UE2 La cellule et les tissus

Apoptose Dr. Jamila Faivre Hpital Paul Brousse Villejuif

Lapoptose

1. Introduction lapoptose Dfinition, Modifications morphologiques, biochimiques et molculaires Mthodes dtude 2. Utilisation de la gntique pour ltude de lapoptose a. Modle dtude: le nmatode Caenorhabditis elegans b. Gnes de lapoptose et de la survie chez C. elegans et Homo sapiens 3. Activation par la voie des rcepteurs de mort 4. Activation par la voie mitochondriale

Ncessit de la mort cellulaire chez les organismes pluricellulaires

Dveloppement embryonnaire
Elimination de cellules en excs : palmures, cellules
germinales, canaux de Mller chez les hommes, canaux de Wolff chez les femmes, neurones ntablissant pas de connexion

Espaces interdigitaux

Rgulation du nombre de cellules et de la forme/taille des organes et du corps

Homostasie tissulaire
Elimination de cellules ne recevant plus de signaux de survie : cellules prostatiques diffrencies chez lhomme si
imprgnation andrognique insuffisante

Development 2000;127:5245 Variation du nombre de cellules germinales

Elimination de cellules dont lADN est endommag ou nayant pas franchi un point de contrle au cours de la mitose

Tolrance de soi - immunit

Elimination de cellules immunitaires reconnaissant les antignes du soi Elimination de cellules infectes (ex T4 infects par le VIH)

Ncrose Apoptose
Ncrose
Membrane Noyau Cytoplasme Cellules normales noyaux intacts (bleu) Cytoplasme et membrane intacts (vert) Contraction cellulaire Perte des microvillosits et des jonctions cellulaires Vsicules membranaires Perte de volume Rtrcissement cytoplasmique Condensation de lADN Fragmentation de lADN Fragmentation des noyaux en corps apoptotiques Formation des sacs sans perte dintgrit membranaire Perte dasymtrie des feuillets de la membrane plasmique Ingestion (phagocytose) des sacs par les cellules voisines sans raction inflammatoire

Apoptose

Perte de lintgrit de la cellule Fuite de son contenu dans le milieu extracellulaire Lyse des membranes Inflammation Elimination des dbris cellulaires par des phagocytes

Acteurs de lapoptose
Caspases (Cystine aspartases)
Protases activables en cascade Existent sous forme de pro-enzymes caspases initiatrices caspases effectices

Partenaires
Protines dassemblage Protines adaptatrices

Equilibre entre facteurs protecteurs et facteurs proapoptotiques

Voies dactivation de lapoptose

Voie des rcepteurs de mort Voie mitochondriale

Mcanismes molculaires de lapoptose

Signal inducteur = signal apoptotique intra- ou extra-cellulaire

Procaspases initiatrices inactives

Caspases initiatrices actives

Procaspases effectrices inactives

Caspases effectrices actives

Protolyse

Les diffrentes classes de caspases humaines

Clivage cytokines proInflammatoires (IL1, IL18)

Rle majeur dans lapoptose

Diffrenciation terminale des kratinocytes

Subdivises en trois grands groupes selon leur site spcifique de reconnaissance du substrat, leur structure ou leur fonction biologique.

Chronologie
Induction de lapoptose Activation de rcepteur Formation du complexe cytochrome c / Apaf-1 Potentiel mitochondrial diminu Activation des caspases Exposition des phosphatidylsrines
Hoechst 33342 Microscopie time lapse Activation caspase 3

Changements morphologiques Fragmentation de lADN 120 Temps (min)

10

20

60

80

100

Exemple des cellules Hela traites par TNFa/Actinomycine D

Gel agarose

Fragmentation de lADN lie lactivation dune endonuclase qui coupe lADN entre les nuclosomes et gnre des fragments dADN de taille quivalente des multiples de 180 paires de bases.

Analyse du cycle cellulaire par cytomtrie de flux

Ncrose Apoptose

Pic sub-G1

Caractres biochimiques
Cellule normale: Phosphatidylsrines uniquement sur face interne de la membrane Cellule en apoptose: phosphatidylsrines dlocalises et exprimes des deux cots de la membrane. Reconnues comme cibles par les macrophages et phagocytes

Marquage lannexine V

L'annexine V prsente une forte affinit pour les phosphatidylsrines. Les cellules apoptotiques seront marques lannexine. Les cellules ncrotiques seront aussi marques par l'annexine. Un double marquage annexine/IP (ne pntre que dans les cellules ncrotiques) permettra de discriminer les cellules apoptotiques (An+/IP-) des cellules ncrotiques (An+/IP+).

Mise en vidence des gnes de lapoptose ced-3 et ced-4 et du gne de survie ced-9 chez le nmatode Caenorhabditis elegans

C. elegans

uf 1090 cellules

Embryon Perte 131 cellules

Adulte 959 cellules

Activateurs de lapoptose des 131 cellules embryonnaires

S. Brenner, J. Sulston et B. Horwitz Nobel Physiologie et Mdecine 2002

Conception basique des signaux de lapoptose

Rpresseur de lapoptose

Activateurs de lapoptose des 131 cellules embryonnaires

Mcanisme extrinsque de lapoptose Voie des rcepteurs de mort

Mcanisme intrinsque de lapoptose Voie mitochondriale

Activation de la voie extrinsque en rponse la fixation de ligands spcifiques de type cytokines sur des rcepteurs de surface appels rcepteurs de mort.

Rles de la mitochondrie : - Mtabolique en gnrant lnergie ncessaire toutes les ractions biochimiques de la cellule - Intgre et propage les signaux de mort produits par divers stress (irradiation, chimio, dommages ADN, p53)

Nature Reviews Cancer 2, 277-288 (2002)

Les rcepteurs de mort Appartiennent la Superfamille des rcepteurs au tumor necrosis factor (TNFR). Incluent le rcepteur Fas/CD95, les rcepteurs au TNF (TNFR-1, TNFR-2) et les rcepteurs au TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) DR-4 et DR-5

Voie extrinsque de lapoptose

1. Activation du rcepteur de mort via son domaine cytoplasmique de mort (death domain, DD) 2. Recrutement des protines adaptatrices Fas associated death domain (FADD) ou TNF receptor associated death domain (TRADD)

3. Interaction des domaines DED des protines adaptatrices et dune caspase initiatrice (pro-caspase-8 ou 10) pour former le complexe DISC 4. Autoclivage de la pro-caspase 8 ou 10, qui active, active son tour les caspase effectrices comme casp.3 Responsable de lexcution de lapoptose Amplification du signal apoptotique

DISC: death inducing signaling complex

Activation de la voie TNF-

Apoptose

Fixation du cytochrome c sur Apaf-1 Stabilisation par fixation dATP Oligomrisation de sept units (Apaf-1)-(cyt c)-ATP Recrutement et activation de procaspase 9 Recrutement et activation des caspases effectrices 3 et 7

Lapoptosome est constitu de cytochrome c, de protines Apaf-1, dATP et de procaspase-9