la concentracin de muestras, utilizando la curva de calibracin.

El cromforo que se usar en este prctico es la riboflavina y la longitud de onda de trabajo ser 445 nm.

MATERIALES - Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0 - Riboflavina 0,1 mM en el buffer nombrado - Espectrofotmetros y cubetas de plstico de camino ptico 1 cm En forma previa al prctico (TAREA) realice los clculos necesarios para la preparacin de las soluciones estndar descritas a continuacin. PROCEDIMIENTO Prepare 5 soluciones estndar de riboflavina en buffer fosfato de sodio de concentracin: 10, 20, 30, 40 y 50 M (2 ml de cada solucin). Mida A de estas soluciones y A de la muestra a 445 nm. Anote sus valores en una tabla de la siguiente forma: Solucin N 1 2 3 4 5 Muestra Riboflavina ml Buffer ml Concentracin M Absorbancia

INFORME - Construya la curva de calibracin - Determine la pendiente de la curva de calibracin (factor de calibracin, k) (use 1 punto sobre la recta y el origen, coordenadas 0,0). - Calcule el coeficiente de extincin molar de la riboflavina a la longitud de onda usada. - Determine la concentracin de la muestra de dos formas: i) interpolando, ii) usando el factor de calibracin.